CN103622909A - 一种含心磷脂的脂质体新制剂及其在抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明是在国际上首次制备心磷脂等组分的米托蒽醌脂质体新制剂，其中阐述了该米托蒽醌脂质体的制备方法及该制剂的表征特性，同时进行了制剂工艺的放大、动物体内药代动力学、药物毒性及抗肿瘤作用研究。该新型制剂具有包封率高、稳定性强等特点，解决了米托蒽醌常规制剂在临床应用过程中半衰期短、具有强烈的骨髓抑制等毒副作用以及抗肿瘤疗效有限等缺陷。本研究证明了该脂质体新剂型与其他剂型相比有很大的优势。

Description

一种含心磷脂的脂质体新制剂及其在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及到米托蒽醌脂质体的制备方法及相关的药物安全性、药代动力学、治疗效率等方面的研究。

研究背景

目前，肿瘤仍然是危害人类健康的主要疾病，其致死率在所有疾病中仍处于前三位，其原因主要是由于肿瘤很难在早期得以诊断，一旦被诊断后往往已处于中晚期阶段。目前，肿瘤的治疗方法仍然是外科手术治疗、放疗和化学疗法。对于那些处于中晚期阶段肿瘤已经转移的患者、接受手术后的肿瘤患者、以及无法进行手术或放疗的肿瘤患者，化学疗法在肿瘤的治疗中占有非常重要的地位，对延缓患者生命周期、增加患者的治疗机会等起着非常重要的作用。但是常规化疗药物在肿瘤治疗过程中往往存在着许多缺陷，由于其分子量小，在机体内随血液代谢过程中造成重要生理器官中的药物峰浓度过高，造成重要生理器官的毒性作用而给病人带来严重的毒副反应；同时由于化疗药物分子量小，在体内代谢过程中很快被肾小球滤过而被肾脏清除掉使得其体内的代谢半衰期很短，严重降低了其治疗效果。因此，克服化疗药物在肿瘤治疗中所存在的严重缺陷，增加药物的半衰期、改变药物的代谢途径、降低药物毒性、提高药物疗效成为化疗药物临床应用过程中首要解决的问题。

脂质体作为一种新型的药物载体具有独特的优点，通过脂质体***携带药物，可以保护药物在循环***中不被降解，降低药物在肾脏中的清除率，从而延长药物在体内代谢的半衰期；同时通过此携带***可以改变药物在体内各组织器官的分布，降低药物在重要生理器官中的峰浓度而减轻药物对机体产生的毒副作用；通过增加药物的代谢半衰期及机体的自身体能而提高药物的治疗疗效；再者脂质体制剂所应用的制剂原料本身具有生物可降解性，不会对机体产生免疫反应及各种毒副作用，因此是一种良好的药物载体***。

米托蒽醌或盐酸米托蒽醌于1979年首先由美国Murdock和Lederle实验室合成并证明其抗肿瘤活性。米托蒽醌分子结构与多柔比星相近，具有平面芳香环而易于嵌入DNA双螺旋体的碱基对中，是一种嵌入型TopoII抑制剂，它通过与DNA交叉连接，抑制TopoII，引起DNA链断裂，从而发挥抗肿瘤作用。。米托蒽醌也对RNA的合成有抑制作用，为周期非特异性药物。米托蒽醌可以和其他药物联用，也可以单独应用于肿瘤治疗领域。米托蒽醌对白血病、淋巴瘤、乳腺癌、***癌等具有抗肿瘤疗效，尤其是对难治性、顽固性白血病疗效显著，近来又被用作免疫抑制剂而用于多发性硬化症的治疗中。但是米托蒽醌与其他蒽环类抗生素(如阿霉素)相似，有较严重毒副作用，可引起骨髓抑制，并有剂量依赖性的心肌毒性，胃肠毒性以及脱发等严重的毒副作用。研究证实，米托蒽醌短期毒性和长期毒性都比阿霉素要低。由于游离的米托蒽醌药物进入血后大部分(95％以上)与血浆蛋白结合，效率较低，但是大量使用又会引起毒性反应，因而极大的限制了其临床应用。本项目研究的目的旨在解决米托蒽醌在临床应用过程中的局限性，即利用含心磷脂的脂质体对米托蒽醌进行包裹，制备出一种新型的米托蒽醌脂质体制剂，从而降低药物在体内的清除速率，改变药物的代谢途径，降低药物对机体的毒副作用，并提高其抗肿瘤疗效。目前，针对米托蒽醌或盐酸米托蒽醌在临床使用的局限性，国内外对米托蒽醌或盐酸米托蒽醌的毫微球、白蛋白微球和固体脂质纳米粒等剂型进行了研究，但效果均不理想。国内在此领域研究还处于刚刚起步阶段，国内外有关米托蒽醌脂质体的报道只有几篇，其研究结果的不足和缺陷之处在于被包裹药物的包封率较低；被包裹药物的药代动力学参数没有得到明显改善；抗肿瘤效果并不理想等。应用含心磷脂的脂质体包封米托蒽醌的脂质体制剂还未见其他报道。

发明概述

本发明进行了对米托蒽醌脂质体制剂的处方、制备工艺的优化及制剂工艺的中试放大研究，解决了脂质体包封率低、稳定性差、临床应用操作复杂等问题，可获得高包封率、高稳定性、临床给药操作简单、且可重复放大生产出符合质量标准的米托蒽醌脂质体制剂。

本发明所述的米托蒽醌脂质体中，可以含有任意各种中性或带电荷的脂质体形成物质和诸如心磷脂这样被认为可与米托蒽醌结合的化合物。所述的脂质体形成物质可以是两亲性分子，诸如磷脂，磷脂酰胆碱、二棕榈酰基林芝县胆碱、磷脂酰丝氨酸、胆固醇等，它们在极性溶剂中形成脂质体。尽管在本制剂中可以使用宽浓度范围的米托蒽醌，但是最有用的浓度在0.5-2mg/ml的范围。米托蒽醌与脂质成分的摩尔比也可以广泛改变，但最有用的范围约为1∶10-1∶20。如果有需要，米托蒽醌脂质体的粒径大小可以使用不同规格的滤膜进行控制。

通过对所得到的米托蒽醌脂质体应用在比格犬内的药代动力学研究，分析该制剂在体内的药物代谢情况，确证米托蒽醌脂质体制剂具有较好的药代动力学试验参数，解决了常规的米托蒽醌制剂半衰期短、肾脏清除速率快、药物在心肌组织中高浓度蓄积等问题。

米托蒽醌脂质体制剂在小鼠体内的毒性研究，进一步确证了脂质体制剂可以改变药物在体内的代谢途径，降低药物在心肌组织等重要器官中的峰浓度及含量，从而降低药物对机体产生的毒副作用，解决了常规米托蒽醌制剂在临床应用中有较高的毒副作用等问题。

米托蒽醌脂质体制剂在裸鼠体内的抗肿瘤作用的研究，通过利用鼠源白血病动物模型及人源乳腺癌动物模型，确证了米托蒽醌脂质体制剂比常规制剂有更好的抗肿瘤疗效，有望解决常规米托蒽醌制剂治疗效果不理想的问题，可以进一步提高临床治疗指数。

