CN103766486B - 一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料及其制备方法，以解决双歧杆菌乳饮料产品中双歧杆菌活力低、保存期短、不易贮存的问题。该乳饮料含有双歧杆菌包埋珠，其制备方法分为两个环节：一是双歧杆菌包埋珠制备；二是含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料制备。本发明有效解决了双歧杆菌在乳饮料含量中活菌数低，保藏期短及食用后双歧杆菌难以大量到达肠道等问题，有效保证了双歧杆菌活菌数量和双歧杆菌活性以及双歧杆菌的贮存时间，实现了双歧杆菌对人体的益生作用。双歧杆菌包埋珠乳饮料制备条件温和，方法简便，便于工业化大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种双歧杆菌包埋珠的乳饮料及其制备方法。
背景技术
双歧杆菌是人体内的正常生理性微生物，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。双歧杆菌的主要生理功能有：1.生物屏障和生物拮抗作用；2.增强免疫和抗肿瘤作用；3.营养作用；4.抑制内毒素的产生；5.廷缓机体衰老。随着年龄的增长、环境污染及抗生素的使用等影响，双歧杆菌在人体肠道内的数量逐渐下降，从而造成肠道内微生态平衡破坏，导致各种疾病衰老的发生。
向肠道内补充双歧杆菌最直接的途径就是采用外源口服食用方式，通过外源口服食用补充增加双歧杆菌在人体肠道的数量，调整人体肠道微生态平衡，提高免疫力，增强体质。双歧杆菌具有对营养要求苛刻、专性厌氧、对氧气、低pH等外界不良环境敏感等特殊的生物学性状，使得双歧杆菌产品在生产、贮存和运输过程中很难保持高活性，双歧杆菌在口服食用时无法耐受低pH值的胃酸、胆盐等环境，很容易失去活性,难以保证大量活菌到达肠道并定殖于肠黏膜上。双歧杆菌的数量及其活性被作为检验含有双歧杆菌的功能食品、保健品或药品等产品质量的重要指标，双歧杆菌产品在保存中及口服食用过程中极易失活，保持双歧杆菌高存活率是这类产品的一大难题。国内外都在试图通过基因改造或耐酸耐氧菌株的筛选等来提高菌种对酸和氧的抵抗能力，在工艺技术上，通过微胶囊化使菌与氧和酸隔离，以提高双歧杆菌的存活率。
发明内容
本发明的目的是提供一种双歧杆菌包埋珠的乳饮料，以解决双歧杆菌乳饮料产品中双歧杆菌活力低、保存期短、不易贮存的问题。
本发明的另一个目的是提供一种双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法。
本发明技术方案如下：一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料，它含有双歧杆菌包埋珠，双歧杆菌包埋珠包含双歧杆菌属长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）CGMCC 编号1.2186、长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）CGMCC编号1.2202、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）CGMCC编号 1.2190、短双歧杆菌（Bifidobacterium brevis）CGMCC编号1.2213、双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CGMCC编号1.2212或动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）CGMCC编号1.1852中的一种，双歧杆菌包埋珠中的双歧杆菌活菌数不小于1×109 CFU/g。上述双歧杆菌购买于北京的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。优选的，双歧杆菌包埋珠为呈球形固态状，直径为3mm—12mm。
一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，包括以下步骤：
（1）双歧杆菌包埋珠的制备
A、菌种活化试管培养
菌种活化前，在无菌室将零下18℃—4℃温度下保存的双歧杆菌安瓿瓶在室温下放置2 h—3 h，然后将安瓿瓶消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2 mL—0.5 mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按体积百分比为2％—5％的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20 h—48 h后，终止培养；以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物；
B、三角瓶一级菌种培养
取试管培养三代液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入三角瓶进行一级菌种液体培养，在厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20h—48h后，终止培养；
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入种子罐进行二级菌种液体培养，在非厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20h—48h后，终止培养；
D、发酵罐培养
将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入发酵罐，在30℃—42℃的温度下培养，当发酵液pH值低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0—6.5之间，培养20 h—48 h后停止培养；
E、菌体离心收集
设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 min—30 min，离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；
F、添加保护剂
将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/100—1/10的保护剂中；在零下20℃—10℃的温度下贮存备用;
G、双歧杆菌的包埋
将悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5min—30min，过滤，用无菌水洗涤，即得双歧杆菌包埋珠；
（2）乳饮料的制备
