CN109959796B - 一种人血清dkk1酶联适配体吸附检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物产品技术领域，涉及一种人血清DKK1含量酶联适配体吸附检测试剂盒及制备方法。所述试剂盒由下列组分制成：琥珀酰亚胺基修饰的96孔板；磷酸盐缓冲液；封闭缓冲液；TMB显色液；检测稀释液；洗涤缓冲液；5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体；生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体；标准品：DKK1蛋白；辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；终止液和封板膜。本发明的试剂盒经实验验证，表明该试剂盒可检测人血清DKK1含量，用作肝癌早期诊断及预警，方法简便，特异性强，灵敏度高，与传统的酶联免疫吸附检测试剂盒相比，检测时间更短，准确率更高，成本更低，有较好的应用前景。

Description

一种人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及酶联适配体吸附检测试剂盒，具体涉及一种人血清DKK1含量酶联适配体吸附检测试剂盒及制备方法。
背景技术
现有技术公开了DKK1蛋白是dickkopf蛋白家族成员，该分泌蛋白包含两个富含半胱氨酸的结构域，可以特异性地与Wnt的受体之一LRP5/6结合，从而干扰LRP5/6与Wnt-Frizzled复合物的结合，抑制下游信号的传导。DKK1的另一个高亲和性受体是Kremen(Krm)，有研究发现在Krm2存在的情况下，DKK1可以与LRP6和Krm2形成三元复合物，并且该三元复合物可以迅速的发生内吞；研究显示，由于这种内吞现象的存在，膜表面的LRP6可以被清除，从而进一步抑制Wnt/β-catenin信号。所述DKK1还被证实通过还原β-catenin，增加OCT4表达抑制Wnt/β-catenin信号通路，该作用在心脏、头和前肢发育中起到关键作用。
研究显示，DKK1在成人体内极少表达，仅在胚胎组织和胎盘中高表达；有研究已证实DKK1在肝细胞肝癌组织中过表达，而在正常肝组织中无法检测；在肝癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤、***等多种细胞培养液中均检测到分泌性DKK1含量提高，有关研究在对831例临床血清样本(424例肝癌，98例乙肝，96例肝硬化，212例正常人对照)的DKK1水平评估后发现，DKK1作为肝癌标志物的检测灵敏度达到69.％，特异性达到90.6％；对于AFP阴性的肝癌患者检测灵敏度为70.4％，特异性为90.0％；因此，检测血清中DKK1可作为肝癌早期诊断及预警的重要手段和指标，尤其是对于AFP阴性的肝癌，具有重要价值。
现有技术还公开了适配体是一类长度小于100个碱基的单链寡核苷酸，经过自身折叠可以形成高级结构，与靶标实现特异性的识别，又被成为“化学抗体”。研究显示，适配体与靶标的亲和力和特异性均不逊于抗体，并且适配体具有识别靶标更多样、研发周期更短、性能更稳定、更易于修饰、成本更低等优势，已被广泛用于科研、诊断、治疗等诸多领域。基于适配体的酶联适配体吸附检测试剂盒与传统的酶联免疫吸附检测试剂盒相比，检测时间更短，准确率更高，成本更低等优点，本申请的发明人拟提供一种酶联适配体吸附检测试剂盒，具体涉及一种人血清DKK1含量酶联适配体吸附检测试剂盒及制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶联适配体吸附检测试剂盒，具体涉及一种人血清DKK1含量酶联适配体吸附检测试剂盒及制备方法。
本发明的检测试剂盒是人血清DKK1酶联适配体吸附定性检测试剂盒，可用于标准化、程式化地定性检测人血清中DKK1，能避免差异化对检测的准确性、可靠性的影响，适用于肝癌早期诊断及预警、尤其为AFP阴性的肝癌早期诊断及预警提供高度灵敏和特异的诊断试剂盒。本发明的基于适配体的酶联适配体吸附检测试剂盒与传统的酶联免疫吸附检测试剂盒相比，检测时间更短，准确率更高，成本更低。
本发明的目的通过下述技术方案施现：
一种人血清DKK1定性检测用酶联适配体吸附试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由如下成分组成：
1)用于包被适配体的琥珀酰亚胺基修饰的96孔板；
2)磷酸盐缓冲盐溶液：137mmol/l(8.0g/l)氯化钠，2.7mmol/l(0.2g/l)氯化钾，8.1mmol/l(1.15g/l)磷酸氢二钠，1.5mM(0.2g/l)磷酸二氢钾，pH 7.4；
3)封闭缓冲液：100ml磷酸盐缓冲液中加入1g牛血清白蛋白；
4)TMB显色液：0.1mol/l(19.2g/l)柠檬酸溶液24.3ml，加0.2mol/l(28.4g/l)磷酸氢二钠溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，将40g邻苯二胺溶解其中，再加30％双氧水0.10ml，用时新鲜配制，避光；
5)检测稀释液：100ml磷酸盐缓冲液加入1g牛血清白蛋白，100μg酵母转运核糖核酸；
6)洗涤缓冲液：100ml磷酸盐缓冲液加入0.5ml吐温-20；
7)5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体；
8)生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体；
9)标准品：DKK1蛋白；
10)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
