CN103773725B - 一株产细菌素的耐低温乳酸菌及其应用 - Google Patents
一株产细菌素的耐低温乳酸菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株产细菌素的耐低温乳酸菌及其应用，该菌株的分类命名为Lactococcus？lactisMD-1，已于2012年12月18日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012533。本发明提供的乳酸菌Lactococcus？lactisMD-1生长温度范围介于4℃-24℃之间，最适生长温度为15℃左右，属于严格意义上的低温乳酸菌；在低温条件下具有很强的生长活性和比生长速率，能够产生具有很强抑菌活性的细菌素；乳酸菌Lactococcus？lactisMD-1及其代谢产物应用于食品的低温生物保鲜，为今后食品保鲜技术的应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及微生物与食品保藏领域，尤其涉及的是一株产细菌素的耐低温乳酸菌及其应用。
背景技术
近年来，随着我国食品安全事件的频频发生，食品的保藏及其安全也日益成为一个备受争议的问题。改善由于食品腐败造成的经济损失，降低食品加工的成本，避免病原微生物通过食物链的传播以及满足消费者日益增长的对于即食食品，味道新鲜、营养并富含维生素、最低程度加工和保存的食品的需求已成为当今食品工业的主要挑战。
应用保护剂是增强食品安全的常用措施。对于化学防腐剂，如硝酸盐和亚硝酸盐，虽然已有报道指出其具有抗Listeriasp.特性，但是这些物质对于人类健康存在威胁，在食品中的应用也一直备受消费者的质疑。而将低温乳酸菌及其代谢物用作生物保护剂取代化学防腐剂应用于食品保鲜中是未来食品保鲜技术发展的一大趋势，具有极大的应用潜力。
近年来，大量研究表明细菌素应用于食品保鲜具有许多益处：（1）延长食品货架期；（2）降低食源性病原菌通过食物链传播的风险；（3）改善由于食品腐败造成的经济损失；（4）减少化学防腐剂的使用量；（5）在不影响食品安全的条件下，降低热处理的强度，从而更好的保持食品的营养和维生素成分及其食品的感官特性；（6）利于开发一些新型食品，如低酸，低盐甚至是高水分食品等；（7）可以满足企业和消费者的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株产细菌素的耐低温乳酸菌及其应用。
本发明的技术方案如下：
一株产细菌素的耐低温乳酸菌，其分类命名为LactococcuslactisMD-1，已于2012年12月18日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2012533。
所述的产细菌素的耐低温乳酸菌及其代谢产物应用于食品的低温生物保鲜。
所述食品为肉制品或者果蔬饮料。
本发明提供的乳酸菌LactococcuslactisMD-1生长温度范围介于4℃-24℃之间，最适生长温度为15℃左右，属于严格意义上的低温乳酸菌；在低温条件下具有很强的生长活性和比生长速率，能够产生具有很强抑菌活性的细菌素；乳酸菌LactococcuslactisMD-1及其代谢产物应用于食品的低温生物保鲜，为今后食品保鲜技术的应用奠定了基础。
附图说明
图1为菌株MD-1对指示菌的抑菌效果；其中图a指示菌为枯草芽孢杆菌，图b指示菌为大肠杆菌，图c指示菌为金黄葡萄球菌，图d指示菌为李斯特菌。
图2为基于16SrRNA序列同源性的MD-1***发育树。
图3为菌株MD-1菌落与细胞形态；其中图a为菌株MD-1的菌落形态，图b为菌株MD-1的细胞形态。
图4为MD-1菌株生长曲线及细菌素产量。
图5为温度对细菌素活性的影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
1、实验材料
1.1样品采集
菌株MD-1分离自野生冷水鱼丁鱥（Tincatinca）的肠道内容物，冷水鱼样品采集自新疆阿勒泰地区额尔齐斯河流域冷水鱼。
1.2指示菌
大肠杆菌（Escherichiacoli）、李斯特菌（Listeriamonocytogenes）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为实验室保存菌株，金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）CICC21600购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.3培养基
