CN103608037B - 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途 - Google Patents

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Abstract

治疗肝癌的方法包括给有此需要的受试者施用抗DKK1单克隆抗体。抗DKK1单克隆抗体还可以施用用于预防或改善肝癌患者中的癌症转移且用于中和血清和组织DKK1。抗DKK1单克隆抗体的用途基于人肝癌中DKK1的上调的发现。

Description

抗DKK1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途
技术领域
本公开内容总体而言涉及通过使用抗DKK1单克隆抗体治疗肝细胞癌。
背景
肝细胞癌（HCC）是全世界第六大最常见的癌症（Parkin，Bray等人，J. Clin 55:74-1080（2005），并且在东南亚和中国特别普遍。
目前用于HCC治疗的分子靶局限于几个细胞发信号途径，如EGFR、IGF-R1、PI3K/AKT/mTOR途径、Ras/RAF/MAPK、VEGF和VEGFR途径等。本发明暗示其他发信号途径如Wnt发信号途径也可以是肝癌中的潜在治疗靶。
Wnt/β-连环蛋白途径是重要的发信号途径之一和肝癌中的潜在治疗靶（Breuhahn，Longerich等人，Oncogene 25：3787-380（2006）；Greten，Korangy等人，Nature391：357-362（2009）。Dickkopf-1（DKK1）被鉴定为充当非洲爪蟾胚胎中的头诱导物的新型基因的分泌性糖蛋白（Glinka，Wu等人，Nature 391 ：357-362（1998）；Fedi，Bafico等人，J.Biol Chem 274：19465-19472（1999）。它通过与Wnt受体LRP5/6结合且拮抗Wnt受体LRP5/6来充当Wnt抑制剂，并且阻断Wnt配体和卷曲受体（Frizzled receptor）之间的相互作用（Bafico，Liu等人，Nat Cell Biol 3：683-686（2001）；Mao，Wu等人，Nature 411 ：321-328（2001）；Semenov，Tamai等人，Curr Biol：11:951-961（2001）。有趣的是，尽管DKK1是Wnt抑制剂，但它在癌症中的功能作用是有争议的。它是一些癌症如成髓细胞瘤、黑素瘤和绒毛膜癌中的潜在肿瘤抑制基因（Kuphal，Lodermeyer等人，Oncogene 25:5027-5036（2006）；Vibhakar，Foltz等人，Neuro Oncol 9：135-144（2007）。还已报道DKK1水平在***癌从原发性肿瘤到转移的进展过程中下降（Hall，Daignault等人，Prostate 68：3696-1404（2008）。然而，近来已发现它在多种癌症包括乳腺、肺、卵巢、***癌和HCC中是上调的（Forget，Turcotte等人，BrJ Cancer 96：646-653（2007）；Hall，Daignault等人2008；Sheng，Huang等人，Clin Chem 55：1656-664 2009；Shizhuo，Tao等人，Int J Biol Markers24：165-170（2009）；Yu，Yang等人，J. Hepatol 50：948-957（2009）。看起来DKK1的功能作用在不同癌症类型中可能是不同的。
DKK1是具有266氨基酸的小分泌性蛋白质（35 kDa），并且可以分泌到血流内。事实上，已发现血清DKK1在具有多个类型的癌症患者中是增加的，并且是有用的生物标记（Politou，Heath等人，Int J Cance 119：1728-1731（2006）；Qian，Xie等人，Blood 110：1587-1594（2007）；Heider，Kaiser等人，Eur J Haematol 82：31-38（2009）；Sato，Yamabuki等人，Cancer Res.（2010）。还已发现它是预后标记且预测食管、卵巢和肺癌中的临床结果（Yamabuki，Takano等人，Cancer Res 67：2517-2525（2007）；Makino，Yamasaki等人，AnnSurg Oncol 16：2058-2064（2009）；Sheng，Huang等人，Clin Chem 55：1656-1664（2009）；Shizhuo，Tao等人2009）。然而，血清DKK1在HCC患者中的临床和预后意义仍有待确定。关于HCC仅存在少数包括单克隆抗体和更多的分子抑制剂的分子靶向疗法。存在应用针对表达更高水平的DKK1的肝癌的抗DKK1单克隆抗体的需要。
概述
本发明的一个实施方案提供了在肝癌治疗中使用针对DKK1的抗DKK1单克隆抗体的方法。此外，抗DKK1抗体的使用不仅预防肝癌，它还抑制肝癌进展，预防肿瘤转移且减少肿瘤复发。
本发明的另一个实施方案是使用DKK1作为关于肿瘤复发的生物标记。
本发明的另一个实施方案是检测增加的血清DKK1蛋白质水平，以测定在患者中DKK1过表达肝癌的存在。
本发明的另一个实施方案是使用抗DKK1单克隆抗体预防肝癌。
本发明的另一个实施方案是检测来自相同患者的配对HCC和非肿瘤组织中DKK1转录物的表达，并且如果存在过表达，则给该患者施用抗DKK1单克隆抗体。
本发明的另一个实施方案是使用抗DKK1单克隆抗体减少DKK1介导的肿瘤生长。
本发明的另一个实施方案是在测定血清DKK1蛋白质中使用的DKK1 ELISA试剂盒。
附图简述
图1指示DKK1的转录物水平在LDA和qPCR分析中在人HCC样品中都是上调的。（A）通过对于38对HCC样品的基于定量PCR的LDA小规模筛选不同Wnt相关转录物显示DKK家族中的DKK1和DKK2转录物而不是DKK3和DKK4的显著上调。（B）在99个配对HCC样品中完成实时qPCR，以验证得自LDA分析的结果。我们发现与非肿瘤肝相比较，在HCCs中DKK1转录物水平的显著上调（P <0.001）。还包括十例正常肝用于分析。
图2指示DKK1的敲低(knockdown)降低SMMC-7721细胞的迁移和侵袭能力。（A）siRNAs有效敲低SMMC-7721细胞中的DKK1转录物水平，如通过qPCR和ELISA测定进行测定的，该细胞显示相对高水平的内源分泌的DKK1。siDKK1#ll和siDKK1#9的敲低效率分别为90%和67%，并且这些克隆用于后续实验中。（B）在稳定的SMMC-7721 DKK1敲低克隆中执行细胞迁移和侵袭测定。用siRNAs敲低DKK1显著减少细胞迁移且侵袭的能力。