发明详述

本发明的目的是制备出高包封率、高稳定性的新型米托蒽醌脂质体纳米制剂。该制剂应符合临床给药操作简单、可重复放大生产等要求，并且可以进一步降低米托蒽醌的药物毒性，提高药物的治疗指数。通过本发明的相关研究，可以解决米托蒽醌在临床应用过程中的局限性，达到更好的抗肿瘤疗效。

本发明的目的可以通过以下方法步骤实现：

脂质体的制备方法可以选择常用的脂质体制备方法，任意方法均可，只要所涉及的制备方法不影响脂质体对药物米托蒽醌的装载包封，本发明主要采用薄膜水化法及硫酸铵梯度法制备米托蒽醌脂质体，并通过冻干法进行中试放大研究。

薄膜水化法，即首先将磷脂和胆固醇按照一定比列混合，溶解于氯仿-乙醇溶液中，将混合物利用旋转蒸发仪在真空条件下干燥，于30℃条件下形成脂质薄膜，干燥残留物出现后再继续次干燥操作过程10min。其次将一定浓度的米托蒽醌盐溶液加入到脂质膜上使脂质膜水化1～3h，之后进行涡旋振荡至混悬液处于均质状态，再对样品进行超声处理以获得脂质体包裹的米托蒽醌，即米托蒽醌脂质体制剂。

硫酸铵梯度法，即首先将磷脂和胆固醇按照一定比例精密称重后溶解于有机溶剂中，在氮气流的作用下形成薄膜，过夜真空除有机溶剂。利用硫酸铵溶液对脂质膜进行水化1～3h。对混合物探头式超声即可得到空白脂质体。其次建立硫酸铵梯度，方法为将空白脂质体装于透析袋内，置于盛有生理盐水的锥形瓶中，密塞与水浴摇摆振荡仪中透析，每隔一段时间用生理盐水替换透析袋外介质。最后进行药物装载，方法为在透析后脂质体中加入米托蒽醌氯化钠溶液，用生理盐水调整米托蒽醌浓度。

冻干法是指采用低温干燥技术，通过反复包封、冻干和重新融合来实现较高的包封率。冻干法为提高脂质体储存期的稳定性提供了较好的解决办法，它改变了液态脂质体不稳定和易氧化的缺点，具有工艺稳定、适合于工业化生产，质量易于控制和产品稳定性好等特点。

将磷脂与胆固醇以1∶1的比例溶于氯仿，通氮气旋转蒸发至氯仿完全蒸干后加入含2％聚乙烯吡咯酮，pH7.4的磷酸盐缓冲液浸泡2h。涡旋混合器下震荡10min使之完全混溶后分装入小瓶、在冻干机中程序冷冻干燥24h后小瓶中可见一块状白色多空固体。取出小瓶，干燥脂质体可密封保存于常温或4℃冰箱中。制备米托蒽醌脂质体时，将1mg/ml的米托蒽醌盐溶液，与冻干的脂质混合，药脂摩尔比控制在1∶15。混合物在室温下水化2h，之后超声处理10分钟。得到米托蒽醌脂质体制剂。

在米托蒽醌脂质体的制备过程中，其可供选用的脂质体材料有很多种，可选用的材料包括天然的、人工合成的、及半合成的生物相容性材料。材料可以是亲水性的或疏水性的。可选用带有正电荷或带有负电荷及电中性的材料作为脂质体的制备材料。合适的脂质体制备材料包括：磷脂类、脂肪酸类、甾醇类等。若对脂质体进一步优化，可选用心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇，生育酚，甚至可以引入糖基链提高脂质体的稳定性。

米托蒽醌脂质体的制备过程需注意，溶解脂质体的溶剂应适宜，溶剂的种类可以是极性的、弱极性的、中性的或非极性的。例如可选用：乙酸、丙酸、氯仿、丙酮、三乙胺等，也可包括无菌注射用水。溶剂的选择标准应该是溶剂易蒸发去除而不产生残留，或其残留量在允许限度之内。可利用多种方法将脂质体制备过程中引入的溶剂去除，例如可以选用过滤法、离心法、和蒸馏法去除相应溶剂，但最佳的方案是选用在真空条件下采取蒸馏的方法对溶剂进行去除，在不影响米托蒽醌药物及脂质体稳定性的前提下也可采用以上多种方法对溶剂进行去除。

本发明的脂质体可引入心磷脂，心磷脂可以是任意种类的，包括天然的和人工合成的。在脂质体的制备过程中可加入适宜的溶剂将心磷脂溶解，溶解心磷脂的溶剂应该是容易去除的，并且溶剂残留量应在允许限度内。可先利用溶剂将心磷脂溶解，再加入米托蒽醌，也可将心磷脂和米托蒽醌混合后一同溶解到溶剂之中。由于心磷脂带有负电荷的特点，在静电吸引作用下，加入心磷脂会提高脂质体中米托蒽醌的包封率，质膜表面的负电荷还可以增加脂质体间的排斥作用，提高脂质体的空间稳定性。因此在不影响药物稳定性和治疗效果的前提下可在米托蒽醌脂质体中引入一定量的心磷脂增加脂质体对米托蒽醌包封率。与此相似的带负电荷的磷脂还有磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸，也可以根据情况应用到脂质体的制备当中。

脂质体所带的电荷可以是脂质体本身特有的电荷，也可以是在某pH条件下脂质体所显现出的电荷，例如在pH中性条件下可制备出带有负电荷的脂质体，脂质体的选择配方可包括卵磷脂、胆固醇、心磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸等。同时在该条件下也可制备出带有正电荷的脂质体，脂质体的选择配方可包括磷脂酰胆碱、硬脂胺和胆固醇等。更为优化的脂质体制备方案的材料选择可包括心磷脂、磷酸卵磷脂、胆固醇。

上述脂质体中米托蒽醌与脂质的相对摩尔质量比有一个合适的范围，优选的范围在1∶1-30更为优选的范围在1∶1-25、更优选的范围在1∶1-20、最优选比例在1∶15。

上述脂质体优选的脂质体制剂的组成包括心磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇。三者的优选比例范围可控制在0.1-5∶1-25∶5-10。还可进一步优化配比，将比例范围控制在0.3-3∶5-20∶6-9。更优选的方案还可将比例控制在0.5-2∶7-15∶6-8。最优选的方案可将三者的比例控制在0.8-1.5∶9-11∶6.5-7。优化的脂质体剂型还可包括诸如a-生育酚等抗氧化剂以及诸如精氨酸、聚乙烯亚胺等提高转染效率和提高脂质体稳定性的相关物质。其中a-生育酚的浓度范围可控制在0.1％以上或在6％之下。精氨酸的浓度配比在1％-20％范围内，聚乙烯亚胺的浓度配比在2％-25％浓度范围内。

在脂质体制备过程中可进行脂膜的水化等操作诱导脂质体的形成，水化的溶液可选择极性溶液，具体可包括生理盐水溶液及PBS溶液，溶液可进一步溶有米托蒽醌。溶液加入后可以选择多种混合方式进行脂膜对药物的包裹。混旋振荡过程应为脂质体的形成提供足够的剪切力，例如可采用磁力搅拌，涡旋振荡、超声处理等方式进行脂质体的制备。优选的方法可采用涡旋振荡的方式，得到的脂质体形式是多层脂质体，若想得到单层脂质体可通过滤膜过滤或进一步超声等方式。

