CN103782168B

CN103782168B - 在糖蛋白产品中包含n-乙酰己糖胺的n-聚醣

Info

Publication number: CN103782168B
Application number: CN201280012595.1A
Authority: CN
Inventors: N·沃什伯恩; E·阿雷瓦洛; K·米莉; C·J·博斯克斯; J·杜夫纳; B·E·柯林斯
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2032-03-12
Also published as: US20160060675A1; EP2686671A2; US9890410B2; CN103782168A; US20120295273A1; EP2686671A4; US9170249B2; WO2012125553A2; WO2012125553A3

Abstract

本发明提供了针对一种N-乙酰己糖胺聚糖例如一种N-乙酰葡糖胺聚糖的不存在、存在或量来评估一种糖蛋白制品的方法。

Description

在糖蛋白产品中包含N-乙酰己糖胺的N-聚醣

本申请要求2011年3月12日提交的美国申请序列号61/452,092的优先权。该在先申请的披露内容被视为本申请的披露内容的部分（并且通过引用结合在此）。

发明领域

本发明涉及用于检测糖蛋白中的特定聚糖结构的方法和材料。

发明背景

抗体表示在药物市场中和在针对多种适应症的开发中日渐发展的一类生物治疗药物。与小分子不同，生物制剂实际上是亚型的混合物，所有的这些亚型包含相同的肽主链但在修饰上不同，并且它们可以具有一系列的药代动力学、药效动力学或安全性曲线。因此重要的是例行地监测产品质量。抗体是包含至少一个可变地被占的N-糖基化位点的糖蛋白。认为在抗体治疗剂中的N-糖基化影响该分子的药代动力学和结构整体性（Krapp（克拉普），Mimura（米姆拉）等人2003）。

发明概述

本发明在部分上是基于可以存在于糖蛋白（例如，糖基化抗体）上的N-乙酰己糖胺聚糖结构的发现。在一些实施例中，N-乙酰己糖胺的存在或量与一种或多种具体生产参数相关联。可以将此聚糖结构的不存在、存在和/或量用于（除其他之外）评估或加工一种糖蛋白制品，从而例如确定是否接受或拒绝一批糖蛋白（例如，糖基化抗体）、或者指导或控制用于产生糖蛋白（例如，糖基化抗体）的一种或多种生产参数。在一些实施例中，可以将在糖蛋白组合物中此结构的不存在、存在或量与例如一个参比标准进行比较，从而例如作出关于该糖蛋白制品的决定，例如分类、选择、接受或丢弃、释放或留存、加工成一种药物产品、装运、移动到一个不同的位置、配制、贴标签、包装、准予进入贸易、或销售或许诺销售该糖蛋白（例如糖基化抗体）的决定。在其他实施例中，该决定可以接受、改变或拒绝一种或多种用于制造糖蛋白（例如，糖基化抗体）的生产参数。

因此，在第一方面，本披露的特征为用于评估一种糖蛋白制品的方法。在一些实施例中，该方法包括：

提供糖蛋白的一种或多种制品，例如糖基化抗体制品；并且

例如使用分离方法，对与糖蛋白相关联的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在和/或量进行确定。

该确定步骤可以包括以下各项的一个或多个：(a)对由一种细胞产生的糖蛋白进行分离，并且确定N-乙酰己糖胺聚糖是否存在于该糖蛋白上，(b)对由一种细胞产生的糖蛋白制品进行分离，并且对在该制品的糖蛋白上N-乙酰己糖胺的存在或量进行确定，(c)将聚糖从由一种细胞产生的糖蛋白分离，并且确定该糖蛋白的聚糖是否包含N-乙酰己糖胺聚糖，并且(d)提供来自由细胞产生的糖蛋白的至少一种肽，并且对在该至少一种肽上的包含N-乙酰己糖胺的聚糖的存在进行确定。用于测量N-乙酰己糖胺的技术可以包括以下方法中的一种或多种以及任意这些方法的组合：色谱法、质谱（MS）法、电泳法（例如，毛细管电泳）、核磁共振（NMR）法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子（例如抗体或凝集素）。

聚糖的来源可以选择下组，该组由以下各项组成：细胞群，例如CHO细胞；分离的糖蛋白，例如分离的糖基化抗体；从糖蛋白（例如糖基化抗体）的切割衍生的肽；或从糖蛋白衍生的聚糖。在一些实施例中，该方法包括用一种或多种酶（例如，PNGase）处理聚糖或糖肽的来源，随后为聚糖群体的分析。在一些实施例中，此方法包括用一种化学品处理糖肽以释放聚糖（例如，酸水解）、随后为所释放的聚糖或单糖的分析和/或连接至单一氨基酸上的聚糖的分析。

在一些实施例中，所使用的方法提供了N-乙酰己糖胺聚糖的定量测量。在一些实施例中，所使用的方法提供了定性测量。

在一些实施例中，该方法还包括制备一种糖蛋白制品，将一种或多种聚糖从糖蛋白制品切割（例如，用一种或多种酶，如PNGase），并且对N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行确定。

在某些实施例中，该方法是在治疗性糖蛋白的生产运行期间通过以下方式进行：从生产线的细胞培养物获得一个样品，从而例如对在生产期间的聚糖结构进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在细胞的培养时期期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在一些实施例中，该方法是在糖蛋白的储存期间通过以下方式进行：从糖蛋白组合物获得一个样品，从而例如对在储存期间的聚糖结构稳定性进行监测。在某些实施例中，该确定步骤随着时间的推移而重复至少一次，例如，该确定步骤在糖蛋白组合物的储存期间重复至少一次、两次、三次或更多次。在其他实施例中，该方法是对糖蛋白组合物而进行，例如作为该糖蛋白组合物的质量测试或释放测试的部分。

在一些实施例中，该确定步骤包括：将在一个在第一糖蛋白制品（从一个第一细胞群产生，该第一细胞群例如在一种或多种第一生产参数下产生）中的包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的水平与在一个在第二糖蛋白制品（在不同的一种或多种生产参数下，从一个第二细胞群和/或相同的细胞产生）中的包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的水平进行比较。在一些这样的实施例中，对糖蛋白制品的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行确定，并且将其与在不同的一种或多种生产参数下生产的糖蛋白的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行比较。

在一些实施例中，该方法包括将N-乙酰己糖胺聚糖的水平与参比标准（例如，对照水平，或在产品说明中的一个范围或值）进行比较的步骤。

在该方法的某些实施例中，该确定步骤包括一种检测分子的使用，该检测分子能够检测N-乙酰己糖胺聚糖的存在或不存在。在某些实施例中，该检测分子包括能够结合至N-乙酰己糖胺的抗体。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。在一些实施例中，这包含与N-乙酰己糖胺形成共价键的另一种糖。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。在一些实施例中，这包含与N-乙酰己糖胺形成共价键的另一种糖。在一些实施例中，该检测分子可以包含荧光部分、或放射性同位素部分。

在一些实施例中，糖蛋白，例如糖基化抗体，是由克隆细胞群（例如克隆CHO细胞群）产生。细胞群可以是培养物，例如或来自用于制造糖蛋白（例如，糖基化抗体）的生物反应器中的细胞培养物的样品。在某些实施例中，细胞群将是已经用至少一种载体进行了转化，该载体对糖蛋白进行编码。治疗性糖蛋白可以是人源的、非人源的或合成来源的。在一些实施例中，糖蛋白可以用于人或兽医学适应症的治疗。

