CN102091036A - 一种含有抗肿瘤药物的复合脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于脂质体，特别涉及肿瘤组织高度靶向性、肿瘤细胞高效穿透性的复合脂质体制剂，其特征为运用透明质酸或透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽和脂质体共同构建一种复合脂质体。此复合脂质体特征在于利用透明质酸和肿瘤选择性穿膜肽的双重肿瘤细胞靶向性，有效解决常规脂质体以及传统穿膜肽对正常和肿瘤细胞均无选择性而导致其治疗时药效增加的同时毒性也增加的难题，充分实现肿瘤药物制备成制剂用于治疗时所需的高效、低毒的临床需求。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体的说是运用透明质酸或透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽和脂质体共同构建一种复合脂质体。此复合脂质体特征在于利用透明质酸和肿瘤选择性穿膜肽的双重肿瘤细胞靶向性，有效地解决常规脂质体以及传统穿膜肽对正常和肿瘤细胞均无选择性而导致其治疗时药效增加的同时毒性也增加的难题，充分实现肿瘤药物制备成制剂用于治疗时所需的高效、低毒的临床需求。
背景技术：
穿膜肽(cell-permeable peptides，CPP)是一类具有较强细胞膜穿透能力的多肽，它们具有高效穿过细胞膜而不损伤细胞膜结构和功能的特点。将穿膜肽通过共价键或非共价键偶合等方式携带各种分子或纳米载体透过细胞膜，已经在介导基因、蛋白质、多肽、小分子、纳米颗粒和脂质体等穿透各种细胞膜方面发挥了巨大作用。
现有研究表明，传统的穿膜肽和普通脂质体(未经修饰的)对正常组织和肿瘤组织一般无选择性，即使主动靶向性脂质体在正常组织也有一定数量的分布，如果将传统的穿膜肽如R8等用来修饰普通脂质体后，由于穿膜肽的高效穿膜特性，在增加肿瘤细胞内药物量的同时，必然伴随正常细胞中药物量的相应增加，这将导致正常细胞组织的更大伤害(毒副作用明显增加)。因此，如果能够构建一种具有肿瘤细胞选择性的穿膜肽，与采用普通穿膜肽相比，将其通过共价键或非共价键偶合等方式与脂质体等纳米载体相结合并携带其穿过细胞膜，在靶向***疾病的领域将具有更大的应用前景。
肿瘤细胞选择性穿膜肽(selective cell penetration peptides on tumor cell，SCPPt)为本实验室在经典穿膜肽基础上创新研究出的一种新型穿膜肽，它具有对肿瘤细胞膜有较高的穿透效率，而对正常细胞膜几乎无穿透或穿透效率较低的特点，主要由5～12个精氨酸和3个组氨酸组成。带有本实验室发明的氨基酸序列的穿膜肽在正常pH环境下，仅带有少量正电荷，无法与细胞表面高度结合而穿膜；而当到达肿瘤组织细胞表面时由于其偏酸性的环境使得组氨酸和精氨酸协同表现出带有大量正电荷，从而能够高效地与带负电荷的细胞表面相结合，体现出较强的穿透肿瘤细胞膜的作用。
透明质酸(HA)是以D-葡萄糖醛酸-N-乙酰氨基葡萄糖为双糖单位组成的直链高分子多糖，是一种广泛存在于机体多种组织的细胞外基质、细胞表面和细胞内部的阴离子物质，属于体内内源性物质，不诱发免疫反应，安全性高。近年来研究表明，HA可与肿瘤细胞表面高表达的CD44、RHAMM等受体结合，激活针对HA的细胞内信号通路或激活HA的内化作用，而调节细胞的运动等行为，且可被肿瘤细胞表面高度表达的HA酶迅速降解消除。此外，***内高浓度HA也有利于巨噬细胞游走，发挥吞噬和杀伤肿瘤细胞的作用。据文献报道，HA可借助其粘弹性作用所形成大分子网状结构包绕巨噬细胞，将巨噬细胞与被吞噬细胞或颗粒隔离，从而限制巨噬细胞的吞噬作用，延长其包被载体的血液循环时间，具有长循环效应。HA为电负性，通过静电作用自组装在正电性的脂质体表面，并证明可显著提高脂质体的肿瘤靶向性。鉴于HA具有良好的生物相容性和可降解性、长循环和负电性、无免疫原性、肿瘤细胞高亲和性和抗肿瘤辅助治疗作用等，已成为目前抗肿瘤主动靶向载体的研究热点之一。
发明内容：
发明目的
本发明的目的旨在提供一种肿瘤组织高度靶向性、肿瘤细胞高效穿透性的复合脂质体及其制备方法和用途。
技术方案
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种含有抗肿瘤药物的复合脂质体，其特征在于：它含有抗肿瘤药物、脂质、透明质酸或透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽。
所述的复合脂质体，其特征在于：按质量比，它含有0.01％-30％的抗肿瘤药物，1％-98％的脂质，0.001％-20％透明质酸钠，0.001％-20％的肿瘤细胞选择性穿膜肽，0-20％的醇，0-20％的抗氧剂，0-20％的防腐剂，0-20％的pH调节剂，0-20％的相变调节剂，0-20％的长循环材料，0-20％的等渗调节剂，0-95％的冻干支撑剂，0-95％的水。
所述的复合脂质体，其特征在于所述的抗肿瘤药物选自下列药物中的一种或多种：紫杉醇、多西紫杉醇、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、长春新碱、长春瑞滨、顺铂、奥沙利铂、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、阿糖胞苷、脱氧氟尿苷、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、米托蒽醌、环磷酰胺、异环磷酰胺、丝裂霉素C、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、吉西他滨、卡培他滨、地西他滨、安西他滨、顺铂、博来霉素、平阳霉素、藤黄酸、新藤黄酸以及这些药物的各种药用盐。
所述的复合脂质体，其特征在于所述的脂质是磷脂和胆固醇，磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或多种。
所述的复合脂质体，其特征在于所述的透明质酸或透明质酸钠的相对分子质量从4×103道尔顿到2×107道尔顿。
