CN103792211A - 一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用 - Google Patents

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李莹
钟金钢
齐攀
马骁
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    • G01N21/55—Specular reflectivity
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Abstract

本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。所述的表面等离子体共振生物芯片是通过在固相载体固定盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，芯片活化后在生物芯片上固定探针得到的；该生物芯片的应用包括通过利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测克伦特罗抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测克伦特罗的应用。该生物芯片具有快速、实时、能现场检测的特点，可迅速给出定量结果、灵敏度高而成本低，不污染环境。

Description

一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物芯片领域，具体涉及一种表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用。
背景技术
二十世纪九十年代，人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)和分子生物学相关学科的发展为生物芯片、基因芯片技术的出现和发展提供了有利条件。生物芯片（biochip）是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程固着于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。蛋白质芯片(protein chip)是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质固定在微型载体上获得，芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。本发明的生物芯片探针是克伦特罗衍生物，是一种蛋白质生物芯片。
尽管生物芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多问题，例如技术成本昂贵、操作复杂、重复性差、分析范围较狭窄、通常需要放射性元素标记或者荧光标记等。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等方面。荧光法是目前使用最多的标记方法，灵敏度不高，需要避光，用于检测结果的激光扫描仪价格昂贵。同位素标记法需要同位素和放射自显影，使用不便，操作复杂，耗时，有严重的污染。本发明不需要标记，可解决荧光标记和放射性元素标记对环境有污染的问题，同时样品处理简单，检测时间短，操作简便。
盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride，CLB)是一种β2-受体激动剂（β2-agonists），因与肾上腺素具有相同的药理作用，也被称为β2-肾上腺素受体激动剂（β2-addrenoeeptor agonists），主要在临床上用于治疗支气管哮喘、痉挛，阻塞性肺炎等疾病。20世纪80年代初，美国一家公司开始将盐酸克伦特罗添加到饲料中，它具有营养再分配的作用，大大提高了动物的瘦肉转化率，从此β2-受体激动剂被称为“瘦肉精”。长期食用含有盐酸克伦特罗的食品的人会发生头痛、胸闷、恶心等不良反应，1983年西班牙首次发生克伦特罗食物中毒事件，1998年香港出现克伦特罗食物中毒事件，世界上因克伦特罗引起的食物中毒已超过1000起。克伦特罗及其盐、酯在中国和很多地区为禁止使用的兽药，并规定在动物性食品中不得检出，但仍有一些饲养者或者饲料厂非法使用克伦特罗，克伦特罗的药物残留检测已成为研究热点。目前检测盐酸克伦特罗的主要方法是高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）等色谱分析法、酶联免疫分析法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等免疫学方法以及电化学方法，对克伦特罗的检测限通常是2.0μg/L。上述方法设备昂贵，检测周期长，对操作人员要求高，难以满足快速、现场检测的需求。
表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）是一种基于麦克斯韦电磁波理论的物理光学现象，它产生于具有复介电常数这一特性的金属表面。表面等离子体共振技术（SPR）利用P偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时进入金属薄膜内的隐失波（倏逝波）,引发金属中的自由电子产生表面等离子体,当隐失波的波矢与表面等离子体的波矢相匹配时，二者将发生共振,入射光的能量被表面等离子体吸收,反射光强急剧下降，发生SPR现象，这时对应的入射角度称为谐振角或者共振角。如果将探针或配体固定于传感器芯片表面，含待分析物的样品流经传感器表面，若流过生物芯片表面的样品中含有与之结合的物质，它们之间发生的相互作用将导致芯片表面的介质折射率发生改变，引起SPR共振角发生改变。通过检测SPR信号改变检测分子间的相互作用的特异性、浓度、动力学、亲合性、协同作用、相互作用模式等。在生物分子相互作用分析过程中，靶物质可以天然存在于分析物中，在自然条件下进行分析，保证了所得结果的真实性。因此，SPR生物传感器具有实时、免标记、操作简单、可定量检测生物分子、检测两种或多种分子间结合的优点。目前，SPR技术已广泛应用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表面等离子体共振生物芯片，该生物芯片以盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物（CLB-BSA）作为探针。