在一些实施例中，该方法进一步包括对由细胞产生的糖蛋白的生物活性进行评估的步骤，例如，如在体外或体内如在动物模型中对糖蛋白的潜在免疫潜在性的存在或水平进行评估。

在一个第二方面，本发明包括针对在糖蛋白上产生N-乙酰己糖胺聚糖的能力而筛选一种或多种细胞的方法，该方法包括：

提供多个细胞群，例如，多个CHO细胞群；

在适合于一种糖蛋白的表达的条件下，将该多个细胞的每一个进行培养；

对由该多个细胞的每一个所产生的N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺）进行测量，并且

基于由所选择的细胞制品所产生的一个目标水平的N-乙酰己糖胺聚糖的存在而选择该多个细胞制品中的一种或多种。

在一些实施例中，该细胞群是CHO细胞群。

可以从由细胞制品所产生的糖蛋白、从细胞制品的分离的糖蛋白、从获得自细胞制品所产生的糖蛋白的肽、或者从获得自细胞制品的或获得自其糖蛋白产物的聚糖制品获得并测量N-乙酰己糖胺聚糖。在某些实施例中，筛选方法进一步包括将糖蛋白表达产物从细胞培养物分离、并且针对在由步骤(c)中的细胞所产生的糖蛋白上的N-乙酰己糖胺聚糖的存在或量进行测量的步骤。在某些实施例中，细胞筛选方法包括对存在于糖蛋白制品上的N-乙酰己糖胺聚糖的量进行定量。在某些实施例中，细胞筛选方法的步骤(b)是在一个生物反应器中发生。

该多个细胞群的每一个可以包括不同的品系群、不同的克隆细胞群、或来自用于制造糖蛋白的细胞培养物的不同的样品（例如，随着时间的推移而取的样品）。在某些实施例中，细胞群是用至少一种载体进行转化，该载体对糖蛋白（例如，糖基化抗体，如人或人源化的糖基化抗体）进行编码。在细胞筛选方法的某些实施例中，该糖蛋白是从这些细胞表达的分泌型糖蛋白。

筛选方法的测量步骤可以包括在此披露的用于对糖蛋白上的N-乙酰己糖胺聚糖进行鉴定和/或定量的任何技术。

在一个第三方面，本发明包括一种用于评估糖蛋白制品的方法。该方法包括对在糖蛋白制品（例如，糖基化抗体制品）中的N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺聚糖）的量进行测量。

在一些实施例中，糖蛋白制品是在宿主细胞（例如，原核或真核宿主细胞）中产生。真核细胞可以是例如酵母、昆虫、真菌、植物或动物细胞（例如，哺乳动物细胞）。在此描述了示例性的宿主细胞。

在一些实施例中，该方法包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将在糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行记录。

在一些实施例中，该方法还包括将所测量的存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平与一个参比标准（例如一个对照或参比说明）进行比较。该参比标准可以是一种含有该糖蛋白制品的药物制剂的一种说明（例如，一种FDA标签或医嘱（Physician’sInsert））或质量标准。

在一些实施例中，可以将存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平测量为相对于样品（例如糖蛋白制品）中的聚糖总量的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括色谱法。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括质谱（MS）法。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括电泳法（例如毛细管电泳）。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括核磁共振（NMR）法。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括单糖分析。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括荧光法。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括UV-VIS吸收。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括酶法。

在一个实施例中，用于测量N-乙酰己糖胺聚糖含量的技术包括使用一种检测分子（例如一种抗体）。

在另一方面，本发明包括一种重组糖蛋白，与具有相同或高度相似的氨基酸序列的参比糖蛋白相比，该重组糖蛋白具有不同水平的N-乙酰己糖胺聚糖。如在此使用的高度相似的氨基酸序列是至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%一致的。

在一些实施例中，参比糖蛋白是可商购的治疗性糖蛋白，例如在表2中所披露的治疗性糖蛋白。与参比糖蛋白相比，该重组糖蛋白可以具有更高或更低水平的N-乙酰己糖胺聚糖，例如，该重组糖蛋白可以具有高或低至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%的水平的N-乙酰己糖胺聚糖，例如由总聚糖的百分比所测量的，或如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量而测量的。在一个实施例中，重组糖蛋白是IgG1制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于3%、5%、10%、或15%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。在另一个实施例中，重组糖蛋白是IgG1制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于40%、50%或55%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。在又另一个实施例中，重组糖蛋白是IgG2制品，并且重组糖蛋白具有如相对于G0F、G1F、G2F和糖基化糖肽的总量所测量的大于或小于5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、15%、20%、或25%的N-乙酰己糖胺聚糖的水平。

在另一方面，本披露的特征为用于调节抗体制品的效应子功能的方法。在一些实施例中，该方法包括：

提供一种抗体制品；并且

调节（例如增加或减少）该抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量。

在一些实施例中，该方法包括增加抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量，例如由此降低抗体制品的效应子功能。在一些实施例中，该方法包括去除与效应子功能相关联的一种或多种聚糖结构（例如唾液酸化聚糖）以及例如添加N-乙酰己糖胺聚糖。在其他实施例中，该方法包括对聚糖结构进行酶修饰或化学修饰以形成N-乙酰己糖胺聚糖，例如用在此所述的酶或化学品。

在其他实施例中，该方法包括减少抗体制品的N-乙酰己糖胺聚糖含量，例如由此增强抗体制品的效应子功能。在一些实施例中，该方法包括去除一种或多种N-乙酰己糖胺聚糖，以及例如添加与效应子功能相关联的聚糖结构（例如唾液酸化聚糖）。在其他实施例中，该方法包括对聚糖结构进行酶修饰或化学修饰以形成与增强的效应子功能相关联的聚糖结构。

在另一方面，本披露的特征为用于评估抗体制品的效应子功能的方法。在一些实施例中，该方法包括：

提供一种抗体制品；并且

对在该制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量进行确定。

附图简要说明

图1是N-乙酰己糖胺聚糖结构的表示。

图2描绘了IgGFc糖肽的MS/MS碎片，该IgGFc糖肽包含单一的N连接的N-乙酰己糖胺聚糖。碎片图式将修饰定位在了序列中间的残基297—Asp残基中。

图3是描绘了存在于可商购的IgG糖蛋白中的截短的N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖的百分比的图。基于G0F、G1F、G2F和未糖基化的糖肽的丰度，对包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白的相对丰度进行计算。对于每一个所测试的可商购的IgG，这些种类包含大于85%的聚糖组合物。

定义

除非在此下文另外定义，在此使用的所有术语是以它们的原始含义而使用，如将由本领域中普通技术人员所理解的。

大致，大约，约略（Ca.）：如在此使用的，术语“大致”、“大约”或“约略”当应用至一个或多个感兴趣的值时，是指与一个所指出的参考值相似的一个值。在某些实施例中，术语“大致”、“大约”或“约略”是指落在所指出的参考值的5%、4%、3%、2%、1%、或更小比例之内的数值的范围。

检测（Detection，Detecting）：如在此使用的，术语“检测”（“detecting”，“detection”）和“检测手段”可互换地使用以指代特定的化学部分（例如，N-乙酰己糖胺，如N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺）是否存在或不存在于化合物、制品、组合物、细胞或细胞群之中或之上的确定。检测手段可以涉及选择性标记、或可鉴定的特征（例如，荧光或放射性部分），并且可以涉及试剂、化合物、细胞或细胞群的标记。检测还可以指使用此类技术（如质谱或相关方法、电泳法、核磁共振、色谱法、或以上项的组合）对化合物、制品、组合物、细胞或细胞群的分析，从而确定一种化学部分在化合物、制品、组合物、细胞或细胞群之中或之上的存在或不存在。检测还可以涉及对正被检测的化学部分的绝对或相对水平的定量。