所述的复合脂质体，其特征在于所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽对于肿瘤细胞或组织有较强的细胞膜穿透作用，对正常细胞或组织的细胞膜穿透作用较弱或不能透过。
所述的复合脂质体，其特征在于所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽选自下列多肽中的一种或多种：RRRRRHHH(R5H3，R在C端或N端)、RRRRRRHHH(R6H3，R在C端或N端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRHHH(R9H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRHHH(R10H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRRHHH(R11H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3，R在C端或N端)，它们的N端被脂肪酸修饰，脂肪酸优选碳链含有8-18个碳原子的，更优选的是硬脂酸。
所述的复合脂质体其特征在于可以制备***的药物制剂。
有益成果
当该复合脂质体注入静脉后，将首先借助外层透明质酸包被具有的长循环性、肿瘤靶向性以及生物降解性，主动聚集于肿瘤组织及细胞表面并被该部位高浓度透明质酸酶迅速降解，使肿瘤细胞选择性穿膜肽裸露于脂质体表面，充分发挥其对肿瘤细胞的高效穿透作用，携带脂质体更多地进入肿瘤细胞，从而使脂质体所包封的抗肿瘤药物更多地进入时瘤细胞并发挥细胞毒作用。此复合脂质体在解决肿瘤组织药物浸润性差难题的同时，有效降低细胞毒药物对正常细胞的伤害，显著改善常用细胞毒药物和穿膜肽由于无肿瘤细胞靶向性而导致的毒副作用，具有非常广阔的应用前景。
具体实施方式：
下列实施例中的R为精氨酸，H为组氨酸
实施例1
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与盐酸多柔比星脂质体来说明这一复合脂质体的制备方法。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.39gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mL DMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入2.00g(3.09mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.64g(3.09mmol)二环己基碳二亚胺和0.42g(3.09mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述的产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRHHH的纯品。质谱表明，其分子量为2143，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3。
依处方量称取注射用大豆磷脂和胆固醇于茄型瓶中，加入一定量氯仿使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。加入柠檬酸溶液(pH4.0)常温手摇水化药脂薄膜，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。离心3000rpm以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各5次进行整粒即可制得空白脂质体。然后在脂质体分散体系中加入盐酸多柔比星，并用1mol/L的Na2HPO4将pH值调节至7.0。最后调整体积，使多柔比星浓度为1mg/mL。将此分散体系于55℃孵育20min即得盐酸多柔比星脂质体。
精密称取8mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的盐酸多柔比星脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的盐酸多柔比星脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3对盐酸多柔比星脂质体的修饰没有对普通盐酸多柔比星脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于90％，常温放置24小时渗漏率小于4％。
精密称取相对分子质量为3×105的透明质酸钠5mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的盐酸多柔比星脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与盐酸多柔比星脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为147.8nm，zeta电位为-20.3mV，多分散指数PDI为0.236，盐酸多柔比星包封率为92.7％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
实施例2
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与硫酸长春新碱脂质体来说明这一复合脂质体的制备方法。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.39gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mL DMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入2.00g(3.09mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.64g(3.09mmol)二环己基碳二亚胺和0.42g(3.09mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述的产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRHHH的纯品。质谱表明，其分子量为2143，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3。
