CN108192841B - 一种产细菌素的嗜冷菌、细菌素及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术、细菌性传染病的治疗与医药领域，更具体地，涉及一种产细菌素的嗜冷菌、该嗜冷菌的细菌素提取方法和细菌素及应用。该嗜冷菌的保藏编号为CCTCC NO：M2017480。本发明的嗜冷菌所产细菌素具有明显的抗菌活性，抑菌谱较宽，热稳定性较好，耐酸碱能力强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术、细菌性传染病的治疗与医药领域，更具体地， 涉及一种产细菌素的嗜冷菌、该嗜冷菌的细菌素提取方法和细菌素及应用。
背景技术
由于抗生素的发现及抗菌药物的研制成功，人类在治疗传染病方面取 得了可喜的成绩，许多过去难以治愈的人和动物的传染病都得到了很好的 治疗，但是近年来，由于抗菌药物的广泛使用，基层医院和兽医人员的业 务水平和专业素养参差不齐，尤其是在畜禽养殖业中滥用抗菌药物现象日 趋严重，致使目前常见致病菌对各种抗菌药物的耐药性问题愈发严重，常 见的多数致病菌均出现了程度不同的多重耐药性，并且已经出现了无药可 用的超级细菌。目前新药的研发速度已经跟不上细菌产生耐药性的速度。 鉴于此，广大研究者们正在努力寻找抗菌药物替代品。
细菌素是一些细菌在其新陈代谢过程中由其细胞内的核蛋白体合成并 分泌到细菌细胞外的具有抗菌活性的蛋白质或肽类物质，可以抑制或妨碍 某些微生物的生长且不易产生抗药性，可以被一些酶类降解，对人体或动 物体不产生致病作用，具有替代抗菌药物的潜力，细菌素不同于抗生素， 属于蛋白质类物质。
发明内容
本发明的目的是提供一种产细菌素的嗜冷菌、细菌素及其提取方法和 应用。本发明的嗜冷菌所产细菌素具有明显的抗菌活性，抑菌谱较宽，热 稳定性较好，耐酸碱能力强。
本发明的第一方面提供一种产细菌素的嗜冷菌(Psychrophile.sp)，简称 为SLJ，其保藏编号为CCTCC NO：M2017480。该菌种的保藏信息如下： 保藏日期：2017年9月8日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)； 保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M2017480； 分类命名：嗜冷菌(Psychrophile.sp)。该嗜冷菌具有SEQ ID NO：1所示的 基因序列。
本发明的发明人在一块培养金黄色葡萄球菌的营养琼脂平板上偶然发 现污染了一种灰白色菌落的细菌，该菌落周围的金黄色葡萄球菌都没有长 出来(如图1所示)。对该菌进行分离培养及培养特性观察、革兰染色形态 观察(如图4所示)、生化试验、初步的抑菌试验(如图5A和图5B所示)， 制备DNA模板，进行16SrRNA基因PCR扩增(如图6所示，目标产物的 长度为1400bp)、序列测定、同源性分析。结果显示：该菌为革兰阳性链状 杆菌，它能发酵葡萄糖、蔗糖和麦芽糖只产酸，不能利用乳糖，吲哚形成 和甲基红试验和VP试验均为阴性，同源性分析表明：该菌与GenBank中 登录号为JX196613.1嗜冷菌同源性高达99.9％，因此，该菌为嗜冷菌。初 步的体外抑菌试验结果显示：该株嗜冷菌的细菌素具有抑制多种细菌的生 长的作用。
本发明的第二方面提供上述的嗜冷菌的细菌素提取方法，该方法包括：
细菌培养：挑取该菌单个菌落接种于培养基内，37℃震荡培养，将培 养液离心，除去菌体，保留上清液；
酸沉淀：将所述上清液的pH值调至1.5-2.5，冷却沉淀，离心弃去上清， 沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提细菌素。
酸沉淀步骤中，优选用浓盐酸调整上清液的pH值。
根据本发明一种具体实施方式，用接种环挑取该菌单个菌落接种于LB 液体培养基内，37℃震荡培养48h，将培养液3500r/min，4℃，离心10min， 除去该菌菌体，保留上清即为该菌的发酵上清液。采用酸沉淀法制取该菌 粗提细菌素。用浓盐酸将上述发酵上清液的pH值调至2.0，4℃过夜沉淀， 10000r/min，4℃，离心20min，弃去上清，沉淀用pH为6.5的磷酸盐缓冲 液溶解，即为粗提细菌素，-20℃保存备用。
本发明的第三方面提供上述的细菌素提取方法得到的细菌素。
本发明的第四方面提供上述嗜冷菌和/或上述细菌素在制备抑菌剂中的 应用。
所述抑菌剂能够抑制革兰阳性菌和革兰阴性菌。具体地，可抑制仔猪 副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、鹅金黄色葡萄球菌、鸭奇异变形杆菌、 鹅奇异变形杆菌1、鹅奇异变形杆菌2、鸡白色葡萄球菌、鸡大肠杆菌、鸡 致病性大肠杆菌1、鸡致病性大肠杆菌2、鹅沙门氏菌1、仔猪黄痢大肠杆 菌1、仔猪黄痢大肠杆菌1、鸽沙门菌、谷氨酸棒杆菌、假单胞菌、鹅粪肠 球菌。
实验证明，本发明中的细菌本身无毒，所产细菌素具有明显的抗菌活 性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等抑制效果较好，抑菌谱较宽，热稳定 性较好，耐酸碱能力强，可以用于饲料添加剂、食品抑菌剂等，具有进一 步开发利用的前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的 上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1示出本发明嗜冷菌的菌落周围的金黄色葡萄球菌的生长均被抑制。 如图中箭头所指，该菌的菌落周围的金黄色葡萄球菌的生长均被抑制。
