CN102680692B - 基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂。本发明采用近红外荧光分子作为标记，采用免疫层析技术，制备近红外荧光免疫层析试纸条。在检测过程中，利用常规近红外光检测仪器，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物的浓度。该试剂可以在微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用。本发明具有灵敏度高、定量准确操作方便的特点。

Description

基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂

技术领域

本发明建立了一种基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂。包括近红外荧光检测试纸条和相应试剂的制备方法。本发明采用近红外荧光分子作为标记，采用免疫层析技术，制备近红外荧光免疫层析试纸条，然后构成包括样品垫/玻璃纤维膜/硝酸纤维素膜和吸水纸的检测卡，其中硝酸纤维素膜上固定有检测线和质控线。在检测过程中，采用近红外光分别扫描质控线和样品线，激发荧光分子发光，发射出的荧光经滤光片，经光电倍增管转换成数字信号，用质控线荧光强度校正检测线荧光强度后代入荧光分析仪中的标准曲线，即可分析检测标本中的待测物的浓度。该***可以在微生物检测、食品安全检测、毒品检测以及危险化学品快速检测中应用。本发明具有灵敏度高、定量准确操作方便的特点。

背景技术

免疫层析法在疾病快速诊断、小分子检测等领域得到了广泛的应用。其原理是将特异的抗原或抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。常用的标记物为胶体金颗粒、酶以及着色微球。胶体金颗粒和着色微球是通过静电吸附将抗原或抗体标记在颗粒表面，通过观察胶体金颗粒或微球在检测线上的聚集显色判断检测结果。酶标记通过催化底物显色，显示检测结果。以上标记技术存在灵敏度低，不能精确定量的缺点。限制了免疫层析应用范围。

荧光标记技术具有灵敏度高，操作简单等特点，被广泛用于生物检测领域。如DNA序列测定、蛋白表达分析、临床诊断等。常用的荧光标记物光谱范围大多在可见光区（400-750nm）。由于生物体的蛋白、核酸等在紫外光的激发下会产生荧光，因此，使用可见光区的荧光标记物会产生较强的背景荧光，干扰检测信号，降低了检测的灵敏度。近红外荧光材料的发射波长范围在650-1000nm，在这个范围内，生物体自发荧光较弱，因此，使用近红外荧光材料作为检测荧光标记物，具有低背景荧光、检测信噪比高，检测灵敏度高的特点。

发明内容

本发明克服了以胶体金颗粒作为标记物免疫层析试剂灵敏度低、定量不准确的问题，建立了一种基于近红外荧光标记物的免疫层析定量检测试剂，以及新的检测方法，所述定量检测试剂包检测试纸条及试纸条的制备方法。其工作原理为：在免疫层析试纸条的样品垫上固定有近红外荧光标记的参照物和能与被检测物特异性结合的抗原或抗体，当检测标本滴加到样品垫上，近红外荧光标记的抗原或抗体与被检测物形成复合物，与参照物在毛细作用下向上涌动，在经过检测线和质控线时分别被固定在两条线上的分子所捕获。用荧光扫描仪分别读取参照线和检测线的荧光强度，将两者的荧光强度代入公式，即可得到样品中待检测物的浓度。

本发明所采用的方法是：

当使用夹心法检测目标分子时（可以是双抗体夹心法检测抗原，也可以是双抗原检测抗体）；在免疫层析试纸的检测线上固定的是与目标分子可以特异性结合的抗原或抗体（双抗体夹心法是抗体，双抗原夹心法是抗原），在质控线上作为参照物的是与目标分子和检测线固定的分子无关的抗体，通常是山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种或多种近红外荧光标记的抗体或抗原，一种是与检测目标特异性结合的抗原或抗体，另外一种是可以与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体，一般是鸡IgY。当含有目标分子的样品滴加到样品垫上时，溶液将结合垫上的两种成分解离，目标分子与解离出来的特异性结合分子形成抗原抗体复合物。抗原抗体复合物以及参照物随溶液向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，被固定在检测线上的目标分子特异性结合分子所捕获。质控分子随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的参照物抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。由于结合垫上参照物的量为一个定值，同时参照物单克隆抗体不会与检测目标分子和抗体结合，因此，参照物的荧光强度可以作为检测试剂的内参。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与标准工作曲线进行计算，就能够得出样品中目标分子的浓度；