中试放大过程中可对制得的脂质体进行冻干分装，冻干过程中可加入冻干相关的保护剂，保护剂可以是单糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物质。其中二糖是用的最多也是最有效的冻干保护剂，常用的二糖有蔗糖或海藻糖，其中蔗糖同脂质的比例可控制在5∶1-10∶1范围内；海藻糖同脂质的比例可控制在3.5∶1-12.5∶1的范围内。但最为优选的方案应将蔗糖同脂质的比例控制在8.5∶1-10.5∶1的范围区间内；海藻糖同脂类的比例可控制在9.0∶1-10.5∶1的范围区间内。冻干得到的脂质体应为粉末形式或团块物形式。冻干型的脂质体应该较为容易进行重新溶解。

将同等体积的米托蒽醌溶液和同等体积的生理盐水溶液加入载有冻干脂质的瓶中，对混合物进行室温下的水合，时间控制在20分钟，之后在涡旋振荡器下进行剧烈的振荡，振荡时长控制在3分钟。振荡完成后还要对混合物进行15分钟的超声处理。利用此方法可将米托蒽醌的包封率控制在90％之上。

本发明对所得到的脂质体的表征进行了研究，首先在外观上，通过光镜下观测可见脂质体的粒径均匀，且无团块状物，透过电镜观察可更清晰的看见大小均匀的脂质体粒子。

其次，对于脂质体制剂而言，粒径对产品的稳定性，药代动力学行为和药效影响很大。为了使脂质体的大小可以复合要求，可使用小孔径的聚碳酸酯膜来控制，应根据所要得到的脂质体粒径大小来选择滤膜的规格。本发明要求脂质体在正常组织的血管处不能透过血管间隙渗漏到组织中，在***时，肿瘤组织的血管通透性增大，使得脂质体可以经过肿瘤血管渗漏至肿瘤组织，同时又要求避免血栓现象的发生，可以更好地发挥治疗作用。本发明将采用电子显微镜和粒径分析仪对所得到的米托蒽醌脂质体制剂进行粒径测定，要求的脂质体粒径范围应在150nm以下，更优选的范围为100～120nm。

再次，可利用多种方法对脂质体的包封率进行测定，例如可采用高速离心的方法，将转速设定到16000rpm，进行30min～1h的离心，对上清液进行液相检测来测出上清液中米托蒽醌的浓度，计算出样品的包封率；或是通过透析的方法，将米托蒽醌脂质体置于透析袋之中，透析膜的截留分子量大概在8000-14000，透析袋置于生理盐水中透析16-20小时，透析后利用甲醇对脂质体进行溶解，样品溶解后利用HPLC对脂质体中米托蒽醌进行检测或利用分光光度计检测，检测波长为658nm。包封率的计算方法为：米托蒽醌脂质体的包封率(％)＝透析后包裹于脂质体内米托蒽醌量/米托蒽醌的投药量×100％。本发明中要求米托蒽醌脂质体的包封率应控制在80％之上，进一步可提高到85％之上，更进一步可提高到90％之上。经过研究考察发现米托蒽醌的包封率受到缓冲液的PH影响，经过考察得出当pH值在7-10范围内，都能明显的测出米托蒽醌有较高的包封率，更为优选的范围为pH值为8-10，最优选的范围是pH值为9，此时的米托蒽醌包封率可能达到90％以上。

脂质体在放置过程中可能发生多种不同的变化，如磷脂质会氧化和水解，生成短链的磷脂，并可能形成具有溶解性的衍生物；另外脂质体还可发生凝聚、融合等物理变化，从而导致包裹物质的渗漏。因此脂质体制剂必须在贮藏期间有良好的稳定性，在体内发挥其缓释作用之前应保持一定的大小及完整性。本发明中专门考察了米托蒽醌新剂型的稳定性，其在8小时之内其包封率处于稳定状态，稳定性良好。

本发明中特别检测了脂质体的Zeta点位，因为Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta电位越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。通过本发明对新型脂质体制剂的Zeta电位的研究发现米托蒽醌新型脂质体剂型的体系更加稳定。

本发明所涉及到的米托蒽醌脂质体，除了向体系中引入原料药米托蒽醌和包裹辅料脂类之外，还涉及到药物成品的赋形剂。赋形剂包括各种形式，可以是液态的、半固态的、固态的；可以是填充剂、配制剂和液体稀释剂。所选用的赋形剂应是无毒的。

合适的赋形剂具备以下特点：可充分维持原料药物米托蒽醌的稳定性；赋形剂可以是水溶性的也可是脂溶性的；赋形剂的添加不引起不良反应；赋形剂的应用不影响药物的药效。赋形剂的种类可多种多样，例如，可以是某些脂肪类物质和酯类物质、聚乙二醇等，或是这些物质的混合物均可作为赋形剂被利用。不同剂型的药物可添加赋形剂，包括粉剂、水剂、喷雾剂、霜剂、凝胶剂、片剂、冲剂、胶囊、丸剂、乳剂、糊剂等等。

本研究米托蒽醌脂质体应优选以上述剂型形式存在，所占的比重应在制剂总比例的0.1％-50％，更有选的范围为0.1％-40％，更优选的范围应位于0.1％-30％，最优选的范围应位于0.1％-25％。可利用常规的或公认的方法将米托蒽醌同适当的赋形剂(单一赋形剂或多种形式混合赋形剂)混合，制备出以上剂型的药物。

本发明所涉及的米托蒽醌脂质体可降低癌细胞对米托蒽醌的耐药作用。通过对新型米托蒽醌脂质体制剂的抗耐药机制的研究，即选取抗耐药乳腺癌肿瘤细胞系，向其中加入不同剂型的米托蒽醌、空白脂质体，并引入阳性对照，通过荧光激发法考察细胞对米托蒽醌的摄取情况，结果发现采用脂质体剂型可减缓米托蒽醌***产生的耐药倾向，同时脂质体剂型的应用还可减低肿瘤细胞对其他抗肿瘤药物的耐药倾向。诸如减低了肿瘤细胞对化疗药物紫杉醇、阿霉素、柔红霉素等的耐药倾向。因此在肿瘤治疗过程中，可将本米托蒽醌脂质体同其他化疗药物联合应用，也可在肿瘤治疗过程中将本研究的米托蒽醌脂质体同其他化疗药物分别应用。

本发明的给药途径多种多样，可以选择口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等，但首选非肠道途径给药，更优选给药方式为静脉给药。

脂质体中米托蒽醌的量以单位剂量衡量，单位剂量可以是每日的用药量，也可以是半日用药量，也可以是1/3日用药量。脂质体中的米托蒽醌可以是一个或多个单位剂量。例如，米托蒽醌可以是1、2、3、4个单位剂量，亦可以是1/4、1/3、1/2单位剂量。单位剂量用于衡量单次给药米托蒽醌的用药量。