本发明的另一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述表面等离子体共振生物芯片的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，包含如下步骤：
（1）在玻璃基底上沉积厚度为45～55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
（2）在培养皿中注入含有HS(CH2)10COOH（巯基十一酸）和HS(CH2)6OH（巯基己酸）的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；
（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；
（5）在生物芯片表面固定盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物（CLB-BSA）；记录表面等离子体共振角的变化，监测生物探针固定的过程，SPR响应值有大幅升高，则探针固定效果较好,当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；
（6）加入乙醇胺（Eth）溶液封闭灭活剩余的酯键；然后注入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。
步骤（1）中所述的玻璃基底优选直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度优选为50nm；
步骤（2）中所述的HS(CH2)10COOH的终浓度为0.5～10mM，优选为1mM；
所述的HS(CH2)6OH的终浓度为4.0～100mM，优选为9mM；
步骤（2）中所述的化学修饰的条件为37℃温浴，避光反应0.5～6h，优选为2h；
步骤（2）所述的氮气吹干的温度为40～60℃，优选为50℃；
步骤（4）中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L；所述的N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；
步骤（4）中所述的活化芯片的时间为10～60min，优选为15min；
步骤（5）中所述的盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物（CLB-BSA）的浓度为83mg/L；所述的固定的时间为10～90min，优选为30min；
步骤（6）中所述的乙醇胺溶液的浓度为1mol/L，pH值为8.5；所述的封闭灭活的时间为3～10min，优选为6min；
步骤（2）、（4）、（5）和（6）中所述的PBS缓冲液清洗的次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min；
所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；
一种表面等离子体共振生物芯片，通过上述制备方法得到；
所述的表面等离子体共振生物芯片的应用，包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测盐酸克伦特罗抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测盐酸克伦特罗的应用；
所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测盐酸克伦特罗抗体，包含如下步骤：
（一）建立标准曲线：
已知浓度的盐酸克伦特罗抗体用PBS缓冲液配制成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
（二）未知样品的检测：
将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（一）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中盐酸克伦特罗抗体的浓度；
（三）下一样品检测：
步骤（二）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
步骤（一）中所述的盐酸克伦特罗抗体标准溶液的优选浓度范围为0.5mg/L～100mg/L；
步骤（一）所述的标准溶液的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～5min，优选反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；
步骤（二）中所述的未知样品的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～5min，优选反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；
步骤（三）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；
步骤（三）中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min；所述的SDS-HCl溶液清洗次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min；
所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；
在生物芯片表面固定盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物（CLB-BSA），直接检测盐酸克伦特罗抗体，可进行抗体筛选和研究免疫反应动力学。同一个芯片至少可连续检测50个样品，一个样品检测完，通入PBS缓冲液，然后通入SDS-HCl溶液，使抗原-抗体结合物解离，再通入PBS缓冲液，SPR响应值降回基线，可继续检测下一个样品。
所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争法检测盐酸克伦特罗，包含如下步骤：
（Ⅰ）建立标准曲线：
