CN107807111A - 集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用 - Google Patents

集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种无变频三维阵列等离子共振传感器，包括等离子共振基底，为纳米结构的空腔阵列，其上覆盖多层材料结构层，包括从下至上依次排布的第一金属层、绝缘层和第二金属层，该多层材料结构层在基底内形成内嵌于所述等离子共振传感器中的光学谐振腔阵列，所述光学谐振腔为锥形杯状的空腔。解决了现有技术等离子共振传感器检测灵敏度有限，且装置大型不便于携带的技术问题，实现了超灵敏、免标记的生物分子检测，为实现早期发现疾病生物标记物的便携式医用生物传感器的开提供基础。

Description

集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标 志物液体活检的应用
技术领域
本发明涉及传感技术领域，特别地，涉及一种集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的。CEA是一种分子量为22KD的多糖蛋白复合物，45％为蛋白质。CEA的编码基因位于19号染色体。一般情况下，CEA是由胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝细胞所合成。通常在妊娠前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量已很低。 96％-97％非吸烟健康成年人血清中CEA浓度小于2.5μg/L，大量吸烟者有 20％-40％的人CEA>2.5μg/L，少数CEA>5.0μg/L。
CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原，分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。正常情况下CEA经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的CEA则进入血和淋巴循环，引起血清CEA异常增高，使上述各种肿瘤患者的血清CEA均有增高。在临床上，当CEA大于60μg/L时，可见于结肠癌、直肠癌、胃癌和肺癌。CEA值升高，表明有病变残存或进展。如肺癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌患者血清CEA量会明显升高，大多显示为肿瘤浸润，其中约70％为转移性癌。一般来说，手术切除后6周，CEA水平恢复正常，否则提示有残存肿瘤，若CEA浓度持续不断升高，或其数值超过正常5-6倍者均提示预后不良。连续随访定量检测血清CEA含量，对肿瘤病情判断更具有意义。
癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。97％的健康成人血清CEA浓度在2.5g/L以下，原发性结肠癌患者CEA增高占45～80％。除原发性结肠癌以外，胰腺癌、胆管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿***的肿瘤阳性率也很高，一般在50～70％。因此该指标检测对于诊断某些疾病具有较大意义。
传统的测定CEA的方法有荧光免疫分析、放射免疫法，酶联免疫检测法等。这些检测方法虽然在一定程度上灵敏有效，但对技术要求高，耗时耗力，且对仪器有一定的要求，各自具有一定的局限性。
目前，检测低浓度生物分子，如肿瘤标志物的免标记感应器，在药物开发研究和现场即时诊断等应用中备受瞩目。光学器件如光子晶体，环形谐振器，干涉仪和表面等离子体共振(SPR)传感器，由于其灵敏检测，是有希望代替传统酶联免疫吸附测定技术(ELISA)的方法。但是，有着精准定位的笨重的外部光学装置仍然是需要的—这限制了应用的普及。另外，基于超强光透射(EOT) 的等离子体传感器可以使用非相干光源激发表面等离子体，用便携式光谱仪实现检测；但是，这些器件的灵敏性要比传统的SPR传感器低一个数量级。
发明内容
本发明提供了一种集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，解决了现有技术检测方法灵敏度有限，操作技术及使用仪器上存在很大局限性的问题。
为实现上述目的，本发明提出了一种集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，包括如下步骤：
(1)将三维等离共振传感器浸入到2～20mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，室温下培养12～36小时，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为1～100μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)，并与巯基十一酸(MUA)共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器置于含有A 待测样本的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
优选的，所述步骤(2)是在室温条件下进行，步骤(1)处理后的传感器用70％的乙醇清洗，清洗后在N2中干燥，干燥后在400mM碳化二亚胺(EDC)与 100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1:1混合的混合物中培养30～120分钟，之后将传感器在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，冲洗后立即用1～100μg/ml的单克隆抗CEA抗体培养1～5小时。