H、原料奶预处理：将原料奶预热至65℃—70℃的温度，打开搅拌机，将蔗糖加入热奶中，全部化开时，用200目过滤布进行过滤；原料奶预热后均质，均质压力为18Mpa—20Mpa；然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至37℃—42℃；
I、制备乳饮料：分为制备配制形乳饮料和发酵型乳饮料两种，
1）制备双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料：按预处理原料奶与水比例为1-6:6-1,进行配比后，加入蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素调制，然后均质、杀菌、冷却，双歧杆菌包埋珠按10-30%的量加入乳饮料中，然后无菌分装；
2）制备双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料：原料奶预处理后，按体积百分比为2％—5％的接种量，将发酵剂接种于预处理后的奶中，在37℃—43℃的温度下培养，酸度达到70—80洁尔涅尔度，终止发酵，然后加入水，乳饮料占40-50%与水占50-60%,再加入蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素，均质后，双歧杆菌包埋珠按质量百分比15-20%的量加入乳饮料中，然后无菌分装，
J、冷藏：将含有有双歧杆菌包埋珠的乳饮料，冷却至20℃—25℃后，进入冷藏温度为2℃—10的冷库，最终成品。
优选的，所述步骤A中培养基的组成和重量配比为：蛋白胨3—15份，牛肉膏1—10份，胰蛋白胨3—10份，酵母浸出粉 1—10份，葡萄糖3—15份，磷酸氢二钾0.5—5份，乙酸钠0.5—5份，柠檬酸氢二铵 0.5—5份，七水硫酸锌0.1—0.5份，七水硫酸镁0.05—0.2份，L-半胱氨酸盐酸盐0.1—1份，低聚果糖0.5—5份，碳酸钙0.5—2份，吐温-80 1—5份和水1000份; 培养基的pH值为6.0—7.5，于0.05Mpa—0.14Mpa湿热灭菌15 min—30 min后使用。
优选的，所述步骤F中保护剂的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份，甘油0.5—5份，抗坏血酸0.1—1份，蔗糖3—10份和水100份；将脱脂牛奶或脱脂奶粉、甘油和蔗糖及水在0.05 Mpa—0.14 Mpa压力下湿热灭菌15min—30min，抗坏血酸采用过滤除菌。
优选的，所述步骤G中包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1，制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为75℃ —95℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.05 Mp—0.14Mpa压力下湿热灭菌15 min—30min。
优选的，所述步骤G中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占50—90份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占10—50份。
优选的，所述步骤G中固化剂为氯化钙溶液，配制过程为用蒸馏水将氯化钙配制成浓度为0.1mol/L的饱和溶液，于0.05Mpa—0.14Mpa湿热灭菌15min—30min后使用。
优选的，所述步骤I中的乳饮料发酵剂是活菌数量为1:1的嗜酸链球菌（Streptococcus thermophilus）CGMCC编号 1.1864与德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）CGMCC编号 1.1863的混合物，菌种购买于北京的中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心（CGMCC）。
优选的，所述步骤I中蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素的加入量为，按生牛乳和水总量加入8-10%蔗糖，0.1-0.2%柠檬酸,0.1- 0.3%食用果胶，0.15-0.2%羧甲基纤维素。
本发明含有双歧杆菌包埋珠乳饮料是双歧杆菌菌种，经液体培养基增殖培养，浓缩分离，通过天然高分子物质食用海藻酸钠、明胶包埋，然后加入到乳饮料中和冷藏等步骤制成含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料。含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料解决了双歧杆菌乳饮料制品低pH不利于长时间维持双歧杆菌活菌数量问题和食用过程中双歧杆菌易失活的问题。
双歧杆菌包埋珠具有耐胃酸、耐胆盐和肠溶性的优点，避免了胃酸和胆盐对摄入人体的双歧杆菌的杀伤作用，提高了双歧杆菌定殖在人体肠道的活菌数量，实现了双歧杆菌对人体的益生作用，保证了益生菌在肠道中的定殖。本发明通过将制备好的双歧杆菌包埋珠加入到乳饮料中制得双歧杆菌包埋珠乳饮料，并合理优化双歧杆菌包埋珠乳饮料工艺。在乳饮料基质中，4℃左右贮存28天月后存活率可保持在10%以上，常温贮存28天后存活率可保持在1%以上。双歧杆菌包埋珠乳饮料制备条件温和，方法简便，便于工业化大生产。
本发明为双歧杆菌乳饮料在生产、贮存、运输和销售时可在较长时间内活性不减弱，为消费时具有足够的活菌数量提供了保障，也为口服食用过程中大量活菌到达肠道提供了保证。含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料主要特点是：双歧杆菌活菌含量高，产品保藏期较长，每批产品质量稳定，提高了双歧杆菌乳饮料产品品质，加入的双歧杆菌包埋珠食用口感弹性十足、爽滑可口。本发明的乳饮料中双歧杆菌包埋珠，在酸度75洁尔涅尔度的乳饮料基质中，2℃—8℃保藏28天，双歧杆菌活菌数大于108 CFU/g。在酸度75洁尔涅尔度乳饮料基质中，室温（25℃左右）贮藏28天，双歧杆菌活菌数大于107 CFU/g。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，不用来限值本发明的范围。
实施例1
（1）双歧杆菌包埋珠制备
A、菌种活化试管培养
培养基组成为，蛋白胨15g，牛肉膏 10g，胰蛋白胨3g，酵母浸出粉1g，葡萄糖15g，磷酸氢二钾 5g，乙酸钠0.5g，柠檬酸氢二铵0.5g，七水硫酸锌0.1 g，七水硫酸镁0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，低聚果糖0.5g，碳酸钙0.5g，吐温-80 5g和水1000g。培养基的pH值为7.0，于0.05MpaMpa湿热灭菌30 min后使用;