当使用间接法检测目标分子时：在免疫层析试纸的检测线上固定的是检测抗原，在质控线上固定的是参照物抗体，一般是山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光标记的生物分子，分别是小鼠抗人抗体的第二抗体和鸡IgY。当含有目标分子的样品滴加到样品垫上后，同时滴加稀释液，溶液将结合垫上的生物大分子解离，近红外荧光标记的第二抗体与人抗体结合，形成抗体复合物，在溶液的推动下，抗体复合物和鸡IgY随溶液向试纸条上端移动。当抗体复合物移动到检测线时，抗体复合物被固定在检测线上的抗原所捕获。鸡IgY随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的山羊抗鸡IgY抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与预先设定的阈值进行比较，就可以得出样品中中是否含有HIV抗体。

当使用竞争法检测小分子时：在免疫层析试纸的检测线上固定的是小分子-BSA偶联物，在质控线上固定的是作为参照的山羊抗鸡IgY多克隆抗体。结合垫上分别用喷涂法固定了两种红外荧光标记的单克隆抗体，分别是抗小分子单克隆抗体和鸡IgY。检测时，首先向样品垫滴加标本，然后滴加稀释液。溶液将结合垫上的生物大分子解离，若样品存在一定浓度的小分子时，全部荧光标记的小鼠单克隆抗体被结合，小分子与抗体结合的复合物在溶液的推动下向试纸条上端移动。当抗原抗体复合物移动到检测线时，抗小分子单克隆抗体不能被固定在检测线上的BSA-小分子复合物所捕获。鸡IgY随溶液继续移动，当移动到质控线时，被固定在质控线上的山羊抗鸡IgY抗体所捕获。反应结束后，用荧光扫描仪测定检测线和质控线的荧光强度。通过计算检测线与质控线荧光强度的比值，并且与预先设定的阈值进行比较，就可以得出样品中是否含有待检测的小分子。

本申请中所使用的荧光扫描仪器为常规的实验扫描仪器，例如北京润博福得科技发展有限公司便携式高灵敏度近红外点荧光扫描仪；

本申请中所使用的近红外荧光标记材料为发射波长在650-1000nm的染料，优选为NHS活化的近红外荧光染料Dylight800。

该检测方法与其他检测方法相比具有如下优点：

生物背景信号低，检测灵敏度高。与胶体金免疫层析试剂相比，基于近红外荧光***对被检测分子的灵敏度提高约10倍。如血红蛋白最低检出限为10ng/ml，而基于胶体金的血红蛋白检测试剂最低检出限一般为100ng/ml。使用间接法检测HIV特异性抗体时，将检测标本系列稀释，近红外荧光***检测灵敏度同样比胶体金免疫层析高10倍。

操作简单。本方法操作程序与传统免疫层析方法相类似，从加样到读取报告操作步骤少，操作人员很容易掌握。

可以定量检测。传统的免疫层析方法是靠金颗粒的聚集效应判读结果。金颗粒的聚集与样品中的浓度存在一定的数量关系，但是只能通过观测金颗粒着色深浅进行半定量。本方法将荧光分子标记在生物大分子上，检测线上的荧光强度反应了与捕获分子相结合的标本的量。通过扫描仪对检测线和控制线荧光值的检测，可以通过计算二者荧光强度比并与标准曲线比较得出被检测物的浓度。