聚糖：如本领域中已知的并且在此所使用的，“聚糖”是糖类。聚糖可以是糖残基的单体或聚合物，并且可以是直链的或分支的。聚糖可以包括天然的糖残基（例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、***糖、核糖、木糖、等）和/或修饰的糖（例如，2’-氟代核糖、2’-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6’磺酸基N-乙酰葡糖胺、等）。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还包括糖蛋白（例如，糖蛋白、糖脂、蛋白聚糖、等）的聚糖组分。该术语还包括游离的聚糖，包括从糖蛋白中切割的或另外地由其释放的聚糖。

聚糖制品：如在此所使用的，术语“聚糖制品”是指根据一个具体的产生方法而获得的一组聚糖。在一些实施例中，聚糖制品是指从一种糖蛋白制品（见以下糖蛋白制品的定义）中获得的一组聚糖。在一些实施例中，聚糖制品包括糖蛋白。在一些实施例中，聚糖制品包括释放的聚糖。

糖蛋白：如在此所使用的，术语“糖蛋白”是指一种“蛋白质”（如在此定义的），该蛋白质包含了共价连接至一个或多个糖部分（即，聚糖）上的一个肽主链。如本领域的普通技术人员所理解，这种肽主链典型地包括具有多种氨基酸残基的一个直链。这个或这些糖部分（moiety）可以是处于单糖、二糖、寡糖、和/或多糖的形式。这个或这些糖部分可以包括糖残基的一个单一的无分支的链或者可以包括一个或多个分支的链。在某些实施例中，糖部分可以包括硫酸根和/或磷酸根基团。可替代地或另外地，糖部分可以包括乙酰基、羟乙酰基、丙基或其他烷基修饰。在某些实施例中，糖蛋白包含O-连接的糖部分；在某些实施例中，糖蛋白包含N-连接的糖部分。

糖蛋白制品：如在此所使用的，术语“糖蛋白制品”是指一组单独的蛋白质分子，该组中的每一个包含一种特定的氨基酸序列（该氨基酸序列包含至少一个糖基化位点），并且多种蛋白质具有共价地附连至该至少一个糖基化位点上的至少一种聚糖。在糖蛋白制品中的一种特定糖蛋白的单独的分子典型地具有相同的氨基酸序列，但是可以在该至少一个糖基化位点的占用方面有所不同和/或在被连接至该至少一个糖基化位点上的聚糖的同一性方面所有不同。即，一种糖蛋白制品可以仅包含一种特定的糖蛋白的一种单一的糖形，但是更典型地包含多种糖形。相同的糖蛋白的不同制品可以在所存在的糖形的同一性方面（例如，在一种制品中存在的糖形可能是另一种制品所缺少的）和/或在不同糖形的相对量方面有所不同。

糖蛋白组合物：如在此使用的，“糖蛋白组合物”是指处于药品或药物产品的形式的糖蛋白制品。

糖苷酶：如在此所使用的，术语“糖苷酶”是指一种试剂，该试剂切割位于聚糖中顺序的糖之间或糖与主链部分之间（例如，在糖蛋白的糖与肽主链之间）的一个共价键。在一些实施例中，糖苷酶是一种酶。在某些实施例中，糖苷酶是包含一个或多个多肽链的一种蛋白（例如，一种蛋白质酶）。在某些实施例中，糖苷酶是一种化学切割试剂，例如肼。

N-聚糖：如在此所使用的，术语“N-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物已从一种糖蛋白释放，但之前通过一个氮连接（参见以下N-连接的聚糖的定义）被连接至糖蛋白。

N-连接的聚糖：N-连接的聚糖是通过一个氮连接而连接至一种糖蛋白的聚糖。存在着不同分类的N-连接的聚糖，但是它们典型地基于共同的核心戊糖(Man)₃(GlcNAc)(GlcNAc)。

O-聚糖：如在此所使用的，术语“O-聚糖”是指糖的一种聚合物，该聚合物从一种结合糖中释放出来，但是之前通过一个氧连接（参见以下O-连接的聚糖的定义）被连接至该结合糖。

O-连接的聚糖：O-连接的聚糖是通过一个氧连接而连接至一种结合糖的聚糖。O-连接的聚糖典型地通过N-乙酰基-D-半乳糖胺（GalNAc）而被附连至糖蛋白或者通过N-乙酰基-D-葡糖胺（GlcNAc）而被附连至L-丝氨酸（Ser）或L-苏氨酸（Thr）的羟基基团。一些O-连接的聚糖还具有多种修饰，如乙酰化和硫酸化。

调节：如在此所使用的，术语“调节”是指作用者在规定的限度之内控制一种参数的值（例如，存在于糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的水平）的能力。因此，在一些实施例中，可以将N-乙酰己糖胺聚糖的水平进行调节从而使它维持在规定的限度之内。在一些实施例中，可以将N-乙酰己糖胺聚糖的水平进行调节，从而使得它不会以大于参比标准的10.0%、5.0%、1.0%、0.5%或0.1%而变化。

蛋白酶：如在此所使用的，术语“蛋白酶”是指一种试剂，该试剂切割位于多肽链中的顺序的氨基酸之间的肽键。在一些实施例中，蛋白酶是一种酶（即，一种蛋白水解酶）。在某些实施例中，蛋白酶是一种蛋白质（例如，一种蛋白质酶），该蛋白质包含一个或多个多肽链。在某些实施例中，蛋白酶是一种化学切割剂。

提供：如在此使用的，术语“提供”是指作用者从任何来源获得一种主题物件（例如细胞制品或糖蛋白制品），包括但不限于通过作用者的自己的制造而获得或者通过作用者从另一个团体接受该物件。例如，如果细胞制品由任何机器、人、或实体来制造或接受的话，则该细胞制品得以提供。在一些实施例中，细胞制品可以被机器所接受，然后它可进行糖蛋白制品的一种或多种测试、处理、或精制。在一些实施例中，细胞制品可以被人接受。在一些实施例中，CHO细胞制品可以从一个外界的实体被接受。在一些实施例中，细胞制品可以被一个人或业务单位（为第二个人或业务单位进行表征服务）所接受。

N-乙酰己糖胺聚糖：如在此使用的术语“N-乙酰己糖胺”描述了在图1中所展示的聚糖结构。

某些实施方案的详细说明

虽然用于合成重组糖蛋白的宿主细胞具有产生复杂的糖基化的胞内机器，但这些细胞不总是具有与天然地表达糖蛋白的细胞相同的酶组分。在制造条件下的细胞系和变体的克隆选择还可以产生在培养的细胞中所表达的糖蛋白方面的异质性。在糖蛋白活性中糖基化的功能作用使得对在细胞系中所产生的治疗产品的仔细表征成为必需。

本披露至少部分地是基于出人意料的发现：许多糖蛋白制品（例如，糖基化抗体制品）包含非常规的N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖结构。例如，已经发现可以在糖基化抗体制品中的抗体的Fc区的糖基化位点Asn297处找到N-连接的N-乙酰己糖胺聚糖。许多糖基化抗体制品包含此结构，并且因此在生产糖基化抗体制品时重要的是鉴定、监测并控制聚糖结构的这个方面。

本披露提供了分析糖蛋白上的聚糖的组成的方法。根据本披露，可以将来自糖蛋白制品的聚糖进行分析以确定它们是否包含N-乙酰己糖胺聚糖。本披露提供了检测与糖蛋白制品（例如，糖基化抗体制品，如在此所述的糖基化抗体制品）相关联的N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在或量的方法，以及产生包含了一定量的聚糖结构或缺乏这种聚糖结构的糖蛋白的方法。

聚糖制品

本披露提供了对在聚糖制品中的单独的聚糖的结构和/或组成进行分析的方法，例如针对N-乙酰己糖胺聚糖（N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺）的不存在、存在或量进行评估。聚糖制品可以从由本领域内的任何可供使用的方法所制得的一种细胞制品或一种糖蛋白而获得。总体而言，获得一种聚糖制品包括以下步骤：(1)获得一种细胞或糖蛋白制品；并且(2)可任选地使聚糖从该细胞或糖蛋白制品释放。在一些实施例中，获得一种聚糖制品可任选地包括用一种可检测的标记物对该聚糖制品进行标记。