在菌种活化前，将4℃保存的长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）安瓿瓶在室温下放置2h，然后在无菌室将安瓿瓶用75%浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2 mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按5％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下37.5℃培养36h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物;
B、三角瓶一级菌种培养
将第三代培养物按5％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下37.5℃培养24h后，终止培养;
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按5％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下37.5℃培养24h后，终止培养;
D、发酵罐培养
发酵罐培养：按5％(体积百分比)的接种量，接入种子罐二级菌种液体培养物，在非厌氧条件下37.5℃条件下培养，当pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0，24h后停止培养;
E、菌体离心收集
设置离心温度4℃，离心转速6000 r/min，离心时间15 min；离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用;
F、添加保护剂
保护剂组成为：脱脂牛奶15g、甘油2g、抗坏血酸0.5g、蔗糖10g和水100g；将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/100的保护剂中；
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按2:1重量比例配制，制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为80℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.05 Mpa下湿热灭菌20min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成0.5mol/L浓度氯化钙溶液，在0.05 Mpa湿热灭菌20min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占50份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占50份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂0.5mol/L氯化钙溶液，形成12 mm直径的双歧杆菌包埋珠，慢速搅拌30min，过滤，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋珠5 min，零下20℃低温贮存备用；
（2）制备双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料
H、原料奶预处理：将生牛乳原料奶预热70℃，打开搅拌机，将原料质量5%的蔗糖加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤。原料奶预热后均质，均质压力为18 Mpa，然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至42℃；
I、接种、发酵：乳饮料发酵剂为嗜酸链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种按照1:1配制，按5％（体积百分比）的接种量，将乳饮料发酵剂接种于预处理后原料奶中， 43℃发酵，乳饮料滴定酸度到达70洁尔涅尔度，终止发酵。进行搅拌破乳冷却至25℃，按乳饮料与水的比例为1:1,加入纯净水，按乳饮料和水总量加入8%蔗糖，0.1%柠檬酸, 0.1%食用果胶，0.2%羧甲基纤维素，均质压力20MPa下均质后，双歧杆菌包埋珠按质量百分比20%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料；
J、冷藏，将终止发酵的双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料，冷却至25℃温度后，进入冷藏温度为4℃的冷库最终成品。
实施例2：
（1）双歧杆菌包埋块的制备
A、菌种活化试管培养
培养基组成为，蛋白胨15g，牛肉膏10g，胰蛋白胨3g，酵母浸出粉1g，葡萄糖15g，磷酸氢二钾5g，乙酸钠0.5g，柠檬酸氢二铵0.5g，七水硫酸锌0.1g，七水硫酸镁0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，低聚果糖0.5g，碳酸钙0.5g，吐温-80 5g和水1000g；培养基的pH值为7.5，于0.14Mpa湿热灭菌15 min后使用；
在菌种活化前，将4℃保存的长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）安瓿瓶在室温下放置3h，然后在无菌室将安瓿瓶用75%浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.25mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按3％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下42℃培养20h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物；
B、三角瓶一级菌种培养
将第三代培养物按3％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下42℃培养20 h后，终止培养；
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按3％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下42℃培养20h后，终止培养；
D、发酵罐培养