图3指示DKK1增强体内的肿瘤生长。（A）DKK1不影响HCC细胞在体内的细胞增殖率。DKK1在PLC/PRF/5中的异位表达导致在Wntβa的不存在或存在下，对细胞增殖率无显著作用，如通过MTT测定评估的。（B）裸鼠注射测定通过将表达DKK1的PLC/PRF/5细胞皮下注射到小鼠的右胁腹内来完成。（C）形成的肿瘤的大小和质量。在注射后3周测量肿瘤的直径且在处死后称重。通过表达DKK1细胞形成的肿瘤长得比载体对照克隆的那些更大。（D）使用ELISA测定检测小鼠的DKK1血清水平。在具有通过表达DKK1的PLC/PRF/5细胞形成的肿瘤的小鼠中检测到高水平的DKK1，但在具有通过对照PLC/PRF/5细胞形成的肿瘤的小鼠中无法检测到该水平。
图4指示DKK1的血清蛋白质水平的逐步增加。DKK1血清水平的逐步增加在HCC患者中可见。DKK1的血清水平从HBV携带者和具有经由早期HCC到晚期HCC的肝硬化的患者的增加。在治疗后HCC患者中的DKK1血清水平显著更低（P <0.001）。
图5指示HCC患者中更高水平的DKK1与更短的存活率相关。在血清同类者的患者中的总体存活和无疾病存活率。1500 pg/ml用作血清数据的截断点。
图6指示在HCC细胞和人HCCs中Wnt/β-连环蛋白活化和DKK1水平上调之间的关系。（A）具有β-连环蛋白核和细胞质阳性的代表病例。NT-L，非肿瘤肝。（B）DKK1转录物水平和通过免疫组织化学染色的β-连环蛋白蛋白质表达之间的统计相关性。DKK1转录物水平和连同或不连同核易位的β-连环蛋白细胞质过表达之间的显著相关（P <0.001）。
图7（A & B）指示在8个HCC细胞系的培养基中的DKK1 分泌水平。它们在很大程度上对应于其通过qPCR测定的转录物水平。（C）X-Y曲线图显示转录物水平和分泌性蛋白质水平。在HCC细胞系中，转录物水平与培养基中DKK1的分泌性蛋白质水平显著相关。
详述
本公开内容描述了针对血清和组织DKK1的抗DKK1单克隆抗体，从而治疗肝癌且预防肿瘤转移和肿瘤复发。抗DKK1单克隆抗体的使用基于人肝癌患者的血清和组织中DKK1的上调及其对细胞转移、侵袭和肿瘤生长的作用的发现。因此，DKK1可以是用于预防、改善和治疗肝癌、癌症转移和肿瘤复发的治疗靶。抗DKK1单克隆抗体的使用增强具有高水平DKK1的癌症患者的存活率。
进行几个实验以限定DKK1对细胞迁移和侵袭和肿瘤生长的意义，并且限定针对它的抗DKK1单克隆抗体的用途。
执行使用LDA分析（Taqman® Low Density Array、LDA）的高流通量q-PCR分析，同时研究Wnt发信号分子在38对人HCCs及其相应非肿瘤肝上的基因表达模式。根据数据，发现当与其相应非肿瘤肝相比较时，两种DKK基因，DKK1和DKK2，在人HCCs中频繁（分别为65.8%、25/38和60.5%、23/38）过表达（分别为P = 0.005和<0.001）。DKK3和DKK4转录物水平各自在肿瘤及其相应非肿瘤肝之间不存在显著差异（分别为P = 0.421和0.823）。通过qPCR分析在独立同类者中分析DKK1转录物的表达水平（n = 99对）。与相应非肿瘤肝相比较，在人HCCs中的DKK1转录物是显著上调的（P < 0.001）。在人HCCs中DKK1的过表达（使用2倍截断）是频繁的，在分析的这个患者同类者中是60%。
分析ELISA测定，以测定总共241个患者中的血清DKK1水平，所述241个患者由50个无HCC的HBV携带者（作为对照）、50个无HCC的肝硬化患者、50个早期HCC患者、50个晚期HCC患者和41个治疗后的HCC患者组成。在HBV携带者组中的血清DKK1水平（平均值± S.D. =431 ± 280 pg/ml）与肝硬化组的DKK1水平并无显著不同（平均值± S.D. = 327 ± 274pg/ml）（P = 0.086）。相比之下，从经由早期HCC到晚期HCC组的肝硬化组存在血清DKK1水平中的逐步增加。与HBV携带者和肝硬化组相比较（对于两者P < 0.001），血清DKK1水平在具有早期HCC（平均值± S.D. = 881 ± 679 pg/ml）和晚期HCC（平均值± S.D. = 1498 ±1280 pg/ml）的患者中显著更高。血清DKK1水平在晚期HCC组中比早期HCC组中显著更高（P< 0.012）。值得注意的是，与晚期HCC组相比较，在治疗后的HCC患者组中血清DKK1水平显著更低（平均值 ± S.D. = 634 ± 366 pg/ml）（P < 0.001）。
DKK1的血清水平在HCC患者中具有预后意义。发现DKK1的血清水平与患者的存活率相关。更高水平的血清DKK1水平与更短的无疾病存活显著相关（P = 0.046）。此外，具有高血清DKK1的患者显示更差的总体存活的趋势，尽管它未达到统计显著性（P = 0.140）。更高水平的血清DKK1（>1500 pg/ml）与更大的肿瘤大小显著相关（P = 0.027），表示增加的肿瘤负荷，产生更多的DKK1分泌到血流内。观察到具有晚期肿瘤期的患者趋于具有更高水平的DKK1，尽管它未达到统计显著性（P = 0.075）。然而，在血清DKK1和血清甲胎蛋白（APF）水平之间无显著相关（P = 0.634）。
测定了DKK1是否对HCC细胞运动性和侵袭能力具有作用。siRNAs用于敲低SMMC-7721 HCC细胞中的DKK1，所述SMMC-7721 HCC细胞在测试的HCC细胞系中具有相对更高的分泌性DKK1蛋白质水平。siRNAs有效敲低DKK1，具有如通过qPCR证实的高达85%减少。分别使用穿透式（transwell）迁移和基质胶侵袭测定，发现DKK1的敲低显著减少两个独立SMMC-7721敲低克隆的迁移和侵袭能力（对于两者P < 0.001）。
使用MTT测定研究DKK1对细胞增殖的作用。在PLC/PRF/5 HCC细胞系中建立慢病毒感染的DKK1稳定克隆，所述PLC/PRF/5 HCC通过ELISA测定具有DKK1蛋白质的低表达。在Wntβa条件培养基的存在或不存在下，表达DKK1细胞的增殖率与载体对照的增殖率并无显著不同。因为DKK1是分泌性蛋白质，所以假设DKK1可能改变肿瘤微环境以促进肿瘤生长。为了测试这个假设，将表达DKK1的PLC/PRF/5细胞皮下注射到裸鼠内，以观察其对致肿瘤性的作用。结果显示表达DKK1的PLC/PRF/5细胞在裸鼠中具有肿瘤形成且形成更大的肿瘤的更高发生率。仅注射有表达DKK1细胞的小鼠在其血清中显示高水平的血清DKK1。数据指示DKK1促进体内肿瘤生长。
在注意到DKK1水平后，抗DKK1单克隆抗体用于治疗肝中的癌症或减少肿瘤生长。单克隆抗体可以以几种剂型施用。
虽然抗DKK1抗体可以作为原始组合物施用，但还可以将它们呈现为药物制剂。相应地，提供了包含抗DKK1抗体或其药学可接受的盐、酯、前体药物或溶剂化物，连同其一种或多种药学可接受的载体和任选的一种或多种其他治疗成分的药物制剂。载体必须在与制剂的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对于其接受者是无害的。合适的制剂依赖于选择的施用途径。众所周知的技术、载体和赋形剂中的任何可以作为合适的且如本领域理解（例如在Remington's Pharmaceutical Sciences）的使用。药物组合物可以以自身已知的方式进行制造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制备、磨细、乳化、装入胶囊、截留或压缩过程。
