CN103642779A - 一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明的甘露聚糖酶具有以下性质：最适pH为5.0，在pH3.5-8.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力，最适反应温度为65℃，并在50℃下非常稳定，另外，其比活力为3133U mg^–1。该甘露聚糖酶具有酸性、高比活、较好的耐热性，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的甘露聚糖酶。

Description

一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域,具体地，本发明涉及一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D及其基因和应用。

背景技术

植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由β-1，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。β-甘露聚糖酶(β-mannanaseEC3.2.1.78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链β-l,4糖苷键，释放出短的β-l,4甘露寡糖。

近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，能源的再生利用研究，人们对β-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。β-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。

β-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35kDa～55kDa之间，最适反应作用温度为50℃～70℃。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用pH达到pH9.0以上，大多最适反应pH在5.5～8.0之间。真菌的β-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45kDa～55kDa，最适作用pH为4.0～6.0，最适作用温度为55℃～75℃。相对细菌而言，真菌来源的β-甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低，耐热性比细菌差。目前国内外，虽然许多β-甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的β-甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。

本发明从Staphylotrichum coccosporum NBRC31817菌株中得到了一个新的β-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点：酸性、较好的热稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的β-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，将会更有应用价值比以前所报道的β-甘露聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种酸性、较好热稳定性、高比活的β-甘露聚糖酶。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供一种制备β-甘露聚糖酶的方法。

本发明的再一目的是提供上述β-甘露聚糖酶的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的β-甘露聚糖酶。该β-甘露聚糖酶Man5D，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1：

其中，该酶全长371个氨基酸，N端21个氨基酸为信号肽序列“MKSSILSPIALGLGLLSTAG A”。

因此，成熟的β-甘露聚糖酶Man5D的理论分子量为37kDa，其氨基酸序列如SEQID NO.2：

该β-甘露聚糖酶Man5D同时具有酸性、高比活等特点。最适pH为5.0，在pH3.5-pH8.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力；最适温度65℃。在50℃下处理60min，剩余酶活在95%以上，即使该酶在60℃下处理10min，依然能够保持30%的酶活力，具有较好的稳定性；具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶处理能力；同时高密度发酵酶活性高，易于工业化生产。

本发明还提供了编码上述β-甘露聚糖酶的基因。该酶的全基因序列如SEQ IDNO.3所示：

本发明通过PCR的方法分离克隆了这β-甘露聚糖酶基因man5D，DNA全序列分析结果表明，β-甘露聚糖酶Man5D结构基因全长1260bp，含有2个内含子，+813～876bp，+966～1045bp，为其内含子序列，cDNA长1116bp，其cDNA序列如SEQ IDNO.4所示：

其中，信号肽的碱基序列为：

“ATGAAGTCCAGCATCCTCTCGCCCATCGCCCTCGGGCTCGGCCTCCTCTCGACCGCCGGCGCC”

因此，成熟基因的编码序列为

SEQ ID NO.5所示：

成熟蛋白理论分子量为37kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将β-甘露聚糖酶基因man5D的cDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定Man5D是一种新的甘露聚糖酶。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组载体，优选为pPIC9-man5D。将本发明的β-甘露聚糖酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-甘露聚糖酶基因***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-man5D。

本发明还提供了包含上述β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/man5D。

本发明还提供了一种制备嗜酸β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组β-甘露聚糖酶的表达；

3)回收并纯化所表达的β-甘露聚糖酶。

其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/man5D。

本发明还提供了上述β-甘露聚糖酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产高温酸性高比活的甘露聚糖酶产品还未见报道。

本发明提供了一个新的甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有酸性、高比活、较好的耐热性和抗蛋白酶能力，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的甘露聚糖酶。

附图说明

图1man5D在毕赤酵母中表达的β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析，l，表达的甘露聚糖酶上清；2，纯化的重组β-甘露聚糖酶。

图2本发明重组β-甘露聚糖酶的最适pH值。

图3本发明β-甘露聚糖酶的pH稳定性。

图4本发明β-甘露聚糖酶最适反应温度。

图5本发明β-甘露聚糖酶热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。燕麦木聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

3、培养基：

(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L魔芋粉，5g/L(NH₄)SO₄，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/LCaCl₂于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min

(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5%酵母提取物、126NaCI，pH7.0)。

(3)BMGY培养基；1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.000049<Biotin，1%甘油(v/v)。

(4)BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1β-甘露聚糖酶编码基因man5D的克隆

提取Staphylotrichum coccosporum基因组DNA

大孢圆孢霉Staphylotrichum coccosporum NBRC31817购自于日本权威菌种保藏管理中心NBRC（NITE biological resource center）。

将产酶培养基培养3天的菌，12,000rpm离心10min，收集的菌丝体加入已高温灭菌的研钵中，用液氮迅速研磨至粉末，然后将研磨好的菌体转移至一个新的，装有15ml CTAB裂解液50mL离心管中，轻柔上下倒置混匀，置于70℃水浴锅保温3h，每隔20min，上下倒置轻柔混匀一次，以便充***解菌体。4℃、12,000rpm离心10min，吸取上清至新的离心管中，加入等体积的氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。取上清再加入等体积的酚/氯仿抽提，室温放置5min。4℃、12,000rpm离心10min。以便尽量除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4℃下l0000rpm离心l0min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置于-20℃备用。

