CN103487580A - Dkk1作为诊断标志物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了DKK1作为诊断标志物的用途，发明人通过分析大量的肝细胞癌样本，从中分析了DKK1和AFP的表达情况，首次发现血清DKK1对于诊断肝细胞癌，尤其是诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌、鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病和/或诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌具有较高的灵敏度和特异性；更特别地，DKK1联合AFP诊断可大大提高临床诊断的准确性。

Description

DKK1作为诊断标志物的用途
技术领域
本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及DKK1作为诊断标志物的用途，其可用于：诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌、鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病和/或诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌。
背景技术
肝脏原发性肿瘤包括肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝内胆管癌、混合性肝细胞癌、胆管囊腺瘤、肝母细胞瘤、血管瘤、类癌、淋巴癌、上皮样血管内皮瘤、鳞状细胞癌、畸胎瘤、以及平滑肌肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤等其它肝脏肉瘤。肝细胞癌(HCC)是其中一种组织学亚型。肝细胞癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居世界第六位，死亡率位居第三位。在西方国家其发病率逐年上升，中国更是肝细胞癌高发国。据统计，全球2008年肝癌新增患病人数约74.8万，死亡69.6万，其中一半均发生在中国。目前，肝细胞癌的病因尚未完全明确，其发生是一个涉及多因素、多阶段和多基因累积变异的过程，主要的因素有病毒感染、黄曲霉毒素的摄入、酒精中毒、水污染、肝螺旋杆菌以及肝硬化等。乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是肝细胞癌的主要致病因素，尤其是在亚洲和非洲；丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界性分布，是欧美等西方国家肝细胞癌发病率升高的主要因素。肝硬化是肝细胞癌发生最危险的因素，也是肝硬化病人主要的死因。由于大多数肝细胞癌患者就诊时已属中晚期，失去了最佳治疗时机，目前仅有30-40%的肝细胞癌患者能实施有效手术治疗手段，五年生存率仅有3-5%。所以及时有效的诊断肝细胞癌是提高患者生存率的关键之一。
目前，筛查和诊断肝细胞癌最常用的方法是影像学和血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)检测。影像包括超声、CT、MRI等，但影像检测花费昂贵，难以广泛应用，且易受操作者经验影响，而且难以区分肝癌和非恶性增生。AFP是当前全世界应用最广泛的肝细胞癌标志物。当其界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55-60%，产生约40%的假阴性率；且其诊断小肝癌的能力更低，灵敏性降为25-52%，大部分早期肝细胞癌患者AFP均无明显升高。这部分AFP阴性肝细胞癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。另外部分非肝癌的慢性肝病患者血清AFP浓度也升高，包括15-58%的慢性乙型肝炎病人，10-43%的慢性丙型肝炎病人和11-47%的肝硬化患者，产生一定的假阳性率。因此发现新的可靠的能弥补AFP不足的肝细胞癌诊断标志物，可极大提高和改善临床综合治疗效果，有助于肝细胞癌患者生存期的延长和生存质量的提高。理想的肿瘤标志物需要有较高的特异性，能够将肝细胞癌与肝炎、肝硬化、肝脏再生结节等区别开来，同时还需有较高的灵敏度，能够诊断早期肝细胞癌，且具有易检测、可重复、非侵入性的特点。
人类基因组计划的完成，高通量基因表达检测方法的发展和大规模数据分析能力的提高，使人们可以更深入地研究肝细胞癌发生发展过程中基因表达的改变，更好地理解肝细胞癌的发病机制，筛选有望应用于临床的生物标志物和药物靶点。本实验室前期通过cDNA表达谱芯片(Affymetrix GeneChip Human Genome U133Plus 2.0Array)技术分析了肝细胞癌患者癌组织及对应癌旁肝组织基因表达谱的差异。结果发现分泌型蛋白DKK1(Dickkopf-1)基因在肝细胞癌组织中高表达；进一步发现DKK1在正常成年人的多种组织中不表达，仅在胎盘组织中表达，具有肿瘤特异性。因此DKK1有潜力成为肿瘤血清蛋白标志物。