附图说明

图1为检测试纸卡的侧面示意图；

1：吸水垫；

2：硝酸纤维膜；

3：含有近红外荧光标记物玻璃纤维膜；

4：反应支持物。

5：检测线；

6：质控线；

7：样品垫

图2为血红蛋白近红外荧光检测图

图3为血红蛋白标准曲线

图4为HIV抗体夹心法近红外荧光检测图

图5为HIV抗体间接法近红外荧光检测图

图6为***近红外应该检测图

图7为不同浓度***检测值

具体实施方式

实施例1：夹心法检测人血红蛋白

1)红外荧光标记血红蛋白单克隆抗体和鸡IgY。

血红蛋白单克隆抗体（英国Abcam公司）和鸡IgY抗体（英国Abcam公司）用PBS透析，按照7μlNHS活化Dylight800近红外荧光染料（美国热电公司）标记1mg血红蛋白单克隆抗体的比例将抗体与荧光染料混合，混合均匀后室温避光反应1小时。反应结束后，将标记产物放到孔径为10K透析袋中，用PBS 4℃透析过夜，去除游离的荧光染料。溶液中添加终浓度为1%BSA和0.1%Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂两种近红外荧光染料标记的抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将血红蛋白捕获单克隆抗体（英国Abcam公司）和羊抗鸡IgY多克隆抗体（英国Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.5cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫如图1方式按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

6)制定标准曲线

取1mg/ml的血红蛋白纯品（英国Abcam公司），用稀释液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）将标准品进行1：10系列稀释，制成100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml 0.01μg/ml样品。用微量加样器吸取50μl以上标本滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加100μl样品稀释液。室温静置5分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数。以50μl系列稀释的血红蛋白标准品作为样品，分别测量检测线和质控线荧光值，用检测线值除以质控线为测量值。每个样品浓度进行测量两次，取平均值后，以测量值对样品浓度做图。结果如图2所示。

用检测峰荧光值除以质控峰荧光值作为检测结果。每个浓度做两次重复试验，取两次结果平均值，以平均值对样品浓度做标准工作曲线，如图3所示。

表1：不同浓度血红蛋白标准品对应检测结果。

浓度（μg/ml)	10000	7500	5000	2500	1000	100	10
								第一次测量（T/C)	1.399058	1.065468	0.71044	0.374832	0.22438	0.02288	0.008268
第二次测量（T/C)	1.399058	0.96568	0.714093	0.374063	0.200634	0.023265	0.008268
								平均值	1.399058	1.015574	0.712267	0.374447	0.212507	0.023072	0.008268

7)检测临床标本

取临床标本，用1ml稀释液（5%BSA，0.1%Tween20，PBS）将标本充分搅匀，用微量加样器吸取50μ以上标本滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加100μl样品稀释液。室温静置5分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数，结果如下表所示。根据标准曲线计算样品中血红蛋白含量。

样品编号	检测值	血红蛋白浓度（mg/ml)
			1	0.1213	0.683704
2	0.0039	0
			3	0.2465	1.611111
4	0.0915	0.462963
			5	0.0903	0.454074
6	0.0128	0

7	0.2376	1.545185
			8	0.0373	0.061481
9	0.3234	2.180741
			10	0.0198	0
11	0.2964	1.980741
			12	0.0091	0
13	0.2703	1.787407
			14	0.01385	0
15	0.02846	0
			16	0.0368	0.057778
17	0.0137	0
			18	0.3729	2.547407
19	0.6835	4.848148
			20	0.1249	0.71037

实施例2：夹心法检测HIV抗体

1)生物大分子近红外荧光标记

将基因工程重组HIV-1gp41（Immune Technology公司）和HIV-2gp36（ImmuneTechnology公司）抗原用PBS透析，安照7μlNHS活化的近红外荧光染料Dylight 800（美国热电公司）标记1mg重组抗原的比例将二者混合，混合均匀后室温避光反应1小时。反应结束后，将标记产物放到孔径为10K透析袋中，用PBS 4℃透析过夜，去除游离的荧光染料。溶液中添加终浓度为1%BSA和0.1%Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存。选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光染料-生物分子溶液，室温风干条带。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂两种近红外荧光染料标记的抗体，室温风干条带。

3)制作样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将HIV-1gp41抗原和HIV-2gp36抗原混合，然后和羊抗鸡IgY多克隆抗体用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.5cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按照图1方式安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，组装成品试纸卡。

6)确定Cutoff值

HIV抗体近红外荧光免疫层析试剂加样后用便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）进行荧光判断，首先读取的是质控线荧光值，然后是检测线荧光强度，用荧光强度对应时间做图，得到荧光强度-时间变化曲线。如图4所示。

