CN103720655A

CN103720655A - 一种d型多肽介导的靶向脂质体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103720655A
Application number: CN201210383701.9A
Authority: CN
Inventors: 闫志强; 杨一祎; 魏岱旭; 钟建; 何丹农
Original assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai National Engineering Research Center for Nanotechnology Co Ltd
Priority date: 2012-10-11
Filing date: 2012-10-11
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2032-10-11
Also published as: CN103720655B

Abstract

本发明属药物制剂领域，涉及一种D型多肽介导的靶向脂质体及其制备方法和应用。本发明涉及一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，该靶向脂质体的组成为：.磷脂、胆固醇、.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物、D型多肽介导的靶向高分子材料；各成分之间的摩尔比为：a：b=5：1～1：5，a：c=1000：1～1000：100，a：d=1000：0.1～1000：100。由于D型多肽与相对应的L型多肽相比稳定性有显著提高，因此本发明得到的D型多肽介导的靶向脂质体显示出更好的肿瘤靶向性与抗肿瘤作用。该靶向脂质体可用于肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

Description

一种D型多肽介导的靶向脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属药物制剂领域，涉及靶向脂质体制剂，具体说是一种D型多肽介导的靶向脂质体。本发明专利涉及D型多肽介导的靶向高分子材料、D型多肽介导的靶向脂质体、载药脂质体、制备方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤一直是困扰人类的重要疾病，目前尚无治愈癌症的方法。常用的化学药物疗法，由于其选择性差，毒副作用大，在应用上受到极大的限制。因此，开发一种能将化疗药物选择性地浓集在肿瘤组织，并且将其高效地载入肿瘤细胞的具有肿瘤靶向性的载体就具有十分重要的意义。

由于肿瘤组织对具有一定粒径的纳米颗粒（10-500nm）具有EPR（高通透性和滞留）效应，即处在血循环中的纳米颗粒可被动靶向至肿瘤组织，发挥所包载药物的抗肿瘤作用。目前，已有多种利用此效应用于肿瘤靶向治疗的纳米递药***上市，如阿霉素脂质体、顺铂脂质体和紫杉醇白蛋白纳米粒。同时由于肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞上表达有一系列特异性受体，研究者们利用其配体修饰纳米递药***，以实现对肿瘤组织的主动靶向递药。

脂质体因具有良好的生物相容性，对被包载的药物具有保护作用以及良好的药动学特征被认为是非常有前途的肿瘤靶向载体。在脂质体表面连接配体或抗体，可以使脂质体获得主动靶向。其中，多肽配基以其分子量小、特异性强的特点在递药***导向分子中占有重要地位。目前常用的多肽配基为天然L型多肽，由于体内存在大量蛋白多肽水解酶，L型多肽在体内易被降解，失去靶向活性。

因此，为了克服传统的L型多肽配基在生理环境下稳定性不理想，易被酶降解的局限性，研究者开展了大量的工作以提高生物活性多肽的稳定性，采用的策略包括多肽侧链改造、非天然氨基酸替换、结构环化等。最终，Chorev和Goodman等人提出的逆反化（retro-inverso）技术为获取稳定性多肽提供了新的思路。通过逆反化技术获得的D型多肽具有高度稳定性。通过稳定性更强的D型多肽介导有望为肿瘤主动靶向治疗及其纳米载体设计提供新的思路，实现更优的治疗效果，显示出良好的潜在应用价值。

Neuropilin-1（NRP-1）是细胞表面的一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，通常表达在一些肿瘤细胞和血管内皮细胞表面，是血管内皮生长因子165（VEGF165）的受体，在肿瘤转移、血管新生、调节血管通透性等方面发挥重要功能。人神经胶质瘤临床病理标本中有NRP-1显著表达，且其表达量随神经胶质瘤恶性程度增加而增加，但在相应的正常组织上皮细胞中却没有表达。目前已有研究者利用NRP-1受体抑制剂来抑制肿瘤血管新生从而达到抑制肿瘤生长和转移的目的。多肽RPARPAR、RPAKPAR、RGERPPR、PVTRPPR、APARPAP等是通过噬菌体展示技术筛选得到的直链七肽，是NRP-1的配体，它们对NRP-1高表达的肿瘤细胞和肿瘤血管表现出特异亲和性，且具有介导噬菌体穿透肿瘤血管进入肿瘤组织内部的能力。