图2A示出本发明嗜冷菌在普通营养琼脂平板上、图2B示出本发明嗜 冷菌在鸡血琼脂平板的生长表现。
图3示出本发明嗜冷菌在LB液体培养基中37℃震荡培养48h的生长 表现。
图4示出本发明嗜冷菌的革兰染色结果。
图5A和图5B示出本发明嗜冷菌粗提细菌素部分抑菌结果。其中，图 5A示出本发明嗜冷菌粗提细菌素对枯草芽胞杆菌的抑菌效果。图5B示出 本发明嗜冷菌粗提细菌素对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。
图6示出本发明嗜冷菌PCR扩增结果。其中，M为DLMarker2000， SLJ为该菌PCR产物电泳图。
图7A和图7B示出本发明嗜冷菌SLJ与嗜冷菌其他9株细菌16SrRNA 基因同源性比对图及基因进化树。
用于专利程序的微生物保藏：
保藏日期：2017年9月8日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学；
保藏编号：CCTCC NO：M2017480；
分类命名：嗜冷菌(Psychrophile.sp)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明 的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这 里阐述的实施方式所限制。
菌种验证
本发明是从微生物实验室中偶然发现的。该菌在各种培养基上的生长 表现如表1所示：在却普曼琼脂和麦康凯琼脂上均不生长。在普通营养琼 脂平板上呈灰白色近似圆形不透明且扁平粗糙干燥大菌落或中等大小菌落(如图2A所示)。在鸡血琼脂上呈不溶血灰白色近似圆形，边缘锯齿状， 不透明且扁平干燥粗糙中等大小菌落(如图2B所示)。在LB液体中表面 有菌膜生成，培养液上层稍浑浊，下层稍透明，震荡后底部有絮状沉淀(如 图3所示)。
表1该菌在各种培养基上的生长表现
该菌16SrRNA序列PCR扩增琼脂糖凝胶电泳
采用细菌通用引物为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO：2)，其下游引物：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO： 3)，合成由通用生物***(安徽)有限公司完成。
反应体系：DNA模板5μL、Taq聚合酶(5U/μL)0.25μL、10×Taq buffer 5μL、dNTPs(2.5μmol/μL)4.0μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL， 用超纯水补充至50μL。
PCR反应条件：95℃，变性5min；退火60℃，退火30s；延伸在72℃ 条件下进行2min，共30个循环；最后72℃延伸5min。
将PCR产物使用1％琼脂糖电泳，电压110V，时间30min，在凝胶成 像***观察、拍照。结果如图6所示。
该菌PCR终产物序列测定及同源性分析
测序由安徽通用生物***有限公司完成。将测序结果进行同源性分析。
该菌测序结果为SEQ ID NO：1所示，在NCBI中提交比对，该菌与嗜 冷菌JX196613.1同源性达99.9％。从嗜冷菌中挑选9株细菌，利用DNASTAR 软件将各菌株序列转化成软件能够识别的形式，用程序求各菌株序列的遗 传距离，构建与该嗜冷菌SLJ的基因同源性对比图及基因***进化树(如 图7A和图7B所示)。可以看出：该菌与从基因Genbank中所选的9株嗜 冷菌的同源性都在99％以上。
细菌素提取
本发明的嗜冷菌对营养要求不高，易于培养。同时，该菌的细菌素提 取步骤不复杂。用接种环挑取该菌单个菌落接种于LB液体培养基内，37℃ 震荡培养48h，将培养液3500r/min，4℃，离心10min，除去该菌菌体，保 留上清即为该菌的发酵上清液。采用酸沉淀法制取该菌粗提细菌素。用36％ 浓盐酸将上述发酵上清液的pH值调至2.0，4℃过夜沉淀，10000r/min，4℃， 离心20min，弃去上清，沉淀用少许pH为6.5的磷酸盐缓冲液溶解，即为粗提细菌素，-20℃保存备用。
抑菌效果验证
本发明嗜冷菌粗制细菌素的抑菌试验结果表明：该菌粗提细菌素抑菌 效果好。
该株嗜冷菌的粗制细菌素具有较宽的抗菌谱，如表2所示：可以抑制 金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、肠球菌、鸭、鹅奇异变形杆菌、鸡、鸽、 鹅沙门菌及鸡大肠杆菌等细菌的生长繁殖，即对革兰阳性菌和大肠杆菌等 革兰阴性菌都有较强的抑菌作用，具有进一步开发利用的前景，有很好的 推广应用价值。
表2该菌粗制细菌素的抑菌试验结果
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽 性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范 围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更 都是显而易见的。