依处方量称取氢化大豆磷脂和胆固醇，溶解于适量的二氯甲烷∶甲醇(体积比1∶1)中，于50℃水浴挥除有机溶剂。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。加入枸橼酸溶液(pH4.3)50℃水浴旋转洗膜，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。离心3000rpm以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各3次进行整粒即可制得空白脂质体。然后在脂质体分散体系中加入硫酸长春新碱溶液和pH9.0的Na2HPO4溶液。加入注射用水使外水相调节pH至7.3，在55℃水浴保温15min即得硫酸长春新碱脂质体。
精密称取8mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3，并将其充分溶解于4mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的硫酸长春新碱星脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的硫酸长春新碱脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3对硫酸长春新碱脂质体的修饰没有对普通硫酸长春新碱脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于80％，常温放置24小时渗漏率小于4％。
精密称取相对分子质量为3×105的透明质酸钠8mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的硫酸长春新碱脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与硫酸长春新碱脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为203.8nm，zeta电位为-23.7mV，多分散指数PDI为0.156，硫酸长春新碱包封率为86.1％。以一定配比的蔗糖和甘露醇为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
实施例3
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3与甲氨蝶呤脂质体来说明这一复合脂质体的制备方法。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.65gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mL DMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入2.38g(3.67mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.76g(3.67mmol)二环己基碳二亚胺和0.50g(3.67mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRRRHHH的纯品。纯品的质谱表明，其分子量为2491，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3。
依处方量称取蛋黄卵磷脂和胆固醇于茄型瓶中，加入4mL***溶解，于冰水浴中一边搅拌一边滴加甲氨蝶呤水溶液2mL。待形成均匀稳定的W/O型乳浊液后，于40℃减压旋蒸蒸去***，得到棕色乳浊液，100W功率探头超声15min，最后0.45μm聚碳酸酯微孔滤膜5次即得甲氨蝶呤脂质体。将甲氨蝶呤脂质体分散体系装入透析袋中，以双蒸水为透析介质，室温下透析24小时除去未包封药物。
精密称取10mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3，并将其充分溶解于4mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的甲氨蝶呤脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3修饰的甲氨蝶呤脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3对甲氨蝶呤脂质体的修饰没有对普通甲氨蝶呤脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于70％，常温放置24小时渗漏率小于5％。
精密称取相对分子质量为1×105的透明质酸钠8mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3修饰的甲氨蝶呤脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R10H3与甲氨蝶呤脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为276.4nm，zeta电位为-24.3mV，多分散指数PDI为0.186，甲氨蝶呤包封率为72.3％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
实施例4