发酵罐培养：按3％(体积百分比)的接种量，接入种子罐二级菌种液体培养物，在非厌氧条件下42℃条件下培养，当pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.5之间，20 h后停止培养。
E、菌体离心收集
设置离心温度8℃，离心转速3000 r/min，离心时间30 min；离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用;
F、添加保护剂
保护剂组成为，脱脂奶粉30g、甘油2g、抗坏血酸0.1g、蔗糖3g和水100g；将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/10的保护剂中；
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由2重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按5:1重量比例配制，
制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为95℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.14 Mpa下湿热灭菌30 min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成0.5mol/L浓度氯化钙溶液，在0.05 Mpa湿热灭菌20min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占90份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占10份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂0.5mol/L氯化钙溶液，形成12 mm宽，12 mm厚，双歧杆菌包埋条，慢速搅拌15min，过滤，切成长12 mm双歧杆菌包埋块，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋块1 min， 10℃低温贮存备用；
（2）制备双歧杆菌包埋块配制型乳饮料
H、原料奶预处理：将生牛乳原料奶预热65℃，打开搅拌机，将原料质量5%的蔗糖加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤。原料奶预热后均质，均质压力为20Mpa，然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至37℃；
I、配制：以生牛乳为原料，原料奶预处理后加入水，按预处理原料奶与水比例为6:4,进行配比后，按生牛乳和水总量加入10%蔗糖，0.2%柠檬酸, 0.3%食用果胶，0.2%羧甲基纤维素进行配制型乳饮料制备，均质压力18MPa下均质后，杀菌温度95℃，时间5分钟，冷却至25℃。双歧杆菌包埋珠按30%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料；
J、冷藏：冷却至20℃温度后，进入冷藏温度2℃冷库，最终成品。
实施例3：
（1）双歧杆菌包埋珠的制备
A、菌种活化试管培养
培养基组成为，蛋白胨15g，牛肉膏 10g，胰蛋白胨3g，酵母浸出粉1g，葡萄糖15g，磷酸氢二钾 5g，乙酸钠0.5g，柠檬酸氢二铵0.5g，七水硫酸锌0.1 g，七水硫酸镁0.05g，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，低聚果糖0.5g，碳酸钙0.5g，吐温-80 5g和水1000g。培养基的pH值为6.0，于0.10Mpa湿热灭菌20min后使用；
在菌种活化前，将零下18℃保存的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）安瓿瓶在室温下放置2.5 h，然后在无菌室将安瓿瓶用75%浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.3 mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按2％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下30℃培养48 h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物。
B、三角瓶一级菌种培养
将第三代培养物按2％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下30℃培养48h后，终止培养。
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按2％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下30℃培养48 h后，终止培养。
D、发酵罐培养
发酵罐培养：按2％(体积百分比)的接种量，接入种子罐二级菌种液体培养物，在非厌氧条件下30℃条件下培养，当pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.2，48 h后停止培养。
E、菌体离心收集
设置离心温度0℃，离心转速9000 r/min，离心时间10 min；离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用;
F、添加保护剂
保护剂组成为，脱脂牛奶10 g、甘油5 g、抗坏血酸1 g、蔗糖5 g和水100 g；将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/50的保护剂中；
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由2重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按1:1重量比例配制，
制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为75℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.10 Mpa下湿热灭菌15 min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成0.5mol/L浓度氯化钙溶液，在0.05 Mpa湿热灭菌20min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占60份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占40份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂0.5mol/L氯化钙溶液，形成直径3 mm，双歧杆菌包埋珠，慢速搅拌5 min，过滤，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋珠2min， 5℃低温贮存备用；