DKK1是Wnt信号通路的抑制因子，最早克隆于1998年，发现其在非洲爪蟾早期发育中能够抑制Wnt诱导的轴的复制而参与头部的形成。Wnt通路是一条对胚胎发育起重要调节作用的信号通路，参与细胞增殖、分化、凋亡、细胞极性和运动等过程，其通路中信号分子的突变或异常表达与多种疾病及癌症相关。该信号通路与肝细胞癌的发生发展也密切相关。Wnt通路受几种分泌蛋白的调控，包括DKK、WIF(Wnt-inhibitor factor)和SFRP(secreted frizzled related protein)等。DKK家族包含进化上相对保守的4个成员(DKK1-4)。DKK1编码一个分泌型糖蛋白，含有两个富含半胱氨酸的保守区域(Cys1、Cys2)，能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-densitylipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)结合，并在膜蛋白Kremen1/2参与下通过引起LRP5/6内吞抑制Wnt-Frizzled-LRP5/6复合体的形成，而抑制经典的Wnt信号通路。
随后本发明人采用ELISA方法，首次在10种不同类型人肿瘤细胞培养上清中检测出高浓度的DKK1蛋白，提示多种人肿瘤细胞分泌和高表达DKK1，DKK1可用于人类恶性肿瘤的临床血清诊断。于是2005年本发明人申报了国家发明专利(CN200510110298.2)和国际PCT专利(PCT/CN2006/000382)。DKK1用于癌症血清诊断的中国专利和国际专利均为本发明人首次在国内和国际上提出申请。
但是，目前血清DKK1对于肝细胞癌的临床意义，尤其对其甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断能力、鉴别诊断肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的能力、对早期肝细胞癌或小肝细胞癌的诊断能力并不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供DKK1作为诊断标志物的用途。
在本发明的第一方面，提供DKK1蛋白或其编码基因在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断肝细胞癌。
在一个优选例中，所述的诊断肝细胞癌包括：
诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌；
鉴别(区分)肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病；和/或
诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌。
在另一优选例中，所述的诊断试剂选自：
特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗DKK1蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
在另一优选例中，所述的甲胎蛋白阴性肝细胞癌为甲胎蛋白不表达或血清甲胎蛋白含量小于20ng/ml的肝细胞癌；或
所述的慢性肝病选自：肝硬化，慢性乙型肝炎；或
所述的小肝细胞癌是肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌；或
所述的早期肝细胞癌是BCLC 0+A级的肝细胞癌。
在本发明的另一方面，提供一种用于诊断肝细胞癌(包括甲胎蛋白阴性肝细胞癌、鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病和/或诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌)的试剂盒，所述的试剂盒中含有：
(1)检测甲胎蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的甲胎蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂；和
(2)检测DKK1蛋白或其编码基因(较佳地，为血清中的DKK1蛋白或其编码基因)的表达情况或表达量的诊断试剂。
在一个优选例中，所述的试剂盒中，先使用(1)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；再使用(2)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中的DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若检测AFP为阳性，DKK1为阳性，则该待测样本的提供者为肝细胞癌；若检测AFP为阴性，检测为DKK1阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。且DKK1能够检测出早期肝细胞癌或小肝细胞癌。
在一个优选例中，所述的试剂盒中，先使用(1)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；再使用(2)的诊断试剂检测待测样品(较佳地，为血清)中的DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若检测AFP为阳性，而DKK1检测为阴性，则该待测样品的提供者非肝细胞癌患者(如为慢性肝病)。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：
特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别甲胎蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗甲胎蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