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3与新藤黄酸脂质体来说明这一复合脂质体的制备方法。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.52gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入2.19g(3.38mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.70g(3.38mmol)二环己基碳二亚胺和0.46g(3.38mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRRHHH的纯品。纯品的质谱表明，其分子量为2317，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3。
依处方量称取大豆磷脂、胆固醇和新藤黄酸，共溶于适量的氯仿中。将此溶液置于100mL茄型瓶中，40℃恒温水浴减压旋转蒸发，抽除氯仿，1小时后即在瓶壁形成均匀的药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。加入pH7.4的PBS缓冲溶液，室温下常压旋转洗膜至薄膜完全脱落。采用探头超声仪超声15min以减小粒径，然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各一次即可制得新藤黄酸脂质体。
精密称取10mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3，并将其充分溶解于4mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的新藤黄酸脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3修饰的新藤黄酸脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3对新藤黄酸脂质体的修饰没有对普通新藤黄酸脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于80％，常温放置24小时渗漏率小于3％。
精密称取相对分子质量为5×104的透明质酸钠8mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3修饰的新藤黄酸脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R9H3与新藤黄酸脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为147.6nm，zeta电位为-19.3mV，多分散指数PDI为0.206，新藤黄酸包封率为82.3％。以1％的甘露醇为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以0.9％氯化钠溶液复溶供注射使用。
实施例5
以肿瘤细胞选择性穿膜肽(R5H3、R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与硫酸长春新碱脂质体所构建的肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的硫酸长春新碱脂质体的体外抑瘤实验为例来说明这一制剂的抗肿瘤功效。
依处方量称取氢化大豆磷脂和胆固醇，溶解于适量的二氯甲烷∶甲醇(体积比1∶1)中，于50℃水浴挥除有机溶剂。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。加入枸橼酸溶液(pH4.3)50℃水浴旋转洗膜，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。离心3000rpm以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各3次进行整粒即可制得空白脂质体。然后在脂质体分散体系中加入硫酸长春新碱溶液和pH9.0的Na2HPO4溶液。加入注射用水使外水相调节pH至7.3，在55℃水浴保温15min即得硫酸长春新碱脂质体。
精密称取8mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3，并将其充分溶解于4mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到以上制得的硫酸长春新碱星脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的硫酸长春新碱脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3对硫酸长春新碱脂质体的修饰没有对普通硫酸长春新碱脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于80％，常温放置24小时渗漏率小于4％。
其他肿瘤细胞选择性穿膜肽(R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与硫酸长春新碱脂质体所构建的脂质体剂型可采用相同的方法制备。
另外，采用相同的方法制备硫酸长春新碱脂质体，并按上述方法用N端被硬脂酸修饰的穿膜肽R8制备R8修饰的硫酸长春新碱脂质体。
选择处于对数生长期的人肝癌细胞株HepG2，弃去培养基并加胰酶消化1min，加入适量DMEM培养基终止消化，镜检计算细胞密度，加入一定量培养基制成5×104个/mL的细胞悬液。加细胞悬液至96孔板，每孔200μL。37℃，5％CO2培养箱培养24小时。配制各种肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的硫酸长春新碱脂质体、R8修饰的硫酸长春新碱脂质体、未修饰的硫酸长春新碱脂质体和硫酸长春新碱注射液的不同浓度的药液。96孔板弃去培养基，在加入200μL用DMEM培养基稀释的药物溶液，使硫酸长春新碱在板上的终浓度均为：1、3、10、15、30、60、120、180、240、300μg/mL，每个浓度设3个复孔，以不加药组为对照。加药后移入37℃，5％CO2培养箱培养48小时。然后，弃去孔内液体，加入DMEM培养基190μL/孔和MTT(5mg/mL)10μL/孔。37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时后，弃去各孔内原有液体，加入二甲基亚砜200μL/孔以溶解沉淀。30min后用酶标仪在570nm波长下测定各孔光密度值。计算药物抑制率：药物抑制率＝(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100％。结果如表一所示，与R8修饰的硫酸长春新碱脂质体、未修饰的硫酸长春新碱脂质体和硫酸长春新碱注射液相比，各种肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的硫酸长春新碱脂质体的细胞毒作用明显增强(P＜0.05)。
