CN102978222A

CN102978222A - 一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用

Info

Publication number: CN102978222A
Application number: CN2012105533234A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 时号; 黄颖娟; 李迅; 邓若冰
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明公开了一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用，该极耐热甘露糖苷酶基因的DNA序列如SEQNO：1所示。极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶的氨基酸序列如SEQNO：2所示。该极耐热甘露糖苷酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在85℃、pH5.5的条件下酶活性最高，比酶活达到144.6U/mg；该蛋白酶在温度为70-95℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在80℃下保温2h，残存酶活大约为70%。上述特性使得本发明得到的甘露糖苷酶比现有甘露糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及一种极耐β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用。

背景技术

聚葡萄甘露糖类是除聚木糖类植物多糖外的另一重要的半纤维素。广泛存在于椰子、魔芋粉、海藻及针叶材等植物体中。甘露聚糖酶和甘露糖苷酶是聚葡萄甘露糖半纤维素酶系中的最为关键的水解酶，前者通过随机切割甘露聚糖的β-1,4-糖苷键，将甘露聚糖水解为甘露寡糖，后者再将甘露寡糖或一定聚合度的甘露聚糖降解为甘露糖甘露糖，是一种重要的糖质营养素，广泛分布于体液和组织中，在调节免疫***、增加伤口愈合、抗发炎效果等生理调节方面有重要作用。

β-甘露糖苷酶作为一种工具酶，它还可以使腐烂植物材料糖化来用作家禽饲料添加剂。另有研究报道，β-甘露糖苷酶在生物燃料和生物塑料工业发挥重要作用。目前国际上报道的β-甘露糖苷酶主要是来源于一些真菌（如黑曲霉）以及一些常温、中温细菌，而来源于极耐热细菌及古菌的β-甘露糖苷酶鲜有报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种极耐热甘露糖苷酶基因，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种上述极耐热甘露糖苷酶基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供上述一种极耐热甘露糖苷酶基因的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种极耐热甘露糖苷酶基因，其DNA序列如SEQ NO：1所示。

上述的极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ NO：2所示。

一种极耐热甘露糖苷酶，氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ NO：2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白质。

一种重组体系，在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO：1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

一种用于扩增极耐热甘露糖苷酶基因的引物，所使用的引物对为：

man1：5’-GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ；

man2：5’-CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。

上述的极耐热甘露糖苷酶在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的应用。酶解反应温度为70-95℃，pH5.0-7.5。所述的甘露聚糖来源于天然植物的甘露聚糖。

上述的重组体系在酶解甘露聚糖或甘露寡糖中的应用。

上述的极耐热甘露糖苷酶在酶解角豆树甘露聚糖中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的甘露糖苷酶具有极强的耐热性能和中性pH条件下高活性的特性，在85℃、pH5.5的条件下酶活性最高，比酶活达到144.6U/mg；该蛋白酶在温度为70℃-95℃、pH为5.0-7.5的范围内，均具有较高的酶活。该甘露糖苷酶的耐热性能极高，在75℃的反应体系中，保温2h酶活性基本保持不变。上述特性使得本发明得到的甘露糖苷酶比现有甘露糖苷酶具有更大的优越性，适用于80℃以上高温、偏酸性pH条件下半纤维素的降解，具有潜在的工业应用价值。该甘露糖苷酶因其具有高效的酶解能力及较强的热稳定性，因此可作为一种高效的工业酶制剂用于甘露糖的生产。

附图说明

图1是甘露糖苷酶Tth manB的SDS-PAGE蛋白电泳图；

图2是Tth manB的最适温度结果图；

图3是Tth manB的最适pH结果图；

图4是Tth manB的热稳定性结果图；

图5是Tth manB降解角豆树甘露聚糖的TLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

以下实施例中所使用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 甘露糖苷酶基因Tth manB的制备

可采用如下人工合成的方式制备Tth manB基因，也可以以Thermotoga thermarum DSM5069 (DSMz，German) 的总DNA为模板通过常规PCR方法得到（引物采用实施例2的引物man1、2）。