（2）制备双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料
H、原料奶预处理：将生羊乳原料奶预热68℃，打开搅拌机，将原料质量5%的蔗糖加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤，原料奶预热后均质，均质压力为19Mpa，然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至40℃；
I、配制：以生牛乳为原料，原料奶预处理后加入水，按预处理原料奶与水比例为1:1,进行配比后，按生牛乳和水总量加入10%蔗糖，0.2%柠檬酸, 0.3%食用果胶，0.2%羧甲基纤维素进行配制型乳饮料制备，均质压力18MPa下均质后，杀菌温度95℃，时间5分钟，冷却至25℃。双歧杆菌包埋珠按30%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料；
J、冷藏：冷却至25℃温度后，进入冷藏温度为10℃的冷库，最终得成品。
实施例4：
（1）双歧杆菌包埋块的制备
A、菌种活化试管培养
培养基组成同实施例1，在菌种活化前，将零下10℃保存的短双歧杆菌（Bifidobacterium brevis）安瓿瓶在室温下放置2h，然后在无菌室将安瓿瓶用75%浓度的酒精棉球擦拭表面消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2 mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按4％(体积百分比)的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下35℃培养36 h后，终止培养。以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物；
B、三角瓶一级菌种培养
将第三代培养物按5％(体积百分比)的接种量接入三角瓶进行一级菌种培养，在厌氧条件下35℃培养24 h后，终止培养；
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按4％(体积百分比)的接种量，接入种子罐进行二级菌种培养，在非厌氧条件下38℃培养24 h后，终止培养；
D、发酵罐培养
发酵罐培养：按4％(体积百分比)的接种量，接入种子罐二级菌种液体培养物，在非厌氧条件下37.5℃条件下培养，当pH低于5.5时用NaOH溶液调节发酵液pH至6.5，24 h后停止培养；
E、菌体离心收集
设置离心温度3℃，离心转速5000 r/min，离心时间20 min；离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；
F、添加保护剂
保护剂组成为，脱脂牛奶10 g、甘油3 g、抗坏血酸0.3 g、蔗糖5 g和水100 g；将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/20的保护剂中；
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按3:1重量比例配制，
制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为80℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.08 Mpa下湿热灭菌15 min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成2mol/L浓度氯化钙溶液，在0.08 Mpa湿热灭菌15min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占70份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占30份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂2mol/L氯化钙溶液，形成5 mm宽，5 mm厚的双歧杆菌包埋条，慢速搅拌10 min，过滤，切成5 mm长双歧杆菌包埋块，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋块2 min，5℃低温贮存备用；
（2）制备双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料
H、原料奶预处理：将生羊乳原料奶预热70℃，打开搅拌机，将原料质量5%的蔗糖加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤。原料奶预热后均质，均质压力为20 Mpa，然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至37℃；
I、接种、发酵：乳饮料发酵剂为嗜酸链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种按照1:1配制，按5％（体积百分比）的接种量，将乳饮料发酵剂接种于预处理后原料奶中， 43℃发酵，乳饮料滴定酸度到达70洁尔涅尔度，终止发酵。进行搅拌破乳冷却至25℃，按乳饮料与水的比例为6:4,加入纯净水，按乳饮料和水总量加入9%蔗糖、0.2%柠檬酸、0.1%食用果胶，0.2%羧甲基纤维素，均质压力18MPa下均质后，双歧杆菌包埋珠按质量百分比15%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料；
J、冷藏，将终止发酵的双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料，冷却至22℃温度后，进入冷藏温度为5℃的冷库最终成品。
实施例5：
重复实施例1的步骤，有以下不同点：
包埋块包含的双歧杆菌菌种为双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum），
（1）双歧杆菌包埋珠制备
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由5重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与95重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按4:1重量比例配制；