本发明中通过对米托蒽醌脂质体新型制剂体内细胞毒研究，发现在给药剂量方面，体重平均为20-22g的白血病荷瘤小鼠的米托蒽醌给药剂量可控制在10mg/kg-50mg/kg；更为优选的给药方案为15mg/kg-45mg/kg；更为优选的给药方案可将给药剂量控制在20mg/kg-40mg/kg；最为优选的给药方案可将米托蒽醌药量控制在30mg/kg-35mg/kg剂量范围内。对于人而言，以60kg体重的人的给药剂量可将米托蒽醌药量控制在1.3mg/kg-6.5mg/kg的范围内；更为优选的给药剂量可将米托蒽醌药量控制在1.9mg/kg-5.8mg/kg的范围内；更为优选的给药剂量可将米托蒽醌药量控制在2.5mg/kg-5.2mg/kg的范围内；最为优选的给药剂量可将米托蒽醌药量控制在3.8mg/kg-4.5mg/kg的范围内。但是可根据具体的情况，例如用药患者的疾病严重程度、患者的体重、所患疾病的性质等方面的因素调整给药剂量以适应具体情况的需要。在某种情况下可将用药剂量的标准调高，而在某种情况下则可将用药剂量的标准调低。适合的用药剂量应是具备好的药效且低毒性的剂量。

脂质体剂型的应用并没有减弱米托蒽醌作为抗肿瘤药的药效，相反，在米托蒽醌给药量相同的情况下，脂质体剂型的应用与单独应用米托蒽醌相比具备更好的药效，米托蒽醌脂质体对肿瘤体积增长的抑制效果更加显著。此外利用脂质体剂型可减弱米托蒽醌所导致的药物毒性，在米托蒽醌给药剂量相同的情况下，脂质体剂型可更好的降低由于药物毒性造成实验动物死亡率。

本发明涉及的米托蒽醌脂质体制剂可延长药物作用时间。在研究过程中，对比格犬体内进行了药代动力学研究，通过对使用米托蒽醌脂质体制剂和单独使用游离米托蒽醌药物比较可知，米托蒽醌的脂质体制剂可明显增加米托蒽醌的血浆峰浓度。此外，脂质体剂型在动物体内的药物半衰期和药-时曲线下的峰面积均要显著高于常规米托蒽醌制剂。

在药物组织分布方面，在小鼠体内，普通米托蒽醌同脂质体型米托蒽醌相比，在心肌组织中的积累量要远远高于后者，并且在肺、肾组织部位的积累量前者也要显著高于后者。而在肝、脾组织的药物分布，脂质体型米托蒽醌要高于普通型米托蒽醌。米托蒽醌药物的主要副反应在于引起受试者的心肌毒性，而由小鼠体内的药物代谢积累分布可知脂质体型米托蒽醌可降低米托蒽醌在心肌部位的积累，减小其心肌毒性。

本发明中涉及的脂质体剂型大大提高了米托蒽醌药物的摄取，发挥了药物的疗效，明显抑制了肿瘤的生长，降低药物的毒副作用，延长了药物的作用时间，大大提高了肿瘤治疗效果。

上面已经对本发明进行了详述，现利用实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅用于解释发明目的，而不是用来限定本发明。

具体实施方式

实施例1

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的一种制备方法。

将脂类和胆固醇(二硬脂酰磷脂酰胆碱/胆固醇＝55/45或二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱/胆固醇＝55/45，配方中有少量的氢化胆固醇)共同溶于氯仿当中，在通入氮气的情况下干燥形成脂膜。之后加入pH4.0的300mM柠檬酸缓冲液进行水化。所得到的多层囊泡脂质体要经过5次冻融处理，之后通过100nm的聚碳酸酯滤膜进行挤出。在632.8nm下进行动态光扫描散射检测脂质体粒径。

米托蒽醌通过跨膜的pH梯度装载被包封于脂质体中，先将空白脂质体在65℃下孵育10min，然后加入米托蒽醌至药脂质量比为1∶10，取1.0ml的药物和脂质体的混合物，向其中加入350ul，0.5M的N2HPO4缓冲液将pH＝4.0调节到pH＝7.2。将得到的混合物在50℃条件下孵育15min。

该方法制得的脂质体平均粒径为100-120nm，包封率达到90％，8h内药物稳定性达到94％。

实施例2

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的另一种制备方法。

将米托蒽醌、心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇按照1∶1∶4.5∶3的摩尔比混合于有机溶剂中，之后对有机溶剂进行蒸发，得到到干燥的药物-脂质膜。利用6％的海藻糖溶液对膜进行水化，通过透析除去未包进的米托蒽醌，并对包封率进行测定，溶液浓度通过HPLC进行测定。

本发明所得脂质体的包封率为79.41±1.26％。

实施例3

本实施例为米托蒽醌脂质体的(LEM)的另一种制备方法。

将心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇以摩尔比为1∶6.8∶10的比例冻干成粉末。米托蒽醌以浓度为1mg/ml溶解于生理盐水中，与干燥脂质混合。药脂摩尔比为1∶12.5。混合物于室温下水化2h，超声10min。可获得包裹米托蒽醌的脂质体。脂质体中米托蒽醌的量通过分光光度计于658nm处测定。药物包封率通过以下公式计算：包封率＝(透析后的药物浓度/透析前的药物浓度)×100％。

上述方法所制备得到的米托蒽醌脂质体的包封率为94.62±3.19％，所得脂质体的粒径为57.63±1.24nm，且稳定性良好，室温下，米托蒽醌脂质体8小时以内的稳定性达到95％以上。

实施例4

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的另一种制备方法。

米托蒽醌脂质体的配方包括3μM的米托蒽醌、3μM的磷脂酰丝氨酸、12μM的磷脂酰胆碱、2.5μM的心磷脂和6.8μM的胆固醇。具体将米托蒽醌同心磷脂共溶于二氯甲烷溶液，将磷脂酰胆碱溶解于已烷，将胆固醇溶解于氯仿，按照配方中的量将磷脂酰胆碱溶液和胆固醇溶液加于混合溶液中进行搅拌，37℃或37℃以下真空蒸发有机溶剂得干燥质膜。加入3ml无菌生理盐水进行涡旋混合，水化，之后超声处理得到单层脂质体。

上述方法所制备得到的米托蒽醌脂质体的包封率为84.04±0.53％，所得脂质体的粒径为在150-200nm之间，8小时以内的稳定性达到90％。

实施例5

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的另一种制备方法。

将米托蒽醌溶于用氯仿溶解的心磷脂溶液，米托蒽醌和心磷脂均为2.5μM。蒸发除有机溶剂，得到干燥的药-脂复合物。向复合物中加入溶于乙烷的15mol磷脂酰胆碱和溶于氯仿的8mol胆固醇。搅拌混合物，37℃或37℃以下真空蒸发有机溶剂得干燥膜。向干燥膜内加入3ml无菌生理盐水，涡旋振荡水化得含药多层脂质体。对多层脂质体进行超声处理得到单层脂质体。

上述方法所制备得到的米托蒽醌脂质体的包封率为82.74±2.52％，所得脂质体的粒径为在120-180nm之间，8小时以内的稳定性达到92.5％。

实施例6

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的另一种制备方法。

将心磷脂、磷脂酰胆碱、胆固醇以摩尔比为1∶6.8∶10的比例精密称重后溶于氯仿中，在氮气流的作用下形成薄膜，过夜真空除有机溶剂。利用300mM的硫酸铵溶液(浓度为0.12mol/L)对脂膜进行水化1h，水化条件为60℃。探头式超声10min，得空白脂质体。