优选的，所述步骤(3)是在室温条件下进行，在10μg/mL的BSA封闭液中培养，之后在10％的乙醇胺溶液中培养30～60分钟来封上未反应的N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)。
优选的，所述集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器对肿瘤标志物癌胚抗原CEA的检出限为1ng/ml。
优选的，所述应用还包括建立CEA线性模型，具体步骤为：
(1)将三维等离共振传感器浸入到10mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为30μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺耦合，并与巯基十一酸共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器分别置于含有浓度梯度范围为0.1ng/ml～1000ng/ml的CEA的磷酸盐缓冲液(PBS)中、含有小鼠免疫球蛋白(Anti-MouseIgG)的磷酸盐缓冲液(PBS)中以及不含CEA 的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
优选的，所述建立CEA线性模型的步骤(4)中，CEA的浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml。
优选的，所述三维等离共振传感器包括等离子共振基底，为纳米结构的空腔阵列，其上覆盖多层材料结构层，包括从下至上依次排布的第一金属层、绝缘层和第二金属层，该多层材料结构层在基底内形成内嵌于所述等离子共振传感器中的光学谐振腔阵列，所述光学谐振腔为锥形杯状的空腔。
优选的，所述三维等离共振传感器的第一金属层厚度为25nm，绝缘层厚度为80nm。
有益效果：
本发明提供的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，对蛋白质比如肿瘤标志物癌胚抗原(CEA)的检出限是 1ng/mL(5pM)，实现了超灵敏的免标记生物分子检测，这是对当前表面等离子体共振(SPR)***，以及在临床上测量蛋白浓度与人体疾病标志物比如CEA水平相关的动态范围的显著改进。
本发明利用集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器检测癌症蛋白标记物，无需用到任何的荧光或化学发光标记物，也没有用到第二抗体或夹心双抗体,与现有技术相比，省去了标记和二抗或双抗体，从而做到了真正的无附加试剂的单步骤检测。与传统的SPR感应器不同，本发明三维等离共振传感器在无共振峰偏移的情况下通过透射峰强度的变化实现了RI传感，因此，检测过程中不需要具有高光谱分辨率的分光仪。对于未来研发便携式医用生物传感器奠定了基础。
附图说明
图1是本发明CEA检测的三维等离共振传感器表面功能化示意图；
图2是CEA线性模型的各实验组相对强度变化的柱状图；
图3是对应图2模型的CEA浓度梯度变化下的相对强度变化图；
图4是10ng/mlCEA实验组随时间变化的透射强度变化图；
图5是图4中A所示部分1μg/ml CEA实验组和10ng/ml CEA实验组与三维等离共振传感器上结合的CEA抗体结合时透射强度变化图；
图6是血清赋形剂对照组，检测人体血清样本中CEA激增(1μg/ml和 100ng/ml)的柱状图；
图7是集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器的结构示意图。
图中：10-三维等离共振传感器，1-等离子共振基底；2-第一金属层；3-绝缘层；4-第二金属层；5-谐振腔；M-入射光；N-透射光。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明中检测用试剂材料采购自Sigma-Aldrich公司。
本发明提供的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，包括如下步骤：
(1)将三维等离共振传感器浸入到2～20mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，优选10～15mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，室温下培养12～36小时，优选 18～32小时，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为1～100μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)，并与巯基十一酸(MUA)共价结合，优选浓度为20～ 60μg/ml；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器置于含有A 待测样本的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
其中，步骤(2)是在室温条件下进行，步骤(1)处理后的传感器用70％的乙醇清洗，清洗后在N2中干燥，干燥后在400mM碳化二亚胺(EDC)与100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1:1混合的混合物中培养30～120分钟，优选30～ 60分钟，之后将传感器在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，冲洗后立即用1～ 100μg/ml的单克隆抗CEA抗体培养1～5小时，优选20～60μg/ml的单克隆抗 CEA抗体，优选培养1～3小时。