制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为80℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.12Mpa下湿热灭菌1530 min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成0.1mol/L浓度氯化钙溶液，在0.12 Mpa湿热灭菌15min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占80份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占20份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂0.5mol/L氯化钙溶液，形成12 mm直径的双歧杆菌包埋珠，慢速搅拌30min，过滤，形成直径5mm双歧杆菌包埋珠，慢速搅拌10 min，过滤，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋珠2 min，5℃低温贮存备用；
（2）双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料制备
H、原料奶预处理：原料奶预处理：将原料奶预热65℃，打开搅拌机，将原料质量5%的蔗糖加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤。原料奶预热后均质，均质压力为18 Mpa，然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至37℃。
I、配制：以生牛乳为原料，原料奶预处理后加入水，按预处理原料奶与水比例为4:6,进行配比后，按生牛乳和水总量加入9%蔗糖，0.25%柠檬酸加量, 0.15%食用果胶，0.15%羧甲基纤维素，进行配制型乳饮料制备，均质压力18MPa下均质后，杀菌温度95℃，时间5分钟，冷却至25℃。双歧杆菌包埋珠按10%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料；
J、冷藏：冷却至25℃温度后，进入冷藏温度为6℃的冷库，最终得成品。
实施例6：
重复实施例1的步骤，有以下不同点：包埋块包含的双歧杆菌菌种为双歧杆菌菌种为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis），
（1）双歧杆菌包埋块制备
G、双歧杆菌的包埋
1）包埋材料溶液的配制：包埋材料溶液由10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90重量份的水配制而成，食用海藻酸钠和食用明胶按3:1重量比例配制；
制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为80℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.10 Mpa下湿热灭菌20min后备用；
2）固化剂的配制：用蒸馏水将氯化钙配制成0.3mol/L浓度氯化钙溶液，在0.10 Mpa湿热灭菌20min后备用；
3）包埋：灭菌后的包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体混合，其中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占70份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占30份；搅拌均匀后，通过挤压机挤入固化剂0.5mol/L氯化钙溶液，形成12 mm直径的双歧杆菌包埋珠，慢速搅拌30min，过滤，形成3mm宽，3mm厚的双歧杆菌包埋条，慢速搅拌5min，过滤，切成3 mm长双歧杆菌包埋块，用无菌水洗涤双歧杆菌包埋块2 min，10℃低温贮存备用；
（2）制备双歧杆菌包埋块发酵型乳饮料
H、原料奶处理：将生牛乳原料奶预热65℃，打开搅拌，按原料加量入5%蔗糖，加入热奶中，全部溶解后，用200目过滤布进行过滤。原料奶预热后均质，均质压力为18 Mpa，杀菌温度95℃，时间5分钟，冷却至42℃；
I、接种、发酵：乳饮料发酵剂为嗜酸链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种按照1:1配制，按5％（体积百分比）的接种量，将乳饮料发酵剂接种于预处理后原料奶中， 42℃发酵，乳饮料滴定酸度到达70洁尔涅尔度，终止发酵。进行搅拌破乳冷却至25℃，按乳饮料与水的比例为4:6,加入纯净水，按乳饮料和水总量加入8%蔗糖，0.2%柠檬酸, 0.1%食用果胶，0.2%羧甲基纤维素，均质压力20MPa下均质后，双歧杆菌包埋珠按质量百分比20%的量加入乳饮料，然后无菌分装，将加入双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料；
J、冷藏，将终止发酵的双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料，冷却至25℃温度后，进入冷藏温度为8℃的冷库最终成品。
Claims (9)
1.一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料，其特征在于：它含有双歧杆菌包埋珠，双歧杆菌包埋珠包含双歧杆菌属长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp. longum）CGMCC 编号1.2186、长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）CGMCC编号1.2202、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）CGMCC编号 1.2190、短双歧杆菌（Bifidobacterium brevis）CGMCC编号1.2213、双歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）CGMCC编号1.2212或动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）CGMCC编号1.1852中的一种，双歧杆菌包埋珠中的双歧杆菌活菌数不小于1×109 CFU/g；双歧杆菌包埋珠为呈球形固态状，直径为3 mm—12 mm。
2.权利要求1所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）双歧杆菌包埋珠的制备