糖蛋白制品

已经描述了用于重组生产糖蛋白的方法。由所培养的细胞分泌的糖蛋白可以通过任何可获得的手段来分离和纯化，例如，阴离子交换色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、免疫亲和层析、及其组合。

N-连接的聚糖制品

在一些实施例中，N-聚糖制品是通过提供一种糖蛋白群体并且从该群体中的糖蛋白中移出N-连接的聚糖而获得。

在一些实施例中，N-连接的聚糖是通过消化而从糖蛋白（例如糖蛋白）移出。总体而言，根据本披露有待使用的聚糖酶在核心的GlcNAc-Asn、GlcNAc-GlcNAc、或Man-GlcNAc残基之间进行切割。可用于从糖蛋白移出N-连接的聚糖的示例性酶类包括但不限于，N-聚糖酶F和/或N-聚糖酶-A、O-聚糖酶和/或EndoH。

在一些实施例中，N-连接的聚糖是通过化学切割而从糖蛋白移出。仅给出一些实例，肼、硼氢化钠、和/或三氟甲磺酸（TFMS）可以用于将聚糖从糖蛋白移出。

O-连接的聚糖制品

在一些实施例中，O-连接的聚糖制品是通过提供一种糖蛋白（例如，糖蛋白）群体并且从该群体中的糖蛋白中移出O-连接的聚糖而获得。

在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过β消除而从糖蛋白（例如糖蛋白）移出。在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过还原性β消除而从糖蛋白（例如糖蛋白）移出。在一些实施例中，O-聚糖是通过非还原性β消除而从糖蛋白（例如糖蛋白）移出。

在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含碱性四氢硼酸盐的溶液中而从糖蛋白（例如，糖蛋白）制品移出。在一些实施例中，使用了硼氘化盐，从而例如将氘标记并入以协助O-连接的聚糖的检测。在不同的示例性方法中，在42℃-45℃下，将糖蛋白制品孵育在包含0.8M-1.0MNaBH₄和0.05M-0.1MNaOH的溶液中持续2-24小时。移出O-连接的聚糖的反应可以通过添加酸（例如，1.0MHCl）而终止。

在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含NaOH的溶液中而从糖蛋白制品移出。在不同的示例性方法中，在27℃-45℃下，将糖蛋白孵育在包含50mM-200mMNaOH的溶液中持续2-48小时。反应可以通过添加酸而终止。

在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含NH₄OH的溶液中而从糖蛋白制品移出。在不同的示例性方法中，在45℃-60℃下，将糖蛋白孵育在包含25%-28%NH₄OH的溶液中持续2-40小时。该反应可以通过在真空下去除NH₄OH而终止。在一些实施例中，该溶液包含（例如，在饱和浓度下的）碳酸铵。在一些实施例中，将经NH₄OH处理的制品用酸（例如硼酸）进行处理。

在一些实施例中，O-连接的聚糖是通过将制品孵育在包含乙胺（例如，大约70%的乙胺）或甲胺（例如，大约40%的甲胺）的水溶液中持续大约4-24小时而从糖蛋白制品移出。

在一些实施例中，O-连接的聚糖制品是从N-连接的聚糖已经被移出的糖蛋白群体获得。

标记聚糖

在一些实施例中，可以在聚糖从糖蛋白释放之前或之后将标记物与聚糖相关联。可以将N-连接的聚糖或O-连接的聚糖（例如，已经从一种糖蛋白群体移出的N-聚糖）与一种或多种可检测的标记物相关联。典型地将可检测的标记物与聚糖的还原端相关联。在一些实施例中，可检测的标记物是荧光部分。根据本披露可以使用的示例性的荧光团包括但不限于2-氨基苯甲酸（2AA）、2-氨基苯甲酰胺（2AB）、和/或2-氨基嘌呤（2AP）。总体而言，根据本披露而使用的荧光团的特征在于在不损害和/或破坏聚糖的条件下具有与寡糖和/或单糖的还原端的反应性。在一些实施例中，荧光部分被直接地附接至还原端。例如，直接附接可以通过还原胺化作用的直接结合而完成。在一些实施例中，荧光部分被间接地附接至还原端。例如，间接附接可以通过一个反应性的连接臂而完成。

在一些实施例中，可检测的标记物包括放射性部分或经同位素标记的分子。根据本披露可以使用的示例性的放射性部分包括但不限于氚（³H）、氘（²H）、和/或³⁵S。典型地，此类部分被直接地附接至荧光团或者以其他方式与荧光团相关联。仅给出一个放射性荧光团的实例，可以对2AP进行修饰以使得所有的氢都被氘化。

聚糖的释放

本披露提供了确定糖蛋白的糖基化模式的改进的方法。此类方法可以涉及使一种聚糖群体经受一种或多种外切糖苷酶处理并且对这些消化产物的结构和/或组成进行分析。在一些实施例中，根据本披露所使用的外切糖苷酶仅识别并且切割一种特定类型的糖苷连接。在一些实施例中，根据本披露所使用的外切糖苷酶识别并且切割多于一种特定类型的糖苷连接。在这些外切糖苷酶中，对于本发明而言可以有用的是α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶；己糖胺酶、甘露糖苷酶；及其组合。

外切糖苷酶

外切糖苷酶是从聚糖的非还原端对末端的糖苷键进行切割的酶类。它们对于特定的单糖连接以及异头性（α/β）是典型地高度特异性的。在一些实施例中，相邻的分枝模式可以影响外切糖苷酶的特异性。外切糖苷酶处理通常导致标准的触角连接的聚糖被切割成包含3个甘露糖以及2个GlcNAc残基的戊糖核心（M3N2）。然而，非常规的修饰的种类（例如，触角或核心岩藻糖化的种类、高甘露糖以及杂合聚糖、乳糖胺扩展的聚糖、硫酸化的聚糖、磷酸化的聚糖，等等）对外切糖苷酶处理具有耐受性，并且可以将它们用色谱方式分辨出并且相对于M3N2戊糖进行定量。

根据本披露可以使用的示例性的外切糖苷酶包括但不限于：唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶。外切糖苷酶可以从任何来源（包括商业来源）获得或者通过从一种细胞来源（例如细菌、酵母、植物、等等）的分离和/或纯化而获得。

在一些实施例中，外切糖苷酶（例如，唾液酸酶、半乳糖苷酶、己糖胺酶、岩藻糖苷酶、以及甘露糖苷酶）可以被分成多个类别或“亚组”。在一些实施例中，不同的亚组显示出对于切割不同类型的连接的不同能力。表1提出了一些示例性的外切糖苷酶，它们的连接特异性、以及从中衍生出每一项的生物体。本领域的普通技术人员应当理解这是一个示例性的，而非全面的外切糖苷酶的列表，并且可以根据本披露使用具有任何连接特异性的任何外切糖苷酶。

表1.外切糖苷酶

“EC#”是指酶学委员会登记号

根据本披露，可以使用任何外切糖苷酶或任何一组外切糖苷酶来消化聚糖群体。总体而言，外切糖苷酶反应在与酶活性相容的条件下发生。例如，可以将pH、温度、反应溶液组分和浓度（例如，盐、洗涤剂、等等）、以及反应时间的长度进行优化以便实现所希望的外切糖苷酶活性水平。参见例如WO2008/130926，其内容通过引用结合在此。