在另一优选例中，所述的试剂盒中，所述的检测DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：
特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗DKK1蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：
核酸抽提试剂；和/或
聚合酶链反应试剂；和/或
蛋白免疫印迹试剂；和/或
酶链免疫反应试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：说明诊断试剂如何使用的使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的方法，所述方法包括：
(a)检测待测样品中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和
(b)检测待测样品中的DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，当甲胎蛋白检测为阴性时，若检测为DKK1阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。
在本发明的另一方面，提供一种鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的方法，所述方法包括：
(a)检测待测样品(较佳地，为血清)中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；
(b)检测DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若甲胎蛋白检测为阳性时，DKK1表达为阴性则该待测样品的提供者为慢性肝病高危。
在本发明的另一方面，提供一种测定早期肝细胞癌或小肝细胞癌的方法，所述方法包括：
(a)检测待测样品中DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和
(b)检测待测样品中的甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；
DKK1可在早期肝细胞癌或小肝细胞癌中表达为阳性，但AFP为阳性或阴性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、DKK1和AFP在肝组织及相应血清中表达情况的比较分析。
通过半定量逆转录聚合酶链式反应(semi-quantitative reverse-transcription PCR，semi-qPCR)检测4例正常肝组织(healthy controls，HC)、8例肝硬化组织(liver cirrhosis，LC)和16例肝细胞癌组织(hepatocellular carcinoma，HCC)中DKK1(图A)和AFP(图D)的mRNA表达情况，以及通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测DKK1(图B)和AFP(图E)的mRNA表达情况。酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测这28例肝组织相应血清中DKK1(图C)和AFP(图F)的蛋白水平。
图2、评估血清DKK1蛋白对AFP阴性肝细胞癌的诊断能力的研究设计。
正常人(HC)；慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)；肝硬化(liver cirrhosis，LC)；肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)；酶联免疫吸附试验；受试者工作特征(receive operating characteristics，ROC)；DKK 1：dickkopf-1；AFP：alpha-fetoprotein。
图3、测试集和验证集各组中血清DKK1蛋白和血清AFP蛋白的浓度。
图A和C为正常对照组(HC)、慢性乙型肝炎组(CHB)、肝硬化组(liver cirrhosis，LC)、肝细胞癌组(HCC)和早期肝细胞癌组(Early-HCC)中血清DKK1蛋白的浓度。图B和D为血清AFP蛋白在这5组中的浓度，当血清AFP浓度高于1210ng/ml时，其浓度以1210ng/ml计算。*，P<0.001。
图4、血清DKK1对肝细胞癌(HCC)的诊断价值。
图A和F为以肝细胞癌(HCC)为病人组，以正常健康人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作的DKK1、AFP及两者联合的ROC曲线。图B和G为DKK1和AFP分别在肝细胞癌(HCC)患者中的阳性率，及DKK1在AFP阴性(AFP-，血清AFP≤20ng/ml)或AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)肝细胞癌(HCC)患者中的阳性率。图C和H为血清DKK1在AFP阴性肝细胞癌(AFP-HCC)和AFP阳性肝细胞癌(AFP+HCC)中的浓度。图D和I为以AFP阴性肝细胞癌(AFP-阴性HCC)为病人组，以正常人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)病人为对照组，制作DKK1的ROC曲线。图E和J为以AFP阳性肝细胞癌(AFP-阳性HCC)为病人组，以正常人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)病人为对照组，制作DKK1的ROC曲线。