表一 实验组各制剂对人肝癌细胞株HepG2的半数抑制浓度(IC50)
制剂 IC50(μg/mL)
硫酸长春新碱注射液 46.3±2.7
未修饰的硫酸长春新碱脂质体 36.1±3.0
R8修饰的硫酸长春新碱脂质体 30.8±1.9
R5H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 25.3±2.7
R6H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 23.3±2.3
R7H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 21.2±2.1
R8H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 19.8±2.4
R9H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 22.0±1.7
R10H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 23.1±1.2
R11H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 24.2±2.6
R12H3修饰的硫酸长春新碱脂质体 25.1±2.4
实施例6
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的组织分布为例来说明其肿瘤靶向性。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.39gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入2.00g(3.09mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.64g(3.09mmol)二环己基碳二亚胺和0.42g(3.09mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的修饰的RRRRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRRRHHH的纯品。纯品的质谱表明，其分子量为2143，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3。
依处方量称取注射用大豆磷脂、胆固醇和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的氯仿使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。10mL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各一次即可制得紫杉醇脂质体。
精密称取8mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3对紫杉醇脂质体的修饰没有对普通紫杉醇脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于96％，常温放置24小时渗漏率小于3％。
精密称取相对分子质量为104的透明质酸钠10mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3修饰的紫杉醇脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R8H3与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为168.4nm，zeta电位为-18.7mV，多分散指数PDI为0.288，紫杉醇包封率为96.5％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
以市售的紫杉醇脂质体为对照，对上述方法制备的紫杉醇复合脂质体在荷瘤小鼠体内的组织分布进行考察。选取腋下接种有S180肉瘤的荷瘤小鼠90只(n＝3)，禁食12小时。按20mg/kg剂量分别尾静脉注射市售紫杉醇脂质体和紫杉醇复合脂质体，给药后分别于5，15，30min，1，2，4，8，12，24，48小时眼眶取血后，断颈处死，取荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤样品，生理盐水冲洗，滤纸吸干其水分。分别精密称重，加入生理盐水1.5mL制成匀浆液。精密量取0.8mL(肝取0.5mL)匀浆液，血浆取150μL，分别加入不同浓度的***内标液50μL，混匀后，加入叔丁基甲醚4mL，涡旋5min，3000r/min离心10min，取有机相3mL，于40℃减压挥干，残渣用流动相200μL溶解，涡旋1min，10000r/min离心10min，取上清液20μL进样，按体内色谱条件进行分析。
给药***的靶向性评价采用靶向效率(Te)作为评价参数。Te值表示药物制剂对靶器官和非靶器官的选择性。Te值越大，选择性越强。本实验考查各器官的AUC与血浆AUC的比值，即Te＝AUC器官/AUC血浆。其结果如表二所示。
表二 靶向性评价