本发明利用逆反化技术，设计了上述这些靶向多肽对应的D型多肽：^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DEG^DR、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA，并将其用于修饰脂质体递药***。该***可通过静脉注射给药，利用肿瘤EPR效应和D型多肽介导作用将其靶向至肿瘤部位，且能在体内停留较长的时间。此脂质体递药***可用作肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

发明内容

本发明的目的是提供一种D型多肽介导的靶向高分子材料、靶向脂质体、载药脂质体、制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，该靶向脂质体的组成为：

a.磷脂；

b.胆固醇；

c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；

d. D型多肽介导的靶向高分子材料；

上述各成分之间的摩尔比为：a：b=5：1～1：5，a：c=1000：1～1000：100，a：d=1000：0.1～1000：100。

组分a所述的磷脂为：蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一种。

组分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一种。

组分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量为400～6000。

组分d所述D型多肽介导的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1：1：1；

其中所述D型多肽的氨基酸序列选自^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DEG^DR、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA；所述的聚乙二醇的重均分子量为400～8000；所述的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一种；

其中所述的D型多肽介导的靶向高分子材料的制备方法包括如下步骤：采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸（Cys）的D型多肽，将其溶于pH7.0的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，两者混合后搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的多肽和DMF，冷冻干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，即D型多肽介导的靶向高分子材料。

所述的聚乙二醇的重均分子量为2000～5000。

本发明提供一种D型多肽介导的靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸铵溶液，在20～-70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20～70℃水浴中依次挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为D型多肽介导的靶向脂质体。

本发明提供一种D型多肽介导的靶向脂质体作为载药脂质体在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用；其中包载的药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。

本发明利用逆反化技术，设计了多个L型靶向多肽所对应的D型多肽：^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DEG^DR、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA，并将这些D型多肽修饰到脂质体表面。该***可通过静脉注射给药，利用肿瘤EPR效应和D型多肽介导作用将其靶向至肿瘤部位。

与常规L型多肽介导的靶向脂质体相比，由于体内没有D型多肽的水解酶，D型多肽比L型多肽稳定性大大提高，从而提高其靶向效果和对肿瘤的治疗效果。

与L型多肽相比，D型多肽在体外血浆中的稳定性比相对应的L型多肽稳定性有显著增加。

本发明的脂质体用激光散射法测定粒径分布。其平均粒径为50~200nm。

本发明通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞对载羧基荧光素（FAM）脂质体的体外摄取，结果证实D型多肽在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞。

本发明通过近红外染料DiR标记脂质体，将包载DiR脂质体经静脉注射于肿瘤动物模型体内，在活体成像仪下观测，证明D型多肽修饰的脂质体对肿瘤组织具有很好的靶向性。

此脂质体递药***可用作肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

于D型多肽与相对应的L型多肽相比稳定性有显著提高，因此本发明得到的D型多肽介导的靶向脂质体显示出更好的肿瘤靶向性与抗肿瘤作用。该靶向脂质体可用于肿瘤诊断或治疗药物的靶向递送。

附图说明

附图1是RPAKPAR与^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR（RI-RPAKPAR）在血浆中的稳定性。

附图2是^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC-PEG-DSPE的¹H-NMR图谱。

附图3是脂质体/DOX和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DOX粒径分布图。

附图4是四种脂质体的透射电镜照片。

附图5是^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM和脂质体/FAM被PC-3肿瘤细胞摄取照片。

附图6是 ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR和脂质体/DiR在***癌皮下瘤动物模型的活体成像图片。

附图7 是^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/阿霉素（RI-RPAKPAR-LS/DOX）对***癌皮下瘤的生长抑制作用。

具体实施方式

通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。

实施例1：

D型多肽-PEG-DSPE的合成、纯化和表征：

采用Boc固相多肽合成技术合成^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC多肽，将其溶于PBS溶液中(pH7.0)，取Mal-PEG-DSPE（马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物）溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，HPLC（高效液相色谱法）监测反应，待Mal-PEG-DSPE反应完全后停止反应，过量的^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC和DMF通过透析（截留分子量3.5kDa）除去。冷冻干燥，得^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE，NMR表征其结构，结果显示，Mal-PEG-DSPE图谱在6.67ppm处显示Mal的特征峰，而^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE图谱上此峰消失，说明^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE合成成功。

