CN103765194A - 目标粒子的检测方法 - Google Patents

Abstract

该目标粒子的检测方法中，(a)调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有前述发光探针的前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体的工序；(b)在前述工序(a)之后，从前述溶液中通过固液分离处理回收前述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；(c)通过扫描分子计数法算出前述试样溶液中存在的前述复合体的分子数；前述分离回收用粒子与由前述目标粒子和前述发光探针形成的结合体结合。

Description

目标粒子的检测方法

技术领域

本发明涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光学***等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学***求出在试样溶液中分散并随机运动、且与基于固液分离处理的分离回收用粒子结合后的粒子的浓度的方法。

本申请基于2011年8月30日在日本提交的日本特愿2011-187600号主张优先权，本文援引其内容。

背景技术

随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学***和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等的分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。提出有例如，荧光相关光谱分析(Fluorescence CorrelationSpectroscopy：FCS。例如，参见专利文献1～3、非专利文献1～3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学***和光子计数技术，测定来自在试样溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积。)内出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度。然后基于由测定的荧光强度的自相关函数的值确定的、微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值，能够取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息，或者检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。此外，提出有利用荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如，专利文献4、非专利文献4)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如，专利文献5)，与FCS同样地，生成检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图。并且，通过对该直方图的分布拟合统计学公式而算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和滞留于共焦体积内的分子的个数的平均值，根据这些信息，推测分子的结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献6、7中提出了：基于使用共聚焦显微镜的光学***测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献8中提出了一种信号运算处理技术，其用于：使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上的荧光微粒的存在。

特别是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学***和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十μL左右),测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此，特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够成为低廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开2005-098876号公报

专利文献2:日本特开2008-292371号公报

专利文献3:日本特开2009-281831号公报

专利文献4:日本专利第4023523号公报

专利文献5：国际公开第2008/080417号

专利文献6:日本特开2007-20565号公报

专利文献7:日本特开2008-116440号公报

专利文献8:日本特开平4-337446号公报

非专利文献

非专利文献1：金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431～1438页。

非专利文献2：Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy、R.Rigler编、Springer、柏林、2000年、第204～224页。

非专利文献3：加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6巻、第2号、第271～277页。

非特許文献4:P.Kask、其他3名(K.Palo,D.Ullmann,K.Gall)、美国《国家科学院院刊》(PNAS)、1999年、第96卷、第13756～13761页。

发明内容

发明要解决的问题

上述的FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理算出所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在试样溶液中的微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度适合调制成：在平衡状态下在秒数量级长度的一次测量时间中有能够统计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内；优选调制成在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等(典型地，共焦体积的体积为1fL左右，所以荧光分子等的浓度优选为1nM左右或其以上。)。换言之，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅地低于能够统计学处理的程度时(例如，大幅地低于1nM时)，产生测量时间内只有稀少的观测对象物进入微小区域内的状态，在荧光强度的测量结果中长期包括着观测对象物在微小区域内完全不存在的状态，并且显著的荧光强度的观测量变少，所以通过如上述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。

专利文献6、7中所述的、使用共聚焦显微镜的光学***的荧光性物质的检测方法中公开有：不进行如上述的涉及荧光强度波动的统计学处理，根据数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，判断试样中的观测对象的荧光分子等的有无，而得到显著强度的荧光信号的频率与试样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献7中，提出了产生搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，即便在这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地进入微小区域内的荧光分子等的存在，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为，并没有实现例如：粒子的计数、定量地算出粒子的浓度或数密度。此外，专利文献8中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒的存在的技术，而不是用于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等的粒子，即不是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术，所以并没有定量地算出在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度。另外,专利文献8的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程，因此可以认为,检测所需要的试样量远大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技术的情况，并且对实施者要求复杂的高难度的操作技术。

另一方面，使用光分析技术检测目标粒子的情况下，通常将目标粒子用发光探针标记，将与该目标粒子结合的发光探针发出的光作为指标间接地进行检测。该情况下，如果试样溶液中存在不与目标粒子结合的游离的发光探针，则不仅检测到由目标粒子与发光探针的结合体的发出的光还检测到由游离的发光探针的光；结果，存在目标粒子的检测精度降低的问题。

因此，本发明的目的在于提供一种检测方法，其不包含如FCS、FIDA、PCH等光分析技术中进行的统计学处理，因此，对于观测对象粒子的浓度或数密度低于上述的光分析技术中处理水平的试样溶液中的观测对象粒子的状态或特性也能够检测，根据该新型的光分析技术，抑制由游离的发光探针导致的影响并且高精度地检测使用发光探针标记后的目标粒子。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述问题进行了深入的研究，结果发现，对于在试样溶液中分散并随机运动的粒子，在以由与该粒子结合的发光探针发出的光作为指标间接地进行检测的情况下，通过使用扫描分子计数法进行结合有发光探针的粒子的检测，即便试样溶液中的观测对象粒子的浓度非常低时，也能够灵敏度良好地检测结合有发光探针的粒子。进而发现，使被发光探针标记的目标粒子与分离回收用粒子结合之后通过固液分离处理进行回收，通过扫描分子计数法检测所回收的分离回收用粒子，对由目标粒子、发光探针和分离回收用粒子形成的复合体的分子数进行计数，由此能够高精度地检测目标粒子，至此完成本发明。

此处，扫描分子计数法是日本特愿2010-044714中由本申请的申请人提出的新型光分析技术。

即，本发明提供以下的目标粒子的检测方法。

(1)一种目标粒子的检测方法，其特征在于，其为检测在溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有：

(a)调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有前述发光探针的前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体的工序；

(b)在前述工序(a)之后，从前述溶液中通过固液分离处理回收前述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；和

(c)算出前述工序(b)中调制的试样溶液中存在的前述复合体的分子数的工序；

前述分离回收用粒子与由前述目标粒子和前述发光探针形成的结合体结合，如下进行前述工序(c)的前述复合体的分子数的计数：

使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学***，移动前述光学***的光检测区域的位置的工序；

一边在前述试样溶液内移动前述光学***的光检测区域的位置，一边检测由该光检测区域中的前述复合体发出的光的工序；

由前述检测到的光逐个检测来自每个复合体的光信号而逐个检测复合体的工序；

对前述逐个检测到的复合体的个数进行计数而计数前述光检测区域的位置的移动中检测到的前述目标粒子的个数的工序。

(2)根据前述(1)所述的目标粒子的检测方法，前述分离回收用粒子在前述试样溶液中的沉降速度为1×10^-6m/s以下。

(3)根据前述(1)或(2)所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置沿着第二路径移动，所述第二路径的位置沿着第一路径移动。

(4)根据前述(3)所述的目标粒子的检测方法，前述第一路径以及第二路径为循环路径；沿着前述第二路径的前述光检测区域的位置的移动周期短于沿着前述第一路径的前述第二路径的位置的移动周期。

(5)根据前述(3)或(4)所述的目标粒子的检测方法，前述光检测区域的位置的移动周期τ1、前述第二路径的位置的移动速度v2、和前述光检测区域的直径d满足：

v2·τ1＞d。

(6)根据前述(3)～(5)的任一项所述的目标粒子的检测方法，通过改变前述光学***的光路而使前述光检测区域的位置沿着前述第二路径移动；通过移动前述试样溶液的位置而使前述试样溶液内的前述第二路径的位置沿着前述第一路径移动。

(7)根据前述(3)～(6)的任一项所述的目标粒子的检测方法，前述第二路径为圆形或椭圆形，前述第一路径为圆形、椭圆形或直线。

(8)根据前述(1)～(7)的任一项所述的目标粒子的检测方法，在前述移动光检测区域的位置的工序中，前述光检测区域的位置以比前述复合体的扩散移动速度更快的速度移动。

(9)根据前述(1)～(8)的任一项所述的目标粒子的检测方法，在由前述检测到的光逐个检测来自每个复合体的光信号而逐个检测复合体的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状，检测到一个复合体进入了前述光检测区域。

(10)根据前述(1)～(9)的任一项所述的目标粒子的检测方法，前述分离回收用粒子为磁性粒子。

发明的效果

本发明的目标粒子的检测方法中应用的扫描分子计数法不进行算出荧光强度的波动这样的统计学处理。因此，通过本发明的目标粒子的检测方法，即便试样中仅极微量地存在作为解析对象的目标粒子时，也能够检测试样中的该目标粒子。进而，本发明的目标粒子的检测方法中，使用分离回收用粒子，从结合有目标粒子的发光探针中分离去除不与目标粒子结合的游离的发光探针之后，通过扫描分子计数法进行检测。因此，由游离的发光探针发出的光的检测被有效地抑制，能够高精度地检测目标粒子。

附图说明

图1A是用于扫描分子计数法的光分析装置的内部结构的示意图。

图1B是共焦体积(共聚焦显微镜的观察区域)的示意图。

图1C是改变镜7的方向，在试样溶液内部移动光检测区域的位置的机构的示意图。

图1D是移动微孔板的水平方向位置而移动试样溶液的位置的机构的示意图。

图2A是说明基于用于扫描分子计数法的光分析技术的光检测原理的示意图。

图2B是用扫描分子计数法测量的光强度的时间变化的示意图。

图2C是说明通过改变本实施方式的光学***的光路而实现的、光检测区域的位置沿着扫描轨迹(第二路径)移动的方式的图。

图2D是说明试样溶液的位置的移动(第二路径的位置沿着第一路径移动)的方式的图。

图2E是说明试样溶液的位置的移动、与光检测区域的位置沿着扫描轨迹移动的关系的图。

图3A是观测对象粒子一边进行布朗运动一边横穿光检测区域时的示意图。

图3B是表示图3A的示意图中的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。

图4A是以快于观测对象粒子的扩散移动速度的速度移动试样溶液内的光检测区域的位置、从而观测对象粒子横穿光检测区域时的示意图。

图4B是表示图4A的示意图中的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图。

图5是以流程图的形式显示根据扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子的计数的处理次序的图。

图6A为表示通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化的例子的图的一例。

图6B是说明在根据通过扫描分子计数法测量的光子计数(光强度)的时间变化进行粒子计数的处理次序中的、检测信号的信号处理工序的例子的图。

图7表示通过扫描分子计数法测量的光子计数数据的实测例(柱状图)、和将数据平滑化后获得的曲线(虚线)、和峰存在区域中拟合的高斯函数(实线)。图中，带有“噪音”的信号作为由噪音或杂质带来的信号被无视。