本实施例的甘露糖苷酶基因Tth manB通过上海捷瑞生物工程有限公司合成，基因序列如SEQ NO：1所示。

实施例2 甘露糖苷酶基因Tth manB的亚克隆

用下述引物对PCR扩增实施例1中的甘露糖苷酶基因：

man1：5’-GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ；

man2：5’-CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。

上述引物合成时，man1引入Nde I酶切位点，man2引入Xho I酶切位点。

PCR反应体系：1μL T．thermarum 合成DNA，1μL man1，1μL man2，25μL Premix ExTaq，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸3min，30Cycles；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。

实施例3 重组克隆、表达载体pET-20b-Tth manB的构建与验证

将纯化过的PCR产物（实施例2制备）、pET-20b（Novagen）用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬，加入1μL 10×Ligase Buffer和1μL Ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μg/mL Amp（氨苄青霉素）的培养皿，37℃培养10-12h。

从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中***了所克隆的目的片段（核苷酸长度为1824bp），进而得到重组克隆、表达载体pET-20b-Tth manB，外源DNA序列如SEQ NO：1所示，其表达的蛋白（极耐热甘露糖苷酶）的氨基酸序列如SEQ NO：2所示，将该蛋白命名为甘露糖苷酶Tth manB。

实施例 4 重组甘露糖苷酶Tth manB的表达与纯化

将重组克隆、表达载体pET-20b-Tth manB（实施例3制备）电转至宿主菌E. coli BL21(DE3)（Novagen），获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基，在37℃温度下，200rpm震荡培养8-12h。取4mL菌液接种于含400mL培养基的1000mL摇瓶中，37℃温度下，200rpm震荡培养，当吸光度（OD₆₀₀）达到0.6-0.8时，加人200μL的1M IPTG，并在30℃温度下，120rpm诱导表达10-12h。4℃，用高速冷冻离心机13000rpm将培养液离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗涤并在4℃下，以13000rpm离心15min，回收菌体，接着用20mL 1×Binding Buffer 重悬（0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazole，pH7.9），在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下13000rpm 离心15min，得到含甘露糖苷酶Tth manB的粗提液。

粗提液先经70℃加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化（方法见His-Bind Kits，Novagen），得纯酶液。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，图中，1为经粗提液中的Tth manB蛋白，2为200 mM咪唑洗脱纯化过后的Tth manB蛋白，3为400 mM咪唑洗脱纯化过后的Tth manB蛋白，分子量约为70 kDa，与理论值相近。

实施例5 重组甘露糖苷酶Tth manB的酶学性质分析

酶活定义为：1min内催化角豆树甘露聚糖（Megazyme，Ireland）产生1μmol甘露糖所需的酶量。

（1）最适温度

用pH值为6.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4得到的纯酶液（稀释的倍数是30倍），用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μL，由0.5%角豆树甘露聚糖100μL，90μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成；反应体系的pH为6.0。将反应体系在60-95℃温育10min后，加入300μL DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示，研究结果表明在85℃时，该甘露糖苷酶具有最高的酶活性；将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度80-100℃的反应体系中酶活性较高。

（2）最适pH

酶活性测定体系为200μL，由0.5%角豆树甘露聚糖100μL，pH4.5-8.5的90μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成。将反应体系在85℃温育10min后，加入300μL DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值，实验设3次重复实验，取平均值。结果如图3所示，研究结果表明，在pH为5.5时，甘露糖苷酶具有最高的酶活性，为144.6U/mg；将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在pH5.0-7.5的条件下，酶活均较高。

（3）重组酶热稳定性

用pH值为7.0的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4得到的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在75℃、80℃、85℃和90℃水浴30min、60min、90min和120min，测定酶的残存酶活，如图4所示。酶活测定反应体系中pH为5.5，测定温度为85℃。实验设3次重复，取平均值，结果如图4所示。研究结果显示，75℃处理2h未见酶活下降，80℃处理2h，残存酶活为70%，结果显示可见该甘露糖苷酶有较强的热稳定性。