MRS培养基：蛋白陈10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温801mL，MgSO4·7H2O0.588g，MnSO4·H2O0.25g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH6.2-6.4，121℃高压蒸汽灭菌20min。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2、实验方法及结果
2.1乳酸菌的分离与筛选
取1克鱼肠道内容物样品，用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6四个稀释度，每个稀释度吸取200μL均匀涂布于MRS固体平板表面，每个稀释度做两个平行，置于16℃培养3-5d，挑取单菌落并连续3次划线分离，得到分离菌株。将分离纯培养物进行接触酶实验和革兰氏染色，挑选接触酶阴性和革兰氏阳性的菌株，并用20%甘油保存于-80℃备用。
从冷水鱼肠道中共分离得到78株纯培养物，经初步鉴定，得到45株疑似乳酸菌。
2.2产细菌素乳酸菌的筛选
2.2.1乳酸菌发酵上清液制备
将从鱼肠道中分离得到的45株疑似乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，16℃静置培养48h，离心（4℃，10000×g，10min）得到上清液，置于4℃冰箱待用。
2.2.2产细菌素乳酸菌的初筛
指示菌稀释液的制备：将大肠杆菌、李斯特菌、枯草芽孢杆菌和金黄葡萄球菌四种指示菌接种于LB液体培养基，37℃培养24h，并进行梯度稀释，做成指示菌稀释液（浓度2.0×108CFU／mL）。
采用牛津杯法：分别吸取100μL指示菌稀释液（活菌数为2.0×108CFU／mL）均匀涂布于LB固体培养基上，再在每个平皿上等间距放置4个牛津杯，向每个牛津杯中加入制备好的保存于4℃冰箱中的发酵上清液200μL，MRS空白培养基作为对照，于4℃冰箱中预扩散5h，后置于37℃培养，18-24h后观察实验结果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌株做三个平行实验，求均值。挑选出牛津杯周围具有较大抑菌圈及发酵产物具有广谱抗性的菌株进行下一步试验。
通过牛津杯法对上述45株乳酸菌菌株的发酵上清液进行抑菌活性的初步筛选，试验结果显示，11株乳酸菌对指示菌具有不同程度的抑制作用，尤其是菌株MD-1对四种指示菌均有明显抑菌效果（如图1）。菌株MD-1对四种指示菌的初筛结果如表1所示。
表1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛结果（抑菌圈直径单位：mm）
2.2.3产细菌素乳酸菌的复筛
（1）酸及酸性末端产物作用的检测与排除
为检测和排除酸及酸性末端产物的干扰，将初步筛选得到的具有明显抑菌圈的11株乳酸菌接种于MRS培养基中，培养48h，获取其发酵上清液并进行抑菌实验。用无菌的1mol/LNaOH调上清液pH值至6.5，不做任何处理的上清液作为对照，分别检测其抑菌活性。
（2）过氧化氢作用的检测与排除
将过氧化氢酶溶解在50mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）中配成母液，加入到排除酸上清液中使过氧化氢酶的终浓度为5mg/mL，在37℃水浴中温育2h后取出，检测过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌活性。未做处理的上清液和加入过氧化氢酶的空白培养基做对照。
由于乳酸菌在代谢过程中产生的酸、过氧化氢等产物对食源性的致病菌或腐败菌的生长也有一定的抑制作用，为进一步确定菌株MD-1发酵上清液中细菌素组分的存在，对其发酵上清液进行排除酸和过氧化氢的干扰。表2为排除酸及过氧化氢作用的抑菌试验结果。表2显示，菌株MD-1的发酵上清液经排除酸干扰（pH值调至6.5）后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和李斯特菌的抑菌圈活性均有不同程度的降低，但排除酸干扰后的上清液再加入过氧化氢酶处理，发现其对上述四种指示菌仍具有明显抑菌效果，试验结果表明菌株MD-1的抑菌组分中除酸和过氧化氢外，可能有细菌素等抑菌肽或其他组分存在。
表2排除酸及过氧化氢作用的抑菌试验结果（单位：mm）
注：表内数据为抑菌圈直径，数值为三次试验的平均值。
2.2.4细菌素蛋白质性质的检测
乳酸菌细菌素（BacteriocinsofLAB）是指乳酸菌在代谢过程中由核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽。为进一步确定菌株MD-1发酵上清液中抑菌组分的蛋白质性质，用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶对筛选出的菌株发酵液进行酶解实验。