制剂包括适合于经口、肠胃外（包括皮下、皮内、肌内、静脉内、关节内和髓内）、腹膜内、经粘膜、经皮、直肠和局部（包括皮肤、颊、舌下和眼内）施用的那些，尽管最合适途径可以依赖例如接受者的条件和病症。制剂可以方便地以单位剂型呈现且可以通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。所有方法包括使肽或其药学可接受的盐、酯、前体药物或溶剂化物（“活性成分”）与载体结合的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。一般地，制剂通过下述进行制备：使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀地且密切地结合，并且随后在需要时，使产物成形为所需制剂。
适合于经口施用的制剂可以呈现为不连续单位例如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；粉末或颗粒剂；含水液体或非含水液体中的溶液或悬浮液；或水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以呈现为丸剂、药糖剂或糊剂。
可以经口使用的药物制剂包括片剂、由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶和塑化剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。片剂可以任选连同一种或多种辅助成分通过压缩或模塑进行制备。压缩片可以通过在合适机器中压缩以自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分进行制备，所述活性成分任选与粘合剂、惰性稀释剂或润滑、表面活性剂或分散剂混合。模制片可以通过在合适机器中模塑由惰性液体稀释剂弄湿的粉状化合物的混合物进行制备。片剂可以任选是有包衣或压痕的或可以配制以便提供其中的活性成分的缓慢或控制释放。用于经口施用的所有制剂应以适合于此类施用的剂量。推入配合胶囊可以含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解或悬浮于合适液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以加入稳定剂。锭剂核与合适包衣一起提供。为了这个目的，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选含有***树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以加入片剂或锭剂包衣中用于鉴定或表征活性肽剂量的不同组合。
抗DKK1抗体组合物可以配制用于通过注射例如通过推注或连续输注肠胃外施用。用于注射的制剂可以以单位剂型连同加入的防腐剂例如在安瓿或多剂量容器中呈现。组合物可以采取此类形式如在油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以含有配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器例如密封安瓿和小瓶中，并且可以以粉末形式或在冷冻干燥（冻干）条件下贮存，仅需要在使用前加入无菌液体载体例如盐水或无菌无热原水。临时注射溶液和悬浮液可以由先前描述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
用于肠胃外施用的制剂包括活性化合物的含水和非含水（油性）无菌注射溶液，其可以含有致使制剂与预期接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的含水和非含水无菌悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。含水注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，悬浮液还可以含有增加化合物的溶解性的合适稳定剂或试剂，以允许制备高度浓缩的液体。
除了先前描述的制剂外，单克隆抗体组合物还可以配制为储存制剂。此类长效制剂可以通过植入（例如皮下或肌内）或通过肌内注射进行施用。因此，例如，肽可以与合适的聚合或疏水材料（例如作为在可接受的油中的乳状液）或离子交换树脂一起配制，或配制为略溶的衍生物例如略溶的可溶性盐。
对于经颊或舌下施用，单克隆抗体组合物可以采取以传统形式配制的片剂、锭剂、软锭剂或凝胶的形式。此类组合物可以包含在调味基础例如蔗糖和***胶或黄蓍胶中的活性成分。
组合物还可以配制为直肠组合物例如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质例如可可脂、聚乙二醇或其他甘油酯。
优选的单位剂量制剂是含有如本文下文描述的有效剂量的单克隆抗体或其合适部分。
关于上文单一剂量形式或与载体材料组合的单克隆抗体的量将取决于肝癌的严重性且特别是施用方式而改变。短语“治疗用途”预期限定在其肝癌治疗中使用的单克隆抗体的量。这个量将用于治疗或减少HCC肿瘤的肿瘤大小。
应当理解除了上文具体提及的成分外，制剂还可以包括就所讨论的制剂类型而言在本领域中常规的其他试剂，例如适合于经口施用的那些可以包括调味剂。
下述实施例显示抗DKK1单克隆抗体的多个限定用途和在DKK1的定量测量中的意义。
实施例
实施例1.
抗DKK1单克隆抗体对体外肿瘤细胞增殖的作用
为了研究抗DKK1单克隆抗体对体外肿瘤细胞增殖的作用，将具有高水平DKK1的HCC细胞（100个细胞/孔）例如SMMC-7721、Hep3B和Huh7种植到96孔板内并且在37℃温育过夜。第二天，将100 μl含或不含1 μg/ml抗DKK1单克隆抗体的培养基更换每个孔中的培养液，并且在37℃温育24、48、72和96小时。在限定温育时间后，完成细胞增殖测定（MTT），以测量细胞增殖率。代替MTT测定，细胞增殖率可以使用细胞计数器通过细胞计数测定来获得。我们的数据显示抗DKK1单克隆抗体可以抑制HCC细胞的增殖。
实施例2.
抗DKK1单克隆抗体对体外肿瘤细胞迁移和侵袭的作用
使用具有8.0-μm孔径的聚碳酸酯膜的穿透式***皿（Corning Inc.，NY）执行细胞迁移测定。使用由基质胶预包被的穿透式***皿（BD Biosciences，San Jose，CA）完成基质胶侵袭测定。简言之，将在无血清培养基中的1 x 105细胞接种到上部室内。含有10%FBS的培养基用作下部室中的化学引诱物。将抗DKK1单克隆抗体（1、5、10 μg/ml）加入穿透室的上部室和下部室内。细胞随后在加湿培养箱中在37℃温育12小时（对于迁移测定）或24小时（对于侵袭测定）。随后用甲醇固定在膜下表面上的迁移或侵袭细胞，用结晶紫染色，在5个随机视野中拍照且计数。每个实验执行三次。数据显示抗DKK1单克隆抗体可以抑制HCC细胞的细胞迁移和侵袭能力。
实施例3.