用HIV-1近红外免疫层析检测试剂检测100份HIV阴性血清和50份阳性血清，读取其检测线和质控线荧光值后计算二者比值，全部HIV阴性检测结果均<0.13，其平均值为0.124，变异系数为0.006，cut-off=阴性值+2倍变异系数=0.136。

7)检测未知标本

选取HIV感染者和未感染者各20血清标本，全部样品用ELISA和Western-Blot进行确认。用微量加样器吸取50μl血清滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加100μl样品稀释液。室温静置5分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数。根据T线（检测线）和C线（参考线）的荧光读数与cutoff值进行比较，判断检测结果。检测结果与ELISA结果进行比较。结果显示为：

20份HIV阴性样品，近红外荧光检测全部为阴性，特异性为100%。

20份HIV阳样品，近红外荧光检测全部为阳性，灵敏度为100%。

实施例3：间接法检测HIV抗体

1)Dylight800标记检测抗原和质控抗体

将羊抗人IgG抗体（购自Abcam公司）用PBS透析，按照7μlNHS活化的Dylight800标记1mg抗体的比例将二者混合，混合均匀后室温避光反应1小时。反应结束后，将标记产物放到孔径为10K透析袋中，用PBS 4℃透析过夜，去除游离的荧光染料。溶液中添加终浓度为1%BSA和0.1%Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存。

2)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光染料-生物分子溶液，室温风干条带。

3)制样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

4)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，首先将HIV-1 gp41和HIV-1 gp36抗原混合，然后将混合抗原和山羊抗鸡IgY多克隆抗体（商品货号或来源）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.5cm，室温风干膜条带。

5)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，按照图1方式组装成品试纸卡。

6)检测过程：

微量加样器吸取50μl血清滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加100μl样品稀释液。室温静置5分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得有限公司）中读数。HIV抗体近红外荧光免疫层析试剂加样后用扫描仪进行荧光判断，首先读取的是质控线荧光值，然后是检测线荧光强度，用荧光强度对应时间做图，得到荧光强度-时间变化曲线。如图5所示

7)确定检测试剂的Cutoff值

用HIV-1近红外免疫层析检测试剂检测100份HIV阴性血清和50份阳性血清，读取其检测线和质控线荧光值后计算二者比值，统计所有阴性和阳性检测值，全部HIV阴性检测结果均<0.13，其平均值为0.122，变异系数为0.006，cutoff=阴性值+2倍变异系数=0.134。

检测未知标本：

标本包括20份正常人和20份HIV感染者血清，全部血清标本同时用HIV荧光定量PCR试剂进行对比试验。结果为：20份HIV阳性标本检测结果全部为阳性，20份HIV阴性标本结果全部为阴性，与ELISA结果和荧光定量PCR结果100%相符。

实施例4:竞争法检测***近红外荧光染料标记抗体

将***单克隆抗体（博美生物科技公司）用PBS透析，安照7μl NHS活化的近红外荧光染料（博美生物科技公司）标记1mg单克隆抗体的比例将二者混合，混合均匀后室温避光反应1小时。反应结束后，将标记产物放到孔径为10K透析袋中，用PBS 4℃透析过夜，去除游离的荧光染料。溶液中添加终浓度为1%BSA和0.1%Tween20，叠氮化钠0.1‰，4℃保存。选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光染料-生物分子溶液，室温风干条带。

1)制作结合垫

选取玻璃纤维素带作为结合垫固相材料，在条带上喷涂近红外荧光染料-生物分子溶液，室温风干条带。

2)制备样品垫

选取纤维素膜带,将封闭液（5%BSA，0.1%Tween 20，PBS）喷涂在膜带上，室温风干后备用。

3)制作免疫层析试纸条

选取硝酸纤维素膜，将BSA-***（博美生物科技公司）和山羊抗鸡IgY多克隆抗体（Abcam公司）用划线机在膜上制成检测带和质控带，检测带和质控带间距0.5cm，室温风干膜条带。

4)组装检测试纸卡

将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按照顺序安装好，然后用切割机切成试纸条，放入塑料卡槽中，按照图1方式组装成品试纸卡。