实施例6 重组甘露糖苷酶Tth manB在角豆树甘露聚糖降解中的应用

重组甘露糖苷酶Tth manB对角豆树甘露聚糖降解研究，具体步骤如下所述：

（1）用pH5.5的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液配制2%角豆树甘露聚糖溶液。混匀，吸取100μL混合液，加入上述的缓冲溶液90μL与含10μL的纯化酶于100μL的反应体系中，80℃水浴震荡0.5h、1h和2h。

（2）分别收集上述0.5h、1h和2h水解液于-20℃的冰箱中保存。

（3）配置上述水解液适宜的TLC的展层剂和显色剂，展层剂中正丁醇：乙酸：水=2：1：1，显色剂为将1g的3,5-二羟基甲苯加入到100mL的硫酸/甲醇溶液（2：8）中配制而成。

（4）用毛细吸管蘸取少量的1%的甘露糖溶液及上述样品，分别点至宽度为10cm、长度为20cm的玻璃硅胶板上，点完样后用吹分机吹干并将硅胶板放置于上述展层剂的层析缸中。

（5）5h后取出玻璃板先风干，再放置于100℃的干燥箱中烘干，在通风橱中用喷壶将硅胶板均匀喷洒，接着在再放置于100℃的干燥箱中烘干。

结果如图5所示，M为1%甘露糖标准液，1、2和3分别为0.5h、1h和2h的水解液。研究结果表明，重组甘露糖苷酶Tth manB可以快速有效水解角豆树甘露聚糖的非还原性末端，生成甘露糖。综上所述，该甘露糖苷酶适于聚合度较高的甘露聚糖的降解，能有效降解甘露寡糖。因此，该极耐热甘露糖苷酶在甘露糖的生产中有潜在的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种极耐热β-甘露糖苷酶基因及其表达蛋白与应用