盐酸克伦特罗标准品用PBS缓冲液配制成不同浓度的标准溶液，不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液分别与定量盐酸克伦特罗抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
（Ⅱ）未知样品的检测：
将未知样品提取液和定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（Ⅰ）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中盐酸克伦特罗小分子的浓度；
（Ⅲ）下一样品的检测：
步骤（Ⅱ）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
步骤（Ⅰ）中所述定量盐酸克伦特罗抗体在混合溶液中终浓度为20mg/L；
步骤（Ⅰ）中所述的盐酸克伦特罗小分子分子量为313.7；
步骤（Ⅰ）中所述的标准溶液的浓度范围为0.5～100μg/L；
步骤（Ⅰ）中所述的静置时间为1～15min，优选时间为5min；
步骤（Ⅰ）中所述的盐酸克伦特罗标准品与盐酸克伦特罗抗体的混合溶液的检测量优选为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～5min；优选反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；
步骤（Ⅱ）中所述未知样品提取液，包含如下具体步骤：
①称2g猪肉或猪肝；
②加入0.1M的HCl6mL，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
③取上清液，加入0.1M的NaOH2mL，加入6mL乙酸乙酯，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
④取步骤③得到的上清液于50℃氮气吹干；
⑤加入1mL三蒸水复溶，得到未知样品提取液；
步骤（Ⅱ）中所述定量盐酸克伦特罗抗体在混合溶液中终浓度为20mg/L；未知样品提取液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3～5min，优选反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为0.5～4°，优选为1～2°；
步骤（Ⅲ）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；
步骤（Ⅲ）中所述的PBS缓冲液清洗次数优选为3次，每次清洗的时间优选为3min；
所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4；
本发明的原理：在固相载体（镀金膜的玻璃片）固定盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物（CLB-BSA）作为生物探针，利用金膜产生表面等离子体共振（SPR）响应，利用自组装单分子层技术在金膜表面修饰巯基，经活化后芯片可以固定探针，样品注入微流通池，与探针发生免疫反应，由P偏振光检测生物芯片探针与样品的反应（图1、图2）。当检测样品中有与探针匹配的物质时，共振角发生变化，SPR检测仪记录检测结果，获得检测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合回归标准曲线，分析实验结果。盐酸克伦特罗的分子量较小（313.7），不适于直接检测。如果生物芯片表面固定盐酸克伦特罗抗体作为探针，盐酸克伦特罗能与抗体结合，但对芯片表面附近的折射率影响小，SPR共振峰的变化小，直接检测效果不好。为了检测盐酸克伦特罗痕量小分子物质，本发明提出抑制免疫型生物芯片法。芯片表面固定CLB-BSA作为探针，CLB小分子与定量的盐酸克伦特罗抗体混合后注入流通池，CLB小分子和芯片表面的CLB-BSA都可以与盐酸克伦特罗抗体结合，是竞争的关系，CLB小分子抑制了盐酸克伦特罗抗体与芯片表面的探针CLB-BSA结合，样品中CLB的浓度与响应值的变化成反比。如果样品中CLB浓度小，则更多的盐酸克伦特罗抗体与芯片表面探针结合，SPR响应值即共振角的变化更大。
本发明的优点与效果如下：
（1）本发明不需要对样品标记，对环境无污染。
（2）本发明只需单一抗体，样品处理简单且用量少，简化了操作步骤，缩
短了检测时间。
（3）本发明采用CLB-BSA作为探针，应用SPR技术进行信号检测，不需要昂贵的检测仪器，降低了芯片的使用成本及实验条件。
（4）本发明可以用便携式SPR检测仪实现样品的现场快速检测，可以广泛应用于普通实验室，有望在超市、市场、工厂等需要食品质量实时监控的场所，实现大量样品的现场快速检测。
本发明可实现生物芯片技术的快速、实时、能现场检测的特点，可迅速给出定量结果、灵敏度高而成本低，不污染环境。直接检测法检测盐酸克伦特罗抗体可研究抗原-抗体亲和力及动力学反应过程，适用于基础研究和抗体的筛选等。竞争抑制检测法可检测猪肝中提取的克伦特罗小分子，灵敏度高，与目前常用的HPLC和ELISA方法检出限相同，可用于食品检测、药物筛选、疾病诊断等领域，将会产生较好的经济效益和社会效益。
附图说明
图1是本发明生物芯片检测***结构模式图。
图2是本发明芯片***模式图。
图3是实施例2制备的标准溶液（5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L和50mg/L）发生免疫反应的表面等离子共振动力学曲线图。
图4是实施例3制备的标准溶液发生免疫反应的表面等离子共振动力学曲线图。
图5是实施例3建立的回归标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
盐酸克伦特罗标准品（100g/mL的乙醇溶液）由农业部环境保护科研监测所提供，分子量为313.7；克伦特罗-牛血清白蛋白（CLB-BSA）耦联物、克伦特罗抗体购于广州弗赛生物科技有限公司；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、乙醇胺（Eth）、十二烷基硫酸钠（SDS）、HS(CH2)10COOH（巯基十一酸）和HS(CH2)6OH（巯基己酸）购于美国Sigma公司；其它试剂购于北京化学试剂公司；PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水；所述的PBS缓冲液的PH为7.4；SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L。