5)检测过程

取1μg/ml***标准品，用正常人尿液系列稀释成1200ng/ml、600ng/ml、300ng/ml、200ng/ml、100ng/ml浓度标本。用微量加样器吸取50μl标本滴加到样品垫上，待样品吸收后用滴管滴加100μl样品稀释液。室温静置5分钟，将样品卡放到便携式高灵敏近红外点荧光扫描仪（北京润博福得科技发展有限公司）中读数，首先读取的是质控线荧光值，然后是检测线荧光强度，用荧光强度对应时间做图，得到荧光强度-时间变化曲线。如图6所示。

1200ng/ml、600ng/ml、300ng/ml、200ng/ml、100ng/ml浓度标本检测结果见下表。

以***浓度对检测值（T/C）做图，如图7所示。

取20份***阳性尿液与20份***阴性尿液用近红外荧光检测，同时用胶体金试纸做对比试验。以1.0作为cotoff值，20份***阳性尿液标本近红外荧光检测结果全部为阳性；20份***阴性尿液全部为阴性。

Claims (6)

1.一种近红外荧光分子免疫层析试纸，其特征在于：由依次在带有粘合剂的反应支持

物上相互搭接的样品垫、结合垫、承载膜、吸水垫组成，其中，

所述的结合垫上分别用喷涂法固定了两种或多种近红外荧光标记材料标记的抗体或抗原，一种是与检测目标特异性结合的抗原或抗体，另外一种是与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体；

所述的承载膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜,承载膜上分别为连接有与目标分子可以特异性结合的抗原或抗体，和连接有与目标分子和检测线固定的分子无关的抗体的质控线；

所述的检测线和质控线区域的荧光强度在检测中分别与标准抗原浓度的标准曲线相对应，完成定量检测，即可得到样品中待检测物的浓度；

所述的近红外荧光标记材料为发射波长在650-1000nm的染料；

结合垫上所述的与质控线上参照物特异性结合的抗原或抗体是鸡IgY；质控线上所述的与目标分子和检测线固定的分子无关的抗体为山羊抗鸡IgY多克隆抗体。

2.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述试纸应用于竞争法检测，所述检测线上固定的是小分子-BSA偶联物，所述质控线上固定的是作为参照的山羊抗鸡IgY多克隆抗体，所述结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光标记的单克隆抗体，分别是抗小分子单克隆抗体和鸡IgY。

3.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述试纸应用于间接法检测，所述检测线上固定的是检测抗原，在质控线上固定的是参照物抗体，山羊抗鸡IgY多克隆抗体；结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光标记的生物分子，分别是小鼠或羊抗人抗体的第二抗体和鸡IgY。

4.权利要求1的近红外荧光分子免疫层析试纸，所述试纸应用于双抗原夹心法或双抗体夹心法检测，所述检测线上固定的是与被检测物可以特异性结合的抗原或抗体，在质控线上固定的是参照物抗体，山羊抗鸡IgY多克隆抗体；结合垫上分别用喷涂法固定了两种近红外荧光标记的生物分子，分别是与被检测物可以特异性结合的抗原或抗体以及鸡IgY。

5.权利要求1-4之一所述的近红外荧光分子免疫层析试纸的制备方法，其主要步骤为：

1)近红外荧光标记单克隆抗体和鸡IgY；

2)制作结合垫；

3)制作样品垫；

4)制作免疫层析试纸条。

6.一种利用权利要求1-4之一所述的近红外荧光分子免疫层析试纸定量检测抗原或抗体的方法，依次包括如下步骤：

i.将抗原或抗体标准品配制成2～10倍梯度的浓度系列标准品；

ii.将上述浓度系列标准品分别用权利要求1-4之一所述的试纸进行免疫层析，利用荧光定量光谱仪分别检测检测线和质检线区域的荧光强度，制作抗原或抗体浓度的标准曲线；

iii.待测抗原或抗体用权利要求1-4之一所述的试纸进行免疫层析，利用上述的标准曲线求得抗原或抗体浓度；

所述的抗原或抗体为血红蛋白、HIV-1gp41、HIV-2gp36或***抗原及抗体。