聚糖结构和活性的分析

总体而言，根据本披露的方法包括使一种聚糖制品经受分析，从而确定在该制品中的糖蛋白是否包含一种N-乙酰己糖胺聚糖结构。在一些实施例中，该分析包括将来自一种来源的一种糖蛋白制品中的聚糖的结构和/或功能与来自另一种来源的至少另一种糖蛋白制品中的聚糖的结构和/或功能进行比较。在一些实施例中，该分析包括将在一个或多个样品中的聚糖的结构和/或功能与在一种参比样品中的聚糖的结构和/或功能进行比较。

可以通过任何一种可供使用的方法来分析聚糖的结构和组成。在一些实施例中，可以通过以下方法来分析聚糖的结构和组成：色谱方法、质谱（MS）法、色谱方法随后是MS、电泳法、电泳法随后是MS、核磁共振（NMR）法、及其组合。

在一些实施例中，可以通过色谱法来分析聚糖的结构和组成，包括但不限于，液相色谱法（LC）、高效液相色谱法（HPLC），超高效液相色谱法（UPLC），薄层色谱法（TLC），酰胺柱色谱法、及其组合。

在一些实施例中，可以通过质谱法（MS）和相关的方法来分析聚糖的结构和组成，这些方法包括但不限于，串联MS、LC-MS、LC-MS/MS，基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI-MS），傅里叶变换质谱法（FTMS），离子迁移率分离质谱法（IMS-MS），电子转移解离法（ETD-MS）、及其组合。

在一些实施例中，可以通过电泳法来分析聚糖的结构和组成，这些电泳法包括但不限于毛细管电泳法（CE）、CE-MS、凝胶电泳法、琼脂糖凝胶电泳法、丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）随后是蛋白质印迹法（使用识别特定的聚糖结构的抗体）、及其组合。

在一些实施例中，可以通过核磁共振（NMR）和相关方法来分析聚糖的结构和组成，这些方法包括但不限于，一维NMR（1D-NMR），二维NMR（2D-NMR），相关谱磁性角自旋NMR（COSY-NMR），全相关光谱NMR（TOCSY-NMR），异核单量子相干NMR（HSQC-NMR），异核多级量子相干（HMQC-NMR），旋转核欧沃豪斯效应谱NMR（ROESY-NMR），核欧沃豪斯效应谱（NOESY-NMR）、及其组合。

在一些实施例中，可以将在此所描述的技术与其他的一种或多种技术相组合，以用于聚糖或糖蛋白的检测、分析、和或分离。例如，在一些实施例中，根据本披露使用一种或多种可供使用的方法对聚糖进行分析（仅给出一些实例，参见Anumula（阿纳马拉），Anal.Biochem.（《分析生物化学》）350(1):1,2006；Klein（克莱因）等人，Anal.Biochem.（《分析生物化学》），179:162,1989；和/或Townsend（汤森特），R.R.CarbohydrateAnalysis”HighPermofrmanceLiquidChromatographyandCapillaryElectrophoresis.（碳水化合物分析高效液相色谱和毛细血管电泳），Z.ElRassi编，181-209页，1995，这些文献中的每一个通过引用以其全文结合在此）。例如，在一些实施例中，使用一种或多种色谱方法、电泳法、核磁共振法、及其组合对聚糖进行表征。示例性的此类方法包括例如，NMR、质谱法、液相色谱法、2-维色谱法、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳法、荧光团辅助糖电泳（FACE）、胶束电动色谱法（MEKC）、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理、及其组合。本领域的普通技术人员将意识到其他技术，这些技术可以与在此所述的方法一起使用而对聚糖进行表征。

在一些实施例中，在此所述的方法允许用于检测在聚糖的一个群体中以低水平存在的聚糖种类（例如，N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺聚糖））。例如，本方法允许检测在聚糖的一个群体中按照以下水平存在的聚糖种类：小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。

在一些实施例中，在此所述的方法允许用于检测在聚糖的一个群体中以低水平存在的特定结构（例如，N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺和/或N-乙酰半乳糖胺聚糖））。例如，本方法允许检测在聚糖的一个群体中按照以下水平存在的特定结构：小于10%、小于5%、小于4%、小于3%、小于2%、小于1.5%、小于1%、小于0.75%、小于0.5%、小于0.25%、小于0.1%、小于0.075%、小于0.05%、小于0.025%、或小于0.01%。

在一些实施例中，在此所述的方法允许检测在聚糖的一个群体中单独的聚糖种类的相对水平。例如，可以对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分比。这种分析提供了在聚糖的一个群体中每个聚糖种类的一个相对百分比的量。在另一个实例中，从1D-NMR实验中的峰面积、或从来自1H-15HSQC谱的交叉峰的体积（例如，具有基于来自标准品的响应的校正）、或通过将样品中相同的峰进行比较而得的相对定量而对单独的聚糖种类的相对水平进行确定。

在一些实施例中，对糖蛋白制品（例如，糖基化抗体制品）的生物活性进行评价。可以通过任何可供使用的方法来分析糖蛋白制品的生物活性。在一些实施例中，对糖蛋白的结合活性进行评价（例如，结合至一种受体）。在一些实施例中，对糖蛋白的治疗活性进行评价（例如，糖蛋白在降低一种疾病或病症的严重性或症状中的活性，或者在延迟一种疾病或病症的症状的出现中的活性）。在一些实施例中，对糖蛋白的药理学活性进行评价（例如，生物利用度、药代动力学、药效动力学）。对于分析糖蛋白治疗剂的生物利用度、药代动力学、以及药效动力学的方法参见例如Weiner（韦纳）等人，JPharmBiomedAnal.（《制药和生物医学分析杂志》）15(5):571-9,1997；Srinivas（斯利尼瓦斯）等人，J.Pharm.Sci.（《制药科学杂志》）85(1):1-4,1996；以及Srinivas（斯利尼瓦斯）等人，Pharm.Res.（《药学研究》）14(7):911-6,1997。

如对于本领域普通技术人员而言将理解的，可以进行测试的具体的生物活性或治疗活性将取决于具体的糖蛋白。

可以通过任何可获得方法对糖蛋白制品的潜在的不良活性或毒性（例如，引起高血压、过敏性反应、血栓形成事件、癫痫发作、或其他不良事件的倾向）进行分析。在一些实施例中，对糖蛋白制品的免疫原性进行评价（例如，通过确定制品是否引发受试者中的抗体响应）。

在不同的实施例中，将包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白制品与不包含或以本底水平包含N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白制品的生物活性、治疗活性等进行比较。在不同的实施例中，将具有N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白制品与具有不同水平的N-乙酰己糖胺聚糖的糖蛋白制品的生物活性、治疗活性等进行比较。

应用

可以利用本披露的方法来分析处于多种状态中任一种的、来自糖蛋白的聚糖，包括例如游离的聚糖、糖蛋白（例如，糖肽类、糖脂类、蛋白聚糖类、等等）、与细胞相关联的聚糖（例如，与细胞核、细胞质、细胞膜相关联的聚糖、等等）；与细胞的、细胞外、细胞内、和/或亚细胞的组分（例如蛋白质）相关联的聚糖；在细胞外空间（例如，细胞培养基）中的聚糖、等等。

本披露的方法可以用于针对一种治疗性或其他商业上相关的糖蛋白的生产而言的工艺开发的一个或多个阶段中。例如，在此所述的方法可以用于对用于生产糖蛋白制品的一种或多种生产参数进行评估，从而比较由不同的生产参数生产的糖蛋白制品，并且确定和/或选择针对糖蛋白制品的一种或多种生产参数，从而可以在生产糖蛋白制品时获得特定的聚糖结构。如在此所使用的生产参数是在生产过程中的参数或要素。可以进行选择的生产参数包括：例如，用于产生糖蛋白制品的细胞或细胞系、培养基、培养过程或生物反应器变量（例如，分批、分批补料、或灌注）、纯化过程以及糖蛋白制品的配制。示例性生产参数包括：1)宿主的类型；2)宿主的遗传学；3)培养基类型；4)发酵平台；5)纯化步骤；以及6)配制。