由表二的结果可知，紫杉醇复合脂质体对肿瘤的靶向效率Te明显高于市售紫杉醇脂质体，而对心脏、肾脏等器官的靶向效率Te明显低于市售紫杉醇脂质体。由此可见，紫杉醇复合脂质体对肿瘤具有较高的靶向性，而且降低了对心脏、肾脏等器官的毒性。
实施例7
以本发明所述及的透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的组织分布为例来说明其肿瘤靶向性。
在50mL侧面带支管、支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入1.13gRinkamide-MBHA树脂(0.74mmol/g)，加20mLDMF溶胀10分钟，抽滤去掉溶剂。然后加入20mL 20％哌啶/DMF溶液，搅拌30分钟，抽滤。用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入1.63g(2.51mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf为2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、0.52g(2.51mmol)二环己基碳二亚胺和0.34g(2.51mmol)HOBt(1-羟基苯并***)和20mLDMF，室温下搅拌进行缩合反应。反应2小时后取少量树脂进行茚三酮显色反应，结果表明缩合反应已完全。抽滤，用DMF洗涤树脂6次，抽滤去掉溶剂。C端的(保护的)氨基酸已联接于树脂上。后面接着联接有C端起的第二个至最后一个(保护的)氨基酸，反应步骤重复上面操作，即从用20％哌啶/DMF溶液脱保护开始，到茚三酮显色试验后用DMF洗涤止。如果茚三酮显色试验表明缩合未完全，则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的a-氨基都用Fmoc保护，氨基酸依次为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。最后脱掉Fmoc保护，投入硬脂酸与N端氨基完成缩合反应。多肽树脂用甲醇洗第三次，真空干燥。
将上述已接肽的树脂加入到50mL圆底烧瓶中，加入15mL试剂K(TFA/苯甲硫醚/EDT/苯酚/水＝87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v))，室温下搅拌3小时。过滤，收集滤液。用三氟乙酸洗三次树脂。合并滤液，将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸，加入体积为8-10倍的***沉淀接有硬脂酸的多肽，放入冰箱过夜。离心，除去***，真空干燥，得到N端被硬脂酸修饰的RRRRRRHHH的粗品。
将100mg上述产物溶于2mL纯水中，用制备用反相HPLC纯化，收集保留主峰，收集液经旋蒸浓缩，然后冷冻干燥得N端被硬脂酸修饰的RRRRRRHHH的纯品。纯品的质谱表明，其分子量为1794，与计算值相符。最终获得N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3。
依处方量称取注射用大豆磷脂、胆固醇和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的氯仿使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。10mL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各一次即可制得脂质体紫杉醇。
精密称取10mg N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3对紫杉醇脂质体的修饰没有对普通紫杉醇脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于96％，常温放置24小时渗漏率小于3％。
精密称取相对分子质量为104的透明质酸钠10mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3修饰的紫杉醇脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R6H3与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为160.7nm，zeta电位为-21.3mV，多分散指数PDI为0.278，紫杉醇包封率为97.0％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
以市售的紫杉醇脂质体为对照，对上述方法制备的紫杉醇复合脂质体在荷瘤小鼠体内的组织分布进行考察。选取腋下接种有H22肝癌的荷瘤小鼠90只(n＝3)，禁食12小时。按20mg/kg剂量分别尾静脉注射市售紫杉醇脂质体和紫杉醇复合脂质体，给药后分别于5，15，30min，1，2，4，8，12，24，48小时眼眶取血后，断颈处死，取荷瘤小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤样品，生理盐水冲洗，滤纸吸干其水分。分别精密称重，加入生理盐水1.5mL制成匀浆液。精密量取0.8mL(肝取0.5mL)匀浆液，血浆取150μL，分别加入不同浓度的***内标液50μL，混匀后，加入叔丁基甲醚4mL，涡旋5min，3000r/min离心10min，取有机相3mL，于40℃减压挥干，残渣用流动相200μL溶解，涡旋1min，10000r/min离心10min，取上清液20μL进样，按体内色谱条件进行分析。
给药***的靶向性评价采用靶向效率(Te)作为评价参数。Te值表示药物制剂对靶器官和非靶器官的选择性。Te值越大，选择性越强。本实验考查各器官的AUC与血浆AUC的比值，即Te＝AUC器官/AUC血浆。其结果如表三所示。
表三 靶向性评价
由表三的结果可知，紫杉醇复合脂质体对肿瘤的靶向效率Te明显高于市售紫杉醇脂质体，而对心脏、肾脏等器官的靶向效率Te明显低于市售紫杉醇脂质体。由此可见，紫杉醇复合脂质体对肿瘤具有较高的靶向性，而且降低了对心脏、肾脏等器官的毒性。
实施例8