图5、血清DKK1鉴别诊断肝细胞癌患者和慢性肝病患者的能力。
图A和E为以肝细胞癌(HCC)为病人组，以慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作的ROC曲线。图B和F为DKK1和AFP分别在慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者中的阳性率，及DKK1在AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)慢性乙型肝炎(CHB)和AFP阳性(AFP+)肝硬化(LC)患者中的阳性率。图C和G为以AFP阴性(AFP-阴性，血清AFP≤20ng/ml)肝细胞癌为病人组，以慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作DKK1的ROC曲线。图D和H为以AFP阳性(AFP-阳性，血清AFP≤20ng/ml)肝细胞癌为病人组，以慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作DKK1的ROC曲线。
图6、血清DKK1对早期肝细胞癌的诊断能力。
图A和D为以早期肝细胞癌为病人组，以正常健康人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作的ROC曲线。图B和E为DKK1和AFP分别在早期肝细胞癌(Early-HCC)患者中的阳性率，及DKK1在AFP阴性(AFP-，血清AFP≤20ng/ml)或AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)早期肝细胞癌患者中的阳性率。图C和F为以早期肝细胞癌(Early-HCC)为病人组，以风险人群慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作的ROC曲线。
图7、血清DKK1对于早期肝细胞癌亚组的诊断能力。
图A和F为血清DKK1分别在AFP阴性(AFP-，血清AFP≤20ng/ml)早期肝细胞癌和AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)早期肝细胞癌中的浓度。图B和G为以AFP阴性早期肝细胞癌患者(AFP-阴性early-HCC)为病人组，以正常人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线。图C和H为以AFP阴性早期肝细胞癌患者为病人组，以风险人群慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线。图D和I为以AFP阳性早期肝细胞癌患者(AFP-阳性early-HCC)为病人组，以正常人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线。图E和J为以AFP阳性早期肝细胞癌患者为病人组，以风险人群慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)为对照组制作ROC曲线。
图8、血清DKK1对单个肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌患者的诊断能力。
图A和D为血清DKK1在单个肿瘤大小≤2cm，>2且≤5cm，＞5且≤10cm和>10cm肝细胞癌患者中的浓度。图B和E为以单个肿瘤小于2cm的小肝癌患者为病人组，以正常人、慢性乙肝患者和肝硬化患者为对照组绘制的ROC曲线。图C和F为以单个肿瘤小于2cm的小肝癌患者为病人组，以慢性乙肝患者和肝硬化患者为对照组绘制的ROC曲线。
图9、血清DKK1单独对具有肝硬化背景或无肝硬化背景的肝细胞癌患者和肝硬化患者的鉴别诊断能力。
图A和F为血清DKK1在肝硬化患者(LC)、具有肝硬化背景的肝细胞癌患者(HCC with cirrhosis)、无肝硬化背景的肝细胞癌患者(HCC without cirrhosis)、具有肝硬化背景的早期肝细胞癌患者(Early-HCC with cirrhosis)和无肝硬化背景的早期肝细胞癌患者(Early-HCC without cirrhosis)中的浓度。图B和G为以肝硬化背景肝细胞癌患者为病人组，以肝硬化患者为对照组制作的ROC曲线。图C和H为以肝硬化背景早期肝细胞癌患者为病人组，以肝硬化患者为对照组制作的ROC曲线。图D和I为以无肝硬化背景肝细胞癌患者为病人组，以肝硬化患者为对照组制作的ROC曲线。图E和J为无以肝硬化背景早期肝细胞癌患者为病人组，以肝硬化患者为对照组制作的ROC曲线。
图10、血清DKK1对肝硬化和具有肝硬化背景的肝细胞癌亚组的鉴别诊断价值。
图A和E为以AFP阴性(AFP-阴性，血清AFP≤20ng/ml)且具有肝硬化背景肝细胞癌患者(HCC)为病人组，以肝硬化患者(LC)为对照组制作ROC曲线。图B和F为以AFP阴性且具有肝硬化背景早期肝细胞癌患者(early-HCC)为病人组，以肝硬化患者(LC)为对照组制作ROC曲线。图C和G为以AFP阳性(AFP-阳性，血清AFP>20ng/ml)且具有肝硬化背景肝细胞癌患者(HCC)为病人组，以肝硬化患者(LC)为对照组制作ROC曲线。图D和H为以AFP阳性且具有肝硬化背景早期肝细胞癌患者(early-HCC)为病人组，以肝硬化患者(LC)为对照组制作ROC曲线。
图11、血清DKK1对具有肝炎背景肝细胞癌患者和慢性肝炎患者的鉴别诊断能力。