硫酸铵梯度的建立：空白脂质体装于透析袋中，置于盛有生理盐水的锥形瓶，密塞于37℃水浴摇摆振荡仪中透析，每隔1h用新鲜生理盐水替换透析袋外介质。药物装载：于透析后脂质体中加入米托蒽醌(mg)氯化钠溶液，以生理盐水调整脂质体溶液中米托蒽醌浓度为1mg·mL-1置37℃水浴保温15min即得。

该方法制得的脂质体平均粒径为70-100nm，包封率达到92％以上，药物稳定性良好，室温下，米托蒽醌脂质体8小时以内的稳定性达到95％以上。

实施例7

本实施例为米托蒽醌脂质体(LEM)的另一种制备方法。

本制备方法需要预先制备出米托蒽醌溶液和空白脂质体，之后将两者混合，得到米托蒽醌脂质体。米托蒽醌脂质体溶液的组成包括1.5mg/ml的盐酸米托蒽醌、乙酸钠(0.004％)、氯化钠(0.75％)、乙酸(0.043％)，溶液的pH为3.3-4.2。

首先制备空白脂质体。取11kg叔丁醇，向其中加入2.5g生育酚酸琥珀酸酯。混合物经历10分钟的混合，使生育酚完全溶解。向混合物中加入55g心磷脂，混合10分钟。再向混合物中加入120g胆固醇，混合10分钟。再向混合物中加入320g卵磷酰胆碱，再混合10分钟。将37℃±2℃的海藻糖水溶液(150g海藻糖/1.5kg水)加入混合物中，直到混合物变为澄清。利用0.22μm孔径的滤器进行无菌过滤，将滤出物分装于无菌玻璃小瓶中，每瓶10g，进行冻干。冻干的脂质体制剂为白色粉末，且易于再溶解。保持冻干脂质体制剂的水分在10％以下，将冻干产物储存于4℃下。

制备出空白脂质体后，在制剂中引入米托蒽醌，具体方法如下：将15mg诺消灵(盐酸米托蒽醌)溶液与8ml无菌生理盐水一同加入到冻干脂质体小瓶中。对小瓶进行30分钟的慢速涡旋处理，实现米托蒽醌同脂质体的水合。之后剧烈涡旋处理3分钟再进行10分钟的超声处理。得到最终的米托蒽醌脂质体溶液，该脂质体可用于注射，应在溶解后8小时内完成应用。

上述方法所制备得到的米托蒽醌脂质体的包封率为91.69±3.59％，所得脂质体在8小时之内的稳定性良好，可达到95％以上。

实施例8

本实施例从体外实验角度证明了脂质体剂型的米托蒽醌与相同浓度的常规剂型米托蒽醌相比具备更好的治疗效果。

取无药培养1周的HL60/ADM细胞，配成5×104/ml的细胞悬液，接种于96孔板中。实验分组为3组：即米托蒽醌脂质体组，游离的米托蒽醌组，空白对照组(加入等体积的生理盐水)。浓度分组为：0.025μg/ml，0.025μg/ml，0.25μg/ml，2.5μg/ml，25μg/ml。每个浓度组设3个复孔。置于CO2孵箱内培养24h，48h后，吸去培养液，加入无血清的培养液和浓度为50mg/ml的MTT溶液，CO2孵箱中孵育4h，离心，弃上清液，加入DMSO(二甲亚砜)150μl/孔，振荡20min，分光光度仪测定D(570)值。按下式求细胞存活率，根据线性方程求IC50。

细胞存活率＝{处理组D(570)值/对照组D(570)值}×100％

细胞抑制率＝1-细胞存活率。

结果为：米托蒽醌脂质体与游离的米托蒽醌药物对HL60/ADM细胞作用24h的IC50分别是：12.42、27.31μg/ml，作用48h的IC50分别是：8.25、12.44μg/ml。可以看出米托蒽醌脂质体与游离的米托蒽醌药物均对HL60/ADM细胞有杀伤作用，但是杀伤率存在较大差异，米托蒽醌脂质体对HL60/ADM细胞的杀伤作用比游离米托蒽醌的杀伤作用强。

实施例9

本实施例证明脂质体型米托蒽醌(LEM)与相同浓度的常规剂型米托蒽醌(MTO)相比具备更低的毒性。

选取雄性19-23g的雄性CD2F1鼠为实验对象，进行单次给药实验，评估药物的体内毒性。共取动物64只，使动物适应饲养环境2周，之后随机将64只动物平均分为8组，每组8只，每只鼠接受尾静脉给药，实验组分别给予各组动物5.5、10.5、15.5mg/kg剂量(按米托蒽醌计)的脂质体型米托蒽醌(LEM)；阳性对照组动物给予5.5、10.5、15.5mg/kg剂量的常规米托蒽醌(MTO)；尾静脉注射空白脂质体或生理盐水作为空白对照，空白脂质体的脂类浓度与15.5mg/kg米托蒽醌脂质体的脂类浓度一致。

每天都要观察鼠的状态，每周都要对鼠进行至少两次的称重。实验终止于第67天，选取有代表性的实验动物分别于实验开始后3天和实验结束时对其进行组织病理学评估。

单次给药毒性实验显示：5.5mg/kg或10.5mg/kg的MTO和LEM对CD2F1鼠均无致死效果。15.5mg/kg剂量的MTO使动物体重在第9天时明显下降了30.7％。在实验第10天时动物全部死亡。而15.5mg/kg剂量的LEM组的小鼠体重在实验前6天有一定的减少，实验的剩余时间里，动物的体重逐渐恢复正常。组织病理学评估的实验结果显示：MTO给药组和LEM给药组实验动物均发现一定的白细胞毒性。实验第61天到第67天，各LEM给药组的白细胞水平同对照组的白细胞水平一致，且各项临床化学指标均趋于正常。MTO各用药组在实验第3天均发现骨髓及脾脏造血干细胞的衰减，并发现脾脏淋巴细胞的衰减。LEM各给药组也发现了相似的细胞毒性，但均无MTO给药造成的细胞毒性严重，且到实验第67天，所有存活动物的骨髓及脾毒性均已恢复。各治疗组均未发现明显的肝、肺毒性。

实施例10

本实施例证明脂质体型米托蒽醌(LEM)与相同浓度的常规剂型米托蒽醌(MTO)相比具备更低的毒性。

选取雄性19-23g的CD2F1鼠为实验对象，进行单次给药实验，评估药物的体内毒性。共取动物40只，使动物适应饲养环境2周，之后随即将32只动物平均分为4组，每组8只，每只鼠接受尾静脉给药。LEM给药组分别给予两组实验动物25.5mg/kg和35.5mg/kg的药量(按米托蒽醌计)；MTO给药组给予一组实验动物25.5mg/kg的药量；以空白脂质体(脂类含量同15.5mg/kg的LEM)和生理盐水作为对照。

每天都要观察鼠的状态，每周都要对鼠进行至少两次的称重。实验同样终止于第67天，选取有代表性的实验动物分别于实验开始后3天和实验结束时对其进行血液毒性及组织病理学评估。