抗DKK1单克隆抗体对体内肿瘤形成的作用
为了评估抗DKK1单克隆抗体对HCC肿瘤形成或起始的作用，将具有高水平DKK1的HCC细胞（100个细胞/孔）例如SMMC-7721、Hep3B、Huh7和MHCC97L/H胰蛋白酶消化并且重悬浮于磷酸盐缓冲盐水。使用25号针将细胞（2 x 106）皮下注射到6周龄雄性免疫缺陷小鼠的胁腹内（对于每组实验n=6）。随后，通过腹膜内注射用抗DKK1抗体或对照IgG（200 μg/小鼠）注射小鼠。注射程序每周进行两次，每组小鼠总共注射10次。通过测量肿瘤的最大和最小直径每周监控肿瘤大小并且通过下式进行估计：体积= 1/2 x（最大直径）x（最小直径）2。我们的数据显示抗DKK1单克隆抗体可以抑制体内肿瘤形成。
实施例4.
抗DKK1单克隆抗体对体内肿瘤生长的作用
为了评估抗DKK1单克隆抗体对HCC肿瘤生长的抑制作用，将具有高水平DKK1的HCC细胞（100个细胞/孔）例如SMMC-7721、Hep3B、Huh7和MHCC97L/H胰蛋白酶消化并且重悬浮于磷酸盐缓冲盐水。使用25号针将细胞（2 x 106）皮下注射到6周龄雄性免疫缺陷小鼠的胁腹内（对于每组实验n=12）。当异种移植物生长至约5 mm直径的大小时，将小鼠随机分成各六只小鼠的2组。随后，通过腹膜内注射抗DKK1抗体或对照IgG（200 μg/小鼠）注射小鼠。注射程序每周进行两次，每组小鼠总共注射10次。通过测量肿瘤的最大和最小直径每周监控肿瘤大小并且通过下式进行估计：体积= 1/2 x（最大直径）x（最小直径）2。数据显示抗DKK1单克隆抗体可以抑制体内肿瘤生长。
实施例5.
抗DKK1单克隆抗体对体内肿瘤转移的作用
原位移植用作小鼠模型以揭示抗DKK1单克隆抗体对肿瘤转移的作用。首先，在通过腹膜内用戊巴比妥（80 mg/kg）麻醉下进行左肋下切口。使肝的左叶暴露且随后用镊子将一片或两片肿瘤组织（来自皮下注射肿瘤，大小约1 mm3）植入肝组织内。缝合腹壁并且在无特定病原体条件下使小鼠保持在笼中。在手术后给予镇痛三天。小鼠维持4周以允许肿瘤生长。随后，将小鼠随机分成各六只小鼠的2组。随后通过腹膜内注射抗DKK1抗体或对照IgG（200 μg/小鼠）注射小鼠。注射程序每周进行两次，每组小鼠总共注射10次。在10次注射后，通过过剂量的戊巴比妥（通过腹膜内150-200mg/kg）对小鼠实施安乐死。取得组织包括肝和肺用于免疫组织化学，以揭示抗DKK1抗体对肿瘤转移的作用。
此外，尾静脉注射或直接肝注射测定也用作小鼠模型，以揭示抗DKK1单克隆抗体对肿瘤转移的作用。将肿瘤细胞（1 x 106）直接注射到免疫缺陷小鼠（对于每组实验n=12）的尾静脉或肝内。随后通过腹膜内注射抗DKK1抗体或对照IgG（200 μg/小鼠）注射小鼠。注射程序每周进行两次，每组小鼠总共注射10次。在10次注射后，通过过剂量的戊巴比妥（通过腹膜内150-200mg/kg）对小鼠实施安乐死。取得组织包括肝和肺用于免疫组织化学，以揭示抗DKK1抗体对肿瘤转移的作用。
数据显示抗DKK1单克隆抗体可以抑制体内肿瘤转移。
实施例6.
血清DKK1蛋白质在癌症预后中的用途：用于肿瘤复发的生物标记
根据数据，显示DKK1的血清水平在HCC患者中具有预后意义。更高水平的血清DKK1水平与更短的无疾病存活相关并且显示更弱的总体存活趋势。此外，观察到具有晚期肿瘤阶段的患者趋于具有更高水平的DKK1。因此，通过DKK1 ELISA测定检测DKK1水平预测HCC患者中的肿瘤复发。
实施例7.
本发明的抗体
本发明中使用的抗体购自商业来源。任何商购可得的针对DKK1蛋白质的单克隆或多克隆抗体都是有用的。它们包括来自R&D Systems、Santa Cruz biotechnology、Novartis Oncology和Pfizer等的抗体。此外，在本发明中的所述抗体可以得自任何其他来源。例如，抗体可以是针对人DKK1蛋白质的新近产生的自制抗体。抗DKK1抗体可以是或不是人源化抗体。
实施例8.
患者样品
99对HCCs及其相应非肿瘤肝组织的同类者用于实时定量PCR（qPCR）。所有患者在Queen Mary Hospital，The University of Hong Kong接受手术切除，并且随机选择用于本研究。在手术切除后立即获得切除样品，在液氮中速冻且保持在-80℃。评估了在QueenMary Hospital收集的总共241个血清样品，所述血清样品来自50个早期HCC（TNM I & II期）患者、50个晚期HCC（TNM III & IV）患者、41个HCC治疗后的HCC患者（在治疗后的中值时间，6个月）、50个肝硬化患者和50个乙型肝炎病毒（HBV）携带者。在使用前将血清样品保存在-80℃。血清同类者的100个早期和晚期HCC患者的特征概括于表1中。
实施例9.
qPCR和TaqMan低密度阵列（LDA）
通过TRIzol试剂（Invitrogen）从HCC细胞系和人HCC样品中提取总RNA。用GeneAmpRNA PCR Kit（Applied Biosystems，Foster City，CA）使用随机六聚体由1 μg总RNA合成第一链cDNA。使用TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems），cDNA随后用于检测靶基因的表达水平。预先设计的Taqman®低密度定制阵列用于LDA分析。选择用于LDA分析的Wnt相关基因在补充表1中列出。qPCR和LDA都在Applied Biosystems 7900HT FastReal-Time System（Applied Biosystems）中执行。对于qPCR，实验为一式三份完成，并且对于LDA，试验为一式两份完成。在来自相同患者的配对HCC和非肿瘤肝组织中的靶基因表达表示为T/NT比。T/NT比>2定义为肿瘤组织中的过表达。在发现其中T/NT过表达比大于2的DKK1转录物后，给有此需要的患者施用抗DKK1单克隆抗体。
实施例10.