图A和C为以具有肝炎背景肝细胞癌患者(HCC)为病人组，以慢性肝炎患者(CHB)为对照组制作ROC曲线。图B和D为以具有肝炎背景早期肝细胞癌患者(early-HCC)为病人组，以慢性肝炎患者(CHB)为对照组制作ROC曲线。
图12、血清DKK1对慢性肝炎和具有肝炎背景的肝细胞癌亚组的鉴别诊断价值。
图A和E为以AFP阴性(AFP-阴性，血清AFP≤20ng/ml)且具有肝炎背景的肝细胞癌(HCC)患者为病人组，以慢性肝炎(CHB)患者为对照组，制作ROC曲线。图B和F为以AFP阴性且具有肝炎背景的早期肝细胞癌(early-HCC)患者为病人组，以慢性肝炎(CHB)患者为对照组，制作ROC曲线。图C和G为以AFP阳性(AFP-阳性，血清AFP>20ng/ml)且具有肝炎背景的肝细胞癌(HCC)患者为病人组，以慢性肝炎(CHB)患者为对照组，制作ROC曲线。图D和H为以AFP阳性且具有肝炎背景的早期肝细胞癌(early-HCC)患者为病人组，以慢性肝炎(CHB)患者为对照组，制作ROC曲线。
具体实施方式
本发明人通过分析大量的肝细胞癌样本，从中分析了DKK1和AFP的表达情况，首次发现血清DKK1对于诊断肝细胞癌，尤其是诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌、鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病和/或诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌具有较高的灵敏度和特异性；更特别地，DKK1联合AFP诊断可大大提高临床诊断的准确性。
本发明人首先在组织水平平行分析了DKK1和AFP的表达情况，随后设计了大样本多中心队列研究，通过检测测试集队列(包括213例正常人、98例慢性乙型肝炎患者、96例肝硬化患者和424例肝细胞癌患者)血清中的DKK1蛋白浓度，发现血清DKK1诊断肝细胞癌具有较好的灵敏度和特异性，尤其在诊断AFP阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌、单个肿瘤小于2cm的肝细胞癌以及鉴别诊断肝细胞癌和慢性肝病中具有诊断价值；血清DKK1对肝细胞癌的诊断价值在验证集(包括99例正常人、73例慢性乙型肝炎患者、72例肝硬化患者和209例肝细胞癌患者)中得到了验证。
如本文所用，“AFP阴性肝细胞癌”是指一种适应症，其是一种肝细胞癌，但其AFP基本上不表达。AFP是当前应用最广泛的肝细胞癌标志物，根据现有技术，当AFP界值为20ng/mL时，AFP诊断肝细胞癌的灵敏度仅为55-60%，产生约40%的假阴性率。这部分AFP阴性肝细胞癌病人在临床上难以诊断，难以评估其治疗效果和疾病进程。
如本文所用，“AFP阳性慢性肝病”是指一种非癌症的适应症，其血清AFP>20ng/ml。AFP是公知的肝细胞癌标志物，由于目前临床诊断以AFP作为肝癌标志物较为普遍，临床上AFP阳性慢性肝病易于被诊断为肝癌。
如本文所用，“小肝细胞癌”是指肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌。
如本文所用，“早期肝细胞癌”是按照巴塞罗那临床肝癌标准(Barcelona ClinicLiver Cancer，BCLC)0+A级的肝细胞癌。
目前临床上，肝癌主要分为以下几类：(1)肝细胞癌，起源于肝细胞的恶性肿瘤；(2)胆管癌，起源于肝内外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，约占原发性肝癌的20%，近年来发病率逐年升高；(3)混合性原发性肝癌，同一肝癌肿块内，肝细胞癌与胆管细胞癌并行；(4)肝血管瘤，较为常见的肝脏良性肿瘤，占肝良性肿瘤的5-20%；(5)肝腺瘤：在肝脏良性肿瘤中，其发病率仅次于肝血管瘤，发病机理可能与性内分泌紊乱有关，主要发于女性；(6)肝脏局灶性结节性增生，肝脏良性病变，发病原因暂不清；(7)肝类癌，恶性肿瘤原发性肝类癌较少见，继发性肝类癌主要有消化道等脏器的类癌转移所致，较常见；(8)肝母细胞瘤：一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤，是儿童中最常见的肝肿瘤；(9)转移性肝癌：原发灶在身体其它部位，转移至肝生长的恶性肿瘤。此外，还有慢性肝病(例如肝炎、肝硬化)也表现为肝部不适，易于被诊断为肝癌。根据以上肝癌以及肝病的特点可知，在临床上肝癌存在复杂性，如何进行区分认定、提高临床诊断准确性是人们亟待解决的问题，临床上非常需要能够准确诊断肝细胞癌(特别是常规难以准确诊断的AFP阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌)的标志物。而AFP尽管已经被作为一种经典的肝癌标志物，但其却不能够完全解决临床上准确细分、诊断的难题，误诊率居高不下。而DKK1这一标志物，尽管本发明人在先已经将之与癌症相关联，然而其是否可以对肝癌的类型进行细分是以往的研究中未知的。
在本发明中，术语“DKK1蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAQ89364提供的蛋白序列基本上相同，也包括DKK1蛋白的同源蛋白。“DKK1蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM 012242.2提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体，也包括DKK1基因的同源基因。术语“AFP蛋白”的氨基酸序列与GenBank登录号AAH27881.1提供的蛋白序列基本上相同。“AFP蛋白的编码基因”的核苷酸序列与GenBank登录号NM 001134.1提供的核苷酸序列基本上相同或其简并的变异体。