A、菌种活化试管培养
菌种活化前，在无菌室将零下18℃—4℃温度下保存的双歧杆菌安瓿瓶在室温下放置2 h—3 h，然后将安瓿瓶消毒，打开安瓿瓶，用无菌吸管吸取0.2 mL—0.5 mL的培养基加入安瓿瓶内，将安瓿瓶内菌物，按体积百分比为2％—5％的接种量接种于培养基中，试管培养，在厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20 h—48 h后，终止培养；以相同接种量、培养条件再连续活化2次，获得三代液体培养物；
B、三角瓶一级菌种培养
取试管培养三代液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入三角瓶进行一级菌种液体培养，在厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20h—48h后，终止培养；
C、种子罐二级菌种培养
取三角瓶一级菌种液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入种子罐进行二级菌种液体培养，在非厌氧条件下，于30℃—42℃的温度下培养20h—48h后，终止培养；
D、发酵罐培养
将经种子罐二级菌种培养的液体培养物，按体积百分比为2％—5％的接种量，接入发酵罐，在30℃—42℃的温度下培养，当发酵液pH值低于5.5时，用NaOH溶液调节发酵液pH至6.0—6.5之间，培养20 h—48 h后停止培养；
E、菌体离心收集
设置离心机温度为0℃—8℃，离心转速为3000 r/min—9000 r/min、离心时间为10 min—30 min，离心结束后除去上清液，收集沉淀的双歧杆菌菌体备用；
F、添加保护剂
将离心收集的菌体悬浮于离心前发酵罐培养液原体积1/100—1/10的保护剂中；在零下20℃—10℃的温度下贮存备用;
G、双歧杆菌的包埋
将悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体与灭菌包埋材料溶液混合，搅拌均匀后，挤入固化剂，慢速搅拌5min—30min，过滤，用无菌水洗涤，即得双歧杆菌包埋珠；
（2）乳饮料的制备
H、原料奶预处理：将原料奶预热至65℃—70℃的温度，打开搅拌机，将蔗糖加入热奶中，全部化开时，用200目过滤布进行过滤；原料奶预热后均质，均质压力为18MPa—20MPa；然后杀菌，杀菌温度为95℃，时间5分钟，冷却至37℃—42℃；
I、制备乳饮料：分为制备配制形乳饮料和发酵型乳饮料两种，
1）制备双歧杆菌包埋珠配制型乳饮料：按预处理原料奶与水比例为1-6:6-1,进行配比后，加入蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素调制，然后均质、杀菌、冷却，双歧杆菌包埋珠按10-30%的量加入乳饮料中，然后无菌分装；
2）制备双歧杆菌包埋珠发酵型乳饮料：原料奶预处理后，按体积百分比为2％—5％的接种量，将发酵剂接种于预处理后的奶中，在37℃—43℃的温度下培养，酸度达到70—80洁尔涅尔度，终止发酵，然后加入水，乳饮料占40-50%与水占50-60%,蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素，均质后，双歧杆菌包埋珠按质量百分比15-20%的量加入乳饮料中，然后无菌分装，
J、冷藏：将含有有双歧杆菌包埋珠的乳饮料，冷却至20℃—25℃后，进入冷藏温度为2℃—10的冷库，最终成品。
3.根据权利要求2所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤A中培养基的组成和重量配比为：蛋白胨3—15份，牛肉膏1—10份，胰蛋白胨3—10份，酵母浸出粉 1—10份，葡萄糖3—15份，磷酸氢二钾0.5—5份，乙酸钠0.5—5份，柠檬酸氢二铵 0.5—5份，七水硫酸锌0.1—0.5份，七水硫酸镁0.05—0.2份，L-半胱氨酸盐酸盐0.1—1份，低聚果糖0.5—5份，碳酸钙0.5—2份，吐温-80 1—5份和水1000份; 培养基的pH值为6.0—7.5，于0.05MPa—0.14MPa湿热灭菌15 min—30 min后使用。
4.根据权利要求3所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤F中保护剂的组成和重量配比为：脱脂牛奶或脱脂奶粉5—30份，甘油0.5—5份，抗坏血酸0.1—1份，蔗糖3—10份和水100份；将脱脂牛奶或脱脂奶粉、甘油和蔗糖及水在0.05 MPa—0.14 MPa压力下湿热灭菌15min—30min，抗坏血酸采用过滤除菌。
5.权利要求4所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤G中包埋材料溶液由2—10重量份的食用海藻酸钠和食用明胶与90—98重量份的水配制而成，食用海藻酸钠与食用明胶的重量配比为1—5:1，制备过程为先称取食用明胶，加入蒸馏水中，蒸馏水的温度为75℃ —95℃，搅拌至完全溶解，再加入食用海藻酸钠，继续搅拌至成为透明溶液，在0.05 MPa—0.14MPa压力下湿热灭菌15 min—30min。
6.权利要求5所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤G中包埋材料溶液与悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体的重量配比为，包埋材料溶液占50—90份，悬浮于保护剂中双歧杆菌菌体占10—50份。
7.权利要求6所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤G中固化剂为氯化钙溶液，配制过程为用蒸馏水将氯化钙配制成浓度为0.1mol/L的饱和溶液，于0.05MPa—0.14MPa湿热灭菌15min—30min后使用。
8.权利要求7所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤I中的乳饮料发酵剂是活菌数量为1:1的嗜酸链球菌（Streptococcus thermophilus）CGMCC编号 1.1864与德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）CGMCC编号 1.1863的混合物。
9.权利要求8所述的一种含有双歧杆菌包埋珠的乳饮料的制备方法，其特征在于：所述步骤I中蔗糖、柠檬酸、食用果胶、羧甲基纤维素的加入量为，按生牛乳和水总量加入8-10%蔗糖，0.1-0.2%柠檬酸,0.1- 0.3%食用果胶，0.15-0.2%羧甲基纤维素。
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