以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽(R5H3、R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与羟基喜树碱脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果为例来说明这一制剂的抗肿瘤功效。
依处方量称取注射用卵磷脂、胆固醇和羟基喜树碱于茄型瓶中，加入一定量的乙醇使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。10mL磷酸盐缓冲溶液(pH4.5)常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。采用实验型高压均质机以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各一次即可制得羟基喜树碱脂质体。
精密称取一定量的N端被硬脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的羟基喜树碱脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)修饰的羟基喜树碱脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)对羟基喜树碱脂质体的修饰没有对普通羟基喜树碱脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于90％，常温放置24小时渗漏率小于3％。
精密称取相对分子质量为104的透明质酸钠10mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)修饰的羟基喜树碱脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)与羟基喜树碱脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为187.5nm，zeta电位为-20.4mV，多分散指数PDI为0.259，紫杉醇包封率为92.5％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
透明质酸钠、其他肿瘤细胞选择性穿膜肽(R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与羟基喜树碱脂质体所构建的复合脂质体可采用相同的方法制备。
另外，采用相同的方法制备羟基喜树碱脂质体，并按上述方法用N端被硬脂酸修饰的穿膜肽R8和透明质酸钠一起制备R8修饰的羟基喜树碱脂质体。
以小鼠艾氏腹水瘤(EAC)为模型：取出生长良好的艾氏腹水瘤细胞接种于雌性NIH品系小白鼠腹腔内(每毫升约5×106个，每只0.2mL)，8天后取腹水，用生理盐水稀释，重新接种于另一只健康小鼠腹腔内，共传3代。将60只雌性NIH品系小白鼠称重，随机分为12组，每组5只；从传代小鼠腹腔中抽出腹水瘤并进行计数，稀释至每毫升4×106个，接种于小鼠右侧背部皮下(每只0.2mL)；将制得的各种羟基喜树碱复合脂质体、R8修饰的羟基喜树碱脂质体、普通羟基喜树碱脂质体和羟基喜树碱注射液按5mg/kg羟基喜树碱，于接种后第7天单次给药，空白对照组注射等体积的生理盐水(空白对照)。接种两周后将小鼠断颈处死，局部用75％乙醇消毒，用剪刀取皮下瘤块，剥去纤维组织并称重，肿瘤抑制率按抑制率％＝(空白对照组肿瘤的平均重量-给药组肿瘤的平均重量)/空白对照组肿瘤的平均重量×100％，瘤重比较如表四所示。结果显示，肿瘤细胞接种后第7天给予羟基喜树碱复合脂质体5mg/kg剂量泊疗，肿瘤抑制率显著高于R8修饰的羟基喜树碱脂质体、羟基喜树碱的普通脂质体和注射液剂型给药组的抑制率(P＜0.05)。由此可知，以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽与羟基喜树碱脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果明显强于R8修饰的羟基喜树碱脂质体、羟基喜树碱的普通脂质体和注射液剂型。
表四 各给药组的瘤体称重(g)和肿瘤抑制率(％)，n＝5，
实施例9
以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽(R5H3、R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果为例来说明这一制剂的抗肿瘤功效。
依处方量称取注射用大豆磷脂、胆固醇和紫杉醇于茄型瓶中，加入一定量的氯仿使其充分溶解，并加入玻璃珠若干。减压旋蒸1小时，挥除有机溶剂形成药脂薄膜。结束后继续抽真空过夜，以除去痕量有机溶剂。10mL纯水常温手摇水合，至茄型瓶壁洗净为止，样品呈均匀的乳浊液。冰水浴中探头超声以减小粒径。然后3000rpm离心以除去探头超声可能掉落的金属屑。取上清液分别过0.45μm，0.22μm聚碳酸酯滤膜各一次即可制得脂质体紫杉醇。
精密称取10mg N端被便脂酸修饰的肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3(R在C端或N端)，并将其充分溶解于2mL的双蒸水中。于常温下，将此溶液缓缓滴加到制得的紫杉醇脂质体分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min，然后将此分散体系在4℃孵育8小时即可制得肿瘤细胞选择性穿膜肽修饰的紫杉醇脂质体。对修饰前后脂质体的包封率和稳定性的考察结果表明，肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3对紫杉醇脂质体的修饰没有对普通紫杉醇脂质体的理化性质产生显著影响，包封率大于96％，常温放置24小时渗漏率小于3％。