其余D型多肽^DR^DP^DP^DR^DEG^DRC、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DPC、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DAC按上述步骤操作，可分别获得^DR^DP^DP^DR^DEG^DRC-PEG-DSPE、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC-PEG-DSPE、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DPC-PEG-DSPE、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DAC-PEG-DSPE。

实施例2：

DRDADPDRDADPDR -脂质体/FAM的制备和表征：

脂质体膜材料处方组成为HSPC（氢化大豆磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物） (55: 45: 2, mol/mol)，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入FAM水溶液水化，60℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机（若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器）依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得脂质体。脂质体用动态光散射法和透射电子显微镜测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰对其粒径无明显影响。

其余D型多肽按上述步骤操作，可分别获得^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/FAM、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/FAM、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/FAM、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA-脂质体/FAM。

实施例3：

DRDADPDRDADPDR -脂质体/DiR的制备和表征：

脂质体膜材料处方组成为 HSPC（氢化大豆磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物） (55: 45: 2, mol/mol)，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，加入DiR甲醇溶液（1.5mg/ml）30μl，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均匀脂质膜，真空干燥 24 小时。加入生理盐水水化，60℃水浴震荡 2 小时，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机（若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器）依次将脂质体挤压过 400、200、100和 50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的DiR，得脂质体。脂质体用动态光散射法和透射电子显微镜测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰对其粒径无明显影响。

其余D型多肽按上述步骤操作，可分别获得^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/DiR、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/DiR、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/DiR、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA-脂质体/DiR。

实施例4：

^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR -脂质体/DOX的制备和表征：

PEG-脂质体膜材料处方组成为HSPC（氢化大豆磷脂）/Chol（胆固醇）/mPEG-DSPE（聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物） (55: 45: 2, mol/mol)，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG-DSPE/ ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DRC-PEG-DSPE (55: 45: 2: 0.5, mol/mol)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得均匀脂质膜，真空干燥24h。加入一定体积的0.155M硫酸铵溶液，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在60℃水浴中，使用高压均质机（若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器）依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体。以生理盐水为洗脱剂，将空白脂质体洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱更换外水相。按照药脂比 1:10 (w/w) 加入阿霉素生理盐水溶液， 60℃水浴 20min。以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得阿霉素脂质体。脂质体用动态光散射法和透射电子显微镜测定粒径，结果显示，平均粒径均为90nm左右，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR修饰对其粒径无明显影响。

其余D型多肽按上述步骤操作，可分别获得^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/DOX、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/DOX、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/DOX、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA-脂质体/DOX。

实施例5：

DRDADPDRDADPDR-脂质体体外肿瘤细胞靶向性验证：

取对数生长期的单层培养PC-3肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶和0.025%乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1×10⁵个细胞接种于培养皿中，每孔体积 1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37℃，5%二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的脂质体/FAM和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM溶液。将培养皿中的培养液吸出，加入脂质体/FAM和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM的系列溶液，37℃孵育1h，吸弃上清液。用PBS溶液洗皿两次，在激光共聚焦显微境下观察细胞内化情况。结果显示脂质体/FAM几乎不被摄取，而^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM则被大量摄取，说明^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM对肿瘤细胞具有良好的体外靶向性。

采用上述方法，验证其余D型多肽修饰脂质体（^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/FAM、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/FAM、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/FAM、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA-脂质体/FAM）的体外靶向性。

实施例6：

DRDADPDRDADPDR-脂质体体内静脉注射后对***癌皮下瘤靶向性的验证：

将处于对数生长期的PC-3细胞胰酶消化，PBS洗涤，分散于PBS中，以1×10⁷细胞（100??l）浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。取成瘤裸鼠模型6只，随机分为两组，分别尾静脉注射脂质体/DiR和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR，给药后不同时间点将裸鼠麻醉，在活体动物成像***内扫描脂质体/DiR和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织的分布。结果显示与脂质体/DiR相比，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR在裸鼠肿瘤组织内的分布显著增加，表明^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR的修饰实现了脂质体对肿瘤的靶向递药。

采用上述方法，验证其余D型多肽修饰脂质体（^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/DiR、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/DiR、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/DiR、DPDADPDRDADPDA-脂质体/DiR）的体内靶向性。