在实验前4天，各组动物未见不良反应发生，在实验第5-8天，25.5mg/kg的MTO用药组的动物陆续死亡。实验第5天，有2只动物死亡，第6天有2只动物死亡，该组剩余实验动物于实验第8天全部死亡。除第3组外，其他组别的实验动物无死亡，并且未发现明显的临床毒性征兆。血液毒性及组织病理学评估的实验结果显示：实验第3天，给予MTO25.5mg/kg及给予LEM35.5mg/kg的动物均发现体内的谷丙转氨酶(ALT)含量有适中的升高。MTO给药组和LEM给药组实验动物均发现一定的白细胞毒性，但LEM组别的白细胞毒性明显低于MTO用药组，实验第61天到第67天，各LEM给药组的白细胞水平同对照组的白细胞水平一致，且各项临床化学指标均趋于正常。MTO各用药组在实验第3天均发现骨髓及脾脏造血干细胞的衰减，并发现脾脏淋巴细胞的衰减。LEM各给药组也发现了相似的细胞毒性，但均没有比MTO给药造成的细胞毒性更严重，且到实验第67天，所有存活动物的骨髓及脾毒性均已恢复。各治疗组均未发现明显的肝、肺毒性。

通过对体重的观察发现，LEM单剂量给药25.0mg/kg组实验第9天动物体重有轻微下降(下降了4.8％)，之后动物的体重又上升至正常。而35.5mg/kg LEM组和25.5mg/kg MTO组的在实验第5天时均见到明显降低，分别减少了23％和31％。随后MTO组动物全部死亡，而LEM组动物体重逐渐恢复正常。总之，25.5mg/kg MTO组的实验动物发生了明显的药物中毒，而LEM组动物虽然发生一定的毒性反应，但毒性反应过后会逐渐恢复。

实施例11

本实施例证明脂质体型米托蒽醌(LEM)与相同浓度的常规剂型米托蒽醌(MTO)相比具备更低的毒性。

选取雄性19-23g的CD2F1鼠为实验对象，进行多次给药实验，评估药物的体内毒性。共取动物64只，使动物适应饲养环境2周，之后随即将64只动物平均分为8组，每组8只，每只鼠接受尾静脉给药。多次给药实验，共分5天给药，每天给药1次，给予实验动物2.0、5.0、8.0mg/kg剂量(按米托蒽醌计)的脂质体型米托蒽醌；阳性对照组动物给予2、5.0、8.0mg/kg剂量的常规米托蒽醌；尾静脉注射空白脂质体或生理盐水作为空白对照，空白脂质体的脂类浓度与8.0mg/kg米托蒽醌脂质体的脂类浓度一致。

每天都要观察鼠的状态，每周都要对鼠进行至少两次的称重。实验终止于第64天。选取有代表性的实验动物分别于实验开始后7天和实验结束时对动物进行血液毒性及组织病理学评估。

多次给药毒性实验结果显示：2.0mg/kg剂量(每天1次，给药5天)的MTO致使实验结束时(64天)有3只CD2F1鼠死亡，5只CD2F1鼠存活；5.0mg/kg剂量(每天1次，给药5天)的MTO使得鼠的体重迅速下降(7-9天体重减少30.45±6.0％，n＝10)，并且在第10天鼠全部死亡；8.0mg/kg剂量(每天1次，给药5天)的MTO使得鼠的体重迅速下降(第7天体重减少28.3％，n＝10)，并且随后鼠全部死亡。2.0mg/kg剂量及5.0mg/kg剂量(每天1次，给药5天)的LEM给药未观察到鼠死亡。5.0mg/kg剂量的LEM导致第8天鼠体重减小了6.7％，随后体重又回升；8.0mg/kg剂量(每天1次，给药5天)的LEM给药在实验结束时(64天)发现有1只鼠死亡，其余存活。

实验第7天，各剂量的MTO及LEM均发生脾脏及骨髓的造血淋巴再生功能减损。多次给药5.0mg/kg或8.0mg/kg剂量的MTO，两组动物均发现低等至中等程度的肝细胞空泡样变性。此外，MTO给药还导致鼠小肠及大肠绒毛或隐窝发生皱缩。与此相对，LEM给药则不产生肠毒性。各给药组均未发现肺、心、肾毒性。

实施例12

本实施例证明脂质体型米托蒽醌(LEM)与相同浓度的常规剂型米托蒽醌(MTO)相比具备更低的毒性。

选取雄性19-23g的CD2F1鼠为实验对象，进行多次给药实验，评估药物的体内毒性。共取动物56只，使动物适应饲养环境2周，之后随即将56只动物平均分为7组，每组8只，每只鼠接受尾静脉给药。多次给药实验，共分5天给药，每天给药1次。给予实验动物5.5、8.0、11.0mg/kg剂量(按米托蒽醌计)的脂质体型米托蒽醌；阳性对照组动物给予2.0、5.5mg/kg剂量的常规米托蒽醌；尾静脉注射空白脂质体或生理盐水作为空白对照，空白脂质体的脂类浓度与8.0mg/kg米托蒽醌脂质体的脂类浓度一致。

每天都要观察鼠的状态，每周都要对鼠进行至少两次的称重。实验终止于第64天。选取有代表性的实验动物分别于实验开始后7天和实验结束时对动物进行血液毒性及组织病理学评估。

体重变化方面，第3组(LEM11.0mg/kg/天)和第5组(MTO5.5mg/kg/天)动物的体重减轻较为明显，第3组(LEM11.0mg/kg/天)动物在实验第7天体重减少了22.5％，第5组动物(MTO5.5mg/kg/天)在实验第7天体重减少了33.7％。在实验第12天，第1组(LEM5.5mg/kg/天)、第2组(LEM8.0mg/kg/天)、第4组(MTO2.0mg/kg/天)动物的体重分别下降了5.5％、27％、26.3％，但随后的实验过程中，这几组动物的体重又恢复正常。各对照组动物的体重则无明显改变。

在药物毒性致死方面，第1组动物在整个实验过程中无死亡发生，而第2组动物在整个实验过程中则发生两例死亡，第4组动物发生5例死亡，第3组和第5组动物在实验结束时全部死亡。

在血细胞毒副作用方面，5.5mg/kg/天的MTO给药同11.0mg/kg/天的LEM给药均可见白细胞、血小板的数量下降。可见两组动物的中性粒细胞、淋巴细胞数量降低和血小板水平减少，同时可见红细胞计数水平呈现一定的增加。而各低剂量给药组的这种血细胞毒性并不明显。5.5mg/kg/天的MTO给药同11.0mg/kg/天的LEM给药均可诱发一定程度的肝损伤，这两组的濒死动物均表现出ALT、AST的明显升高、且两组动物的胆红素水平均明显高于对照组小鼠。

总之，临床病理学数据显示，5.5mg/kg/天的MTO给药同11.0mg/kg/天的LEM给药呈现相似的药物毒性。且剂量为5.5mgmg/kg/天的MTO要比相同剂量的LEM的体内毒性及动物致死率高出许多。这可证明脂质体剂型的应用可明显降低米托蒽醌的药物毒性。