还可以利用本披露来监测在一个特定的细胞培养物中所发生的糖基化作用的程度和/或类型（例如在细胞培养物中所产生的糖蛋白制品中的N-乙酰己糖胺聚糖的程度），由此允许调节或可能终止这种培养，以便（例如）实现一种特别希望的糖基化模式或避免发展一种特别不希望的糖基化模式。

还可以利于本披露来评价细胞或细胞系（例如，CHO细胞系）的糖基化作用特征，这些细胞或细胞系被认为用于产生一种特别希望的糖蛋白（例如，甚至是在对这些细胞或细胞系进行工程化以产生该糖蛋白、或产生一种处于商业上相关水平的糖蛋白之前）。

例如，当该目标糖蛋白是治疗性糖蛋白（例如在一个或多个国家中已经历了监管评审）时，经常所希望的是对这些培养物进行监测以对它们将产生具有与药物产品的已确立的糖基化模式尽可能接近的糖基化模式的产物的可能性（例如，具有的与药物产品接近的N-乙酰己糖胺聚糖含量的程度）进行评价，例如无论它是否正在通过确实相同的路径而产生。如在此所使用的，“接近”是指一种糖基化模式，该模式与所确立的药物产品的糖基化模式具有至少大约75%、80%、85%、90%、95%、98%、或99%的相关性。在此类实施例中，典型地在多个时间点获取这些生产培养物的样品，并且将它们与一个已确立的标准物或与一个对照培养物进行比较以便评价相对的糖基化作用。

例如，在一些实施例中，用于监测一种糖蛋白的生产的方法可以包括以下步骤：(i)在一种糖蛋白的生产过程中，从该生产体系移出至少第一和第二包含聚糖的样品；(ii)使该第一以及第二包含聚糖的样品各自经受一个分析以确定特定修饰（例如，N-乙酰己糖胺聚糖）是否存在；并且(iii)将从该第一包含聚糖的样品获得的产物与从该第二包含聚糖的样品获得的的那些进行比较，从而确定差别并且因此使糖蛋白生产的进程得到监测。在一些实施例中，生产体系包括CHO细胞。

无论是否出于质量控制的目的而监测一种具体的目标蛋白的生产，可以利用本披露来（例如）监测处于具体的发展阶段的、或在具体的生长条件下的糖基化作用。

在一些实施例中，在此所述的方法可以用于表征、调节和/或控制或比较治疗性产品的质量。仅给出一个实例，本发明的方法学可以用于评价在产生一种治疗性蛋白产品的细胞中的糖基化作用。具体而言，假定糖基化作用可经常影响一种治疗性蛋白产品的活性、生物利用度、或其他特征，则用于在这种治疗性蛋白产品的生产过程中对细胞的糖基化作用进行评价的方法是特别希望的。除其他事项之外，本披露可以协助在用于治疗性蛋白的生产体系中的糖基化作用的实时分析，并且因此可以实现糖基化作用的调节。

在一些实施例中，糖蛋白制品是糖基化抗体制品。术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域（可变区）或免疫球蛋白可变结构域（可变区）序列的一种蛋白质。例如，抗体可以包含一个重（H）链可变区（在此缩写为VH或HV），以及一个轻（L）链可变区（在此缩写为VL或LV）。在另一个实例中，抗体包含两个重（H）链可变区以及两个轻（L）链可变区。术语“抗体”包括抗体的抗原结合片段连同完整的抗体。术语全长抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性地结合至感兴趣的靶标的能力的全长抗体的一个或多个片段。

抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM（连同它们的亚型）的结构特征。抗体可以来自任何来源，但灵长类（人和非人灵长类）以及灵长类化的来源是优选的。

抗体的VH或VL链可以进一步包含所有的或部分的重或轻链恒定区，由此分别形成重或轻免疫球蛋白链。在一个实施例中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重和轻免疫球蛋白链是由例如二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区包含三个免疫球蛋白结构域—CH1、CH2和CH3。轻链恒定区包含CL结构域。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区典型地介导抗体与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫***中的不同的细胞（例如，效应细胞）以及经典补体***中的第一组分（Clq）。

在一个实施例中，糖基化抗体具有人的或实质上具有人的一个或多个区域。例如，这些可变区的一个或多个可以是人的或实质上是人的。例如，这些CDR的一个或多个可以是人的，例如HCCDR1、HCCDR2、HCCDR3、LCCDR1、LCCDR2、和/或LCCDR3。轻链（LC）和/或重链（HC）CDR的每一个可以是人的。HCCDR3可以是人的。这些框架区中的一个或多个可以是人的，例如HC和/或LC的FR1、FR2、FR3、和/或FR4。例如，Fc区可以是人的。在一个实施例中，所有框架区是人的。

代表性的糖蛋白产品包括，例如表2中所提供的糖基化抗体：

表2：示例性的可商购的糖蛋白产品

在一些实施例中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自不同来源或样品的糖蛋白中的聚糖彼此进行比较。在一些此类的实例中，随着时间获得了来自相同来源（例如，来自相同的CHO细胞来源）的多个样品，以使得糖基化模式中（并且特别是在细胞表面的糖基化模式中）的变化（例如，N-乙酰己糖胺聚糖的存在或程度上的变化）得以监测。在一些实施例中，样品之一是一种历史样品或历史样品的一个记录。在一些实施例中，样品之一是一个参比样品。

在一些实施例中，本披露提供了多种方法，在这些方法中将来自由不同细胞来源所表达的糖蛋白的聚糖彼此进行比较。在一些实施例中，被比较的细胞来源的一个或多个是CHO细胞。

在一些实施例中，将来自不同的细胞培养物样品的、在不同的生产参数（但在其他方面相同）下制备的聚糖进行比较，这些生产参数例如细胞类型、培养类型（例如，连续进料对比分批进料，等等）、培养条件（例如，培养基的类型、一种或多种具体的培养基中具体成分的存在、或浓度，渗透性，pH，温度，一种或多种因素（如渗透性、pH、温度，等等）变换的时间或程度）、培养时间、分离步骤、等等，从而确定所选择的生产参数对糖基化的影响。在某些实施例中，对来自不同细胞培养物样品（这些样品是在一些条件下制备，这些条件在一个单一选择的生产参数方面有所不同）的聚糖进行比较，从而确定该单一选择的生产参数对糖基化模式的影响（例如，N-乙酰己糖胺聚糖的不存在、存在、或程度）。因此，在其他应用中，使用在此所述的技术可以有助于确定具体生产参数对细胞中的糖基化模式的影响。

在一些实施例中，对来自不同批次的一种糖蛋白的聚糖（无论是通过相同的方法还是通过不同的方法制备的，以及无论是同时制备还是分开制备的）进行了比较。在此类实施例中，本披露有助于糖蛋白制品的质量控制。可替代地或另外地，一些此类的实施例有助于对一种产生糖蛋白的特定培养物的进展进行监测（例如，当在不同的时间点将样品从该培养物移出，并对样品进行分析并将这些样品彼此进行比较时）。在一些实例中，随着时间获得了来自相同来源的多个样品，使得糖基化模式中的变化得以监测。在一些实施例中，将包含聚糖的样品以大约30秒、大约1分钟、大约2分钟、大约5分钟、大约10分钟、大约30分钟、大约1小时、大约2小时、大约3小时、大约4小时、大约5小时、大约10小时、大约12小时、或大约18小时的间隔、或以甚至更长的间隔移出。在一些实施例中，将包含聚糖的样品以不规则的间隔移出。在一些实施例中，将包含聚糖的样品以5小时的间隔移出。