11)终止液：1mol/l硫酸；
12)封板膜。
本发明的人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒，通过下述的方法制备，其包括：
1)采用包被适配体的琥珀酰亚胺基修饰的96孔板(购自康宁公司)；
2)配制磷酸盐缓冲盐溶液：由1l去离子水中加入8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，2.8g十二水合磷酸氢二钠，0.2g二水合磷酸二氢钾制成，pH值为7.4；
3)制备封闭缓冲液：由100ml磷酸盐缓冲液中加入1g牛血清白蛋白制成；
4)制备TMB显色液：由0.1mol/l柠檬酸溶液24.3ml，加0.2mol/l磷酸氢二钠溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，然后将40g邻苯二胺溶解其中，再加30％双氧水0.10ml制成；
5)配制检测稀释液：由100ml的磷酸盐缓冲液加入1g的牛血清白蛋白和100μg酵母转运核糖核酸制成；
6)配制洗涤缓冲液：由100ml的磷酸盐缓冲液加入0.5ml的吐温-20制成；
7)所述5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体的序列为：NH2-5’-catatgattaggctgtaacggggctaggcggggatcatt-3’；
8)生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体购自R&D Systems公司；
9)DKK1蛋白购自北京义翘神州科技有限公司；
10)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素购自R&D Systems公司；
11)终止液采用1mol/l硫酸；
12)用封板膜封板。
所述的一种人血清DKK1定性检测用试剂盒，其特征在于该试剂盒在使用时还需用到以下材料：
1)酶标仪(带450nm)；
2)加样器，10μl、100μl、1000μl的一次性枪头；
3)吸水纸或吸水巾。
本发明中，所述柠檬酸、二水合磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、邻苯二胺、硫酸均为化学纯；所述的牛血清白蛋白、酵母转运核糖核酸、吐温-20均为分析纯。
本发明所述的上述药剂均可直接从商店购得。
本发明所述的吐温-20的化学成分是聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。
本发明进行了试验检测，其中，用所述的试剂盒绘制了检测标准曲线(如图1所示)，以确定检测限；检测结果显示，试剂盒检测限可低至62.5pg/ml，可以达到实际样本的检测要求；继而，采用所述的试剂盒对30例正常人血清和30例肝癌患者血清的DKK1含量进行了检测，结果显示，肝癌中的DKK1阳性率明显高于正常组，检测的p值为0.0003，有统计学意义(如图2所示)。
本发明的有益效果有：制备的人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒，准确性、可靠性高，适用于检测与DKK1蛋白相关疾病，包括肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、骨髓瘤、子宫内膜癌、***或类风湿关节炎；本发明尤其为肝癌早期诊断及预警、以及AFP阴性的肝癌早期诊断及预警提供了高度灵敏和特异的诊断试剂盒；本发明的基于适配体的酶联适配体吸附检测试剂盒与传统的酶联免疫吸附检测试剂盒相比，检测时间更短，准确率更高，成本更低。
附图说明
图1是用本发明的试剂盒绘制的检测标准曲线。
图2是本发明试剂盒检测正常人血清(n＝30)和肝癌患者血清(n＝30)DKK1蛋白量，p＝0.0003。
具体实施方式
实施例1制备人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒
1，所述的检测试剂盒由下列组分组成：
1)用于包被适配体的琥珀酰亚胺基修饰的96孔板；
2)磷酸盐缓冲盐溶液：137mmol/l(8.0g/l)氯化钠，2.7mmol/l(0.2g/l)氯化钾，8.1mmol/l(1.15g/l)磷酸氢二钠，1.5mM(0.2g/l)磷酸二氢钾，pH 7.4；
3)封闭缓冲液：100ml磷酸盐缓冲液中加入1g牛血清白蛋白；
4)TMB显色液：0.1mol/l(19.2g/l)柠檬酸溶液24.3ml，加0.2mol/l(28.4g/l)磷酸氢二钠溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，将40g邻苯二胺溶解其中，再加30％双氧水0.10ml，用时新鲜配制，避光；
5)检测稀释液：100ml磷酸盐缓冲液加入1g牛血清白蛋白，100μg酵母转运核糖核酸；
6)洗涤缓冲液：100ml磷酸盐缓冲液加入0.5ml吐温-20；
7)5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体；
8)生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体；
9)标准品：DKK1蛋白；
10)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
11)终止液：1mol/l硫酸；
12)封板膜。
按下述制备方法：
1)采用包被适配体的琥珀酰亚胺基修饰的96孔板(购自康宁公司)；
2)配制磷酸盐缓冲盐溶液：由1l去离子水中加入8.0g氯化钠，0.2g氯化钾，2.8g十二水合磷酸氢二钠，0.2g二水合磷酸二氢钾制成，pH值为7.4；
3)制备封闭缓冲液：由100ml磷酸盐缓冲液中加入1g牛血清白蛋白制成；