实施例13

本实施例证明脂质体型米托蒽醌(LEM)与相同浓度的常规剂型米托蒽醌(MTO)相比在动物血液中的血药浓度更高，并且LEM在动物体内的半衰期要长于MTO，LEM在动物体内的清除率要低于MTO。

以雄性19-23g的CD2F1小鼠作为实验对象，小鼠分为2组，每组36只。通过尾静脉注射的方式给予第1组小鼠5mg/ml的MTO，给予第2组小鼠5mg/ml的LEM(按米托蒽醌计)。于给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时通过心脏穿刺的方式对不同组的4只小鼠进行取血，取血前对小鼠进行麻醉。取出的血液置于加有肝素的试管中，并向其中加入20μl100mg/ml抗坏血酸的0.1M柠檬酸缓冲液(pH3.0)。血液样本在4℃2000rpm下离心10分钟以分离血浆。取血后对小鼠进行脱臼处死。快速分离不同的组织(肝、脾、心脏、肾、肺)用低温生理盐水进行漂洗。在用于米托蒽醌分析前，将血液和组织样本于-20℃储存。

利用反向HPLC对血液和组织样本中的米托蒽醌进行分析。将0.01mg/ml的己烷磺酸和0.5mg/ml的抗坏血酸加入到0.25ml的血浆样本中，并向其中加入0.25μg的阿美蒽醌作为内参物。涡旋振荡30秒，之后在向其中加入0.5ml的0.1M硼酸盐缓冲液(pH9.5)及150μl的1M头孢匹胺氢化物，再次涡旋振荡30秒。样品用10ml二氯甲烷提取，水平摇动1小时，3000rpm离心15min。分离出9ml的有机层，在通入氮气下蒸发。样品重溶解于100μl流动相，之后进行HPLC检测分析。组织样本用1mlpH3.0包含20％抗坏血酸的0.1M柠檬酸盐缓冲液进行匀浆化处理，并用上述方法进行提取。利用反向色谱(Waters-bondapak C18)分离米托蒽醌，流动相的组成包括33％乙腈、67％pH2.7的0.16M甲酸铵。流速为1.0ml/min。在600nm下进行检测。内参物和米托蒽醌的保留时间分别为3.7及4.3分钟。

血浆的药动学参数利用标准方法进行评测，利用血浆浓度-时间曲线的线性回归分析计算出清除率常数(K)。利用外标法计算出曲线下面积(AUC)。半衰期利用如下公式计算：t1/2＝0.693/K。

药物代谢方面：MTO给药后的血浆峰浓度为0.41±0.10μg/ml，与此对应，LEM给药后血浆峰浓度为20.95μg/ml，是MTO的51.1倍。LEM给药的血浆浓度-时间曲线下的峰面积要显著高于MTO给药(28.12vs0.14)。LEM给药的半衰期要显著长于MTO，LEM半衰期为67分钟，而MTO半衰期则为7.3分钟。LEM剂型米托蒽醌的总体清除率要显著低于MTO，两者分别为0.17μg·h/ml和22.3μg·h/ml。

在米托蒽醌药物组织分布方面，分别给予CD2F1小鼠MTO(5mg/kg)或LEM(5mg/kg)后，5分钟在心肌组织处达到峰浓度。给予MTO后1克心肌组织的米托蒽醌积累量为10.8±0.2μg，给予LEM后1克心肌组织的米托蒽醌积累量为5.6±0.9μg。LEM给药心肌组织的米托蒽醌浓度至少小于MTO给药的两倍；(P＜0.02)LEM给药在鼠肝脏和脾脏部位的积累要显著高于MTO给药(心脏：P＜0.001，脾脏：P＜0.008)；LEM给药在鼠肺部及肾部的积累要显著低于MTO给药(肺：P＜0.001，肾：P＜0.003)。

与MTO相比，LEM的应用使得米托蒽醌在CD2F1鼠心脏、肺、肾的积累量显著降低，在肝脏和脾脏的积累量有明显升高。这证明脂质体型米托蒽醌(LEM)可改变常规剂型米托蒽醌在体内的分布。米托蒽醌的毒性主要体现在心肌毒性方面，利用脂质体型米托蒽醌(LEM)给药与常规剂型(MTO)给药相比可显著减小米托蒽醌在心肌组织处的积累，具体而言，在给予MTO后5分钟和15分钟米托蒽醌的心肌积累浓度为10.8-10.2μg/g，在实验后48小时降至6.0μg/g；在给予LEM后5分钟和15分钟米托蒽醌的心肌积累浓度为5.6-4.7μg/g，在实验后48小时降至1.5μg/g。以上数据可证明LEM的应用可降低米托蒽醌的心肌毒性。

实施例14

犬体内药动学参数测定，18只比格犬按性别及体重指数均分为3组，分别为米托蒽醌脂质体组0.2，0.4和1.0mg/kg组；0.2mg/kg组6只犬经过3周的洗脱期后给予游离的米托蒽醌1.0mg/kg。分别于给药后不同时间(15、30、45min和1、2、4、8、24、48、72、96、120h)从前肢静脉取血1ml置肝素抗凝管中。采用HPLC法测定血浆中米托蒽醌的药物浓度，色谱柱为ZorbaxSB-C18分析柱(150mm×4.6mm，5μm，Agilent公司，SN：USCM014615)，C18预置柱(4mm×3.0mm，Phenonenex，Torrance，CA，USA)；检测波长655nm；流动相：乙腈与庚烷磺酸钠缓冲液(庚烷磺酸钠2.01g，冰醋酸4.5ml，水500ml)64∶36(v/v)；柱温30℃；流速1.0ml/min。取犬血浆200μl，加入蛋白沉淀剂400μl[乙腈-甲醇(含0.5mol/LHCl)＝10∶90，v/v]，涡流混合30s，室温放置30min，离心(11000r/min)15min后，取上清液20μl进样，记录色谱图。采用DAS(ver2.1.1)药动学软件对实测的血药浓度数据进行计算，在运用SPSS(ver111.5)统计学软件对药动学参数进行成组t检验、配对t检验和相关性性检验。

药动学参数测定与比较可知米托蒽醌脂质体在比格犬体内0.2～1.0mg/kg呈线性动力学特征，与1.0mg/kg的游离米托蒽醌相比，等剂量的米托蒽醌脂质体的AUC和t1/2更高，清除速率更低，分布容积更小。

实施例15

本实施例证实脂质体型米托蒽醌(LEM)制剂在对比格犬给药后在血浆中的血药浓度高于常规米托蒽醌(MTO)给药后的血药浓度。LEM的药物清除速度较MTO缓慢。

体重为10-14kg的比格犬分别经尾静脉注射0.25mg/kg，0.5mg/kg，1mg/kg的米托蒽醌脂质体，和剂量为0.25mg/kg的游离米托蒽醌。并且分别于药物注射后的5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，24h和48h每个时间点收集每个组的比格犬的血液。血液在4℃，2000rpm条件下离心10min，分离血浆。利用反向高效液相色谱法对血浆样本中的米托蒽醌进行分析。米托蒽醌通过反相色谱法被分离出来，流动相为乙腈(33％)和0.16M的甲酸铵缓冲液，pH2.7(67％)的混合物组成，流速为1.0ml/min。米托蒽醌的检测波长为600nm。本方法在米托蒽醌的治疗范围内线性和重现性均良好。其灵敏度为10ng/ml。