在一些实施例中，根据本披露的方法可以用于监测糖蛋白在其通过细胞进行生产的历程期间的糖基化模式。例如，糖蛋白的生产（例如，商业性生产）可以涉及以下步骤：(1)将产生糖蛋白的细胞进行培养，(2)在培养过程中以规则的或不规则的间隔获得样品，并且(3)对在所获得的一个或多个样品中所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式进行分析。在一些实施例中，此类方法可以包括将在所获得的样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式彼此进行比较的一个步骤。在一些实施例中，此类方法可以包括将在所获得的一个或多个样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式与一个参比样品的糖基化模式进行比较的一个步骤。

在一些实施例中，根据本披露的方法可以用于监测糖蛋白在储存历程中的糖基化模式。例如，该方法可以包括：在糖蛋白制品的储存期间以规则的或不规则的间隔获得样品，并且(3)对在所获得的一个或多个样品中的一种或多种糖蛋白的糖基化模式进行分析。在一些实施例中，此类方法可以包括将在所获得的样品中的一种或多种糖蛋白的糖基化模式彼此进行比较的一个步骤。在一些实施例中，此类方法可以包括将在所获得的一个或多个样品中的一种或多种糖蛋白的糖基化模式与一个参比样品的糖基化模式进行比较的一个步骤。

在这些实施例的任一个中，可以将聚糖分析的特征记录在例如一个质量控制记录中。如以上所指明，在一些实施例中，与糖蛋白的一个先前的或标准批次的历史记录和/或与一个参比样品进行了比较。

在一些实施例中，将来自一种特定糖蛋白的不同批次的聚糖（无论是通过相同的方法还是不同的方法制备的，以及无论是通过同时制备还是分开制备的）彼此之间和/或与一个参比样品进行比较。在一些实施例中，批次对批次的比较可包括以下步骤：(i)提供来自糖蛋白的一个第一批次的一个第一聚糖制品；(ii)提供来自糖蛋白的一个第二批次的一个第二聚糖制品；(iii)使该第一和第二聚糖制品各自经受一个分析程序；并且(iv)将从该第一聚糖制品获得的分析结果与从该第二制品获得的切割产物进行比较，从而对这两个批次的一致性进行评价。在一些实施例中，可以通过从来自一个批次的至少一种糖蛋白移出至少一种聚糖、并且可任选地对所移出的聚糖进行分离而提供聚糖制品。在一些实施例中，可以将聚糖制品如在此所述地进行标记（例如，荧光地和/或放射性地；例如，在分离之前和/或之后）。

在一些实施例中，本披露有助于糖蛋白制品的质量控制。可以对聚糖分析的特征进行记录（例如在一个质量控制记录中）。如以上所指明，在一些实施例中，与糖蛋白的一个先前的或标准批次的历史记录进行了比较。在一些实施例中，与一种参比糖蛋白样品进行了比较。

在某些实施例中，可在研究中利用本披露来修饰一种细胞的糖基化特征，例如以便确立具有一个或多个所希望的糖基化特征的一种细胞系和/或培养条件，例如，产生糖蛋白的一种细胞系，这些糖蛋白具有一定量的N-乙酰己糖胺聚糖或缺乏N-乙酰己糖胺聚糖。然后，可以利用这种细胞系和/或此类培养条件（如果希望的话）用于产生一种特定的目标糖蛋白，预期这种或此类糖基化特征对该目标糖蛋白是有益的。在具体实施例中，该细胞是CHO细胞。

根据本披露，可以使用在此所述的技术来检测希望的或不希望的聚糖，例如用来对糖蛋白产品中一种或多种污染物的存在进行检测或定量，或用来对一种或多种活性的或所希望的种类的存在进行检测或定量。

在某些实施例中，在此所述的方法协助聚糖的检测，这些聚糖在一种来源（例如，一种生物样品，聚糖制品，等等）中以非常低的水平存在。在此类实施例中，有可能检测聚糖的水平和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖在聚糖的一个群体中按照以下水平存在：小于大约10%、5%、4%、3%、2%、1.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%、或0.01%。在一些实施例中，有可能对聚糖的水平进行检测和/或可任选地对其进行定量，这些聚糖的水平包括聚糖制品的0.1%至5%之间，例如，0.1%至2%之间，例如，0.1%至1%之间。在一些实施例中，在此所述的方法允许检测在聚糖的一个群体中单独的聚糖种类的相对水平。例如，可以对液相色谱法中每个峰之下的面积进行测量并且将其表达为总数的一个百分比。这种分析提供了在聚糖的一个群体中每个聚糖种类的一个相对百分比的量。

在一些实施例中，在此所述的方法允许一种糖蛋白（例如包含N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）的糖蛋白）的制造。例如，糖蛋白的制造（例如，商业性生产）可以涉及以下步骤：(1)培养产生糖蛋白的细胞，(2)获得糖蛋白的样品（例如，在培养过程中以规则的或不规则的间隔，和/或在培养过程结束时获得），并且(3)针对N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）的存在、不存在和/或量，将在所获得的一个或多个样品中所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式进行分析。在一些实施例中，此类方法可以包括将在获得的样品中的所产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式与一个参比进行比较，例如将在所产生的糖蛋白中的N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）的存在、不存在和/或量与一个参比（例如，药物说明，如对于所产生的糖蛋白的针对N-乙酰己糖胺聚糖（例如，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺）的存在、不存在和/或量而言的药物说明）进行比较。在一些实施例中，这些方法可以包括将在所获得的一个或多个样品中产生的一种或多种糖蛋白的糖基化模式与一个参比样品的糖基化模式进行比较的一个步骤。

在一些实施例中，该方法包括糖蛋白的进一步的加工，例如，该进一步的加工可以包括将糖蛋白制品与一个第二组分（例如，赋形剂或缓冲液）进行组合。在一个实施例中，该进一步的加工可以包括以下项中的一种或多种：将糖蛋白制品进行配制；将糖蛋白制品加工为药物产品；将糖蛋白制品与一个第二组分（例如，赋形剂或缓冲液）组合；改变制品中糖蛋白的浓度；将糖蛋白制品进行冷冻干燥；将糖蛋白的一个第一和第二等分部分合并以提供一个第三的较大的等分部分；将糖蛋白制品分为较小的等分部分；将糖蛋白制品布置在一种容器中，例如气密或液密容器；将糖蛋白制品进行包装；将包含糖蛋白制品的一种容器与一个标签相关联；将糖蛋白制品装运至或移至不同的位置。

本披露参考以下的实例将得到更确切的阐述。然而，应当理解的是本披露不以任何方式被这些实例所限制。

鉴于参考了在此提供的说明书的实例，本领域普通技术人员可以易于想到在本发明的范围之内的不同的其他组合。

实例

实例1：

基于如所理解的生物合成糖基化途径，所鉴定的截短的N-连接的聚糖不是所期望的。总体而言，糖蛋白通过标准的糖基化级联而行进，这种标准的糖基化级联导致多个潜在的N-连接的聚糖种类，所有的这些种类包含至少一个核心结构，这种核心结构包含2个GlcNAc部分和3个甘露糖残基。所鉴定的这个种类仅由单一的N-乙酰己糖胺组成，该N-乙酰己糖胺连接至抗体Fc结构域中的Asn297上。通过单克隆抗体的胰蛋白酶消化的质谱分析而对该种类进行鉴定。具有比非糖基化肽的预期质量较高的质量203Da的种类被观察为具有696.8（这是具有一个HexNAc的肽的质量）的m/z的[M+2H]²⁺离子。这个种类的MS/MS查询（interrogation）揭示了该肽包含连接至单一天冬酰胺残基的己醣胺残基（该肽包括肽（EEQYNSTYR））（图2）。