<130> 100

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1824

<212> DNA

<213> Thermotoga thermarum

<400> 1

atggatttcc tgctgggtat taactactgg agccgctctg gcgctatgta tatgtgggaa 60

gacgagtact ttaacgaaga agttattgag aacgagatca tcgaaatgaa aaacctgggc 120

atgaacattt gtcgttcctt cctgtttctg ccgacttttt ttccgaaacc gaacaagatt 180

tctgagaagc atgttgagcg ttatctgaag ttcctgaacc tgtgcgagga gcatggcctg 240

aagaccctgc tgacctttat cgttggtcac atgagcggtg aaaactttga tccgccgttc 300

cgtaaccagc gcgacctgta catggatgaa tttatgctgc agcagcagtg tttttttgtt 360

aagtctattg ttgaaaaagt gcgttcttcc ccggcagttt acggttatat cctgtctaac 420

gaaatgccgc tgtacggtgg tactggcgaa ccggagaaag ttctgaactg ggttaagaaa 480

ctggtggaag tgatcaagag cgttgacccg acccgtccgg tgggcactgg tgatggttgt 540

tggaacgtgt ttggtggcga aaacggtttt aacctgcgtg aaatctctaa aatcgtggac 600

tatctgggtc cgcacgtgta tctgtccgag actgacgaat accgtcactc tatgatcccg 660

gaattcgtga tccgttacct gtcccagtac gacctgccga tcctgtatga agagtttggc 720

gcgtcttctg ctcaggctct ggacgagaac attgcgctgt attaccgcga agtgctgatc 780

aactgcctga ttaacggtgc tatcggtgcg ctgggttggt gtctgaacga tttcaactac 840

ccgaacatga aaccgtatct gcatcacccg tttgaactga aatttggtat cttcaaagtg 900

gacggtgcac gcaaaccggc tgcggaagag attgtgaaat tcaagaactt cgtggattct 960

ctggaaaaca ttcagtatcc gaacgcagaa gcgtgcatcc tggttccgtc ctattacaac 1020

aaacagtacc cgttctcctt tgacgatccg aaggagacct tcaaacatct gctgcaggca 1080

actgttctgt gtgcgaaagc gggtttcgtt gtggacctgg ttgaggaaga aaactataag 1140

cgttggaagt cctacaaact gattatcctg ccgtccgagc gcaagtacct ggcaaccact 1200

tgggaaaacc tgcacaagta tgttcaggct ggtggtaacc tgtatatctc ttattactgg 1260

ggcaaatatg actttcatca gggtatttgg tcccagaacc tggagtccct gatcggctgc 1320

aagctgaacc tgcgctacgg cctgaccagc tctctgccga gcaaagttaa actggaatat 1380

ggtggtctga cttggaaact gaacgtggag aagtgcaacg aatgggagaa atcctatgct 1440

ccgatcgttt ctatcctgga aaccgctgaa tctatcgagc tgggccagtc cgatctgcag 1500

ctggtgaaga acaaggtggg ctccggtaaa gtgttcttta tcaacttccc gctggagcac 1560

attctgtctg ttaacgagaa aatcaacctg tctgacctga gccatctgat ctaccgctgc 1620

atcgcgaagc aggcttctct gaacctgtgt tactgcgaca accagcgtgt tcgcgtgcgt 1680

aagatcaagt ccggtcgtaa aactctgtac ctgatccaga acatcgcatg ggacaaagag 1740

caggtgcaga ccatcttcga caactcctcc acctatcacg tgcagattga gctggacccg 1800

aaagagtata agctgctgaa cttc 1824

<210> 2

<211> 608

<212> PRT

<213> Thermotoga thermarum

<400> 2

Met Asp Phe Leu Leu Gly Ile Asn Tyr Trp Ser Arg Ser Gly Ala Met

1 5 10 15

Tyr Met Trp Glu Asp Glu Tyr Phe Asn Glu Glu Val Ile Glu Asn Glu

20 25 30

Ile Ile Glu Met Lys Asn Leu Gly Met Asn Ile Cys Arg Ser Phe Leu

35 40 45

Phe Leu Pro Thr Phe Phe Pro Lys Pro Asn Lys Ile Ser Glu Lys His

50 55 60

Val Glu Arg Tyr Leu Lys Phe Leu Asn Leu Cys Glu Glu His Gly Leu

65 70 75 80

Lys Thr Leu Leu Thr Phe Ile Val Gly His Met Ser Gly Glu Asn Phe

85 90 95

Asp Pro Pro Phe Arg Asn Gln Arg Asp Leu Tyr Met Asp Glu Phe Met

100 105 110

Leu Gln Gln Gln Cys Phe Phe Val Lys Ser Ile Val Glu Lys Val Arg

115 120 125