ELISA测定
通过DueSet® ELISA Development试剂盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测量来自细胞培养基的血清DKK1和分泌DKK1。简言之，96孔Maxisorp NUNC-Immuno板（ThermoFisher Scientific，Roskilde，Denmark）在室温用在1 x PBS中的单克隆小鼠抗人DKK1捕获抗体（R&D Systems）包被过夜。用洗涤缓冲液洗涤（具有0.05%Tween 20的1 x PBS）的板用1 x 测定稀释剂（BioLegend，San Diego，CA）在室温封闭1小时。将稀释的患者血清或条件培养基温育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤板。加入山羊抗人检测抗体（R&D Systems）并且温育另外2小时。加入链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶并且温育20分钟，并且在洗涤后加入TMB底物试剂（BioLegend）另外20分钟。通过2 N硫酸停止底物反应，并且使用Infinite F200 Tecan多板阅读器（Tecan Austria GmbH，Salzburg，奥地利）在450 nm波长处测量消光。
实施例11.
细胞系
HCC细胞系PLC/PRF/5、Huh7和Hep3B购自美国典型培养物中心（Manassas，VA），HLE购自Japanese Cancer Resources Bank（日本东京），BEL-7402和SMMC-7721得自上海细胞生物学研究所（Shanghai Institute of Cell Biology），MHCC-97L来自Liver CancerInstitute of Fudan University（中国上海）。所有HCC细胞都维持在补充有10%胎牛血清（FBS）和100单位/ml青霉素和链霉素（Invitrogen，Gaithersburg，MD）的DMEM中。
实施例12.
DKK1敲低和过表达稳定克隆的建立
用于敲低DKK1的小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸购自Thermo Scientific Dharmacon®（Thermo Fisher Scientific，Lafayette，CO）。根据制造商的方案（Invitrogen），通过Lipofectamine 2000™将ON-TARGETplus™ DKK1 siRNA（LQ-003843-01）转染到HCC细胞内。非靶对照（NTC）siRNA用作对照。随后如上所述通过qPCR证实敲低效率。从人胎盘cDNA文库中扩增全长人DKK1基因，并且亚克隆到pGEM-T载体内并且随后亚克隆到慢病毒(lenti)表达载体pWPXL内。根据制造商的方案制备具有DKK1基因的慢病毒颗粒用于感染HCC PLC/PRF/5细胞。随后通过GFP标记用流式细胞术分选感染的细胞。
实施例13.
体外细胞迁移和侵袭测定
使用具有8.0-μm孔径的聚碳酸酯膜的穿透式***皿（Corning Inc.，NY）执行细胞迁移测定。使用由基质胶预包被的穿透式***皿（BD Biosciences，San Jose，CA）完成基质胶侵袭测定。简言之，将在无血清培养基中的1 x 105细胞接种到上部室内。含有10%FBS的培养基用作下部室中的化学引诱物。细胞随后在加湿培养箱中在37℃温育12小时（用于迁移测定）或24小时（用于侵袭测定）。随后用甲醇固定在膜下表面上的迁移或侵袭细胞，用结晶紫染色，在5个随机视野中拍照且计数。每个实验执行三次。
实施例14.
细胞增殖测定（MTT）
通过CellTiter 96® AQueous One溶液细胞增殖测定（Promega，Madison，WI）来测定表达DKK1细胞的细胞增殖。将细胞种植到96孔板中并且在37℃温育过夜。第二天将100 μl培养基替换每个孔中的培养液，并且随后根据制造商的说明书执行测定。简言之，将15 μl染料溶液加入每个孔内，并且在37℃温育30分钟。使用Infinite F200，Tecan多板阅读器（Tecan Austria GmbH）在595 nm处记录吸光度。所有实验一式三份且在2次独立实验中执行。
实施例15.
体内致肿瘤性测定
为了评估致肿瘤性，将DKK1稳定细胞胰蛋白酶消化并且重悬浮于磷酸盐缓冲盐水。使用25号针将细胞（2 x 106）皮下注射到6周龄雄性BALB/c裸鼠的胁腹内（对于每组实验n=5）。通过测量肿瘤的最大和最小直径每周监控肿瘤大小并且通过下式进行估计：体积=1 / 2 x（最大直径）x（最小直径）2。
实施例16.
免疫组织化学
使用标记的链霉抗生物素蛋白-生物素方法，对***固定、石蜡包埋的切片执行关于β-连环蛋白的免疫组织化学染色。对于抗原修复，将切片浸入具有1 mM EDTA的缓冲液中并且煮沸15分钟。抗人β-连环蛋白单克隆抗体（BD Biosciences）以1:100稀释度使用。对于阴性对照，将一抗替换为Tris缓冲盐水。核阳性评估为不存在或存在；细胞质阳性评估为0（无染色）和1（阳性染色）；并且膜阳性评估为0、1和2。
统计分析
通过SPSS for Windows 17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL）分析HCC患者的临床病理学特征，包括肿瘤大小、根据Edmondson分级的细胞分化、无分化的静脉侵袭进入肝门或肝小静脉内、直接肝侵袭、肿瘤微卫星形成、肿瘤包囊化、肿瘤结节数目和血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）状态。通过卡方检验或Fisher's精确检验分析分类数据，而无论何时合适时，独立的t或曼-怀二氏（Mann-Whitney）检验用于连续数据。通过Kaplan-Meier方法评估存活曲线，并且通过时序检验估计两组之间的统计差异。使用Student's test分析来自迁移和侵袭测定的结果。当P值小于0.05时，检验视为显著的。
支持前述，公开了本发明的多个实施方案的更详细说明。
材料与方法
患者样品
99对HCCs及其相应非肿瘤肝组织的同类者用于实时定量PCR（qPCR）。所有在QueenMary Hospital，The University of Hong Kong接受手术切除，并且随机选择用于本研究。在手术切除后立即获得切除样品，在液氮中速冻且保持在-80℃。评估在Queen MaryHospital收集的总共241个血清样品，所述血清样品来自50个早期HCC（TNM I & II期）患者、50个晚期HCC（TNM III & IV）患者、41个HCC治疗后的HCC患者（在治疗后的中值时间，6个月）、50个肝硬化患者和50个乙型肝炎病毒（HBV）携带者。在使用前将血清样品保存在-80℃。血清同类者的100个早期和晚期HCC患者的特征概括于表1中。