图8是表示实施例1中，将测定时间设为240秒钟通过扫描分子计数法检测使用磁体进行了纯化处理的试样溶液而得到的峰数的结果的图。

图9是表示实施例1中，将测定时间设为2秒钟通过扫描分子计数法检测没有使用磁体进行纯化处理的试样溶液而得到的峰数的结果的图。

图10是表示实施例2中，将测定时间设为240秒钟通过扫描分子计数法检测使用磁体进行了纯化处理的试样溶液而得到的峰数的结果的图。

图11是表示实施例2中，将测定时间设为2秒钟通过扫描分子计数法检测没有使用磁体进行纯化处理的试样溶液而得到的峰数的结果的图。

具体实施方式

以下，对于本发明的目标粒子的检测方法的一实施方式进行说明。

首先，对扫描分子计数法进行说明。扫描分子计数法为如下技术：一边通过微小区域扫描试样溶液内，一边当在试样溶液中分散并随机运动的发出光的粒子(以下，称为“发光粒子”。))横穿微小区域内时，检测由微小区域中的发光粒子发出的光，由此，一个一个逐个检测试样溶液中的发光粒子，能够获得发光粒子的计数、试样溶液中的发光粒子的浓度或数密度的相关信息。扫描分子计数法与FIDA等光分析技术同样地，检测所需的试样可以是微量(例如，数十μL左右)，另外，测定时间短；并且与FIDA等光分析技术的情况相比，对于更低浓度或数密度的发光粒子，可以定量检测其浓度或数密度等特性。

需要说明的是，发光粒子是指通过荧光、磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的粒子。本实施方式的目标粒子的定量方法中，目标粒子与发光探针结合而成的物质为发光粒子。

本实施方式和本说明书中，共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学***的“光检测区域”是指在这些显微镜中检测到光的微小区域，当由物镜照射照明光时，相当于该照明光聚光的区域。在共聚焦显微镜中，所述区域尤其根据物镜与小孔之间的位置关系确定。发光粒子没有照明光而发光的情况下，例如，为通过化学发光或生物发光而发光的粒子的情况下，在显微镜中不需要照明光。需要说明的是，本说明书中，言及发光粒子的“信号”时，只要没有特别的限定，是指表示由发光粒子发出的光的信号。

边在试样溶液内移动光检测区域的位置、即通过光检测区域扫描试样溶液内边逐次地进行光的检测。这样一来，移动的光检测区域包含与随机运动的粒子结合或缔合的发光探针时，检测到由发光探针发出的光，由此检测到一个粒子的存在(根据实验的方式，也包括如下情况：发光探针暂时与要检测的粒子(目标粒子)结合之后，在检测光时从粒子解离。)。接着，在逐次检测到的光中逐个检测来自发光探针的光信号，由此，一个一个地逐个逐次地检测到(结合有发光探针的)粒子的存在，能够得到关于粒子在溶液内的状态的各种信息。具体而言，例如，在上述构成中，可以计数逐个检测到的粒子，从而计数在光检测区域的位置移动中检测到的粒子的个数(粒子的计数)。根据所述构成，通过组合粒子的个数与光检测区域的位置的移动量，能够获得与试样溶液中的粒子的数密度或浓度相关的信息。特别是，通过任意手法例如以规定速度移动光检测区域的位置等来确定光检测区域的位置移动轨迹的总体积，就能够具体计算粒子的数密度或浓度。当然，并不是直接确定绝对数密度值或浓度值，也可以算出相对于多个试样溶液、或者相对于成为浓度或数密度基准的标准试样溶液的相对的数密度或浓度之比。

另外，扫描分子计数法中，采用改变光学***的光路而移动光检测区域的位置的构成。根据该构成，光检测区域的移动是迅速的，并且在试样溶液中实质上不产生机械振动、流体力学的作用。因此，作为检测对象的粒子能够不受力学的作用的影响，在稳定的状态下进行光的测量(试样溶液中，振动或流动起作用时，粒子的物理性质存在变化的可能性。)。并且，在扫描分子计数法中，由于使试样溶液流动的构成不是必需的，因此能够用与FCS、FIDA等情况下同样微量(1～数十μL左右)的试样溶液进行测量和分析。

在上述的逐个地检测粒子的工序中，由逐次检测到的光信号判断与一个粒子结合的发光探针(包括：一个发光探针与一个粒子结合的情况；多个发光探针与一个粒子结合的情况；以及根据实验方式的、与一个粒子结合之后从粒子解离的发光探针的情况。以下同样)是否进入光检测区域，可以根据按照时间顺序检测到的光信号的形状而进行。本实施方式中，典型地，当检测到具有比规定阈值大的强度的光信号时，能够检测到与一个粒子结合的发光探针进入了光检测区域。更具体而言，通常，表示由发光粒子发出的光的信号在光检测部的按照时间顺序的检测值即光强度数据中表现为具有某种程度以上的强度的钟形的脉冲状信号形式。噪音或者并非钟形的脉冲状或者表现为强度小的信号的形式。因此，也可以在按照时间顺序的光强度数据上，检测具有超过规定阈值的强度的脉冲状信号，将其作为表示由单一的发光粒子发出的光的信号。“规定阈值”能够通过实验设定为适当的值。

此外，在上述移动光检测区域的位置的工序中，可以根据与粒子结合后的发光探针的特性或试样溶液中的数密度或浓度，适当改变试样溶液内部的光检测区域的位置的移动速度。如本领域技术人员所理解，由与粒子结合后的发光探针所检测到的光的形态，可能会根据其特性或试样溶液中的数密度或浓度而改变。特别是，如果光检测区域的移动速度过快，则由与1个粒子结合后的发光探针得到的光量减少，为了精度良好且灵敏度良好地检测到由与1个粒子结合后的发光探针发出的光，优选适宜改变光检测区域的移动速度。

进一步，在上述移动光检测区域的位置的工序中，适当的是将试样溶液内的光检测区域的位置的移动速度设定为高于与作为检测对象的粒子结合后的发光探针(即，本实施方式的目标粒子的定量方法中，与目标粒子结合的状态的发光探针)的扩散移动速度(由布朗运动造成的粒子的平均移动速度)。如上述说明，通过扫描分子计数法，当光检测区域通过存在有与一个粒子结合后的发光探针的位置时，检测由该发光探针发出的光而逐个检测发光探针。然而，当与粒子结合后的发光探针在溶液中由于布朗运动而随机移动，在光检测区域中出入多次时，多次检测到来自一个发光探针的(表示希望检测的粒子存在的)光信号，难以将检测到的光信号与一个希望检测的粒子的存在对应起来。因此，如上所述，将光检测区域的移动速度设定为高于与粒子结合后的发光探针的扩散移动速度(具体而言，设定为以比与目标粒子结合的状态的发光探针的扩散移动速度快的速度移动)；由此，能够使与一个粒子结合后的发光探针对应于一个(表示粒子的存在的)光信号。需要说明的是，扩散移动速度随着与粒子结合后的发光探针而改变，所以如上述，优选根据与粒子结合的发光探针的特性(特别是扩散常数)，适当改变光检测区域的移动速度。

可以以任意方式，进行用于移动光检测区域的位置的光学***的光路改变。

例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜改变光路，使光检测区域的位置发生变化。光检测区域的位置的移动轨迹可以任意地设定，也可以选自例如圆形、椭圆形、矩形、直线和曲线。

扫描分子计数法中，其光检测机理自身与FIDA等光分析技术的情况相同，采取对来自共聚焦显微镜或多光子显微镜的光检测区域的光进行检测的构成，所以试样溶液的量同样地可以是微量的。然而，扫描分子计数法中，不进行算出荧光强度的波动这样的统计学处理，所以扫描分子计数法的光分析技术能够适用于粒子的数密度或浓度大幅地低于FIDA等光分析技术所需要的水平的试样溶液。

另外，扫描分子计数法中，由于能够逐个检测溶液中分散或溶解的每个粒子，所以可以使用该信息定量地进行粒子的计数、试样溶液中的粒子的浓度或数密度的计算、或者取得与浓度或数密度相关的信息。即，通过扫描分子计数法，使通过光检测区域的粒子与检测到的光信号一一对应，一个一个地检测出粒子，所以能够进行溶液中分散并随机运动的粒子的计数，与以前相比较，能够精度良好地确定试样溶液中的粒子的浓度或数密度。实际上，根据逐个检测与目标粒子结合的状态的发光探针并计数其数目、确定粒子浓度的本实施方式的目标粒子的定量方法，即使试样溶液中的与目标粒子结合的发光探针的浓度是比通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度能够确定的浓度更低的浓度，也能够定量地检测目标粒子。

进一步，根据改变光学***的光路、利用光检测区域扫描试样溶液中的方式，不对试样溶液产生机械振动或流体力学作用，使试样溶液内部在均匀的状态或试样溶液机械上稳定的状态下进行观察。因此，与例如使试样产生流动的情况(赋予流动的情况下难以恒常地赋予同样的流速，并且装置构成变得复杂，还有需要的试样量大幅地增大，并且由于流动导致的流体力学的作用，溶液中的粒子、发光探针或结合体或者其他的物质存在变质或变性的可能性。)相比较，定量的检测结果的可靠性提高；另外，对于试样溶液中的成为检测对象的粒子，能够在没有力学作用的影响下或没有人为影响的状态下进行测量。

＜用于扫描分子计数法的光分析装置的构成＞

可以通过在基本的构成中如图1A中示意性的示例那样组合能够实施FCS、FIDA等的共聚焦显微镜的光学***和光检测器而构成的光分析装置实施扫描分子计数法。参照同一图，光分析装置1是由光学***2～17、和用于控制光学***的各部分的行为并获得、分析数据的计算机18构成的。光分析装置1的光学***可以与通常的共聚焦显微镜的光学***同样，此处，自光源2放射的在单模光纤3内传播的激光(Ex)在光纤的射出端以固有的NA规定的角度放射为发散的光，通过准直仪4成为平行光，在分色镜5、反射镜6、7处发生反射，入射至物镜8。在物镜8的上方，典型地配置有分注了1～数十μL的试样溶液的试样容器或排列有孔10的微孔板9；自物镜8射出的激光在试样容器或孔10内的试样溶液中聚集为焦点，形成光强度强的区域(激发区域)。试样溶液中，分散或溶解有作为观测对象物的粒子、与所述粒子结合的发光探针、带有发光标记（典型地为荧光色素等）的分子，与发光探针结合或缔合的粒子(根据实验的方式，与粒子暂时结合后与粒子解离的发光探针)进入激发区域时，发光探针就在其间被激发而发出光。发出的光(Em)通过物镜8、分色镜5，在镜11处反射，在聚光镜12处聚光，通过小孔13，透过二次滤片14(此处，只选择特定的波长范围的光成分。)被导入至多模光纤15而到达光检测器16，转换成按照时间顺序的电信号之后，输入至计算机18，按照后面说明的方式实施用于光分析的处理。需要说明的是，如本领域技术人员所知，在上述的构成中，小孔13配置于与物镜8的焦点位置共轭的位置上，由此，仅自图1B中示意地所示的激光的焦点区域即激发区域内发出的光通过小孔13，而来自激发区域以外的光被挡住。图1B所例示的激光的焦点区域通常是具有1～10fL左右的实际体积的、位于本光分析装置中的光检测区域(典型地，光强度呈现以区域的中心为顶点的高斯型分布或洛伦兹型分布。实际体积是以光强度为1/e2的面为界面的几乎椭球体的体积。)，被称为共焦体积。另外，扫描分子计数法中，检测来自一个粒子与发光探针的结合体或来自发光探针的光，例如，来自一个或数个荧光色素分子的微弱光，所以光检测器16优选使用能够用于光子计数的超高灵敏度的光检测器。此外，为了改变欲进行观察的孔10，在显微镜的平台(没有图示)上可以设有用于移动微孔板9的水平方向位置的平台位置变化装置17a。可以通过计算机18控制平台位置变化装置17a的动作。通过所述的构成，即使被检体为多个，也能够实现快速的测量。

进一步，上述的光分析装置的光学***中，设置有改变光学***的光路、通过光检测区域扫描试样溶液内部、即用于在试样溶液内移动焦点区域(即，光检测区域)的位置的机构。所述用于移动光检测区域的位置的机构，例如如图1C示意性示例的，也可以采用改变反射镜7的方向的镜转向器17。所述的镜转向器17也可以与装备在普通的激光扫描型显微镜中的检流计镜装置相同(移动光检测区域的位置的方式)。另外，进一步，如图1B所例示，为了移动注入有试样溶液的容器10(微孔板9)的水平方向的位置而移动试样溶液内的光检测区域的相对的位置，也可以操作平台位置变化装置17a(移动试样溶液的位置的方式)。通过上述的改变光路而移动光检测区域的绝对的位置的方式，使光检测区域沿着扫描轨迹(第二路径)而绕转移动，同时地，通过移动试样溶液的位置的方式，使试样溶液内的光检测区域的扫描轨迹的位置沿着规定的移动路径(第一路径)移动。利用任意方式的情况下，镜转向器17在计算机18的控制下与光检测器16的光检测协调而被驱动，以实现预期的光检测区域的位置移动模式。光检测区域的位置的移动轨迹可任意地选自圆形、椭圆形、矩形、直线、曲线或它们的组合(可以从计算机18的程序中的各种移动模式中选择。)。需要说明的是，图中没有显示但也可以通过上下移动物镜8而使光检测区域的位置沿上下方向移动。如上所述，根据不移动试样溶液而改变光学***的光路而移动光检测区域的位置的构成，试样溶液内实质上不发生机械振动或流体力学的作用，能够排除力学作用对观测对象物的影响，能够实现稳定的测量。

当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过吸收多光子而发光时，上述光学***作为多光子显微镜使用。在此情况下，仅在激发光的焦点区域(光检测区域)中发出光，所以可以去除小孔13。此外，当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过化学发光或生物发光现象而不依赖激发光发光时，可以省略用于产生激发光的光学***2～5。当粒子与发光探针的结合体或发光探针通过磷光或散射发光时，直接使用上述共聚焦显微镜的光学***。另外，在光分析装置1中，如图所示，可以为如下构成：可以设置有多个激发光源2，根据用于将粒子与发光探针的结合体或发光探针激发的光的波长，选择适当的激发光的波长。同样地，也可以在检测光的光路上***分色镜14a，将检测光分割成多个波长频带，分别地通过多个光检测器16进行检测。根据所述的构成，在涉及发光粒子的发光波长特性(发光光谱)的信息的检测以及包含多种发光粒子的情况下，能够根据它们的波长分别地检测由它们发出的光。进而还有，关于光的检测，还可以使用在规定的方向上偏振的光作为激发光，将检测光的、与激发光的偏振方向垂直的方向的成分分别地进行检测而能够检测发光粒子的光的偏振特性。该情况下，在激发光的光路上***偏振片(没有图示)，在检测光的光路上***偏振光分束器14a。

＜扫描分子计数法的光分析技术的原理＞

FIDA等分光分析技术与以前的生物化学分析技术相比，其优点是必需的试样量非常少，并且可以快速实施检查。然而，在FIDA等分光分析技术中，原理上根据荧光强度波动计算观测对象粒子的浓度或特性。因此，为了获得精度良好的检测结果，要求试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度是如下水平：在荧光强度测量中，在光检测区域CV内总是存在一个左右的观测对象粒子，在测量时间内总是检测到显著的光强度(光子计数)。如果观测对象粒子的浓度或数密度低于上述时，例如，当观测对象粒子只是偶尔进入光检测区域CV内的水平时，仅在一部分测量时间内出现显著的光强度(光子计数)，因而难以以良好的精度计算光强度的波动。此外，在观测对象粒子的浓度大幅地低于测量中通常在光检测区域内存在一个左右的观测对象粒子的水平时，光强度波动的运算易受背景的影响，为了获得对运算而言为充分量的显著的光强度数据，测量时间延长。与此相对，即使当观测对象粒子的浓度低于FIDA等分光分析技术要求的水平时，本实施方式的扫描分子计数法也能够检测观测对象粒子的数密度或浓度等特性。

扫描分子计数法的光分析技术中，作为进行的处理，直接了当地说，驱动用于移动光检测区域的位置的机构(镜偏向器17)而改变光路，如图2A～2E中示意地描述，一边在试样溶液内移动光检测区域CV的位置即利用光检测区域CV扫描试样溶液内，一边实施光检测。

如此一来，例如，如图2A所示，在光检测区域CV移动期间(图2A中，时间t0～t2)，当通过存在有1个粒子(图中，发光探针结合有荧光色素)的区域时(t1)，检测到如图2B所述的显著的光强度(Em)。如此，实施上述的光检测区域CV的位置的移动和光检测，通过一个一个地检测在此期间出现的图2B所例示的显著的光强度而逐个检测出结合有发光探针的粒子。通过将其个数进行计数，能够得到与存在于所测量的区域内的粒子的个数或者浓度或数密度相关的信息。所述扫描分子计数法的光分析技术的原理中，粒子一个一个地被检测出且不进行如荧光强度波动的算出这类统计学运算处理，所以可以认为即便是欲观测粒子浓度低至无法用FIDA等以充分精度分析程度的试样溶液中，也能够得到关于粒子的浓度或数密度的信息。

另外，通过扫描分子计数法这类逐个检测、计数试样溶液中的粒子的方法，与由通过荧光分光光度计或酶标仪测量的荧光强度来检测被荧光标记的粒子的浓度时相比，能够测定至更低的浓度。当通过荧光分光光度计或酶标仪来检测某被荧光标记的粒子的浓度时，通常假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例。然而，该情况下，被荧光标记的粒子的浓度充分地降低时，噪音信号的量相对于由被荧光标记的粒子发出的光的信号量变大(S/N比恶化)，被荧光标记的粒子的浓度与光信号量之间的比例关系瓦解，确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由被检测的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，从检测结果中排除了噪音信号，只将对应于各个粒子的信号进行计数而算出浓度，所以与通过假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更低的浓度。

进而还有，当一个观测对象粒子结合有多个发光探针时，与传统的假定荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而确定浓度的方法相比，扫描分子计数法这类对试样溶液中的粒子逐个检测、计数的方法的情况下，粒子浓度高一侧的粒子浓度的测量精度提高。在一个观测对象粒子结合有多个发光探针的情况下，向试样溶液添加某一量的发光探针时，观测对象粒子的浓度升高时，相对而言与粒子结合的发光探针的个数降低。在此情况下，由于每一个观测对象粒子的荧光强度降低，因此，被荧光标记的粒子的浓度与光量之间的比例关系瓦解，所确定的浓度值的精度恶化。另一方面，扫描分子计数法在由检测到的光信号检测对应于各个粒子的信号的工序中，每个粒子的荧光强度降低的影响变少，由粒子数算出浓度，所以，与假设荧光强度与被荧光标记的粒子的浓度成比例而检测浓度时相比较，能够检测至更高的浓度。

＜通过扫描分子计数法的试样溶液的光强度的测定＞

就扫描分子计数法的光分析中的光强度的测定而言，除了在检测中驱动镜转向器17，在试样溶液内移动光检测区域的位置(试样溶液内部的扫描)以外，可以以与FCS或FIDA中的光强度检测工序相同的方式实施光强度检测。在操作处理中，典型地，在微孔板9的孔10中注入试样溶液而载置于显微镜的平台上后，使用者对计算机18输入测定开始的指示，计算机18根据存储装置(没有图示)存储的程序(将用于在试样溶液内移动光检测区域的位置的光路进行改变的次序、和在光检测区域的位置的移动中检测来自光检测区域的光的次序)，开始试样溶液内的光检测区域中的激发光的照射以及光强度的测量。所述测量中，在根据计算机18程序的处理操作的控制下，镜偏向器17驱动镜7(检电镜)，在孔10内进行光检测区域的位置的移动，与此同时，光检测器16将逐次检测到的光转换为电信号，传送给计算机18，计算机18以任意方式由送达的光信号生成按照时间顺序的光强度数据并保存。需要说明的是，典型地光检测器16为能够检测到单光子到达的超高灵敏度光检测器，所以，光的检测是以如下方式进行的光子计数：在规定时间内，间隔规定的单位时间(BINTIME)如每10μ秒逐次地测量到达光检测器的光子的个数，按照时间顺序的光强度的数据可以为按照时间顺序的光子计数数据。

光强度测量中的光检测区域的位置移动速度可以是任意的，可以设定为适合例如实验或分析目的的规定速度。当根据所检测到的观测对象粒子的个数获得与其数密度或浓度相关的信息时，光检测区域所通过的区域的大小或体积是必需的，所以以移动距离受掌握的方式进行光检测区域的位置移动。需要说明的是，测量中的经过时间与光检测区域的位置的移动距离成比例关系的方式，能够容易地解释测定结果，所以移动速度基本上优选为恒定速度，但并非仅限于此。

此外，对于光检测区域的位置移动的速度，为了由测量的按照时间顺序的光强度数据逐个检测观测对象粒子，或以良好的精度定量实施观测对象粒子数的计数，优选将所述的移动速度设定为比观测对象粒子(更严密地，粒子与发光探针的结合体或者与粒子结合后分解而游离的发光探针、本实施方式中，为结合有发光探针的目标粒子)的随机运动即布朗运动导致的移动速度更快的值。扫描分子计数法的光分析技术的观测对象粒子是分散或溶解在溶液中的自由地随机运动的粒子，由于布朗运动，位置伴随着时间而移动。因此，光检测区域的位置的移动速度比粒子的布朗运动导致的移动慢时，如图3A示意地描述，粒子在区域内随机地移动，由此，光强度如图3B所示随机地变化(如已知，光检测区域的激发光强度以区域的中心为顶点向外侧降低。)，难以确定对应于各个观测对象粒子的显著的光强度的变化。于是，如图4A所示，优选粒子几乎直线地横穿光检测区域，由此，按照时间顺序的光强度数据中，如图4B例示，对应于各个粒子的光强度变化的分布图大致一致(粒子几乎直线地通过光检测区域的情况下，光强度变化的曲线与激发光强度分布几乎相同。)，将光检测区域的位置的移动速度设定为快于粒子的布朗运动导致的平均的移动速度(扩散移动速度)，以容易确定每个观测对象粒子与光强度的对应关系。

具体而言，由于布朗运动，具有扩散系数D的观测对象粒子(更严密的是，粒子与发光探针的结合体，或与粒子结合后再分解、游离的发光探针)通过半径Wo的光检测区域(共焦体积)时所需的时间Δt是由均方位移的关系式

(2Wo)²＝6D·Δt…(1)

推断出

Δt＝(2Wo)²/6D…(2)

所以观测对象粒子通过布朗运动移动的速度(扩散移动速度)Vdif大约是

Vdif＝2Wo/Δt＝3D/Wo…(3)

此处，光检测区域的位置的移动速度可以参考前述Vdif而设定为比之更快的值。例如，假定观测对象粒子的扩散系数为D＝2.0×10^-10m²/s左右的情况下，Wo为0.62μm左右，则Vdif为1.0×10^-3m/s，所以光检测区域的位置的移动速度设定为其大约10倍的15mm/s即可。此外，当观测对象粒子的扩散系数未知时，为了找到使在光检测区域的位置移动速度的各种设定下的光强度变化曲线成为预期曲线(典型的是与激发光强度分布几乎相同)的条件，可以重复进行预备实验，确定适当的光检测区域的位置的移动速度。

为了实现发光粒子以外的其他物质的稳定性，试样溶液内的流动或振动等干扰应该最小。因此，光检测区域的位置的移动原则上优选通过改变显微镜的光学***的光路而进行。这是因为，如上述说明，通过利用镜转向器17的光路的改变，能够比较容易地高速地进行光检测区域的位置的移动。

关于这一点，在物镜的视野的周边，通常像差变大，光检测区域的尺寸、形状存在根据位置而不同的可能性；所以利用改变光路进行的光检测区域的位置的移动的范围优选在物镜的像差少的视野的中心附近的区域内进行。

另一方面，如果光检测区域的位置的移动范围限于物镜的视野的中心附近的区域内，则光检测区域所通过的区域即扫描区域变小，能够检测到的发光粒子的个数也变少。另外，重复地通过小的区域的情况下，特别是对于扩散慢的粒子，光检测区域重复地通过其存在区域而多次检测到同一粒子。当然，通过有意地重复检测由同一粒子发出的光而精度良好地估计其光的特性也是有用的；但发光粒子的个数的计数、浓度或数密度的检测等想要尽可能增多发光粒子的检测数时，优选不多次检测同一粒子而扫描更广范围的区域或更长的距离。另外，此时，想要得到关于发光粒子的浓度的信息时，优选容易估计扫描区域(光检测区域的通过区域)的长度或体积且光检测区域的尺寸、形状几乎没有变化。

如下进行光检测区域位置的移动：使光检测区域的位置在规定的扫描轨迹上移动并且使该扫描轨迹移动，以使光检测区域的位置在短时间内尽可能不通过(排除路径的交差点)同一区域，由此能够稳定地扫描更广范围的区域或者更长的距离。光检测区域的位置的移动路径任选三维的或者二维的。

即，光检测区域的位置在试样溶液内沿着第二路径移动；所述第二路径的位置沿着第一路径移动。通过所述构成，由于光检测区域的位置所沿着移动的第二路径的位置被移动，至少至第二路径沿着第一路径的位置移动结束为止，试样溶液内的光检测区域的位置的移动路径不通过(排除路径瞬间地交差的情况)同一区域，检测到同一发光粒子二次以上的可能性大幅地被降低。另外，由于光检测区域的位置在试样溶液内移动，所以光检测区域的位置的形状、尺寸的变化被抑制为最低限度。

为了尽可能地将光检测区域的形状、尺寸的变化抑制为最低限度，光检测区域的位置应该在物镜的视野内被限制在像差小的范围内。另一方面，可以认为观测对象物为随机运动的发光粒子，所以经过了充分的时间、即曾经检测到的发光粒子扩散并移动到别的地点后，则光检测区域的位置也可以通过同一位置。因此，作为光检测区域的位置的轨迹的第二路径、与作为第二路径的位置的轨迹的第一路径可以分别为循环路径。例如，第二路径具体而言，任选圆形或椭圆形。另一方面，第一路径的形状任选圆形、椭圆形或直线。该情况下，以试样溶液为基准的光检测区域的位置的轨迹容易地把握，由于容易确认光检测区域的位置在短时间内不连续地通过同一区域，可以将沿着第二路径的光检测区域的位置的移动周期设定为短于第二路径的位置沿着第一路径移动的移动周期。

具体而言，首先，驱动图1A的镜转向器17而改变光路，在物镜的视野内，如图2C，使光检测区域沿着扫描轨迹(第二路径)而绕转移动。并且，与该运动同时地，如图2D，连续地驱动平台位置变化装置17a而移动试样溶液的位置，由此，以试样溶液为基准而移动光检测区域的扫描轨迹的位置，尽量避免光检测区域在短时间内扫描同一区域。［如图2D，如果将试样溶液的位置的移动设为循环路径，当光检测区域的扫描轨迹的位置完成该循环路径一圈时，光检测区域再次扫描相同的区域，而在光检测区域的扫描轨迹的位置完成一圈时，通常可以假定发光粒子通过扩散移动到其他的位置，所以可以认为再次检测到同一发光粒子的可能性极低。］

需要说明的是，虽然优选以试样溶液为基准的光检测区域的速度大致一定以使发光粒子的光的信号的脉冲状形状总是一定；但如果试样溶液的位置的移动速度高至与光检测区域的扫描轨迹上的移动速度相匹敌的程度，则以试样溶液为基准的光检测区域的速度变化。因此，合适的是，试样溶液的位置的移动速度优选与光检测区域的扫描轨迹上的移动速度相比较充分地低(例如，20%以下)。另外，如图2E所示，当光检测区域完成扫描轨迹一圈时，为了避免前次(i)的绕转时通过的区域与此次(ii)绕转时通过的区域重复，设定试样溶液的位置的移动速度(扫描轨迹的位置的移动速度)v2和光检测区域的扫描轨迹上的移动周期τ1与光检测区域的直径d之间满足：

v2·τ1＞d…(4)

的关系。由此，当光检测区域的位置沿着第二路径一周时，第二路径至少移动相当于光检测区域的直径的距离，所以在光检测区域的位置连续绕转中能够避免光检测区域与前次绕转中通过的区域重复。具体而言，光检测区域的直径d为0.4～30μm，当光检测区域在扫描轨迹上的移动周期τ1为0.6～600m秒时，试样溶液的位置的移动速度v2为0.67μm以上。实际上，通常光检测区域在扫描轨迹上的移动周期τ1被设定为6～60m秒，所以该情况下，试样溶液的位置的移动速度v2为17μm以上。光检测区域在扫描轨迹上的移动速度典型地被设定为10～90mm/秒，所以试样溶液的位置的移动速度v2小至几乎可以无视。

共聚焦光学显微镜的光学***中的试样溶液内的光检测区域的位置的移动，具体而言，能够通过显微镜的光学***的光路的改变、或包含试样溶液的容器的移动的任一者而进行。因此，光检测区域的位置沿着第二路径的移动通过改变显微镜的光学***的光路而进行，第二路径的位置沿着第一路径的移动可以通过移动试样溶液的位置而进行。换言之，根据该方式，通过组合利用改变光学***的光路的光检测区域的绕转运动和试样溶液的绕转运动，能够更广或更长距离地扫描试样溶液内。此处，利用改变显微镜的光学***的光路实现的、试样溶液内的光检测区域的位置沿着第二路径的移动任选以任意的方式进行。例如，可以利用激光扫描型光学显微镜中采用的检流计镜等改变显微镜的光学***的光路，使光检测区域的位置发生变化。根据改变显微镜的光学***的光路而改变光检测区域的位置的方式，因为光检测区域的移动是快速的并且试样溶液中实质上不发生机械振动或流体力学作用，所以能够在作为检测对象的发光粒子不受力学作用的影响而稳定的状态下进行光的检测，这一点是有利的。第二路径具体而言，任选圆形或椭圆形。另一方面，第一路径的形状任选圆形、椭圆形或直线。需要说明的是，试样溶液的移动可以优选为如前所述的移动显微镜的平台等，从而连同试样溶液的容器一起移动。该情况下，溶液内不产生流动，所以可以认为试样溶液对发光粒子的影响被降低。

＜通过扫描分子计数法的光强度的分析＞

经上述处理获得试样溶液的按照时间顺序的光强度数据时，可以在计算机18中，根据存储在存储装置中的程序进行处理(由检测到的光逐个检测来自各个发光粒子的光信号的次序)，由此实施如下所述的光强度的分析。

(i)一个观测对象粒子的检测

在按照时间顺序的光强度数据中，当一个观测对象粒子通过光检测区域时的轨迹是如图4A所示几乎直线状时，与该粒子相对应的光强度变化如图6A示意性地描述，具有反映(由光学***确定的)光检测区域的光强度分布的曲线(通常几乎呈钟形)。因此，观测对象粒子的检测的手法之一中，对于光强度设定阈值Io，超过该阈值的光强度持续时间宽度Δτ在规定的范围时，判定为该光强度的分布图与一个粒子通过光检测区域相对应，检测到一个观测对象粒子。光强度的阈值Io以及时间宽度Δτ的规定的范围是根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后再分解而游离的发光探针)所发出的光的强度而预想的曲线确定的；所述观测对象粒子相对于光检测区域以规定的速度相对地移动。具体的值可以根据实验任意地设定，也可以根据观测对象粒子与发光探针的结合体(或者与粒子结合后分解而游离的发光探针)的特性而选择确定。

此外，作为观测对象粒子的检测的其他方法，光检测区域的光强度分布假定为高斯分布：

I＝A·exp(-2t²/a²)…(5)

此时，对显著的光强度曲线(可以明确判断为非背景的曲线)拟合式(5)算出的强度A和宽度a落入规定范围内时，该光强度曲线可判断为对应一个观测对象粒子通过了光检测区域，可以视为检测到一个观测对象粒子。(当强度A和宽度a落在规定范围之外时，可以在分析中作为噪音或异物而无视。)

(ii)观测对象粒子的计数

观测对象粒子的计数可以如下进行：通过任意方法计数通过上述观测对象粒子的检测方法检测到的粒子的个数。然而，当粒子的个数较大时，也可以通过例如图5和图6B所示例的处理来进行。

参照图5和图6B，在根据按照时间顺序的光强度(光子计数)数据计数粒子数的方法的一个例子中，在通过上述说明的光强度测定、即用光检测区域扫描试样溶液内和进行光子计数，获得按照时间顺序的光信号数据(光子计数数据)后(步骤100)，对所述按照时间顺序的光信号数据(图6B最上部分“检测结果(未处理)”)，进行SMOOTHING(平滑化)处理(步骤110，图6B中上部分“SMOOTHING”)。粒子和发光探针的结合体或发光探针发出的光是概率地发出的，在微小的时间内存在数据值产生欠缺，所以通过所述平滑化处理，可以无视如前述的数据值的欠缺。平滑化处理可以例如通过移动平均法而进行。需要说明的是，可以根据获得光信号数据时的光检测区域的位置移动速度(扫描速度)、BIN TIME，适当设定实施平滑化处理时的参数，例如，在移动平均法中一次取平均的数据点数或移动平均的次数等。

然后，为了检测在平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据中存在显著信号的时间区域(峰存在区域)，对平滑化处理后的按照时间顺序的光信号数据对时间进行一阶微分值运算(步骤120)。按照时间顺序的光信号数据的时间微分值，如图6B中下部分的“时间微分”所示信号值变化时间点处的值的变化变大，所以通过参考所述时间微分值可以有利地确定显著的信号(峰信号)的起点和终点。

之后，在按照时间顺序的光信号数据中，逐次检测显著的信号(峰信号)，判断检测到的峰信号是否是与观测对象粒子相对应的信号。

具体而言，首先，在按照时间顺序的光信号数据的按照时间顺序的时间微分值数据基础上，逐次地参照时间微分值，搜索一个峰信号的始点和终点进行确定，从而确定峰存在区域(步骤130)。一旦确定了一个峰存在区域，就对该峰存在区域中的平滑化的按照时间顺序的光信号数据进行钟形函数拟合(图6B下部分的“钟形函数拟合”)，算出钟形函数的峰强度Imax、峰宽度(半高全宽(full width half maximum))w、拟合中的(最小二乘法的)相关系数等参数(步骤140)。需要说明的是，拟合的钟形函数典型的是高斯函数，也可以是洛伦兹型函数。由此，判断算出的钟形函数的参数是否落在一个粒子与发光探针的结合体或发光探针通过光检测区域时检测到的光信号所描述的钟形曲线参数的规定范围内，即，峰强度、峰宽度、相关系数是否分别落在规定范围内等(步骤150)。这样，如图7左侧所示，算出的钟形函数的参数被判断为落在与一个粒子和发光探针的结合体或者与发光探针对应的光信号规定的范围内时，则该信号判定为与一个观测对象粒子对应的信号，由此，判断为检测到一个观测对象粒子，计数为一个粒子(粒子数的计数增加。步骤160)。另一方面，如图7右侧所示，将算出的钟形函数的参数没有在规定范围内的峰信号作为噪音而无视。

上述的步骤130～160的处理中的峰信号的搜索和判定可以在按照时间顺序的光信号数据的整个领域内重复地进行，每检测到一个观测对象粒子则作为粒子而计数。因此，在结束对按照时间顺序的光信号数据全部区域的峰信号搜索后(步骤170)，将所获得的粒子计数值作为在按照时间顺序的光信号数据中检测到的观测对象粒子的个数。

(iii)观测对象粒子的数密度或浓度的确定

进行了观测对象粒子的计数后，使用在获得按照时间顺序的光信号数据的过程中光检测区域所通过的区域的总体积，确定观测对象粒子的数密度或浓度。然而，光检测区域的实际体积依赖于激发光或检测光的波长、透镜的开口数、光学***的调整状态而改变，所以由设计值计算通常是困难的，因此，计算光检测区域所通过的区域的总体积也不简单。在本文中，典型的是，可以在与所要检查的试样溶液的测定相同的条件下，对已知粒子浓度的溶液(参照溶液)进行上文说明的光强度测定、粒子的检测和计数，根据检测到的粒子的个数和参照溶液的粒子的浓度，确定光检测区域所通过的区域的总体积，即确定观测对象粒子的检测数和浓度之间的关系。

作为参照溶液的粒子，可以优选为与观测对象粒子所形成的粒子和发光探针的结合体(或与观测对象粒子结合后再游离的发光探针)具有相同发光特性的发光标记(荧光色素等)。具体而言，例如，对于粒子浓度为C的参照溶液，其粒子的检测数为N时，光检测区域所通过的区域总体积Vt则根据

Vt＝N/C…(6)

而获得。另外，准备多个不同浓度的溶液作为参照溶液，分别对其实施测定，将算出的Vt的平均值作为光检测区域所通过区域的总体积Vt而采用即可。因此，一旦获得Vt值，粒子的计数结果为n的试样溶液的粒子的数密度c就根据

c＝n/Vt…(7)

而获得。需要说明的是，可以不通过上述方法，而利用任意方法例如FCS、FIDA等得到光检测区域的体积、光检测区域所通过区域的总体积即可。此外，本实施方式的光分析装置也可以如下构成，对于规定的光检测区域的移动模式，将各种标准粒子的浓度C和粒子的个数N之间的关系(式(6))的信息预先存储在计算机18的存储装置中，装置的使用者在实施光分析时可以适当利用存储的关系信息。

＜目标粒子的检测方法＞

本实施方式的目标粒子的检测方法的特征在于，其为检测在溶液中分散并随机运动的目标粒子的方法，使用分离回收用粒子，从与目标粒子结合后的发光探针中将不与目标粒子结合的游离的发光探针分离去除，之后通过扫描分子计数法检测结合有发光探针的目标粒子。扫描分子计数法为能够在分子离散的状况下逐个粒子地测定发光粒子的测定方法，所以对于pM级以下的浓度比较低的发光粒子也能够进行测定。因此，通过本实施方式的目标粒子的检测方法，即使当试样溶液中的解析对象的目标粒子的浓度非常低时，也能够高灵敏度地计数结合有发光探针的目标粒子。进而，本实施方式的目标粒子的检测方法在使被发光探针标记的目标粒子与分离回收用粒子结合之后，通过固液分离处理回收分离回收用粒子，对于该被回收的分离回收用粒子利用扫描分子计数法进行检测。被发光探针标记的目标粒子与分离回收用粒子结合，所以通过固液分离处理与分离回收用粒子一起被回收，而不与目标粒子结合的游离的发光探针从分离回收用粒子中分离而被去除。即，因为在去除了游离的发光探针之后利用扫描分子计数法进行检测，所以由游离的发光探针发出的光的检测被有效地抑制，能够高精度地检测目标粒子。

具体而言，本实施方式的目标粒子的检测方法具有下述工序(a)～(c)。

(a)调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有前述发光探针的前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体的工序；

(b)在前述工序(a)之后，从前述溶液中通过固液分离处理回收前述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；

(c)算出前述工序(b)中调制的试样溶液中存在的前述复合体的分子数的工序。

以下，对于每个工序进行说明。

首先，作为工序(a)，调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含与前述发光探针结合的前述目标粒子和前述分离回收用粒子的溶液；在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体。

本实施方式和本说明书中，“在溶液中分散并随机运动的粒子”是指在溶液中分散或溶解的原子、分子或者它们的聚集体等粒子(可以为发光的或不发光的的任一者。)，是指非固定于基板等而在溶液中自由地进行布朗运动的粒子。

目标粒子为在溶液中分散并随机运动的、以检测为目的的粒子。作为目标粒子，可列举出例如：蛋白质、肽、核酸、核酸类似物质、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚集体等生物分子、病毒、细胞等粒子状的生物学的对象物或非生物学的粒子(例如：原子、分子、胶束、金属胶体等)等。核酸可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增的核酸。核酸类似物质可列举DNA或RNA这类天然类型核苷酸(天然存在的核苷酸)的侧链等被氨基等官能团修饰的物质、用蛋白质或低分子化合物等标记的物质等。更具体而言，可列举出例如：桥式核酸(BNA,Bridged nucleic acid)、天然型核苷酸的4’位氧原子被硫原子置换的核苷酸、天然型核糖核苷酸的2’位羟基被甲氧基取代的核苷酸、己糖醇核酸(HNA,Hexitol Nucleic Acid)、肽核酸(PNA)等。

另外，本实施方式中使用的发光探针为与目标粒子特异地或非特异地结合或者吸附的物质，只要是在与目标粒子结合的状态下发出光的物质，就没有特别的限定。另外，发光探针与目标粒子的结合任选可逆的结合、或者共价键等不可逆的结合。例如，发光探针任选为发光物质自身，或者为使发光物质结合在与目标粒子特异地或非特异地结合或者吸附的物质上而成的物质。作为发光物质，典型地为荧光性物质，但也可以为通过磷光、化学发光、生物发光、光散射等发出光的物质。作为荧光物质，只要是由特定波长的光照射就发出荧光的物质即可，没有特别的限定，可以从用于FCS或FIDA等的荧光色素中适当的选择使用。

例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，发光探针可列举出：使与目标粒子杂交的寡核苷酸结合荧光物质等发光物质而成的物质、结合有荧光物质等发光物质的核酸结合性蛋白质、与核酸结合的色素分子等。作为该寡核苷酸,可以为DNA，也可以为RNA，也可以为cDNA这样的人工扩增物质。可以是部分或全部包含核酸类似物质的物质；所述核酸类似物质能够与天然的核酸碱基同样地形成核苷酸链或碱基对。另外，目标粒子为蛋白质或低分子化合物等的情况下，作为发光探针，可以使用用荧光物质等发光物质对目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体、或者将像生物素和抗生物素蛋白那样与目标粒子特异性结合的物质进行标记而得到的物质。需要说明的是，与核酸、蛋白质等目标粒子特异或非特异地结合或吸附的物质与发光物质的结合可以通过常规方法进行。

另外，本实施方式中使用的发光探针任选为能够通过合成反应等与目标粒子结合的发光物质自身。例如，可以使荧光色素等发光物质中的官能团与目标粒子中的官能团通过各种合成反应而结合。作为该合成反应，可列举出例如：用水溶性碳化二亚胺使羧酸与氨基结合的EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐)反应，预先将1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合而使羧酸和氨基结合的反应，使活性化的醛基、甲苯磺酰基与目标粒子中的官能团结合的反应等。另外，使用具有双极性的连接体将目标物质中的氨基与发光物质中的氨基交联的反应也可以。

本实施方式中使用的发光探针也可以为与目标粒子非特异地结合等的物质，从目标粒子的检测/定量的精度的观点出发，优选特异地结合等物质。需要说明的是，作为与目标粒子特异地结合的发光探针，只要是与物理或化学的性质与目标粒子类似的其他物质相比更优先与目标粒子结合的物质即可，不需要与除了目标粒子以外的物质完全地不结合的物质。例如，目标粒子为核酸的情况下，作为发光探针使用的被发光物质标记的寡核苷酸既可以具有与该目标粒子的碱基序列完全地互补的碱基序列，也可以具有与该目标粒子的碱基序列错配的碱基序列。

本实施方式中，供于利用扫描分子计数法的检测的试样溶液中，不与目标粒子结合的游离的发光探针(单独存在的发光探针)的大部分被去除。因此，与目标粒子结合状态的发光探针、和单独存在状态的发光探针，即便发光特性相同，也能够高精度地检测出目标粒子。

本实施方式中，也可以使用在与目标粒子结合的状态、和单独存在的状态下发出的光的发光特性不同的发光探针。在发光探针单独存在的状态以及与目标粒子结合的状态下，使特定波长的光的强度不同(例如，使荧光强度不同)，由此能够更高精度地检测出目标粒子。需要说明的是，在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下，发光探针的发光特性不同是指：在与目标粒子结合的状态以及单独存在的状态下，特定的波长的光强度不同。

例如，目标粒子为蛋白质的情况下，与蛋白质结合且改变周围环境时荧光强度、荧光波长变化的色素(例如，疏水性探针ANS、MANS、TNS这类的荧光色素)可以作为发光探针使用。另外，发光探针也可以其自身不发光。例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用与该目标粒子杂交的寡核苷酸作为发光探针，通过使与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，结合在由目标粒子与发光探针形成的缔合体上，能够使在发光探针单独存在的状态以及在与目标粒子结合的状态下的发光特性不同。作为与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，可列举出荧光性嵌入剂或结合了荧光物质的沟结合剂等。

其他的，可以使用例如：由至少两个构成要素形成的、通过与目标粒子结合而使前述的至少两个构成要素的相互位置变化而发出荧光的物质作为发光探针。作为这样的物质的例子，可列举出：与某粒子结合时结构变化而发出强的荧光的荧光性蛋白质、或者与某粒子结合时聚集而形成荧光性金属络合物的分子(络合物的配体)。通过所述的构成，在所有情况下，单独的发光探针或不与目标粒子结合的发光探针均几乎不发光，或者即便发光也与目标粒子和发光探针的结合体的波长不同，所以能够选择地检测由目标粒子和发光探针的结合体发出的光。

另外，通过利用荧光共振能量转移现象(FRET)，能够使单独存在的发光探针、和与目标粒子结合的状态的发光探针的发光特性不同。例如，作为发光探针可以使用如下物质：使在FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质(荧光物质、猝灭物质)按照在发光探针单独存在的状态下产生FRET、在与目标粒子结合的状态下不产生FRET的方式在与目标粒子结合的物质上结合而形成的物质。与目标粒子结合后的发光探针不再产生FRET，所以由成为能量供体的荧光物质发出荧光。另一方面，从单独存在的发光探针中，检测不到由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，或检测到的荧光是减弱的。因此，通过检测由成为能量供体的荧光物质发出的荧光，能够与单独存在的发光探针区别地检测到结合有发光探针的目标粒子。

例如，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以优选使用分子信标探针作为发光探针；该分子信标探针如下形成：使FRET中成为能量供体的荧光物质和成为能量受体的物质按照单链核酸分子的状态下产生FRET、与其他单链核酸分子杂交形成缔合体的状态下不产生FRET的方式在当为单链核酸分子的状态时形成分子内结构体的寡核苷酸上结合。可列举出例如，3’末端侧结合有成为能量供体的荧光物质或成为能量受体的物质、5’末端侧结合有剩余的另一者并且3’末端侧区域和5’末端侧具有彼此互补的碱基序列，这些碱基序列形成碱基对由此形成分子内结构(所谓的茎-环结构)的物质。需要说明的是，分子信标探针的形成分子内碱基对的彼此互补的区域，可以夹着与目标粒子杂交的区域而存在；3’末端侧的区域和5’末端侧的区域既可以为分别包含3’末端或5’末端的区域，也可以为不包含3’末端或5’末端的区域。此外，就形成碱基对的区域的碱基数或碱基序列而言，为所形成的碱基对的稳定性低于与目标粒子的缔合体、且在检测条件下能够形成碱基对的程度即可。

另外，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用与双链结构特异地结合的荧光性双链核酸结合物质，即便该荧光性双链核酸结合物质与标记了发光探针的荧光物质之间产生FRET，也能够区别单独存在的发光探针和与目标粒子结合的发光探针。即，荧光性双链核酸结合物质和标记了发光探针的荧光物质中的任一者成为FRET的能量供体，另一者成为FRET的能量受体。由单独存在的发光探针，检测到由标记该发光探针的荧光物质发出的荧光。与此相对，与目标粒子结合的发光探针和荧光性双链核酸结合物质结合，所以能够检测到由FRET发出的荧光，结果能够与单独存在的发光探针区別而检测。

此外，当进入发光探针与目标粒子的缔合体的碱基对之间的荧光性嵌入剂的量过多时，检测自FRET发出的荧光时的背景变得过高，存在影响检测精度的担心。因此，优选将发光探针设计成在发光探针与目标粒子的缔合体中形成双链的区域为400bp以下。

其他的，本实施方式中，也可以使用两种发光探针。例如，在目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，将两种发光探针设计成相对于目标粒子相互邻接而杂交，将一者的发光探针用FRET中的成为能量供体的荧光物质标记，将另一者的发光探针用该FRET中的成为能量受体的物质标记。该情况下，单独存在的发光探针不产生FRET，而通过与目标粒子结合，该两种发光探针相互接近而产生FRET。因此，通过检测自该FRET发出的荧光，能够检测出与发光探针结合的目标粒子。

目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，可以使用2种发光探针，利用猝灭自动连接(Quenched Autoligation，QUAL)反应，使与目标粒子结合的发光探针发出光(J.AM.CHEM.SOC.,2002,(10),p2096)。

具体而言，设计并制作：与目标粒子杂交并且具有特殊的3’末端修饰碱基的核酸探针(N探针)；和与该N探针的3’末端侧相邻且与目标粒子杂交并且在5’末端侧修饰有猝灭色素和荧光色素的核酸探针(E探针)。如果2个探针与目标粒子杂交，则发生非酶连接(Autoligation)反应，此时，猝灭色素从E探针脱离。即，只在2个探针与目标粒子杂交时才产生荧光。

本实施方式中使用的分离回收用粒子，与目标粒子和发光探针的结合体特异地或非特异地结合或吸附，并且能够悬浮于水中，能够通过通常的固液分离处理与液体分离。作为分离回收用粒子，可以使用例如：使能够悬浮于水中并且通过通常的固液分离处理能够与液体分离的粒子，与特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质结合而成的粒子。其他的，也可以使用如下粒子作为分离回收用粒子：表面具有不与未和目标粒子结合的发光探针结合而能够结合与目标粒子结合的状态的发光探针的部位，能够悬浮于水中并且能够通过通常的固液分离处理与液体分离。

分离回收用粒子在通过扫描分子计数法的测定中，需要在试样溶液中维持悬浮状态。因为在测定中，在试样溶液中沉淀的粒子难以通过扫描分子计数法进行正确的检测。因此，本实施方式中使用的分离回收用粒子在试样溶液中的沉降速度优选为1×10^-6m/s以下，更优选为1×10^-7m/s以下。

需要说明的是，粒子的沉降速度通常通过Stokes式而求出。下述式(8)中，r为珠半径，ρ_P为珠密度，ρ_f为溶液密度，g为重力加速度，η为溶液的粘度。

$v_s=\frac{2}{9}\frac{r^2({\mathrm{\ρ}}_p-{\mathrm{\ρ}}_f)g}{\mathrm{\η}}...\left(8\right)$

用作分离回收用粒子的粒子任选为能够悬浮于水中并且能够通过通常的固液分离处理与液体分离的粒子；该技术领域中，可以从通常用于进行物质的纯化·分离等处理的粒子中适宜选择而使用。本实施方式中使用的分离回收用粒子任选为磁性粒子或非磁性粒子。其他的，分离回收用粒子任选为病毒、细菌、细胞等生物材料。本实施方式中使用的分离回收用粒子任选为由1种材质形成的粒子或者由2种以上的材质形成的粒子。进而，可以使用1种分离回收用粒子，也可以将2种以上的分离回收用粒子混合而使用。

作为磁性粒子，可列举出例如：由四氧化三铁(Fe₃O₄)、三氧化二铁(γ-Fe₂O₃)、各种铁氧体、铁、锰、镍、钴、铬等金属形成的粒子、或者由包含钴、镍、锰等的合金形成的粒子等。另外，该磁性粒子可以为只由磁性体形成的粒子，也可以为非磁性体粒子的内部含有磁性体的微粒的粒子。作为该非磁性体粒子，例如，有：由疏水性聚合物形成的胶乳粒子、由交联的亲水性聚合物形成的胶乳粒子等。任选为由2～4种左右的单体的共聚物形成的胶乳粒子。作为该疏水性聚合物，例如，有：聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚己内酰胺、聚对苯二甲酸乙二醇酯等。

另外，作为该交联的亲水性聚合物，例如，有：聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚(丙烯酸2-氧基乙酯)（poly(2-oxyethylacrylate)）、聚(甲基丙烯酸2-氧基乙酯)（poly(2-oxyethylmethacrylate)）、聚(丙烯酸2,3-二氧基丙酯)（poly(2,3-dioxypropylacrylate)）、聚(甲基丙烯酸2,3-二氧基丙酯)（poly(2,3-dioxypropylmethacrylate)）、聚乙二醇甲基丙烯酸酯、葡聚糖等。其他的，任选为在胶乳粒子等非磁性体粒子的表面上固定有磁性体微粒而成的粒子。

作为非磁性粒子，例如，有：由玻璃、陶瓷、塑料、胶乳等形成的粒子。其他的，也可以为铝、镍、氧化铝、氧化钛、氧化锆等不带有磁性的金属粒子。

作为本实施方式中使用的分离回收用粒子，优选为使磁性粒子、玻璃粒子、或者胶乳粒子与特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质结合而成的粒子。另外，由于磁性粒子通过使用磁场能够简便地进行固液分离处理，所以更优选为磁性粒子。例如，使装有磁性粒子的悬浮液的容器接近磁体，将磁性粒子集中到该容器的与该磁体最接近的面之后，去除上清，由此能够仅将磁性粒子回收至该容器内。

分离回收用粒子只要是在利用扫描分子计数法的测定中，能够在试样溶液中维持悬浮状态的物质，就没有特别地限定；其平均粒子径、密度等可以考虑所使用的分离回收用粒子的素材、试样溶液的粘度等而适宜调整。例如，分离回收用粒子的平均粒子径可以为1nm～100μm，优选为0.01～50μm。

为了制造本实施方式中使用的分离回收用粒子，作为与能够在水中悬浮的并且能够通过通常的固液分离处理与液体分离的粒子结合的、特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质，可以使用：与目标粒子杂交的寡核苷酸、目标粒子的抗原或抗体、目标粒子的配体或受体、或者像生物素和抗生物素蛋白那样与目标粒子特异地结合的物质等与发光探针同样的物质。需要说明的是，分离回收用粒子也可以为与目标粒子非特异地结合等的物质，从目标粒子的检测/定量的精度的观点出发，优选特异地结合等的物质。

对于使能够在水中悬浮的并且能够通过通常的固液分离处理与液体分离的粒子、与特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质结合的方法，没有特别地限定，可以物理地吸附，也可以与粒子表面的官能团化学地结合。化学地结合的情况下，可以根据适合于各官能团的方法使其结合。可列举出例如：EDAC反应、预先将EDC和NHS混合而使羧酸与氨基结合的反应，使用具有双极性的连接体使氨基之间交联的反应，使活性化的醛基、甲苯磺酰基、与特异地或者非特异地结合或吸附目标粒子的物质中的官能团结合的反应等。在粒子表面上不具有官能团的磁性粒子的情况下，也可以用官能团覆盖粒子表面。

具体而言，工序(a)：首先，调制包含目标粒子、发光探针和分离回收用粒子的溶液，或者调制包含结合有发光探针的目标粒子、发光探针和分离回收用粒子的溶液。为了调制该溶液而对目标粒子等添加的溶剂，只要是不阻碍由目标粒子、发光探针和分离回收用粒子形成的复合体(以下，有时称为3者复合体。)的溶液，就没有特别的限定，可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。

该溶液可以通过例如，在适当的溶剂中分别添加目标粒子、发光探针和分离回收用粒子而调制。只要最终能够形成3者复合体，则对于添加的顺序没有特别的限定。具体而言，可以在实质上几乎同时添加目标粒子、发光探针和分离回收用粒子之后，在调制的溶液中形成3者复合体。另外，可以添加目标粒子和发光探针而形成由目标粒子和发光探针形成的结合体之后，添加分离回收用粒子而形成3者复合体；也可以添加目标粒子和分离回收用粒子而形成由目标粒子和分离回收用粒子形成的结合体，之后添加发光探针而形成3者复合体。

只是使目标粒子与发光探针共存于相同的溶液中就能够使两者结合的情况下，调制包含目标粒子和发光探针的溶液之后，只需根据需要以规定时间孵育该试样溶液，就能使目标粒子与发光探针在该溶液中结合。

另一方面，目标粒子、发光探针为双链结构的核酸或者核酸类似物质的情况下，优选使包含目标粒子和发光探针的溶液中的核酸等变性之后使两者缔合。需要说明的是，“使核酸或核酸类似物质变性”是指使碱基对解离。例如，使分子信标探针中彼此互补的碱基序列所形成的碱基对解离，解开分子内结构成为单链结构，或使双链核酸分子成为单链核酸分子。需要说明的是，当发光探针是包含PNA等核酸类似物质的寡核苷酸时，即使目标粒子是双链核酸分子，有时不进行特别的变性处理也可以形成包含该发光探针和目标粒子的缔合体。

作为变性处理，可列举出：利用高温处理的变性(热变性)或利用低盐浓度处理的变性等。其中，热变性对于荧光物质等发光物质的影响比较小且操作简便，所以优选进行热变性。具体而言，热变性可以通过将该溶液进行高温处理而使该溶液中的核酸等变性。通常地，DNA在90℃下、RNA在70℃下保温数秒至2分钟左右，能够通过保温使之变性；但根据目标粒子的碱基的长度等进行变性的温度千差万别，只要能够变性，就对其温度没有限定。另一方面，通过低盐浓度处理进行变性可以是例如利用纯水等稀释，将该溶液的盐浓度调整至足够低，从而进行。

根据需要使之变性之后，使前述溶液中的目标粒子与发光探针缔合。当进行热变性时，在高温处理后，使该溶液的温度降至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的温度，由此能够使该溶液中的两者适当缔合。另外，当通过低盐浓度处理进行变性时，通过添加盐溶液等，使该溶液的盐浓度升高至目标粒子能够与发光探针特异地杂交的浓度，能够使该溶液中的两者适当缔合。

需要说明的是，可以根据两者的缔合体的熔解曲线，求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如可以使仅含有两者的溶液的温度从高温向低温变化，测定该溶液的吸光度或荧光强度来求出熔解曲线。根据所获得的熔解曲线，从变性的两条单链核酸分子开始形成缔合体的温度，至几乎全部成为缔合体的温度这一范围内的温度，都可以作为两者能够特异地杂交的温度。也可以用使溶液中的盐浓度自低浓度向高浓度变化来代替温度，同样地确定熔解曲线，能够求出两条单链核酸分子能够特异地杂交的浓度。

通常可以用Tm值(熔解温度)，代替两条单链核酸分子能够特异地杂交的温度。例如，利用普遍使用的引物/探针设计软件等，根据发光探针的碱基序列信息，能够算出与目标粒子杂交的区域的Tm值(双链DNA的50%解离为单链DNA的温度)。

此外，为了抑制非特异杂交，在形成缔合体时，优选使溶液的温度较缓慢地下降。例如，使溶液温度为70℃以上而使核酸分子变性后，可以按0.05℃/秒以上的降温速度，降低该溶液的液温。

此外，为了抑制非特异地杂交，优选预先在溶液中添加表面活性剂、甲酰胺、二甲亚砜或尿素等。

这些化合物可以只添加一种，也可以组合添加2种以上。通过添加这些化合物，在较低温度环境下也能够使非特异的杂交难以发生。

通常地，为了效率良好地标记目标粒子，需要比目标粒子还要过剩量的发光探针。因此，预先添加目标粒子和发光探针而形成由目标粒子和发光探针形成的结合体的情况下，形成反应后的溶液中，包含结合有发光探针的目标粒子和发光探针。因此，也可以通过向目标粒子与发光探针的结合反应后的反应溶液中添加分离回收用粒子来调制工序(a)的溶液。

也可以例如，在通过EDAC反应等合成反应使荧光色素与目标粒子结合之后的反应溶液中，添加分离回收用粒子，根据需要进行孵育而形成3者复合体。另外，目标粒子为核酸或核酸类似物质的情况下，使用用荧光物质标记的引物或用荧光物质标记的dNTP、和用能够与分离回收用粒子结合的物质标记的引物，将目标粒子作为模板进行PCR，由此能够得到用荧光物质和能够与分离回收用粒子结合的物质两者标记的目标粒子作为PCR产物。也可以向该PCR的反应溶液中添加分离回收用粒子，根据需要进行孵育而形成3者复合体。

接着，作为工序(b)，从工序(a)中调制的含有3者复合体的溶液中，通过固液分离处理将分离回收用粒子回收，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液。

作为固液分离处理，只要是能够将溶液中悬浮的分离回收用粒子与液体成分分离而回收的方法，就没有特别的限定，可以从固液分离处理中使用的已知的处理中适宜选择而使用。例如，可以对于含有3者复合体的溶液进行离心分离处理，使分离回收用粒子沉淀，去除上清；也可以将该溶液使用滤纸或过滤器进行过滤，将残留于滤纸等的表面的分离回收用粒子回收。另外，当分离回收用粒子为磁性粒子时，使加入了该溶液的容器接近磁体，将分离回收用粒子集中到该容器的与该磁体最接近的面之后去除上清。

通过使回收的分离回收用粒子在适当的溶剂中悬浮而调制试样溶液。该溶剂，只要是不阻碍由与目标粒子结合后的发光探针发出的光的检测、以及不阻碍利用扫描分子计数法检测与目标粒子结合后的发光探针的溶剂，就没有特别的限定；可以从该技术领域中通常使用的缓冲液中适宜选择而使用。作为该缓冲液，有例如：PBS(磷酸缓冲生理盐水、pH7.4)等磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。

被回收的分离回收用粒子可以在调制试样溶液之前通过适当的缓冲液进行洗涤。通过洗涤，可以更严密地将游离的发光探针从分离回收用粒子中分离而去除。

之后，作为工序(c)，通过扫描分子计数法计数调制的试样溶液中的3者复合体(结合有发光探针的目标粒子)的分子数。具体而言,将试样溶液置于用于前述的扫描分子计数法的光分析装置中，通过前述的手法，检测由3者复合体中的发光探针发出的光并解析，由此算出3者复合体的分子数。算出的3者复合体的分子数为试样溶液中的目标粒子的分子数。

包含分离回收用粒子的3者复合体为大的粒子，溶液中的扩散运动的速度比较慢。因此，工序(c)的利用扫描分子计数法对试样溶液进行的测定中，使光检测区域的位置的移动如下进行：使试样溶液内的光检测区域的位置在规定的扫描轨迹上移动并且优选使该扫描轨迹以光检测区域的位置在短时间内尽可能不通过(排除路径的交差点)同一区域的方式移动。即，使光检测区域的位置在试样溶液内沿着第二路径移动；所述第二路径的位置沿着第一路径移动。光检测区域由于在其位置移动期间扫描除路径的交差点之外的试样溶液内不同的区域，所以将同一3者复合体作为不同的粒子检测的可能性大幅地降低，3者复合体的检测数的偏差被缩小，或者，将由3者复合体中的发光探针的退色导致的影响抑制至最低限度。

实施例

接着，以下示出实施例等，进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于下列实施例。

[实施例1]

使用ATTO(注册商标)488作为发光探针，使用ATTO(注册商标)488-biotin作为被发光探针标记的目标粒子，使用磁性粒子作为分离回收用粒子，通过本实施方式的目标粒子的检测方法检测溶液中的ATTO(注册商标)488-biotin。

具体而言，使用包含1M NaCl和0.05体积%浓度(V/V)pluoronic F127的TE缓冲液(本实施例中，以下，称为缓冲液。)，使ATTO(注册商标)488-biotin(sigma-aldrich Corp.制)和ATTO(注册商标)488(ATTO-TECGmbH)分别溶解以成为0.2μM。将ATTO(注册商标)488-biotin和ATTO(注册商标)488以体积比计为0：1000、1：999、5：995、或10：990混合而成的溶液，分别用作0%(mol)、0.1%(mol)、0.5%(mol)、或1%(mol)色素修饰生物素溶液。接着，将25μL的10mg/mL(≈10pM)链亲合素修饰磁性珠(商品名：Dynabeads(注册商标)MyOne Streptavidin C1、invitorgen Corp.制)和25μL的色素修饰生物素溶液混合而调制悬浮液。通过将各悬浮液进行30分钟孵育，使磁性珠上的链亲合素结合ATTO(注册商标)488-biotin中的生物素。

使用磁体，使各悬浮液中的磁性珠沉淀，将全部上清去除。对于残留的磁性珠，通过加入1mL的缓冲液使磁性珠再悬浮之后，使用磁体使磁性珠沉淀，之后去除上清液。重复同样的操作计6次，进行磁性珠的洗涤。将洗涤后的磁性珠悬浮于25μL的缓冲液，调制悬浮液(已纯化)。

将得到的各悬浮液(已纯化)中的、与链亲合素修饰磁性珠结合的状态的ATTO(注册商标)488-biotin通过扫描分子计数法进行计数。作为对照，对于没有进行使用了磁体的纯化处理的各悬浮液(无纯化)，同样地通过扫描分子计数法进行计数。

具体而言，使用具备共聚焦荧光显微镜的光学***和光子计数***的单分子荧光测定装置MF-20(Olympus Corporation)作为光分析装置，以将上述的各悬浮液稀释了1000倍的溶液作为试样溶液，获得各试样溶液的按照时间顺序的光强度数据(光子计数数据)。此时，激发光使用200μW的488nm的激光，使用带通滤波器，测定510～560nm的波长频带的光，生成按照时间顺序的光强度数据。使试样溶液中的光检测区域按照15mm/秒(6000rpm)的移动速度旋转，将BIN TIME设为10μ秒，将测定时间设为2秒钟或240秒钟。将通过测定得到的按照时间顺序的光强度数据平滑化之后，通过微分进行峰的检测。在被视为峰的区域中，提取能够近似高斯函数的、强度为5以上的峰的峰强度。

将利用扫描分子计数法的计数结果示于图8和9中。图8为在测定时间为240秒钟下检测使用磁体进行了纯化处理的试样溶液的结果；图9为在测定时间为2秒钟下检测没有使用磁体进行纯化处理的试样溶液的结果。结果，进行了纯化处理的情况下，0体积%色素修饰生物素溶液中几乎检测不到峰，与此相对，观察到依赖ATTO(注册商标)488-biotin的添加量的峰数的增大(参照图8。)。与此相对，没有进行纯化处理的情况下，不论ATTO(注册商标)488-biotin的添加量如何，都没有确认到检测的峰数的差别(参照图9。)。由这些结果可知，使用磁性粒子将结合有发光探针的目标粒子纯化，将不与目标粒子结合的过剩量的发光探针去除，由此提高目标粒子的检测精度。

[实施例2]

对于实施例1中调制的试样溶液，通过移动试样溶液的位置的方式，使光检测区域的位置在试样溶液内的平面内沿着第二路径移动；所述第二路径的位置沿着第一路径移动，通过扫描分子计数法进行检测。

具体而言，对于实施例1中利用扫描分子计数法的检测中使用的各试样溶液，使用实施例1中使用的单分子荧光测定装置MF-20，在以下的条件下利用扫描分子计数法进行检测。激发光使用200μW的488nm的激光，使用带通滤波器，测定510～560nm的波长频带的光，生成按照时间顺序的光强度数据。使试样溶液中的光检测区域以15mm/秒(6000rpm)的移动速度旋转。进一步，按照1mm/秒沿着圆形(OD：1mm)驱动测定容器。另外，将BIN TIME设为10μ秒，将测定时间设为2秒钟或240秒钟。将通过测定得到的按照时间顺序的光强度数据平滑化之后，通过微分进行峰的检测。在被视为峰的区域中，提取能够近似高斯函数的、强度为5以上的峰的峰强度。

将利用扫描分子计数法的计数结果示于图10和11中。图10为在测定时间为240秒钟下检测使用磁体进行了纯化处理的试样溶液的结果；图11为在测定时间为2秒钟下检测没有使用磁体进行纯化处理的试样溶液的结果。结果，与实施例1的情况同样地，进行纯化处理的情况下，观察到峰数依赖ATTO(注册商标)488-biotin的添加量增大(参照图10。)。与此相对，没有进行纯化处理的情况下，不论ATTO(注册商标)488-biotin的添加量如何，均没有确认到检测的峰数的差别(参照图11。)。另外，进行纯化处理的情况下，与实施例1的情况相比较，标准偏差变小，表明通过驱动平台能够降低测定的偏差。

产业上的可利用性

根据本发明的目标粒子的检测方法即便在溶液中仅以非常低浓度存在的情况下，也能够抑制由游离的发光探针造成的影响并且高精度地通过扫描分子计数法检测出用发光探针标记的目标粒子，所以能够利用于临床被检体等解析对象物质的浓度为微量的试样的解析/检查等领域中。

附图标记说明

1…光分析装置(共聚焦显微镜)

2…光源

3…单模光纤

4…准直仪透镜

5…分色镜

6、7、11…反射镜

8…物镜

9…微孔板

10…孔(试样溶液容器)

12…聚光镜

13…小孔

14…二次滤片

14a…分色镜或偏振光分束器

15…多模光纤

16…光检测器

17…镜转向器

17a…平台位置变化装置

18…计算机

Claims (10)

1.一种目标粒子的检测方法，其特征在于，

其为检测在溶液中分散并随机运动的粒子的方法，具有：

(a)调制包含目标粒子、与所述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有所述发光探针的所述目标粒子、所述发光探针和所述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由所述目标粒子、所述发光探针和所述分离回收用粒子形成的复合体的工序；

(b)在所述工序(a)之后，从所述溶液中通过固液分离处理回收所述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；和

(c)算出所述工序(b)中调制的试样溶液中存在的所述复合体的分子数的工序，

所述分离回收用粒子与由所述目标粒子和所述发光探针形成的结合体结合，如下进行所述工序(c)的所述复合体的分子数的计数：

使用共聚焦显微镜或多光子显微镜的光学***，移动所述光学***的光检测区域的位置的工序；

一边在所述试样溶液内移动所述光学***的光检测区域的位置，一边检测由该光检测区域中的所述复合体发出的光的工序；

由所述检测到的光逐个检测来自每个复合体的光信号而逐个检测复合体的工序；和

对所述逐个检测到的复合体的个数进行计数而计数所述光检测区域的位置的移动中检测到的所述目标粒子的个数的工序。

2.根据权利要求1所述的目标粒子的检测方法，其中，所述分离回收用粒子在所述试样溶液中的沉降速度为1×10^-6m/s以下。

3.根据权利要求1或2所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置沿着第二路径移动，所述第二路径的位置沿着第一路径移动。

4.根据权利要求3所述的目标粒子的检测方法，其中，所述第一路径以及第二路径为循环路径；沿着所述第二路径的所述光检测区域的位置的移动周期短于沿着所述第一路径的所述第二路径的位置的移动周期。

5.根据权利要求3或4所述的目标粒子的检测方法，其中，

所述光检测区域的位置的移动周期τ1、所述第二路径的位置的移动速度v2、和所述光检测区域的直径d满足：

v2·τ1＞d。

6.根据权利要求3～5的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，通过改变所述光学***的光路而使所述光检测区域的位置沿着所述第二路径移动；通过移动所述试样溶液的位置而使所述试样溶液内的所述第二路径的位置沿着所述第一路径移动。

7.根据权利要求3～6的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，所述第二路径为圆形或椭圆形，所述第一路径为圆形、椭圆形或直线。

8.根据权利要求1～7的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在所述移动光检测区域的位置的工序中，所述光检测区域的位置以比所述复合体的扩散移动速度更快的速度移动。

9.根据权利要求1～8的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，在由所述检测到的光逐个检测来自每个复合体的光信号而逐个检测复合体的工序中，根据检测到的按照时间顺序的光信号的形状，检测到一个复合体进入了所述光检测区域。

10.根据权利要求1～9的任一项所述的目标粒子的检测方法，其中，所述分离回收用粒子为磁性粒子。

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