实施例1表面等离子体共振生物芯片的制备
（1）以直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片作为基底，在玻璃基底上沉积厚度为50nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
（2）培养皿中注入含有终浓度为1mM的HS(CH2)10COOH（巯基十一酸）和9mM HS(CH2)6OH（巯基己酸）的乙醇溶液4mL，37℃温浴，避光，对金膜表面进行化学修饰2h；然后通入PBS缓冲液充分清洗3次，每次3min，洗掉未结合物质；50℃氮气吹干；
（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗3次，每次3min，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）的混合液150μL，活化芯片15min；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次3min；其中，混合液中，N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L、N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；
（5）在生物芯片表面通入83mg/L的CLB-BSA100μL，固定生物探针，固定时间为30min；记录表面等离子体共振角的变化，监测生物探针固定的过程,当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次3min；
（6）加入1mol/L的乙醇胺溶液（pH=8.5）150μL，封闭灭活剩余的酯键6min；然后通入PBS缓冲液清洗3次，每次3min。
实施例2利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测盐酸克伦特罗抗体
（1）建立标准曲线：
用PBS缓冲液配制成不同浓度的CLB抗体标准溶液：浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L、50mg/L和100mg/L；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别取100μL依次注入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例1制备得到的表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为3min；对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液发生免疫反应的表面等离子体共振动力学曲线（图3），以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
（2）未知样品的检测：
将100μL的未知样品通入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间设定为3min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中CLB抗体的浓度；
（3）下一样品检测：
一个样品检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗3次，每次清洗3min；再通入SDS-HCl溶液处理1～3次，使抗原-抗体结合物解离，每次处理3min；然后通入PBS缓冲液3次，每次清洗的时间是3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
配制不同浓度的CLB抗体标准溶液，样品浓度分别为：1mg/L、5mg/L、10mg/L、30mg/L，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测上述CLB抗体标准溶液中CLB抗体的含量：通过SPR检测仪测定的数据结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出样品中CLB抗体浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表1所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测***具有良好的检测能力，实验方法可行。
表1利用表面等离子体共振生物芯片直接法检测盐酸克伦特罗抗体结果分析
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随着免疫反应的进行，生物芯片表面抗原-抗体结合物增多，SPR响应值增大。随样品中CLB抗体浓度升高，免疫反应速度增快，SPR共振角增大，共振曲线右移。检测每个样品时，免疫反应先快后慢，逐步趋于饱和。
实施例3利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测盐酸克伦特罗
（1）建立标准曲线：
CLB标准品溶液与CLB抗体溶液混合，在混合溶液中CLB抗体的终浓度为20mg/L；CLB标准品的终浓度分别为0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L；混合溶液静置5min，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与抗体溶液的混合溶液分别取100μL注入表面等离子共振仪的微流通池，与实施例1制备得到的表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，反应时间为3min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录免疫反应过程中SPR共振角的变化，获得各个CLB标准溶液的表面等离子共振动力学曲线（图4），以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线（图5）；
（2）克伦特罗的检测