4)制备TMB显色液：由0.1mol/l柠檬酸溶液24.3ml，加0.2mol/l磷酸氢二钠溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，然后将40g邻苯二胺溶解其中，再加30％双氧水0.10ml制成；
5)配制检测稀释液：由100ml的磷酸盐缓冲液加入1g的牛血清白蛋白和100μg酵母转运核糖核酸制成；
6)配制洗涤缓冲液：由100ml的磷酸盐缓冲液加入0.5ml的吐温-20制成；
7)所述5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体的序列为：NH2-5’-catatgattaggctgtaacggggctaggcggggatcatt-3’；
8)生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体购自R&D Systems公司；
9)DKK1蛋白购自北京义翘神州科技有限公司；
10)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素购自R&D Systems公司；
11)终止液采用1mol/l硫酸；
12)用封板膜封板。
所述柠檬酸、二水合磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、邻苯二胺、硫酸均为化学纯；所述的牛血清白蛋白、酵母转运核糖核酸、吐温-20均为分析纯；
所述的上述药剂均可直接从商店购得。
2、准备以下材料：
1)酶标仪(带450nm)；
2)加样器，10μl、100μl、1000μl的一次性枪头；
3)吸水纸或吸水巾。
3、人血清样品准备和贮存：空腹采血，自然存放1-2小时后离心。其中装有分离胶的管采的血样直接3000rmp离心15分钟；普通玻璃或塑料管采的血则放置37度30分钟后3000转/分离心10分钟，处理后的待检血样密闭贮存于2-8℃冰箱；
4、按如下检测程序进行检测：
1)包被：检测当天，用检测稀释液稀释5’氨基化的DKK1适配体至50nmol/l，加入琥珀酰亚胺基修饰的96孔板中，每孔100μl，用封板膜封板后室温静置30分钟；
2)吸出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液震荡洗涤共3次，每次拍干后离心甩干；
3)封闭：每孔加入300ul封闭缓冲液，用封板膜封板后室温静置1小时；
4)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔，100μl/孔。DKK1蛋白作为标准品，以磷酸盐缓冲液梯度稀释(1：100；1：1000；1：2000；1：4000；1：8000)用封板膜封板后室温静置1小时。
5)倾倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液震荡洗涤3次，每次拍干后离心甩干；
6)每孔加入50ng/ml生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体(用检测稀释液稀释)100μl，用封板膜封板后室温静置1小时；
7)倾倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液震荡洗涤3次，每次拍干后离心甩干；
8)每孔加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(用检测稀释液1：200稀释)100μl，用封板膜封板后室温静置30分钟；
9)倾倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液震荡洗涤3次，每次拍干后离心甩干；
10)显色：每孔加入TMB显色液(现配现用)100μl，用封板膜封板后37℃恒温水浴20分钟，滴加终止液100μl/孔终止反应。
11)将酶标板置于酶标仪中，以空白对照孔调零，波长450nm读取结果。
本实施例中进行了初步验证，用所述的试剂盒绘制了检测标准曲线(如图1所示)，以确定检测限；结果显示，所述试剂盒检测限可低至62.5pg/ml，可以达到实际样本的检测要求；继而，用试剂盒对30例正常人血清和30例肝癌患者血清的DKK1含量进行了检测，结果显示，肝癌中的DKK1阳性率明显高于正常组，检测的p值为0.0003，有统计学意义(如图2所示)。
Figure IDA0001570909060000011

Claims (3)

1.一种人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
1）用于包被适配体的琥珀酰亚胺基修饰的96孔板；
2）磷酸盐缓冲盐溶液；
3）封闭缓冲液；
4）TMB显色液；
5）检测稀释液；
6）洗涤缓冲液；
7）5’氨基化的识别DKK1蛋白的核酸适配体，其序列为
5’- catatgattaggctgtaacggggctaggcggggatcatt -3’ ；
8）生物素标记的山羊抗人DKK1多克隆抗体；
9）标准品；
10）辣根过氧化物酶标记链霉亲和素；
11）终止液；和，
12）封板膜。
2.根据权利要求1所述的人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒使用时还需材料：
1）酶标仪，带450nm；
2）加样器，10μl、100μl、1000μl的一次性枪头；
3）吸水纸或吸水巾。
3.根据权利要求1所述的人血清DKK1酶联适配体吸附检测试剂盒，其特征在于，与DKK1蛋白相关疾病包括肺癌、肝癌、食管癌、胰腺癌、骨髓瘤、子宫内膜癌、***或类风湿关节炎。
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