qPCR和TaqMan低密度阵列（LDA）
通过TRIzol试剂（Invitrogen）从HCC细胞系和人HCC样品中提取总RNA。用GeneAmpRNA PCR Kit（Applied Biosystems，Foster City，CA）使用随机六聚体由1 μg总RNA合成第一链cDNA。使用TaqMan Gene Expression Assays（Applied Biosystems），cDNA随后用于检测靶基因的表达水平。预先设计的Taqman®低密度定制阵列用于LDA分析。选择用于LDA分析的Wnt相关基因在补充表1中列出。qPCR和LDA都在Applied Biosystems 7900HT FastReal-Time System（Applied Biosystems）中执行。对于qPCR，试验为一式三份完成，并且对于LDA，试验为一式两份完成。在来自相同患者的配对HCC和非肿瘤肝组织中的靶基因表达表示为T/NT比。T/NT比>2定义为肿瘤组织中的过表达。因此，给患者施用抗DKK1单克隆抗体用于治疗人HCC。
ELISA测定
通过DueSet® ELISA Development试剂盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测量来自细胞培养基的血清DKK1和分泌DKK1。简言之，96孔Maxisorp NUNC-Immuno板（ThermoFisher Scientific，Roskilde，Denmark）在室温用在1 x PBS中的单克隆小鼠抗人DKK1捕获抗体（R&D Systems）包被过夜。用洗涤缓冲液洗涤（具有0.05%Tween 20的1 x PBS）的板用1 x 测定稀释剂（BioLegend，San Diego，CA）在室温封闭1小时。将稀释的患者血清或条件培养基温育2小时。随后用洗涤缓冲液洗涤板。加入山羊抗人检测抗体（R&D Systems）并且温育另外2小时。加入链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶并且温育20分钟，并且在洗涤后加入TMB底物试剂（BioLegend）另外20分钟。通过2 N硫酸停止底物反应，并且使用Infinite F200 Tecan多板阅读器（Tecan Austria GmbH，Salzburg，奥地利）在450 nm波长处测量消光。
本发明还包括测定血清DKK1蛋白质的试剂盒。在一个非限制性例子中，试剂盒可以包括如上所述在容器中的一种或多种试剂。在一个容器中，抗DKK1单克隆抗体在试剂盒中的密封容器中。试剂盒可以具有根据需要在试剂盒中排列的多个容器。
细胞系
HCC细胞系PLC/PRF/5、Huh7和Hep3B购自美国典型培养物中心（Manassas，VA），HLE购自Japanese Cancer Resources Bank（日本东京），BEL-7402和SMMC-7721得自上海细胞生物学研究所(Shanghai Institute of Cell Biology)，并且MHCC-97L来自Liver CancerInstitute of Fudan University（中国上海）。所有HCC细胞都维持在补充有10%胎牛血清（FBS）和100单位/ml青霉素和链霉素（Invitrogen，Gaithersburg，MD）的DMEM中。
DKK1敲低和过表达稳定克隆的建立
用于敲低DKK1的小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸购自Thermo Scientific Dharmacon®（Thermo Fisher Scientific，Lafayette，CO）。根据制造商的方案（Invitrogen），通过Lipofectamine 2000™将ON-TARGETplus™ DKK1 siRNA（LQ-003843-01）转染到HCC细胞内。非靶对照（NTC）siRNA用作对照。随后如上所述通过qPCR证实敲低效率。从人胎盘cDNA文库中扩增全长人DKK1基因，并且亚克隆到pGEM-T载体内并且随后亚克隆到慢病毒表达载体pWPXL内。根据制造商的方案制备具有DKK1基因的慢病毒颗粒用于感染HCC PLC/PRF/5细胞。随后通过GFP标记用流式细胞术分选感染的细胞。
体外细胞迁移和侵袭测定
使用具有8.0-μm孔径的聚碳酸酯膜的穿透式***皿（Corning Inc.，NY）执行细胞迁移测定。使用由基质胶预包被的穿透式***皿（BD Biosciences，San Jose，CA）完成基质胶侵袭测定。简言之，将在无血清培养基中的1 x 105细胞接种到上部室内。含有10%FBS的培养基用作下部室中的化学引诱物。细胞随后在加湿培养箱中在37℃温育12小时（用于迁移测定）或24小时（用于侵袭测定）。随后用甲醇固定在膜下表面上的迁移或侵袭细胞，用结晶紫染色，在5个随机视野拍照且计数。每个实验执行三次。
细胞增殖测定（MTT）
通过CellTiter 96® AQueous One溶液细胞增殖测定（Promega，Madison，WI）来测定表达DKK1细胞的细胞增殖。将细胞接种到96孔板中并且在37℃温育过夜。第二天将100 μl培养基替换每个孔中的培养液，并且随后根据制造商的说明书执行测定。简言之，将15 μl染料溶液加入每个孔内，并且在37℃温育30分钟。使用Infinite F200，Tecan多板阅读器（Tecan Austria GmbH）在595 nm处记录吸光度。所有实验一式三份且在2次独立实验中执行。
体内致肿瘤性测定
为了评估致肿瘤性，将DKK1稳定细胞胰蛋白酶消化并且重悬浮于磷酸盐缓冲盐水。使用25号针将细胞（2 x 106）皮下注射到6周龄雄性BALB/c裸鼠的胁腹内（对于每组实验n=5）。通过测量肿瘤的最大和最小直径每周监控肿瘤大小并且通过下式进行估计：体积=1 / 2 x（最大直径）x（最小直径）2。
免疫组织化学
使用标记的链霉抗生物素蛋白-生物素方法，对***固定、石蜡包埋的切片执行关于β（-连环蛋白的免疫组织化学染色。对于抗原修复，将切片浸入具有1 mM EDTA的缓冲液中并且煮沸15分钟。抗人β-连环蛋白单克隆抗体（BD Biosciences）以1:100稀释度使用。对于阴性对照，将一抗替换为Tris缓冲盐水。核阳性评估为不存在或存在；细胞质阳性评估为0（无染色）和1（阳性染色）；并且膜阳性评估为0、1和2。
统计分析