基于本发明人的新发现，可以以DKK1蛋白或其编码基因作为测定肝细胞癌，特别是检测甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌、以及鉴别鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的标志物(标记物)。通过分析待测样品(样本)中DKK1蛋白或其编码基因的表达情况，从而得知受试者的患病状况，为疾病的诊断或预后提供依据。所述的待测样品或待测样本是患者的体液，较佳地是血清。
可采用各种技术来检测DKK1的表达情况，这些技术均包含在本发明中。检测核酸可用的已有技术如(但不限于)：基因芯片技术、探针杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、Northern Blot等方法。检测蛋白可借助于质谱分析仪器等，或可通过WesternBlot或ELISA等方法。
作为本发明的一种选择方式，通过定量或半定量的聚合酶链反应(PCR)法来分析样品中DKK1基因的表达情况以及表达量，从而可做出判断。较佳地，通过实时定量Realtime-PCR实现检测。
基于本发明的新发现，本发明还提供了特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂。任何可识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂均包含在本发明中，用作检测肝细胞癌，尤其是甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌的标志物(标记物)、以及鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的标志物。所述的特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKK1蛋白的抗体。
本发明还提供了一种特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂的用途，用于检测肝细胞癌，尤其是甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌或相关高危人群，以及鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病。
作为本发明的一种实施方式，所述的试剂是抗DKK1的抗体；更特别的例如是单克隆抗体或多克隆抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的抗原可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生，所述的动物如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。
本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
所述的抗体可用于免疫化学技术中，检测标本中的DKK1水平，从而用于诊断肝细胞癌，尤其是甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌或判断患病风险(易感性)，以及鉴别诊断肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病。
作为本发明的另一种实施方式，所述的试剂是特异性扩增DKK1基因的引物，在得知了DKK1的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出引物。作为本发明的更优选方式，所述的引物是引物对，具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述的引物对能够扩增获得合适长度的扩增产物，检测的特异性良好。
也可利用基因芯片技术来进行DKK1的检测。在得知了DKK1的核苷酸序列后，人们易于基于此设计出探针。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照现有公知技术。
利用所述的抗体、探针或引物，可以检测体液中DKK1的水平，因而可用于检测肝细胞癌，尤其是甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌，可用于预测早期肝细胞癌或小肝细胞癌的发生，或者用于制备检测制剂或试剂盒等。
本发明还提供了用于检测肝细胞癌，尤其是甲胎蛋白阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌或小肝细胞癌以及鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的试剂盒，该试剂盒包括：特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂。更佳地，所述的试剂盒还包括：特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂；从而可通过先检测待测样品中AFP的表达情况来确定AFP表达情况(如阳性则肝细胞癌高危)；进一步地检测DKK1的表达情况(如阳性则肝细胞癌高危)；这种检测手段将使得肝细胞癌的检测更为准确，且可在更早的时间被准确诊断，可极大地减少误诊漏诊以及为肝细胞癌治疗赢得时间。所述的试剂例如是：所述的特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗DKK1蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。所述的特异性识别AFP蛋白或其编码基因的试剂例如是：特异性扩增AFP蛋白的编码基因的引物；或特异性识别AFP蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗AFP蛋白的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