其中，所述步骤(3)是在室温条件下进行，在10μg/mL的BSA封闭液中培养，之后在10％的乙醇胺溶液中培养30～60分钟来封上未反应的N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)，优选培养30～40分钟。
实施例1
本实施提供一种集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，用于检测肿瘤标记物CEA浓度，如图1所示，所述三维等离共振传感器表面结合MUA(11-mercaptuoudecanoic acid，巯基十一酸)，将CEA抗体结合到MUA上，待测样本中的CEA抗原与CEA结合，通过检测CEA 抗原与CEA结合后三维等离共振传感器的透射强度，测得CEA抗原浓度。具体包括如下步骤：
(1)将三维等离共振传感器浸入到10mM的巯基十一酸 (11-mercaptuoudecanoicacid，MUA)溶液中，室温下培养24小时，传感器表面形成自组装单层膜,一层MUA分子紧密而均匀覆盖在传感器表面；
(2)将浓度为30μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)，并与巯基十一酸(MUA)共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器置于含有待测样本的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
其中，所述步骤(2)是在室温条件下进行，步骤(1)处理后的传感器用 70％的乙醇清洗，清洗后在N2中干燥，干燥后在400mM碳化二亚胺(EDC)与100 mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1:1混合的混合物中培养30分钟，之后将传感器在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，冲洗后立即用30μg/ml的单克隆抗CEA抗体培养2小时。
所述步骤(3)是在室温条件下进行，在10μg/ml的BSA封闭液中培养，之后在10％的乙醇胺溶液中培养30分钟来封上未反应的N-羟基琥珀酰亚胺耦合 (NHS)。
本实施例中，检测样品为CEA浓度为1μg/ml和100ng/ml的人体血清样本，以血清赋形剂作为对照组，检测结果如图6所示，透射强度随CEA浓度的增长而激增。本发明快速有效的检测出CEA浓度变化。
实施例2
本实施例还建立了CEA线性模型，具体步骤为：
(1)将三维等离共振传感器浸入到10mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为30μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺耦合，并与巯基十一酸共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器分别置于含有浓度梯度范围为0.1ng/ml～1000ng/ml的CEA的磷酸盐缓冲液(PBS)中、含有小鼠免疫球蛋白(Anti-MouseIgG)的磷酸盐缓冲液(PBS)中以及不含CEA 的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
其中，所述步骤(2)是在室温条件下进行，步骤(1)处理后的传感器用 70％的乙醇清洗，清洗后在N2中干燥，干燥后在400mM碳化二亚胺(EDC)与100 mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1:1混合的混合物中培养30分钟，之后将传感器在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，冲洗后立即用30μg/ml的单克隆抗CEA抗体培养2小时。
所述步骤(3)是在室温条件下进行，在30μg/ml的BSA封闭液中培养，之后在10％的乙醇胺溶液中培养30分钟来封上未反应的N-羟基琥珀酰亚胺耦合 (NHS)。
所述步骤(4)中，CEA的浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50 ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml。参见图2，显示了检测上述6中CEA浓度、抗体(IgG)对照组和PBS赋形剂对照组的透射强度，透射强度随CEA浓度的增加而增强，浓度0.1ng/ml CEA的透射强度低于抗体(IgG)对照组的透射强度，可见本发明CEA的检出限是1ng/ml(5pM)。参见图3，显示了对应图2模型的 CEA浓度梯度变化下的相对强度变化，与图2所示线性模型具有良好的吻合性。参见图4，显示了浓度10ng/ml CEA实验组随时间变化的透射强度变化图。参见图5，显示了浓度1000ng/ml CEA和浓度10ng/ml CEA与固定在传感器表面上的 CEA抗体相结合时透射强度随时间的变化，随着结合时间的增长，透射强度均增强。
由图2-图5所示结果可知，本发明应用中，利用集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器检测癌症蛋白标志物CEA的浓度，检出限为1ng/ml，明显低于现有技术中CEA的检出限3ng/ml，本发明三维等离共振传感器器件的光学敏感特性，使其透光率对于表面抗原抗体的结合非常敏感，从而能达到灵敏、精确的检测结果。这是对当前表面等离子体共振(SPR)***，以及在临床上测量蛋白浓度与人体疾病标志物比如CEA水平相关的动态范围的显著改进。