将未知样品提取液和CLB抗体溶液混合，CLB抗体在混合溶液中的终浓度为20mg/L；混合溶液静置5min，将100μL的混合溶液注入微流通池进行免疫反应，反应时间为3min；对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，扫描范围为1～2°；记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中CLB小分子的浓度；
（3）下一样品的检测
一个样品检测结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗3次，每次清洗3min；再通入SDS-HCl溶液处理1～3次，使抗原-抗体结合物解离，每次处理3min；然后通入PBS缓冲液3次，每次清洗的时间是3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
配制不同浓度的CLB标准溶液，样品浓度分别为：2μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L，记为其真实值；同时利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测上述CLB标准溶液中CLB的含量：通过SPR检测仪测定的数据结合步骤（1）得到的回归标准曲线，计算出样品中CLB小分子浓度的检测值；检测值与真实值进行对比，如表2所示。检测值与真实值的绝对偏差均较小，其相对偏差亦均较小，说明SPR生物芯片检测***具有良好的检测能力，实验方法可行。
表2利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测克伦特罗结果分析
Figure BDA0000462733030000111
当样品中CLB浓度大时，可与芯片表面探针结合的CLB抗体数量少，免疫反应速度慢，SPR响应值低，CLB小分子浓度与SPR响应值成反比。经测定每个生物芯片至少可连续检测50组样品，超过50组样品SPR响应值明显下降，说明生物芯片表面固定的探针受损。这时芯片表面通入0.1mol/L的HCl溶液可实现芯片再生，重新自组装并固定生物探针。
竞争抑制法检测CLB小分子的标准曲线近似呈倒“S”型，对每一个浓度进行反复测试（3次）的标准偏差小于1%，检出限小于2μg/L，低于商业化仪器Biacore2000的CLB检出限10μg/L，与HPLC和ELISA的CLB检出限2μg/L相同。IC50值为10μg/L。由未知浓度的待测样品SPR响应值，查询标准曲线，可得出样品中CLB的浓度，可用于食品质量监控和现场实时检测。
实施例4利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测猪肝中的盐酸克伦特罗，步骤为：
（1）猪肝样品提取液的制备
①称2g猪肝；
②加入0.1M的HCl6mL，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
③取上清液，加入0.1M的NaOH2mL，加入6mL乙酸乙酯，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
④取步骤③得到的上清液于50℃氮气吹干；
⑤加入1mL三蒸水复溶，得到猪肝样品提取液；
（2）采用竞争抑制法，检测含有CLB的猪肝提取液与未含有CLB的猪肝提取液（对照组）。
表3利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测猪肝中的盐酸克伦特罗结果分析
Figure BDA0000462733030000121
实验结果表明，含有CLB的猪肝提取样品与对照组SPR响应值有明显区别，证明该方法对可以检测猪肉、猪肝提取物，与酶联免疫吸附法有相近的结果和检出限（表3），但是表面等离子体共振生物芯片方法步骤更简单，不需要二抗和荧光染色剂等，SPR生物芯片可以用于克伦特罗样品的现场检测，有推广价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）在玻璃基底上沉积厚度为45～55nm的金膜作为表面等离子体共振生物芯片的固相载体；
（2）在培养皿中注入含有HS(CH2)10COOH和HS(CH2)6OH的乙醇溶液，对金膜表面进行化学修饰；然后通入PBS缓冲液清洗，洗掉未结合物质；氮气吹干；
（3）将上述固相载体固定在SPR检测仪上；
（4）流通池中通入PBS缓冲液清洗，待基线稳定后加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的混合液活化芯片；然后通入PBS缓冲液清洗；
（5）在生物芯片表面固定盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物；记录表面等离子体共振共振角的变化，监测生物探针固定的过程，当共振角不再升高时，探针固定过程结束；然后注入PBS缓冲液清洗；
（6）加入乙醇胺溶液封闭灭活剩余的酯键；然后注入PBS缓冲液清洗；得到表面等离子体共振生物芯片。
2.根据权利要求1所述的表面等离子体共振生物芯片的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的玻璃基底为直径为20mm、厚度为1mm的圆形玻璃片；所述的金膜的厚度为50nm；
步骤（2）中所述的HS(CH2)10COOH的终浓度为1mM；所述的HS(CH2)6OH的终浓度为9mM；
步骤（2）中所述的化学修饰的条件为37℃温浴，避光反应2h；
步骤（2）所述的氮气吹干的温度为50℃；
步骤（4）中所述的N-羟基琥珀酰亚胺的终浓度为0.05mol/L；所述的N-乙基-N’-（二甲氨基丙基）碳二亚胺的终浓度为0.05mol/L；
步骤（4）中所述的活化芯片的时间为15min；
步骤（5）中所述的盐酸克伦特罗-牛血清白蛋白耦联物的浓度为83mg/L；所述的固定的时间为30min；
步骤（6）中所述的乙醇胺溶液的浓度为1mol/L，pH值为8.5；所述的封闭灭活的时间为6min；
步骤（2）、（4）、（5）和（6）中所述的PBS缓冲液清洗的次数为3次，每次清洗的时间为3min；
所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。
3.一种表面等离子体共振生物芯片，其特征在于由权利要求1或2所述方法制备得到。
4.权利要求3所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用。