精密称取相对分子质量为104的透明质酸钠10mg，溶解于4mL的双蒸水中，调节pH值至6.0。于常温下将此溶液缓缓滴加到制得的肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3修饰的紫杉醇脂质体的分散体系中，滴加过程保持不断地磁力搅拌。滴加结束后继续搅拌30min即得以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽R5H3与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体。该复合脂质体平均粒径为162.4nm，zeta电位为-19.3mV，多分散指数PDI为0.265，紫杉醇包封率为98.4％。以1％的蔗糖为冻干保护剂，将上述复合脂质体制备成冻干粉保存，使用时以5％的葡萄糖溶液复溶供注射使用。
透明质酸钠、其他肿瘤细胞选择性穿膜肽(R6H3、R7H3、R8H3、R9H3、R10H3、R11H3、R12H3，R在N端或C端)与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体可采用相同的方法制备。
另外，采用相同的方法制备紫杉醇脂质体，并按上述方法用N端被硬脂酸修饰的穿膜肽R8和透明质酸钠一起制备R8修饰的紫杉醇脂质体。
取生长良好的人卵巢癌细胞株COC1细胞接种于BABL/C裸鼠背部皮下。经过5周后，接种部位肿瘤开始生长，第8周时肿瘤直径达1.5cm左右，可以用于实验。上述方法成功接种肿瘤的裸鼠共60只，随机分为12组，每组5只。
将制得的各种紫杉醇复合脂质体、R8修饰的紫杉醇脂质体、普通紫杉醇脂质体和紫杉醇注射液按10mg/kg紫杉醇，单次尾静脉注射给药，空白对照组注射等体积的生理盐水(空白对照)。给药一周后将小鼠断颈处死，局部用75％乙醇消毒，用剪刀取皮下瘤块，剥去纤维组织并称重，肿瘤抑制率按抑制率％＝(空白对照组肿瘤的平均重量-给药组肿瘤的平均重量)/空白对照组肿瘤的平均重量×100％，瘤重比较如表五所示。结果显示，肿瘤细胞接种后给予紫杉醇复合脂质体10mg/kg剂量治疗，肿瘤抑制率显著高于R8修饰的紫杉醇脂质体、紫杉醇普通脂质体和紫杉醇注射液剂型给药组的抑制率(P＜0.05)。由此可知，以透明质酸钠、肿瘤细胞选择性穿膜肽与紫杉醇脂质体所构建的复合脂质体在荷瘤小鼠体内的抑瘤效果明显强于R8修饰的紫杉醇脂质体、紫杉醇普通脂质体和紫杉醇注射液剂型。
表五 各给药组的瘤体称重(g)和肿瘤抑制率(％)，n＝5，
Claims (10)
1.一种含有抗肿瘤药物的复合脂质体，其特征在于：它含有抗肿瘤药物、脂质、透明质酸或透明质酸钠和肿瘤细胞选择性穿膜肽。
2.根据权利要求1所述的复合脂质体，其特征在于：按质量比，它含有0.01％-30％的抗肿瘤药物，1％-98％的脂质，0.001％-20％透明质酸钠，0.001％-20％的肿瘤细胞选择性穿膜肽，0-20％的醇，0-20％的抗氧剂，0-20％的防腐剂，0-20％的pH调节剂，0-20％的相变调节剂，0-20％的长循环材料，0-20％的等渗调节剂，0-95％的冻干支撑剂，0-95％的水。
3.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于所述的抗肿瘤药物选自下列药物中的一种或多种：紫杉醇、多西紫杉醇、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、柔红霉素、长春新碱、长春瑞滨、顺铂、奥沙利铂、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、阿糖胞苷、脱氧氟尿苷、依托泊苷、替尼泊苷、喜树碱、羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康、米托蒽醌、环磷酰胺、异环磷酰胺、丝裂霉素C、白消安、洛莫司汀、卡莫司汀、司莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、吉西他滨、卡培他滨、地西他滨、安西他滨、顺铂、博来霉素、平阳霉素、藤黄酸、新藤黄酸以及这些药物的各种药用盐。
4.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于所述的脂质是磷脂和胆固醇，磷脂选自天然磷脂、半合成磷脂和全合成磷脂中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于所述的透明质酸或透明质酸钠的相对分子质量从4×103道尔顿到2×107道尔顿。
6.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽对于肿瘤细胞或组织有较强的细胞膜穿透作用，对正常细胞或组织的细胞膜穿透作用较弱或不能透过。
7.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于所述的肿瘤细胞选择性穿膜肽选自下列多肽中的一种或多种：RRRRRHHH(R5H3，R在C端或N端)、RRRRRRHHH(R6H3，R在C端或N端)、RRRRRRRHHH(R7H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRHHH(R8H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRHHH(R9H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRHHH(R10H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRRHHH(R11H3，R在C端或N端)、RRRRRRRRRRRRHHH(R12H3，R在C端或N端)，它们的N端被脂肪酸修饰。
8.根据权利要求7所述的脂肪酸，其特征在于：脂肪酸的碳链可以含有8-18个碳原子，优选为硬脂酸。
9.根据权利要求1或2所述的复合脂质体，其制备方法包括有机溶剂注入法、薄膜分散法、逆向蒸发法、主动载药法、反复冻融法、冻干法以及上述各方法相结合的方法。
10.权利要求1或2所述的复合脂质体，其特征在于可以制备***的药物制剂。
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