通过SPSS for Windows 17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL）分析HCC患者的临床病理学特点，包括肿瘤大小、根据Edmondson分级的细胞分化、无分化的静脉侵袭进入肝门或肝小静脉内、直接肝侵袭、肿瘤微卫星形成、肿瘤包囊化、肿瘤结节数目和血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）状态。通过卡方检验或Fisher's精确检验分析分类数据，而无论何时合适时，独立的t或曼-怀二氏检验用于连续数据。通过Kaplan-Meier方法评估存活曲线，并且通过时序检验估计两组之间的统计差异。使用Student's test检验分析来自迁移和侵袭测定的结果。当P值小于0.05时，检验视为显著的。
结果
DKK1的转录物在人HCCs中是显著上调的
使用LDA分析（Taqman® Low Density Array，LDA）执行高流通量q-PCR分析，以研究Wnt发信号分子（补充表1）在38对人HCCs及其相应非肿瘤肝上的基因表达模式。根据我们的数据，发现当与其相应非肿瘤肝相比较时，两种DKK基因，DKK1和DKK2，在人HCCs中频繁（分别为65.8%、25/38和60.5%、23/38）过表达（分别为P = 0.005和<0.001，曼-怀二氏检验）（图1A）。DKK3和DKK4转录物水平各自在肿瘤及其相应非肿瘤肝之间不存在显著差异（分别为P = 0.421和0.823）。在本研究中，DKK1是调查的焦点。
为了证实来自LDA分析的结果：DKK1在人HCCs中是过表达的，通过qPCR分析在独立同类者中分析DKK1转录物的表达水平（n = 99对）。根据数据，与相应非肿瘤肝相比较，在人HCCs中的DKK1转录物是显著上调的（P <0.001，曼-怀二氏检验）（图1B）。在人HCCs中DKK1的过表达（使用2倍截断）是频繁的，在分析的这个患者同类者中是60%。DKK1转录物的过表达指示给有此需要的患者施用抗DKK1单克隆抗体的需要。
DKK1的抑制减少HCC细胞的迁移和侵袭能力
既然DKK1在人HCC中是过表达的，因此研究发现它如何影响肿瘤进展。发现DKK1是抑制Wnt/β-连环蛋白途径的抑制剂，因此它被提议为肿瘤抑制基因[5,22]。然而，DKK1在癌症进展和转移过程中的确切作用是有争议的。因此，测定DKK1是否对HCC细胞运动性和侵袭能力具有作用。siRNAs用于敲低SMMC-7721 HCC细胞中的DKK1，所述SMMC-7721 HCC细胞在测试的HCC细胞系中具有相对更高的分泌性DKK1蛋白质水平（图7）。siRNAs有效敲低DKK1，具有如通过qPCR证实的高达85%的减少（图2A）。分别使用穿透式迁移和基质胶侵袭测定，发现DKK1的敲低显著减少两个独立SMMC-7721敲低克隆的迁移和侵袭能力（对于两者P <0.001，Student's t检验）（图2B）。
DKK1在体内增强HCC细胞生长
使用MTT测定研究DKK1对细胞增殖的作用。在PLC/PRF/5 HCC细胞系中建立慢病毒感染的DKK1稳定克隆，所述PLC/PRF/5 HCC通过ELISA测定具有DKK1蛋白质的低表达（图7B）。在Wntβa条件培养基的存在或不存在下，DKK1表达细胞的增殖率与载体对照并无显著不同（图3A）。将表达DKK1的PLC/PRF/5细胞皮下注射到裸鼠内，以观察其对致肿瘤性的作用。结果显示表达DKK1的PLC/PRF/5细胞在裸鼠中具有肿瘤形成且形成更大的肿瘤的更高发生率（图3B&C）。仅注射有表达DKK1的细胞的小鼠在其血清中显示高水平的血清DKK1（图3D）。该数据指示DKK1促进体内肿瘤生长。
HCC细胞系中分泌的DKK1与DKK1转录物水平相关
DKK1是具有266氨基酸的小分泌性蛋白质（35 kDa）。已证明DKK1可以从肿瘤分泌到血流内，并且在肿瘤中具有DKK1过表达的患者在其血液中具有增加的DKK1蛋白质水平。首先，评估了ELISA测定在检测人DKK1蛋白质中的效力。因为不存在关于HCC细胞培养物或患者样品中的分泌DKK1水平的在先数据，所以采用7个HCC细胞系，以测试DKK1蛋白质在培养基中的存在和水平。证实了在温育后DKK1蛋白质在条件培养基中是可检测的（图7B）。此外，在测试的所有HCC细胞系中，qPCR检测的DKK1转录物水平与ELISA检测的相应的分泌性DKK1蛋白质的量良好相关，如图7中所示（r2 = 0.817，P = 0.005）。
DKK1的血清水平在HCC中是上调的并且显示从肝硬化到HCC的逐步增加
随后用ELISA测定总共241个患者中的血清DKK1水平，所述241个患者由50个无HCC的HBV携带者（作为对照）、50个无HCC的肝硬化患者、50个早期HCC患者、50个晚期HCC患者和41个治疗后的HCC患者组成（图4C）。在HBV携带者组中的血清DKK1水平（平均值± S.D. =431 ± 280 pg/ml）与肝硬化组并无显著不同（平均值± S.D. = 327 ± 274 pg/ml）（P =0.086，曼-怀二氏检验）。相比之下，从经由早期HCC到晚期HCC组的肝硬化组存在血清DKK1水平中的逐步增加。与HBV携带者和肝硬化组相比较（对于两者P < 0.001，曼-怀二氏检验），血清DKK1水平在具有早期HCC（平均值± S.D. = 881 ± 679 pg/ml）和晚期HCC（平均值± S.D. = 1498 ± 1280 pg/ml）的患者中显著更高。血清DKK1水平在晚期HCC组中比早期HCC组中显著更高（P < 0.012，曼-怀二氏检验）。值得注意的是，与晚期HCC组相比较，血清DKK1水平在治疗后的HCC患者组中显著更低（平均值 ± S.D. = 634 ± 366 pg/ml）（P< 0.001，曼-怀二氏检验）。
在HCC患者中血清DKK1水平的临床病理学相关性
用于ELISA测定的患者的临床病理学特征概括于表1中。在临床病理学相关联后，高水平的血清DKK1（>1500 pg/ml）与更大的肿瘤大小显著相关（P = 0.027，Fisher' s精确检验）（表2），表示增加的肿瘤负荷，产生更多的DKK1分泌到血流内。观察到具有晚期肿瘤期的患者趋于具有更高水平的DKK1，尽管它未达到统计显著性（P = 0.075，Fisher' s精确检验）。然而，在血清DKK1和血清AFP水平之间无显著相关（P = 0.634，Fisher' s精确检验）。
DKK1的血清水平在HCC患者中具有预后意义
发现DKK1的血清水平与患者的存活率相关。更高水平的血清DKK1水平与更短的无疾病存活显著相关（P = 0.046，时序检验）（图5）。此外，具有高血清DKK1的患者显示更差的总体存活的趋势，尽管它未达到统计显著性（P = 0.140，时序检验）。