根据已经发表的β-甘露聚糖酶基因保守序列设计合成了兼并引物P1，P2（见表1）。以Staphylotrichum coccosporum基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min;94℃30sec,50～45℃30sec,72℃30sec,12个循环(其中每个循环后复性温度下降1℃);94℃30min,45℃30sec,72℃30sec,30个循环;72℃10min。得到一约180bp片段，将该片段回收后送三博生物技术有限公司测序。根据测序得到的核甘酸序列设计TAIL-PCR引物uspl，usp2，usp3；dspl，dsp2，dsp3（见表1）。通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。

表1本实验所需的引物

实施例2β-甘露聚糖酶cDNA的获得

提取Staphylotrichum coccosporum总RNA，利用Oligo(dT)₂₀和反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R（见表1），扩增该单链cDNA，获得甘露聚糖酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。

通过对甘露聚糖酶的基因组序列和cDNA序列比对后发现该基因有含有2个内含子，cDNA长1116bp，编码371个氨基酸和一个终止密码子，N端21氨基酸为其信号肽序列，经比对证明从Staphylotrichum coccosporum中分离克隆得到的编码甘露聚糖酶的基因为新基因。

实施例3β-甘露聚糖酶工程菌株的构建

（1）表达载体的构建及在酵母的表达

以测序正确的甘露聚糖酶Man5D的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和Not I限制性酶切位点的表达引物F和R（见表1），对Man5D的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体pPIC9(Invitrogen,San Diego)，β-甘露聚糖酶Man5D成熟蛋白的序列***到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体pPIC9-man5D，转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，涂布于组氨酸缺陷性的RDB平板，30℃培养2-3天，挑取在RDB平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

以同样的方式构建含Man5D信号肽序列的cDNA的表达载体，并转化。

（2）高甘露聚糖酶活性转化子的筛选

用灭过菌的牙签从长有转化子的RDB板上挑取单菌落，按照编号先点到MM上，再点到相应编号的MD平板上，每个平板上点100个单菌落，共计200个转化子；将点有转化子的MM、MD平板置于30℃培养箱中培养1～2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种于装有3mL BMGY培养基的离心管中，30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液3,000×g离心15min，去上清，离心管中再加入1mL含有0.5%甲醇的BMMY培养基，在30℃、220rpm诱导培养；诱导培养48h后，3,000×g离心5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出高甘露聚糖酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。

实施例4重组β-甘露聚糖酶的制备

（1）β-甘露聚糖酶基因Man5D在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达

筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1L三角瓶中，30℃，220rpm摇床振荡培养48h；5,000rpm离心5min，轻柔弃上清，再向菌体加入100mL含有0.5%甲醇的BMMY液体培养基，30℃，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇溶液以补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5%左右；(3)12,000×g离心10min，收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。

（2）重组β-甘露聚糖酶的纯化

收集摇瓶表达的重组β-甘露聚糖酶上清液，通过10kDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用10kDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重组Man5D，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取Man5D浓缩液2.0mL经预先用20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡过的HiTrap Q Sepharose XL阴离子柱，然后用0-1mol/L的NaCl进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定，利用SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯度（图1）。

实施例5重组β-甘露聚糖酶部分性质分析

采用DNS法对本发明的甘露聚糖酶进行活性分析。具体方法如下：在pH5.0，65℃条件下，1mL的反应体系包括l00μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应l0rnin，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5mn。冷却后540nm测定OD值。甘露聚糖酶活性单位定义：在一定条件下，每分钟分解甘露聚糖生成lμmol还原糖所需的酶量为1个活性单位(U)。

（1）甘露聚糖酶Man5D的最适pH及pH稳定性

经纯化的实施例3表达的甘露聚糖酶Man5D在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH3.0～8.0的柠檬酸一磷酸氢二钠系列缓冲液及pH8.0～l0.0Tris-HCl系列缓冲液。纯化的甘露聚糖酶Man5D在不同pH的缓冲体系.90℃下测定的pH适性结果（图2）表明：Man5D的最适pH为5.0，在pH3.5-Ph8.0范围内，该酶能够维持其60%以上的酶活力。

将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理60min，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明（图3），分析结果表明pH4.0-pH9.0之间能够维持80%以上的酶活力，说明该酶具有优良的pH稳定性。

（2）甘露聚糖酶Man5D反应最适温度及热稳定性

纯化的甘露聚糖酶在pH5.0条件下，测定不同温度（30-80℃）下的酶活性，分析实验结果表明显示，该酶的最适反应温度为65℃（图4）。耐温性测定为甘露聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在65℃下进行酶活性测定。热稳定性实验表明：该酶在60℃下处理60min，剩余酶活在95%以上，即使该酶在50℃下处理10min，依然能够保持30%的酶活力，这表明该酶具有良好的稳定性（图5）。

（3）重组β-甘露聚糖酶的动力学参数的测定

用不同浓度的角豆胶（0.25–5mg mL^-1）为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)缓冲液体系中，65℃下测定酶活性，计算出其K_m值。经测定，以角豆胶为底物时的K_m值和Vmax分别为2.94mg ml^–1和8780μmol min^–1mg^–1。测定纯化后酶液中的蛋白含量为0.22mg mL^-1，再通过酶酶活性测定方法，测得其酶活为1934U/mL，最后得到β-甘露聚糖酶的比活为3133U mg^-1。

Claims (9)

1.一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种高比活酸性β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的一种高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D。

3.根据权利要求2所述的高比活酸性β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

4.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组表达载体pPIC9-man5D。

6.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组菌株。

7.包含权利要求2所述高比活酸性β-甘露聚糖酶基因的重组菌株GS115/man5D。

8.一种制备高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞；

（2）培养宿主细胞；

（3）分离纯化获得β-甘露聚糖酶Man5D。

9.权利要求1所述高比活酸性β-甘露聚糖酶Man5D的应用。

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