结果表明：游离的米托蒽醌和米托蒽醌脂质体在剂量为0.25mg/kg时的半衰期分别是0.21h和1.37h(p＜0.05)；游离米托蒽醌和米托蒽醌脂质体在剂量为0.25mg/kg时的清除率分别为715.66ml/min/kg和14.18ml/min/kg(p＜0.05)；游离米托蒽醌和米托蒽醌脂质体在剂量0.25mg/kg时的AUC值分别为0.29mg.h/ml和55.31mg.h/ml(p＜0.05)。具体情况见表1。

表1不同剂型米托蒽醌比格犬动物体内药代动力学比较

本实施例表明给予脂质体型米托蒽醌(LEM)的比格犬与相同剂量的常规米托蒽醌(MTO)相比，其产生的米托蒽醌血浆浓度的峰值提高了5-10倍。脂质体制剂还可增加米托蒽醌的AUC值并降低其清除率，并且随着米托蒽醌引入量的增多，AUC也会随剂量线性增加。

实施例16

本实施例证明了米托蒽醌脂质体(LEM)与游离的米托蒽醌(MTO)相比有更好的抗癌活性。

不同剂型米托蒽醌在CD2F1小鼠白血病模型中的抗癌作用：第0天，雌性CD1F1小鼠尾静脉注射1×10⁴个L1210白血病细胞，肿瘤接种24h之后，小鼠随机分为四组(n＝10)，分别通过尾静脉单剂量给药LEM或MTO。LEM的单次给药剂量分别为10.0mg/ml和20.0mg/ml，MTO的单次给药剂量为10.0mg/ml，空白对照组给相应体积的生理盐水。每天观察小鼠状态，实验进行60天。

不同剂型米托蒽醌在Balb/c裸鼠乳腺癌模型中的抗癌作用：将对数生长期的MCF-7乳腺癌细胞(2×10⁶个/0.2ml)皮下接种于雌性Balb/c裸鼠的乳腺区域。待肿瘤生长到平均体积为50mm³时，开始进行治疗。将MCF-7乳腺癌模型小鼠随机分为5组(n＝6)。分别尾静脉注射给予MTO0.5mg/kg，MTO1.0mg/kg，LEM2.5mg/kg，LEM5.0mg/kg进行治疗，空白组每天给等体积的生理盐水。隔天给药一次，共给药5次。肿瘤体积的表示方法：以治疗前的肿瘤体积(第0天时的肿瘤体积)为100％，实验开始后每周测两次体积，分别与第0天的肿瘤体积做比值，以此方法来评估肿瘤体积的变化。

本实施例研究过程中，MTO的单次给药剂量选择10.0mg/kg，因为MTO的单次给药剂量大于10.0mg/kg时，会对CD2F1小鼠表现出严重的毒性反应；LEM治疗裸鼠的单次给药剂量选择20.0mg/kg，因为当MTO治疗裸鼠时的单次给药剂量如果大于20.0mg/kg，裸鼠就会产生严重的毒性反应。在L1210肿瘤模型小鼠中，生理盐水小鼠在接种L1210肿瘤细胞后8天之内全部死亡，但是接受LEM(单次给药剂量为20mg/kg)治疗的小鼠在60天内没有出现死亡，全部存活。本研究表明了米托蒽醌脂质体具有较好的治疗效果。小鼠单次给予游离米托蒽醌10.0mg/kg进行治疗的小鼠存活率为20％；然而接受米托蒽醌脂质体治疗的小鼠存活率为40％，该现象表明米托蒽醌脂质体与游离的米托蒽醌相比具有更高的抗癌活性。

不同剂型米托蒽醌在Balb/c裸鼠模型中的抗癌作用实验进行了48天，接受剂量为2.5mg/kg的LEM和剂量为5mg/kg的LEM治疗的小鼠肿瘤体积明显比生理盐水组的肿瘤体积小(p＜0.05)；并且LEM组小鼠的肿瘤体积与MTO组小鼠的肿瘤体积相比也明显减小(p＜0.05)。生理盐水组的肿瘤体积为1692.1±198.5％；剂量为2.5mg/kg的LEM组的肿瘤体积为1046.5±145.3％；剂量为5.0mg/kg的LEM组的肿瘤体积为815.7±96.2％；0.5mg/kg游离米托蒽醌治疗组的肿瘤体积为1392.5±245.3％，1.0mg/kg游离米托蒽醌治疗组的肿瘤体积为1152.9±22.7％。

Claims (10)

1.本发明中的脂质体由磷脂、胆固醇组成，所包封的药物为常规化疗药物，该脂质体可用于哺乳动物的肿瘤治疗，其中哺乳动物可以是人。

2.权利要求1中的米托蒽醌脂质体，其特征在于组成的磷脂中，带负电荷的磷脂是磷脂酰肌醇、磷脂酸或磷脂酰丝氨酸、牛心磷脂中的一种或几种；其中所述的心磷脂可选自天然心磷脂或合成心磷脂；中性磷脂为鸡蛋卵磷脂或氢化大豆卵磷脂中的一种或多种。

3.权利要求1中的米托蒽醌脂质体，所包封的常规化疗药物可以是米托蒽醌、阿霉素、紫杉醇表阿霉素、顺铂等多种化疗药物。

4.权利要求1中所述的米托蒽醌脂质体，其特征为冻干过程中时加入冻干相关的保护剂，保护剂可以是单糖、二糖、寡聚糖、多糖、多元醇及其他水溶性高分子物质。

5.权利要求1中脂质体的制备的常用方法有很多，例如：薄膜法、超声法、硫酸铵梯度法及冻干法、表面活性剂去除法，高压均质法等，最为常用的是薄膜分散法和硫酸铵梯度法，冻干法可以实现工业化生产规模。本发明所用的制备方法可以从以上众多方法中选择。

6.权利要求1中脂质体的米托蒽醌的浓度范围约在0.5-2mg/ml，米托蒽醌同脂类的比例应在1∶10-1∶20范围内。

7.权利要求1中脂质体的米托蒽醌的包封率至少在90％以上，粒径范围应在10nm-0.5μm范围内。

8.权利要求1中的米托蒽醌脂质体给药途径可以为口服给药、静脉给药、局部给药、腹膜内给药等。药物安全性要高于常规米托蒽醌，可包括用药后动物体重减轻低、动物死亡率低、体内白细胞杀伤低、心肌毒性低、骨髓及脾脏造血功能抑制低等方面。

9.权利要求1中米托蒽醌脂质体可以用于治疗非何杰金(氏)淋巴瘤，骨髓瘤，晚期乳腺癌，膀胱癌，卵巢癌及肝癌，急性非淋巴细胞自血病，特别对急性淋巴细胞白血病和晚期乳腺癌以及非何杰金(氏)淋巴瘤由很高的高肿瘤活性，尤其是急性淋巴细胞白血病和晚期乳腺癌。

10.权利要求1中所述的脂质体，如果有需要可与不同于米托蒽醌的第二种治疗剂一起联合应用，所述的第二种治疗剂包括抗肿瘤药，抗真菌药，抗生素以及其它活性药物。