在人HCCs中的β-连环蛋白过表达和DKK1水平的上调之间的显著相关。
已暗示DKK1是Wnt/β-连环蛋白发信号的下游靶[23,24]。因此，我们通过免疫组织化学分析在83例人HCC中的Wnt/β-连环蛋白蛋白质的表达，并且将其与相应DKK1转录物水平的过表达相关联。Wnt/β-连环蛋白在48例中的细胞质中是过表达的，含或不含核染色（核易位）。核染色在12（14.5%）例中观察到，并且具有核染色的所有这些病例都显示细胞质染色。在DKK1转录物水平的过表达（到>_2倍）和β-连环蛋白细胞质过表达之间存在显著相关（P<0.001），含或不含核易位（表6）。
讨论
认为DKK1是Wnt/β-连环蛋白发信号途径的负调节物，但它在癌症中的功能作用是有争议的。近来已发现它在不同癌症包括乳腺、肺、卵巢、***癌和HCC中是上调的[11、12、13、14、15]。根据人HCC样品中Wnt发信号分子的高流通量qPCR LDA分析，DKK1是显示过表达的基因之一。这使用qPCR分析在独立HCC同类者中得到验证。在功能上，DKK1在肿瘤细胞迁移和侵袭中起关键作用。DKK1在体内显示增强肿瘤生长，但在体外不促进细胞增殖。在肝癌形成的多步过程中DKK1转录物水平中的逐步增加得到证明，所述多步过程为从慢性肝炎和经由早期HCCs到晚期HCCs的肝硬化。
与HCCs中上调的DKK1转录物水平的发现一致，存在HCC患者具有血清DKK1的上调的广泛证据。不仅是HCC患者中上调的血清DKK1水平，还首次证明在总共241个血清样品中的血清DKK1蛋白质水平中的相似逐步增加，所述血清样品来自HBV携带者、肝硬化患者和具有早期和晚期HCC的患者。在HCC治疗后还存在血清DKK1的显著减少。这些发现提示DKK1在HCC的进展中起作用。事实上，已报道血清DKK1蛋白质在一些癌症包括胃肠道、乳腺和***和多发性骨髓瘤中是增加的[17,19,25]。此外，在本研究中，DKK1血清蛋白质水平在肝切除或HCC治疗后被显著减少。与我们的发现一致，Heider等人显示血清DKK1蛋白质在抗骨髓瘤治疗后的具有多发性骨髓瘤的患者中降低 [16]。这些数据和目前数据指示升高的血清DKK1蛋白质主要通过肿瘤团块分泌。清楚的是血清DKK1在肝癌形成过程中在患者中是上调的，指示DKK1是用于检测肿瘤发展和HCC复发的新的潜在血清标记。
HCC患者在手术切除后的长期存活是不满意的，主要是由于肿瘤复发的高发生率。因此，用于预测复发的一些可靠生物标记的建立在HCC的临床管理中是特别重要的。就血清肿瘤生物标记而言，AFP是最常用的。然而，它在检测HCC或其在治疗后的复发中具有特异性与灵敏度方面的局限性。存在开发更佳或补充性血清肿瘤标记的需要。目前，在更广泛的规模上研究少数标记的应用，包括Des-γ-羧基凝血酶原（DCP）、磷脂酰肌醇聚糖-3、a-岩藻糖苷酶（AFU）和转化生长因子-β1（TGF-β1）和黑素瘤相关抗原基因（MAGE）[26,27]。基于我们在HCC中增加的血清DKK1蛋白质水平且尤其是它从经由早期HCC到晚期HCC的肝硬化的逐步增加和在HCC治疗后降低的发现，进一步研究DKK1作为早期HCC和肿瘤复发的诊断中的肿瘤生物标记的价值将是有价值的。
在本研究中，发现增加的DKK1血清蛋白质是不利的预后标记并且与HCC患者的更短的无疾病存活显著相关。在HCC患者中，无疾病存活主要归因于肝内转移和肿瘤复发，这两者都与静脉侵袭有关[28]。我们的体外数据已显示机械上（mechanistically），DKK1增强HCC细胞的细胞迁移和侵袭。相似观察已在HEK-293细胞系中报道[29]。根据这些数据，明确的是DKK1可以用于促进肝内转移和肿瘤复发。为此，开发针对血清和组织DKK1的抗DKK1单克隆抗体可以是用于预防肿瘤转移和减少肿瘤复发的潜在新型的治疗方法。在非常近期的报道中，Sato等人证实抗DKK1单克隆抗体能够抑制肺癌细胞系A549的细胞侵袭和生长[19]。它支持抗DKK1单克隆抗体预防HCC转移和复发的应用。
根据临床病理学分析，发现高水平的血清DKK1蛋白质与更大的肿瘤大小显著相关（表2）。因此，假设DKK1在促进细胞生长中起作用。然而，通过细胞计数测定或MTT测定，DKK1在PLC/PRF/5中的异位表达不改变体外细胞增殖率，所述PLC/PRF/5是具有最低水平的DKK1表达的HCC细胞系。类似地，另一个HCC细胞系BEL-7402和正常肝细胞系MIHA在DKK1异位表达后未显示细胞增殖率中的显著改变（数据未显示）。有趣的是，DKK1在裸鼠注射测定中增强肿瘤形成效率且促进肿瘤生长。在我们的体外和体内数据之间的差异结果暗示DKK1可能调节肿瘤微环境，以增强肿瘤生长。事实上，已发现DKK1是通过抑制Wnt/β-连环蛋白途径的内皮细胞活化中的介质 [30]。使用体内微血管重建动物模型，Glaw等人显示DKK1显著增加成年大鼠中的血管密度和血管直径[31]。这些报道指示DKK1可以在微血管重建和血管生成活化中起作用，并且可以解释通过DKK1的体内肿瘤生长的促进。
发现在人HCCs中的DKK1转录物水平和β-连环蛋白细胞质过表达（含或不含核易位）之间的显著相关。已提示DKK1是Wnt/β-连环蛋白发信号的下游靶，并且在Wnt/β-连环蛋白发信号中的负反馈圈下调节[23,24]。因此，DKK1过表达可能是Wnt/β-连环蛋白发信号过度活化的结果。然而，观察到具有高表达的DKK1转录物但不具有β-连环蛋白染色或具有β-连环蛋白的轻微染色的HCC病例亚组。其指示除了Wnt/β-连环蛋白发信号外，其他一个或多个发信号途径也可以促进或调节DKK1表达。期待关于HCC中的DKK1机制控制和调节的进一步研究。
血清和组织DKK1水平在多步肝癌形成过程中以逐步方式增加。DKK1在体外增强HCC细胞的迁移和侵袭能力，并且在体内促进肿瘤生长。血清DKK1水平在HCC中具有预后意义。血清DKK1是对于HCC具有预后价值的潜在肿瘤标记。
随后为参考文献列表，其指的是正文中的参考文献编号和引用。它们通过引用合并进入本文。
应当理解本领域技术人员可以根据本发明的多个实施方案的公开内容修改且验证本发明。此类等价物包含在与随附的权利要求的范围内。
参考文献：
表1. HCC患者的临床病理学特征的概括。
表2. HCC患者中的DKK1血清水平的临床病理学相关性

Claims (3)

1.抗-DKK1单克隆抗体在制备用于诊断肝细胞癌复发的药剂中的用途。
2.权利要求1的用途，其中该单克隆抗体是人源化的单克隆抗体。
3.抗-DKK1单克隆抗体在制备用于诊断肝细胞癌复发的方法的药剂中的用途，其中该方法包括以下步骤：从具有肝细胞癌的患者中获得血清样品；检测血清样品中的血清DKK1蛋白质水平，以确定是否DKK1血清水平已经增加。
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