首先调发酵上清液至三种酶的最适作用pH值，各取3mL发酵液分别加入三种酶，使酶终浓度1mg/mL，37℃水浴2h，70℃加热20min灭酶，将处理液pH调回6.5，牛津杯法检测抑菌活性。未做处理的上清液和加入酶的空白培养基做对照。
表3酶对细菌素活性的影响
注：抑菌活性以抑菌圈的直径表示，+有抑菌活性，-没有抑菌活性。
表3为酶对细菌素活性的影响，从表3可以看出，菌株MD-1的发酵上清液经蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶排除处理后，抑菌活性消失，表明菌株MD-1的抑菌物质对蛋白酶较敏感，初步确定菌株MD-1所产抑菌物质为蛋白质性质的某种细菌素。
2.3菌株最适生长温度测定
将菌株的液体培养液按0.5mL的接入量接入装有5mL液体富集培养基的试管中，分别置于4℃、10℃、16℃、24℃、30℃、37℃六个温度下培养，每个温度2个平行，培养24h后420nm测OD值。
菌株生长温度实验结果显示，菌株MD-1的生长温度范围在4℃-24℃，最适生长温度为15℃左右。根据Morita的定义，菌株MD-1属于严格意义上的低温乳酸菌。
2.4耐低温乳酸菌16SrDNA序列分析
提取耐低温乳酸菌MD-1的DNA，并用细菌16SrRNA基因通用引物27F和1492R（27f：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）进行PCR扩增。PCR的反应体系：10×扩增缓冲液5μL，dNTP混合物（终浓度200umol）1μL，TaqDNA聚合酶（1U）0.2μL，DNA膜板（30-50ng）5.0μL，引物（0.4umol）各1μL，2mmol/LMgCl24.0μL，ddH2O补足至50μL。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸7min。反应在Bio-RadiCyclerThermalCycler（Bio-RadLaboratories，Hercules，CA）仪器上进行。扩增产物送交上海生工生物科技有限公司采用ABI377DNA自动测序仪进行测序。测序结果提交到GenBank数据库。
菌株MD-1的16SrRNA基因序列提交NCBI到GenBank数据库，利用BLAST搜索同源性较高的序列，用CLUSTALX1.81和MEGA4.0软件进行序列的比对分析并建立***发育树（图2所示）。可知菌株MD-1隶属于乳球菌属（Lactococcus），与已知种Lactococcuslactis***发育关系最接近，初步确定该菌为LactococcuslactisMD-1。
2.5菌株MD-1的生长特性与生理生化鉴定
2.5.1菌株MD-1的菌落生长特性及形态特征
菌株MD-1生长周期快，呈现约为1mm的白色菌落（图3）、表面湿润光滑、边缘整齐、凸起。菌株革兰氏染色显阳性，接触酶阴性，细胞形态呈球状，无鞭毛，不运动。
2.5.2菌株MD-1生理生化鉴定
生理生化特性的分析主要参照《乳酸菌分类鉴定及实验方法》和《常见细菌***鉴定手册》的方法进行。菌株MD-1的生理生化试验结果如表4所示。
表4菌株MD-1生理生化实验
注：+阳性结果，-阴性结果
2.6菌株生长曲线及细菌素产量测定
产细菌素菌株以3%的接种量接种于100mLMRS培养基中于10℃培养箱中培养，每隔3h取样测OD600、pH及抑菌活性。
测定菌株MD-1生长曲线及细菌素产量（见图4），结果显示，菌株在稳定期时，抑菌活性达到最大，并且保持相对稳定。由图4可以看出，发酵上清液的pH由6.14降到4.34，菌株培养液的OD600值从0.054增至1.679。
2.7细菌素的耐热性
将细菌素发酵液在4℃、30℃、37℃、45℃、60℃、80℃、100℃水浴锅中分别放置培养30min、60min、90min，以及121℃、20min处理，冰浴处理，以4℃过夜备用的细菌素发酵液做对照，以李斯特菌作为指示菌，测定其抑菌活性（结果见图5）。
由图5可知菌株MD-1的含抑菌物质的发酵上清液在热处理后都有一定的抑菌活性，观察4-100℃范围内的热处理，发现上清液的抑菌效果改变并不明显，上清液在冰浴处理后抑菌活性显示很强，在121℃高压处理20min后，上清液不显示抑菌活性。可见菌株MD-1产生的细菌素有一定的耐热性，其耐高温特性、较强的低温活性，使其在食品低温保鲜中有很好的应用前景。
2.8pH、表面活性剂对细菌素抑菌活性的影响
用无菌1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH将细菌素发酵液的pH调至2.0-12.0，以pH6.0的细菌素发酵液做对照，在30℃放置培养2h，再以1mol/L的HCl和1mol/L的NaoH将pH调至6.0，测定抑菌活性。细菌素发酵液分别加1%（W/V）的化学试剂，例如吐温80、尿素、SDS、EDTA、TritonX-100、NaCl在37℃培养4h，以未加1%的化学试剂的发酵液和加1%的化学试剂的灭菌空培养基做对照，以李斯特菌作为指示菌，测定抑菌活性。