实施例7：

DRDADPDRDADPDR-脂质体/DOX对***癌皮下瘤的生长抑制作用：

将处于对数生长期的PC-3肿瘤细胞胰酶消化，PBS洗涤，分散于PBS中，以1×10⁷细胞（100??l）浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。将24只已接种PC-3肿瘤细胞的裸鼠随机分为4组（每组6只），分别设为N.S.，DOX，脂质体/DOX和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DOX组。将100??l相应的制剂分别在接种后第29、35、41天经尾静脉注射到裸鼠体内，阿霉素的总剂量为18mg/kg。在接种后51天，将裸鼠处死，取出皮下瘤测量体积。体积由以下公式计算得到：

V (mm³) = (d² × D) / 2

其中d和D分别为皮下瘤的短径和长径，单位为mm。

采用上述方法，验证其余D型多肽修饰脂质体（^DR^DP^DP^DR^DEG^DR-脂质体/DOX、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR-脂质体/DOX、^DR^DP^DP^DR^DT^DV^DP-脂质体/DOX、^DP^DA^DP^DR^DA^DP^DA-脂质体/DOX）的体内靶向性。

附图1、RPAKPAR与^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR（RI-RPAKPAR）在血浆中的稳定性

由图可见，多肽RPAKPAR在血浆中24h降解剩余15%左右，而^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DR则基本未被降解，说明D型多肽与对应的L型多肽相比，稳定性有显著提高。

附图2、^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC-PEG-DSPE的¹H-NMR图谱

图中A为Mal-PEG-DSPE的核磁图谱，B为^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC-PEG-DSPE的核磁图谱，由图可看出，A图显示出马来酰亚胺峰，而B图中该峰消失，而其余峰基本保持不变，显示Mal-PEG-DSPE中的马来酰亚胺基团已与^DR^DA^DP^DK^DA^DP^DRC反应。

附图3、脂质体/DOX和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DOX粒径分布图

脂质体/FAM和^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。

附图4 四种脂质体的透射电镜照片

由图可见脂质体均为球形或近球形的小单室脂质体，外观圆整，平均粒径与粒度仪测定结果相近。

附图5、^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM和脂质体/FAM被PC-3肿瘤细胞摄取照片

^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM（A）和脂质体/FAM（B）于37℃分别与肿瘤细胞作用4小时后的荧光显微照片，由图可知，肿瘤细胞对^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/FAM的摄取量远大于脂质体/FAM。

附图6 ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR和脂质体/DiR在***癌皮下瘤动物模型的活体成像图片

^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR（左）和脂质体/DiR（右）分别尾静脉注射至***癌皮下瘤动物模型体内，24小时后活体成像仪检测，由图可知，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DiR在肿瘤组织内的分布量远大于脂质体/FAM，显示出良好的肿瘤靶向性。

附图7 ^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/阿霉素（RI-RPAKPAR-LS/DOX）对***癌皮下瘤的生长抑制作用

药效学实验结果如图所示，^DR^DA^DP^DR^DA^DP^DR-脂质体/DOX组皮下瘤体积显著小于RPAKPAR-脂质体/DOX组，说明与L型多肽相比，D型多肽修饰的脂质体在增强阿霉素抗肿瘤生长作用方面显示出显著的优越性。

Claims

1.一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，该靶向脂质体的组成为：

a.磷脂；

b.胆固醇；

c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；

d. D型多肽介导的靶向高分子材料；

2.根据权利要求1所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，组分a所述的磷脂为：蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂、二硬脂酰鞘磷脂中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，组分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺、蛋磷脂酰乙醇胺中的一种。

4.根据权利要求1所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，组分c所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量为400～6000。

5.根据权利要求1所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，组分d所述D型多肽介导的靶向高分子材料由D型多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中D型多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1：1：1；

其中所述的D型多肽介导的靶向高分子材料的制备方法的具体步骤为：采用固相多肽合成法合成C端外接半胱氨酸（Cys）的D型多肽，将其溶于pH7.0的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，两者混合后搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的多肽和DMF，冷冻干燥，得到D型多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，即D型多肽介导的靶向高分子材料。

6.根据权利要求5所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体，其特征在于，所述的聚乙二醇的重均分子量为2000～5000。

7.根据权利要求1～6之一所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均匀脂质膜，真空干燥；再加入0.155M的硫酸铵溶液，在20～-70℃水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20～70℃水浴中依次挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为D型多肽介导的靶向脂质体。

8.根据权利要求1～6之一所述的一种D型多肽介导的靶向脂质体作为载药脂质体在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用；其中包载的药物选自阿霉素、表阿霉素、柔红霉素、紫杉醇或紫杉醇衍生物。