5.根据权利要求4所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：包括利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测盐酸克伦特罗抗体的应用和利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测盐酸克伦特罗的应用。
6.根据权利要求5所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过直接法检测盐酸克伦特罗抗体包含如下步骤：
（一）建立标准曲线：
已知浓度的盐酸克伦特罗抗体用PBS缓冲液配制成不同浓度的标准溶液，以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
（二）未知样品的检测：
将未知样品注入微流通池与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得未知样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（一）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中盐酸克伦特罗抗体的浓度；
（三）下一样品检测：
步骤（二）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
7.根据权利要求6所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：
步骤（一）中所述的盐酸克伦特罗抗体标准溶液的浓度范围为0.5mg/L～100mg/L；
步骤（一）所述的标准溶液的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；
步骤（二）中所述的未知样品的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；
步骤（三）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；
步骤（三）中所述的PBS缓冲液清洗次数为3次，每次清洗的时间为3min；
所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。
8.根据权利要求5所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：所述的利用表面等离子体共振生物芯片通过竞争抑制法检测盐酸克伦特罗包含如下步骤：
（Ⅰ）建立标准曲线：
盐酸克伦特罗标准品用PBS缓冲液配制成不同浓度的标准溶液，不同浓度的盐酸克伦特罗标准溶液分别与定量盐酸克伦特罗抗体溶液混合，静置，得到各个标准溶液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液；以PBS缓冲液为基准，各个标准溶液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液分别注入表面等离子共振仪的微流通池，与表面等离子体共振生物芯片上的探针发生免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得各个标准溶液的表面等离子共振动力学曲线，以标准溶液浓度作为横坐标，共振角作为纵坐标，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
（Ⅱ）未知样品的检测：
将未知样品提取液和定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液注入微流通池进行免疫反应，对表面等离子体共振生物芯片反应区进行表面等离子体共振扫描，记录SPR共振角的变化，获得待测样品的表面等离子体共振动力学曲线，结合步骤（Ⅰ）得到的回归标准曲线，计算出未知样品中盐酸克伦特罗小分子的浓度；
（Ⅲ）下一样品的检测：
步骤（Ⅱ）中的免疫反应结束后，微流通池先通入PBS缓冲液清洗1～5次，每次清洗的时间是1～5min；再通入SDS-HCl溶液清洗1～3次，每次清洗时间是1～3min；，使抗原-抗体结合物解离；然后通入PBS缓冲液1～5次，每次清洗的时间是1～3min；SPR响应值降回基线，继续检测下一个样品。
9.根据权利要求8所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于步骤（Ⅱ）中所述未知样品提取液，包含如下具体步骤：
①称2g猪肉或猪肝；
②加入0.1M的HCl6mL，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
③取上清液，加入0.1M的NaOH2mL，加入6mL乙酸乙酯，振荡10min，室温下4000r/min离心10min；
④取步骤③得到的上清液于50℃氮气吹干；
⑤加入1mL三蒸水复溶，得到未知样品提取液。
10.根据权利要求8所述的表面等离子体共振生物芯片在生物芯片领域中的应用，其特征在于：
步骤（Ⅰ）中所述定量盐酸克伦特罗抗体在混合溶液中终浓度为20mg/L；
步骤（Ⅰ）中所述的盐酸克伦特罗小分子分子量为313.7；
步骤（Ⅰ）中所述的标准溶液的浓度范围为0.5～100μg/L；
步骤（Ⅰ）中所述的静置时间为5min；
步骤（Ⅰ）中所述的盐酸克伦特罗标准品与盐酸克伦特罗抗体的混合溶液的检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；
步骤（Ⅱ）中所述定量盐酸克伦特罗抗体在混合溶液中终浓度为20mg/L；未知样品提取液与定量盐酸克伦特罗抗体的混合溶液检测量为100μL；所述的免疫反应的反应时间为3min；所述的表面等离子体共振扫描范围为1～2°；
步骤（Ⅲ）中所述的SDS-HCl溶液中SDS的质量分数为1%，HCl的浓度为0.01mol/L；
步骤（Ⅲ）中所述的PBS缓冲液清洗次数为3次，每次清洗的时间为3min；所述的PBS缓冲液的组成如下：终浓度为2mmol/L的NaH2PO4,终浓度为2mmol/L的Na2HPO4、终浓度为150mmol/L的NaCl和水，pH值为7.4。
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