表5pH、酶、表面活性剂对细菌素活性的影响
注：抑菌效果以抑菌圈的直径表示：－，≤8mm（没有抑菌效果）；+，8～10mm；++，10～15mm；+++，15～20mm；++++，>20mm；牛津杯直径为8mm。
表5为pH、酶、表面活性剂对细菌素活性的影响测定pH值对细菌素发酵上清液的抑菌活性的影响。由表5的可以看出，细菌素发酵液的pH值影响其对指示菌的抑菌活性，将细菌素发酵液的pH调至3～8之间，30℃放置培养2h后再用1mol/L的HCl和1mol/L的NaoH将pH调回至6.0，测定抑菌活性，发现对指示菌均有抑制作用，尤其是调节上清液pH介于4.0-6.0之间，对指示菌的抑制效果最为显著；而pH调至极酸（pH2.0）和碱性条件（pH9-12）时，发现抑菌活性降低甚至消失。上述实验结果表明，菌株MD-1所产细菌素等抑菌肽组分在酸性条件下（pH值介于3-8）抑菌特性较稳定，但在极酸或碱性条件下，细菌素对于指示菌的抑菌活性完全消失，可能是鉴于细菌素组分的蛋白质特性，在极酸或碱性条件下由于蛋白质组分的变性而导致其抑菌活性的丧失。结果表明，菌株MD-1所产细菌素可应用于酸性、中性以及弱碱性环境中的食品保鲜领域中。酶对发酵上清液抑菌活性的影响实验，经蛋白酶处理后的发酵上清液抑菌活性完全消失，结果表明，菌株MD-1上清液中的抑菌组分对蛋白酶较为敏感，同时也进一步证实了上清液中抑菌活性成分的蛋白质性质。菌株MD-1发酵上清液经SDS、EDTA、TritonX-100处理后，发现抑菌效果较显著；而经Tween80、NaCl、尿素（Urea）处理后抑菌活性消失，试验结果表明，不同表面活性剂对于菌株MD-1的抑菌活性的影响差异较大。
实施例2产细菌素耐低温乳酸菌LactococcuslactisMD-1在肉制品保鲜中的应用
屠宰后的新鲜羊肉置于70%酒精浸泡30min进行表面消毒，取出沥干酒精后，置于紫外灯下15min表面灭菌处理，迅速置于4℃冰箱冷却8-10h，以无菌操作将肉样切分成小块，每块约100g。将培养至对数期的菌株MD-1的菌悬液进行梯度稀释，制成浓度约为105-106CFU/ml的稀释液。将肉样品置于制备好的菌株MD-1的稀释液中浸泡10min，取出沥去多余溶液后，置于无菌的复合材料制成的真空包装袋内，对照组直接将未浸泡菌液的肉样品用真空包装袋包装，置于4℃条件下冷藏，每隔24h取出两份平行样品及对照样品检测其细菌群落总数变化情况。
试验结果显示，对照组的菌落总数在保藏期间一直呈现显著增长态势，至第6天时菌落总数约为6×105CFU/g，已超出国家标准（GB/T9961-2008）规定的冷鲜肉菌落总数允许范围（<=5.0×105CFU/g）；而经LactococcuslactisMD-1菌悬液稀释液浸泡处理的样品在4℃条件下冷藏，可使肉样的货架期延长至18d。
实施例3菌株LactococcuslactisMD-1所产细菌素在果蔬汁饮料中的应用
酸土芽孢杆菌是一种耐酸且耐热的产孢子菌，最适于在25～60℃、pH2.5～6.0的环境下生长、繁殖，广泛分布于花园、森林土壤以及生产饮料的用水中。因此，酸土芽孢杆菌很容易被带入果汁及果汁类饮料的生产加工过程中，引起果汁及果汁类饮料的酸败引起果汁类产品的腐败。
将耐低温乳球菌LactococcuslactisMD-1发酵上清液接种到购买的不加任何防腐剂的神内食品有限公司生产的神内胡萝卜汁和蟠桃汁中，每种果汁分别分装于八组试管内，其中七组为试验组，按10%的体积比添加LactococcuslactisMD-1发酵上清液，对照组不添加发酵上清液的果蔬汁。再将100μl的酸土芽孢杆菌孢子悬浮液接种于每一试管内，混合均匀，巴氏灭菌，置于室温下保温储存。在贮存期间，每天从每一试管内取样50μl，进行细菌菌落总数的统计。试验结果发现，5d后添加乳酸菌LactococcuslactisMD-1发酵上清液的实验组比对照组的菌落总数减少1个数量级，乳酸菌LactococcuslactisMD-1在一定程度上抑制酸土芽孢杆菌孢子的生长。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一株产细菌素的耐低温乳酸菌，其特征是，保藏编号为CCTCCNO：M2012533。
2.根据权利要求1所述的产细菌素的耐低温乳酸菌的应用，其特征是，所述的产细菌素的耐低温乳酸菌及其代谢产物应用于食品的低温生物保鲜。
3.根据权利要求2所述的耐低温乳酸菌的应用，其特征是，所述食品为肉制品或者果蔬饮料。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160330 Termination date: 20170121 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |