CN103760161A - 一种葡萄糖的比色检测方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种葡萄糖的比色检测方法，是将样品经预处理、加缓冲液稀释后与葡萄糖氧化酶混合，反应生成过氧化氢，然后加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液，混合反应后，采用目视比色法或紫外-可见分光光度计测定得出样品中葡萄糖的含量。本发明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再以二硫化钼为催化剂催化过氧化氢与显色剂的显色反应，采用目视比色法半定量测定葡萄糖浓度，或通过紫外分光光度计定量测定葡萄糖浓度。本发明解决了现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、操作简便、能够实现可视化快速检测样品中葡萄糖含量。
Description
技术领域
本发明属于葡萄糖检测技术领域，具体涉及一种葡萄糖的比色检测方法。
背景技术
近年来由于饮食结构的改变、生活节奏的日趋紧张以及少动多坐的生活方式等诸多因素的影响，全球糖尿病的发病率增长迅速，使糖尿病成为继肿瘤、心血管病变之后第三大严重威胁人类健康的慢性疾病。血清中葡萄糖含量的检测是临床检验和监控糖尿病的主要手段。目前用于血清葡萄糖含量检测的国家卫生标准参考方法（标准号：WS/T 350-2011）是采用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶联合的方法。这些天然酶在温和条件下具有较高的底物特异性和催化效率，但是天然酶存在纯化困难、易失活、不易保存、价格较高等缺点。在目前已经公布的葡萄糖含量检测相关专利中，主要为电化学方法（专利号：200710176028.0；专利号：200910067282.6；专利号：201010617684.1；专利号：201110083906.0；专利号：201110391001.X；专利号：201110343243.1；专利号：201110345081.5；专利号：201220071992.3；专利号：201210189645.5；专利号：201210416267.X；专利号：201310087177.5；专利号：201310141232.4；专利号：201310290148.9；专利号：201310354574.4）。电化学检测灵敏度高，但是容易受到血氧以及血液中其他电活性物质的干扰，而且在检测过程中需要消耗一定的能量，另外，电极的制备往往较为复杂且无法直观判断血清葡萄糖含量，需要专门的仪器。其他检测葡萄糖的方法如共振散射光谱法（专利号：200810073470.5）、近红外光谱法（专利号：98100787.2）、化学发光法（专利号：200910236714.1；专利号：201210509888.2）、荧光光谱法（专利号：200680029822.6；专利号：201310250093.9）等都需凭借昂贵的专业仪器并且在专业技术人员的操作下才能完成对葡萄糖的检测。而葡萄糖快速测定的相关试剂盒（专利号：201210459910.7）、试纸（专利号：200410033020.5；专利号：201210579953.9）等因其构造复杂，制作过程繁琐，价格昂贵，在实际应用中也受到很大的限制。基于酶催化体系的比色检测法是近年来较热门的检测方法，它利用反应过程中体系颜色及色度的变化实现对目标物的检测，具有检出限低，灵敏度高的优点，但是常需要使用过氧化物酶（HRP），而过氧化物酶价格较高、易失活、不易保存。因此，又有人提出基于模拟酶检测血清葡萄糖的方法。自中国科学院阎锡蕴课题组发现纳米材料四氧化三铁具有类过氧化物酶催化活性(Nature Nanotechnology，2007，2，577-583)以来，汪尔康等人利用该特性实现了对过氧化氢和葡萄糖的检测（Analytical Chemistry，2008，80，2250-2254），氧化石墨烯也被发现具有类过氧化物酶活性，并已应用于过氧化氢和葡萄糖的检测（Advanced Materials，2010，20，2255-2262）。在申请的专利中，人们也提出基于模拟酶比色检测葡萄糖的方法（专利号：201110275358.1；专利号：201310244132.4；专利号：201310260524.X）。然而这些方法成本高、颜色变化较为单一、不易保存携带。
发明内容
本发明的目的在于提供一种葡萄糖的比色检测方法，利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再以二硫化钼为催化剂催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖，可解决现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长，背景干扰大等问题，本发明的方法成本低、操作简便、能够实现可视化快速检测样品中葡萄糖的含量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种葡萄糖的比色检测方法，是将样品经预处理，加缓冲液稀释后与葡萄糖氧化酶混合，反应生成过氧化氢，然后加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液进行显色反应，采用目视比色法，将反应后的溶液颜色与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定葡萄糖的浓度。
所述比色标准系列的制备是将葡萄糖标准品加缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液进行显色反应即得比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
一种葡萄糖的比色检测方法，是将样品经预处理，加缓冲液稀释后与葡萄糖氧化酶混合，反应生成过氧化氢，然后加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算葡萄糖的含量。
所述标准曲线方程的建立是将葡萄糖标准品加缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后采用紫外-可见分光光度计测定在652 nm波长处的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计在450 nm波长处测定吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
稀释样品和葡萄糖标准品所用缓冲液的pH值为3-9。
显色反应中所用缓冲液的pH值为1-9。
显色反应的温度为30~60 ℃。
所用的显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
本发明的显著优点是：
（1）本发明通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再由二硫化钼催化显色剂与过氧化氢反应产生颜色变化，以指示葡萄糖的不同浓度。葡萄糖浓度不同，则溶液颜色及颜色深浅均不同；通过肉眼观察即可判断葡萄糖是否超标，而不必借助任何仪器，因此检测成本低，操作简便。
（2）本发明所使用的二硫化钼无需修饰即可用于葡萄糖的检测。
（3）本发明中分光光度法检测葡萄糖的检测限可以达到1 μM，线性范围为5 μM到150 μM（R2=0.9992）。
（4）本发明的反应条件温和，检测速度快，重现性好，且无需昂贵的检测仪器，操作简便，可实现葡萄糖的可视化快速识别和检测。
具体实施方式
标准葡萄糖溶液的检测：将20 μL葡萄糖氧化酶溶液与180 μL用缓冲液（pH 3-9）配制的不同浓度的葡萄糖溶液混合，30~60℃下反应30 min，然后加入0.05 mL的二硫化钼溶液、0.05 mL 显色剂和0.2 mL缓冲溶液(pH 1-9)，混匀，放置30 min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652 nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入10 μL 20%（V/V）硫酸溶液终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450 nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
样品中葡萄糖检测：取30 μL样品，用水稀释到50 μL，然后加入500 μL Ba(OH)2溶液，混匀，再加入500 μL ZnSO4溶液，混匀后在3880 rpm离心10 min。取200 μL 上清液，用缓冲液（pH 3-9）稀释5倍，作为测试样品。其他操作同标准葡萄糖溶液的测定。
所用的显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
标准葡萄糖溶液的检测：将20 μL葡萄糖氧化酶溶液（10 mg/mL）与180 μL用醋酸-醋酸钠缓冲液（10 mM，pH 3）配制的不同浓度的葡萄糖溶液混合，30 ℃下反应30 min，然后加入0.05 mL的二硫化钼溶液（18 mg/L）、0.05 mL 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（20 mM）和0.2 mL 醋酸-醋酸钠缓冲溶液(10 mM，pH 1)，混匀，放置30 min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在405 nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
血清葡萄糖检测：取30 μL血清样品，用水稀释到50 μL，然后加入500 μL Ba(OH)2溶液(0.11 M)，混匀，再加入500 μL ZnSO4溶液(0.0765 M)，混匀后在3880 rpm离心10 min。取200 μL上清液，用醋酸-醋酸钠缓冲液（10mM，pH 3）稀释5倍，作为测试样品。其他操作同标准葡萄糖溶液的测定。
实施例2
标准葡萄糖溶液的检测：将20 μL葡萄糖氧化酶溶液（10 mg/mL）与180 μL用Tris-HCl 缓冲液（10mM，pH 9）配制的不同浓度的葡萄糖溶液混合，60℃下反应30 min，然后加入0.05 mL的二硫化钼溶液（18 mg/L）、0.05 mL 邻苯二胺（0.3M）和0.2 mL Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 9)，混匀，放置30min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在450 nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
血清葡萄糖检测：取30 μL血清样品，用水稀释到50 μL，然后加入500 μL Ba(OH)2溶液(0.11 M)，混匀，再加入500 μL ZnSO4溶液(0.0765 M)，混匀后在3880 rpm离心10 min。取200 μL上清液，用Tris-HCl 缓冲液（10mM，pH 9）稀释5倍，作为测试样品。其他操作同标准葡萄糖溶液的测定。
实施例3
标准葡萄糖溶液的检测：将20 μL葡萄糖氧化酶溶液（10 mg/mL）与180 μL用Tris-HCl 缓冲液（10mM，pH 6.9）配制的浓度依次为0μM、5μM、20μM、40μM、60 μM、80μM、100μM、150 μM的标准葡萄糖溶液分别混合，37??C下反应30 min，然后加入0.05 mL二硫化钼溶液（18 mg/L）、0.05 mL 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液(12 mM) 和0.2 mL Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 6.9)，混匀，在30℃下放置30 min后，利用目视比色法进行半定量分析，或利用紫外-可见分光光度法在652 nm波长处测定吸光度，进行定量分析；或者加入10 μL 20%（V/V）硫酸溶液终止反应后，利用目视比色法进行半定量分析或利用紫外-可见分光光度法在450 nm波长处测定吸光度，进行定量分析。
结果显示，随着葡萄糖浓度的增加，二硫化钼催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行显色反应的产物在652 nm左右的吸光度逐渐增大，相应溶液的颜色由黄色逐渐变为浅绿色，再由蓝绿色变至蓝色。加入硫酸终止反应后，随着葡萄糖浓度的增加，二硫化钼催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺进行显色反应的产物在450 nm左右的吸光度逐渐增大，相应的溶液的颜色由浅黄色逐渐变为深黄色，线性方程为Y=0.234+0.0114X（R2=0.9992）。
血清葡萄糖检测：取30 μL血清样品用水稀释到50 μL，然后加入500 μL Ba(OH)2溶液（0.11 M），混匀，再加入500 μL ZnSO4溶液（0.0765 M），混匀后在3880 rpm离心10 min。取200 μL上清液，用Tris-HCl 缓冲液（10 mM，pH 6.9）稀释5倍作为测试样品，其他操作同标准葡萄糖溶液的测定。
结果显示，随着血清中葡萄糖浓度的升高，测试样品溶液颜色（蓝色或深黄色）逐渐加深。
本发明利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再以二硫化钼为催化剂催化过氧化氢与显色剂的显色反应来检测葡萄糖，随着葡萄糖浓度不同，溶液颜色及颜色深浅均不同，通过肉眼观察即可判断葡萄糖是否超标，而不必凭借任何仪器，因此检测成本低，操作简便。而分光光度法检测葡萄糖的检测限可以达到1 μM，线性范围为5 μM到150 μM（R2=0.9992）。本发明反应条件温和，检测速度快，重现性好，可实现葡萄糖的可视化快速识别和检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：将样品经预处理，加缓冲液稀释后与葡萄糖氧化酶混合，反应生成过氧化氢，然后加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液进行显色反应，采用目视比色法，将反应后的溶液颜色与比色标准系列进行比较，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用目视比色法半定量测定葡萄糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：所述比色标准系列的制备是将葡萄糖标准品加缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液进行显色反应即得比色标准系列，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应得到比色标准系列。
3.一种葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：将样品经预处理、加缓冲液稀释后与葡萄糖氧化酶混合，反应生成过氧化氢，然后加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并根据标准曲线方程计算葡萄糖的含量。
4.根据权利要求3所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立是将葡萄糖标准品加缓冲液稀释，配制成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液与葡萄糖氧化酶混合反应后，加入二硫化钼溶液、显色剂和缓冲液，显色反应后采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，或在显色反应后加入硫酸溶液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖的浓度作为横坐标，绘制标准曲线并得出标准曲线方程。
5.根据权利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：稀释样品和葡萄糖标准品所用缓冲液的pH值为3-9。
6.根据权利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：显色反应中所用缓冲液的pH值为1-9。
7.根据权利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：显色反应的温度为30~60℃。
8.根据权利要求1-4任一所述的葡萄糖的比色检测方法，其特征在于：所用的显色剂为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐或邻苯二胺。
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