还在一些商业抗体中以不同水平发现了这个种类（图3）。通过使用酶切（即胰蛋白酶），将肽从各个可商购的抗体产品衍生。将肽进行还原，并且进行烷基化，并通过LC-MS进行分析，其中使用了MS/MS用于肽测序。使用来自肽测序的氨基酸序列以确定肽的一致性。将糖肽观察为相对于非糖基化肽的质量位移。基于G0F（岩藻糖化的，但是没有半乳糖残基的双触角聚糖）、G1F（岩藻糖化的和一个半乳糖残基的双触角聚糖）、G2F（岩藻糖化的和两个半乳糖残基的双触角聚糖）、以及未糖基化的糖肽的丰度，对在不同的可商购的抗体产品中的HexNAc-糖肽的相对丰度进行计算。

这个种类的存在不限于抗体的具体类别，因为它在IgG1和IgG2治疗剂两者中均得以鉴定。

用于分析聚糖种类的程序：

通过使用酶切（即胰蛋白酶），将肽从药品衍生。将肽进行还原，并且进行烷基化，并通过LC-MS进行分析，其中使用了MS/MS用于肽测序。使用来自肽测序的氨基酸序列以确定肽的一致性。将糖肽观察为相对于非糖基化肽的质量位移。

这个数据展示了在糖基化单克隆抗体中N-连接的N-乙酰己糖胺的存在。图2示出了从单克隆抗体衍生的聚糖的片段的荧光色谱图。

扩展和替代方案

尽管已经参考具体说明性实施例而具体地示出并说明了这些方法，但应理解的是可以在不偏离本披露的精神和范围的情况下作出在形式和细节上的不同改变。因此，旨在要求在这些方法的范围和精神之内所提出的所有实施例及其等效物。本披露的方法、***、和测定的权利要求书、说明书以及图表不应被解读为限制所描述的要素的顺序，除非针对那个另有说明。

在本申请中引用的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文以及网页，无论这类文献和类似材料的格式如何，它们都通过引用以其全部内容明确地结合在此。在所结合的文献和类似材料的一个或多个不同于本申请或与本申请矛盾的情况下，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等，以本申请为准。在此所使用的小节标题仅是出于组织性目的并且不应当解释为以任何方式限制所描述的主题。虽然已经结合各种实施例和实例描述了这些方法，并不旨在将这些方法限制于这样的实施例或实例。相反，如将为本领域的普通技术人员所理解的是，这些方法涵盖各种替代方案、修改以及等效物。

Claims

1.一种用于制造糖蛋白制品的方法，所述方法包括

培养细胞以产生一种重组糖蛋白制品；

对在所产生的制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量进行确定；并且

基于该确定，将该糖蛋白制品加工为药物产品。

2.如权利要求1所述的方法，进一步包括将所确定的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量与用于该糖蛋白制品的针对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量而言的一个参比值进行比较。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述确定步骤包括用于对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行鉴定或定量的方法的使用，该方法选自下组，该组由以下各项组成：色谱法、质谱(MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子、及其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其中在生物反应器中培养所述细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括以下中的一个或者多个：配制所述糖蛋白制品；加工所述糖蛋白制品成为药物产品；组合所述糖蛋白制品与第二组分；改变所述制品中所述糖蛋白的浓度；冷冻干燥所述糖蛋白制品；组合所述糖蛋白的第一和第二等分部分以提供第三的较大的等分部分；将所述糖蛋白制品分为较小的等分部分；将所述糖蛋白制品布置在容器中；包装所述糖蛋白制品；关联包含所述糖蛋白制品的容器与标签；将所述糖蛋白制品装运至或移至不同的位置。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括将所述糖蛋白制品布置在容器中，并且所述容器是气密或液密容器。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括以下中的一个或者多个：配制所述糖蛋白制品；加工所述糖蛋白制品成为药物产品；组合所述糖蛋白制品与第二组分；冷冻干燥所述糖蛋白制品。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括配制所述糖蛋白制品。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括加工所述糖蛋白制品成为药物产品。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述加工步骤包括冷冻干燥所述糖蛋白制品。

12.一种用于评估糖蛋白制品的方法，该方法包括：

提供一种糖蛋白制品；

对在该制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量进行确定；并且

可任选地，基于所述确定，作出一个关于该糖蛋白制品的决定。

13.如权利要求12所述的方法，其中该确定步骤包括以下任一项：

对糖蛋白进行分离并且对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行测量；

从一种糖蛋白制品获得一种聚糖制品，并且对在该聚糖制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行测量；

对存在于一种糖蛋白上的聚糖进行切割，并且对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行检测；并且

提供来自一种糖蛋白制品的至少一种肽并且对在该至少一种肽上的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行测量。

14.如权利要求12所述的方法，进一步包括将所确定的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量与用于所述糖蛋白制品的针对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的不存在、存在或量而言的参比值进行比较的一个步骤。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述确定步骤包括一种用于对单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖进行鉴定或定量的方法的使用，该方法选自下组，该组由以下各项组成：色谱法、质谱(MS)法、电泳法、核磁共振(NMR)法、单糖分析、荧光法、UV-VIS吸收、酶法、使用一种检测分子、及其组合。

16.如权利要求12所述的方法，其中该糖蛋白制品是来自在一种用于制造糖蛋白的生物反应器中的一种细胞培养物的一个样品。

17.如权利要求12所述的方法，其中这些提供和确定步骤是随着时间的推移而重复至少一次。

18.如权利要求12所述的方法，进一步包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将该确定步骤的结果进行记录的一个步骤。

19.如权利要求12所述的方法，其中该确定步骤包括进行一种色谱法。

20.如权利要求12所述的方法，其中该确定步骤包括进行一种质谱(MS)法。

21.如权利要求12所述的方法，其中该确定步骤包括进行一种电泳法。

22.如权利要求12所述的方法，其中该确定步骤包括进行一种核磁共振(NMR)法。

23.一种用于评估糖蛋白制品的方法，包括：对存在于一种糖蛋白制品中的一种单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量，由此而评估该糖蛋白制品。

24.如权利要求23所述的方法，进一步包括在一种印刷的或计算机可读取的介质中，将存在于该糖蛋白组合物中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的水平进行记录。

25.如权利要求23所述的方法，进一步包括将所测量的存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的水平与一个参比水平进行比较。

26.如权利要求25所述的方法，其中该参比水平是针对一种包含该糖蛋白的药物制品的一个说明或质量标准。

27.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种色谱法。

28.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种质谱(MS)法。

29.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种核磁共振(NMR)法。

30.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行单糖分析。

31.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种荧光法。

32.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种UV-VIS吸收法。

33.如权利要求23所述的方法，其中对存在于该糖蛋白制品中的单一N-乙酰己糖胺残基组成的N-连接的聚糖的量进行测量包括进行一种酶法。

34.如权利要求1所述的方法，其中所述N-连接的聚糖由单一N-乙酰葡糖胺残基组成。

35.如权利要求1所述的方法，其中所述糖蛋白是抗体。

36.如权利要求1所述的方法，其中所述糖蛋白是治疗性抗体。

37.如权利要求12所述的方法，其中所述N-连接的聚糖由单一N-乙酰葡糖胺残基组成。

38.如权利要求12所述的方法，其中所述糖蛋白是抗体。

39.如权利要求12所述的方法，其中所述糖蛋白是治疗性抗体。

40.如权利要求23所述的方法，其中所述N-连接的聚糖由单一N-乙酰葡糖胺残基组成。

41.如权利要求23所述的方法，其中所述糖蛋白是抗体。

42.如权利要求23所述的方法，其中所述糖蛋白是治疗性抗体。