Ser Ser Pro Ala Val Tyr Gly Tyr Ile Leu Ser Asn Glu Met Pro Leu

130 135 140

Tyr Gly Gly Thr Gly Glu Pro Glu Lys Val Leu Asn Trp Val Lys Lys

145 150 155 160

Leu Val Glu Val Ile Lys Ser Val Asp Pro Thr Arg Pro Val Gly Thr

165 170 175

Gly Asp Gly Cys Trp Asn Val Phe Gly Gly Glu Asn Gly Phe Asn Leu

180 185 190

Arg Glu Ile Ser Lys Ile Val Asp Tyr Leu Gly Pro His Val Tyr Leu

195 200 205

Ser Glu Thr Asp Glu Tyr Arg His Ser Met Ile Pro Glu Phe Val Ile

210 215 220

Arg Tyr Leu Ser Gln Tyr Asp Leu Pro Ile Leu Tyr Glu Glu Phe Gly

225 230 235 240

Ala Ser Ser Ala Gln Ala Leu Asp Glu Asn Ile Ala Leu Tyr Tyr Arg

245 250 255

Glu Val Leu Ile Asn Cys Leu Ile Asn Gly Ala Ile Gly Ala Leu Gly

260 265 270

Trp Cys Leu Asn Asp Phe Asn Tyr Pro Asn Met Lys Pro Tyr Leu His

275 280 285

His Pro Phe Glu Leu Lys Phe Gly Ile Phe Lys Val Asp Gly Ala Arg

290 295 300

Lys Pro Ala Ala Glu Glu Ile Val Lys Phe Lys Asn Phe Val Asp Ser

305 310 315 320

Leu Glu Asn Ile Gln Tyr Pro Asn Ala Glu Ala Cys Ile Leu Val Pro

325 330 335

Ser Tyr Tyr Asn Lys Gln Tyr Pro Phe Ser Phe Asp Asp Pro Lys Glu

340 345 350

Thr Phe Lys His Leu Leu Gln Ala Thr Val Leu Cys Ala Lys Ala Gly

355 360 365

Phe Val Val Asp Leu Val Glu Glu Glu Asn Tyr Lys Arg Trp Lys Ser

370 375 380

Tyr Lys Leu Ile Ile Leu Pro Ser Glu Arg Lys Tyr Leu Ala Thr Thr

385 390 395 400

Trp Glu Asn Leu His Lys Tyr Val Gln Ala Gly Gly Asn Leu Tyr Ile

405 410 415

Ser Tyr Tyr Trp Gly Lys Tyr Asp Phe His Gln Gly Ile Trp Ser Gln

420 425 430

Asn Leu Glu Ser Leu Ile Gly Cys Lys Leu Asn Leu Arg Tyr Gly Leu

435 440 445

Thr Ser Ser Leu Pro Ser Lys Val Lys Leu Glu Tyr Gly Gly Leu Thr

450 455 460

Trp Lys Leu Asn Val Glu Lys Cys Asn Glu Trp Glu Lys Ser Tyr Ala

465 470 475 480

Pro Ile Val Ser Ile Leu Glu Thr Ala Glu Ser Ile Glu Leu Gly Gln

485 490 495

Ser Asp Leu Gln Leu Val Lys Asn Lys Val Gly Ser Gly Lys Val Phe

500 505 510

Phe Ile Asn Phe Pro Leu Glu His Ile Leu Ser Val Asn Glu Lys Ile

515 520 525

Asn Leu Ser Asp Leu Ser His Leu Ile Tyr Arg Cys Ile Ala Lys Gln

530 535 540

Ala Ser Leu Asn Leu Cys Tyr Cys Asp Asn Gln Arg Val Arg Val Arg

545 550 555 560

Lys Ile Lys Ser Gly Arg Lys Thr Leu Tyr Leu Ile Gln Asn Ile Ala

565 570 575

Trp Asp Lys Glu Gln Val Gln Thr Ile Phe Asp Asn Ser Ser Thr Tyr

580 585 590

His Val Gln Ile Glu Leu Asp Pro Lys Glu Tyr Lys Leu Leu Asn Phe

595 600 605

Claims

1.一种极耐热甘露糖苷酶基因，其DNA序列如SEQ NO：1所示。

2.权利要求1所述的极耐热甘露糖苷酶基因表达的极耐热甘露糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ NO：2所示。

3.一种极耐热甘露糖苷酶，其特征在于：氨基酸序列为权利要求2所述的SEQ NO：2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有甘露糖苷酶活性的衍生蛋白质。

4.一种重组体系，其特征在于：在所述的重组体系上克隆有如SEQ NO：1所示的DNA序列；所述的重组体系包括重组质粒和重组菌。

5.一种用于扩增权利要求1所述的极耐热甘露糖苷酶基因的引物，其特征在于：所使用的引物对为：

man1：5’-GGAATTCCATATGGATTTCCTGCTGGGTATTAACT-3’ ；

man2：5’-CCGCTCGAGGAAGTTCAGCAGCTTATACTCTTTC-3’ 。

6.权利要求2所述的极耐热甘露糖苷酶在酶解甘露聚糖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为70-95℃，pH5.0-7.5。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的甘露聚糖来源于角豆树。

9.权利要求4所述的重组体系在酶解甘露聚糖中的应用。