本发明实施例1和实施例2中，所述集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器立足于3D等离激元纳米杯谐振器结构，由具有沉积金(Au)层的、纳米结构的聚合物基质构成。具体的，所述三维等离共振传感器包括等离子共振基底，为纳米结构的空腔阵列，其上覆盖多层材料结构层，包括从下至上依次排布的第一金属层、绝缘层和第二金属层，该多层材料结构层在基底内形成内嵌于所述等离子共振传感器中的光学谐振腔阵列，所述光学谐振腔为锥形杯状的空腔。所述第一金属层为Au层，厚度为25nm，所述绝缘层为CdS或SiO2或TiO2层，厚度为80nm。如图7所示，显示了所述等离子共振传感器的多层结构和照明方向，M所示为入射光，N所示为透射光。
为了在纳米结构的空腔阵列中嵌入光学谐振腔，将CdS或SiO2或TiO2层放在第一层Au上，然后再加上第二层Au。选择CdS层的原因是可见光区内其 RI高，消光系数(k)低，而Au层在纳米尺度上提供了具有强约束力的电磁场。本发明将此独特的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器称为多层纳米莱克格斯杯阵列(ML-namoLCA)，因为下层纳米杯结构与古罗马人制作的莱克格斯杯具有相似的光学性能。本发明发现，通过在高性能传统纳米等离子传感器上添加纳米结构的空腔阵列，可以看到全新的光学和光谱性能。本发明引进了一种RI变化不会引起峰值波长偏移，但是RI变化可以通过高灵敏性使用峰值强度变化来检测的新型三维等离共振传感器。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将三维等离共振传感器浸入到2～20mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，室温下培养12～36小时，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为1～100μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)，并与巯基十一酸(MUA)共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器置于含有A待测样本的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
2.根据权利要求1所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述步骤(2)是在室温条件下进行，步骤(1)处理后的传感器用70％的乙醇清洗，清洗后在N2中干燥，干燥后在400mM碳化二亚胺(EDC)与100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按1:1混合的混合物中培养30～120分钟，之后将传感器在磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，冲洗后立即用1～100μg/ml的单克隆抗CEA抗体培养1～5小时。
3.根据权利要求1所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述步骤(3)是在室温条件下进行，在10μg/mL的BSA封闭液中培养，之后在10％的乙醇胺溶液中培养30～60分钟来封上未反应的N-羟基琥珀酰亚胺耦合(NHS)。
4.根据权利要求1所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器对肿瘤标志物癌胚抗原CEA的检出限为1ng/ml。
5.根据权利要求1至4任一所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，还包括建立CEA线性模型，具体步骤为：
(1)将三维等离共振传感器浸入到10mM的巯基十一酸(MUA)溶液中，传感器表面形成自组装单层膜；
(2)将浓度为30μg/ml的CEA抗体通过碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺耦合，并与巯基十一酸共价结合；
(3)将步骤(1)处理后的无变频三维阵列等离子共振传感器在BAS封闭液中培养，之后在乙醇胺溶液中培养；
(4)将步骤(3)培养后的无变频三维阵列等离子共振传感器分别置于含有浓度梯度范围为0.1ng/ml～1000ng/ml的CEA的磷酸盐缓冲液(PBS)中、含有小鼠免疫球蛋白(Anti-MouseIgG)的磷酸盐缓冲液(PBS)中以及不含CEA的磷酸盐缓冲液(PBS)中培养；
(5)进行光谱测量，在水中测量透射峰。
6.根据权利要求5所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，CEA的浓度分别为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml。
7.根据权利要求1至4、6任一所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述三维等离共振传感器包括等离子共振基底，为纳米结构的空腔阵列，其上覆盖多层材料结构层，包括从下至上依次排布的第一金属层、绝缘层和第二金属层，该多层材料结构层在基底内形成内嵌于所述等离子共振传感器中的光学谐振腔阵列，所述光学谐振腔为锥形杯状的空腔。
8.根据权利要求7所述的集成纳米光学谐振腔的三维等离共振传感器用于癌症蛋白标志物液体活检的应用，其特征在于，所述第一金属层厚度为25nm，绝缘层厚度为80nm。
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