序列表
<110> 安徽科技学院
<120> 一种产细菌素的嗜冷菌、细菌素及其提取方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1400
<212> DNA
<213> 嗜冷菌(Psychrophile)
<400> 1
gccttcccga aggttaggct atccacttct ggtgcaatca actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcattc tgatccgcga ttactagcga 120
ttcctacttc atggagtcga gttgcagact ccaatctgga ctacgatagg ctttttgaga 180
ttcgcatcac atcgctgtgt agctgccctc tgtacctacc attgtagcac gtgtgtagcc 240
ctggtcgtaa gggccatgat gacttgacgt cgtccccgcc ttcctccagt ttgtcactgg 300
cagtatcctt agagttcccg gcttaacccg ctggtaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360
tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtat 420
tctaattccc gaaggcactc ccgcatctct gcaggattct agatatgtca agaccaggta 480
aggttcttcg cgttgcatcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtctactt attgcgttag 600
ctgcgtcact aagtcctcaa gggacccaac gactagtaga catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctaccca cgctttcgaa cctcagtgtc aatatgatgc 720
cagaaggctg ccttcgccat cggtattcct ccagatctct acgcatttca ccgctacacc 780
tggaattcta ccttcctctc acctattcta gcctaacagt atcagatgca gttcccaggt 840
taagcccggg gatttcacat ctgacttatc aagccaccta cgctcgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 960
gcttattctg cagctaatgt catcgtccat gggtattaac catggagtct tcttcactgc 1020
ttaaagtgct ttacaaccaa aaggccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcagggtt 1080
gcccccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtccgggc cgtgtctcag 1140
tcccggtgtg gctgatcatc ctctcagacc agctacagat cgtcgccatg gtaggccttt 1200
accccaccat ctagctaatc cgacttaggc tcatctaata gcgagagcaa caagttgccc 1260
cctttctccc gtaggtcgta tgcggtatta attcgagttt ccccgagcta tcccccacta 1320
ctaggtagat tcctaagtat tactcacccg tccgccgctc gacgcctgat agcaagctat 1380
catcgtttcc gctcgactgc 1400
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22
Claims (3)
1.一种产细菌素的嗜冷菌(Psychrophile.sp)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2017480，所述嗜冷菌的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的嗜冷菌在产细菌素中的应用。
3.权利要求2所述的嗜冷菌在产细菌素中的应用，其特征在于，所述细菌素的提取过程包括：
细菌培养：挑取该菌单个菌落接种于培养基内，37℃震荡培养，将培养液离心，除去菌体，保留上清液；
酸沉淀：将所述上清液的pH值用浓盐酸调整调至1.5-2.5，冷却沉淀，离心弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，得到粗提细菌素。
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