所述的试剂盒中还可含有：核酸抽提试剂(如核酸抽提液)；和/或聚合酶链反应试剂(如dNTP，Taq酶)；和/或蛋白免疫印迹试剂；和/或酶链免疫反应试剂(如显色液或杂交液)。
作为一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：用于免疫化学分析的试剂，所述的试剂例如：第二抗体、染色剂、显色剂等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书等。更具体地，所述的试剂盒可以是一种基于酶联免疫反应(ELISA)技术的试剂盒。ELISA技术以及基于该技术的检测试剂对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
作为另一种优选方式，所述的试剂盒中还可含有：(A)各种PCR反应用试剂，例如但不限于：Taq酶，PCR缓冲液，dNTP，DNA聚合酶等；或(B)各种提取DNA或RNA(即制备PCR反应模板)所需的试剂，例如但不限于：酚、氯仿、异戊醇、NaCl等；或(C)提取DNA或RNA的试剂盒。
所述的特异性识别DKK1蛋白或其编码基因的试剂、或特异性识别AFP1蛋白或其编码基因的试剂也可固定于试纸上，制备成免疫胶体金试纸或类似检测材料。
此外，所述的试剂盒中还可含有本发明的试剂盒的使用说明书和/或标准操作程序。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1、肝组织标本及相应血清收集
肝组织标本共28例，其中正常人肝组织4例，来自复旦大学肝癌研究所肝外科肝移植捐赠者；肝硬化患者肝组织8例，来自苏州大学第一附属医院感染科肝硬化活检患者；肝细胞癌患者肝癌组织16例(其中8例患者血清AFP≤20ng/ml，8例AFP>20ng/ml)，来自复旦大学肝癌研究所肝外科肝癌手术切除患者。并同时其收集相应血清28例。
2、RNA抽提
用Trizol试剂抽提细胞总RNA，加入Trizol后充分吹打至不粘稠，按每毫升Trizol加200μl氯仿，剧烈振荡15秒后室温静置5min；4℃，10,000rpm高速离心15min；小心将无色上层水相移入一新的RNase-Free的离心管中，按每毫升Trizol体积加500μl异丙醇，室温静置10min，4℃，10,000rpm离心10min；弃上清，75%酒精(按每毫升Trizol至少用1ml 75%酒精)洗涤，4℃，8,000rpm离心10min，弃上清；室温干燥RNA沉淀5-10min(勿使RNA完全干燥)，用RNase-Free的H2O于55-60℃溶解10min，立即至于冰上。分光光度计法定量并检测纯度，取少量总RNA进行甲醛变性电泳，检查RNA完整性。
3、逆转录
逆转录反应体系：按20μl反应体积、细胞总RNA 1μg量(表1)进行。
表1、逆转录反应体系
Figure BDA00001744984200131
反应条件：37℃45min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)，4℃保存。可加入ddH2O稀释40倍备用。
4、半定量PCR
以稀释后的cDNA模板进行半定量PCR扩增，PCR反应体系如下(表2)。
表2、普通PCR反应体系
Figure BDA00001744984200132
反应条件：94℃5min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，32cycles(DKK1和AFP)，28循环(ACTB)；72℃5min；4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。以ACTB(β-actin)作为内参。
引物序列为：
DKK1(GenBank NM_012242.2):
正向：5’-GACCCAGGCTTGCAAAGTGAC-3’(SEQ ID NO：1)，
反向：5’-CGCTACCATCGCGACAAAGA-3’(SEQ ID NO：2)；
AFP(GenBank NM_001134.1):
正向：5’-TGGGACCCGAACTTTCCAAG-3’(SEQ ID NO：3)，
反向：5’-CCTGCAGACAATCCAGCACAT-3’(SEQ ID NO：4)；
ACTB(GenBank NM_001101.3)：
正向：5’-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3’(SEQ ID NO：5)，
反向：5’-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3’(SEQ ID NO：6)。
5、实时荧光定量PCR
实时荧光定量反应体系如表3。
表3、实时荧光定量PCR反应体系
Figure BDA00001744984200141
PCR反应按ABI 7300仪器推荐条件，用两步法PCR扩增程序进行：Stage 1：95℃ 30sec；Stage 2：95℃ 5 sec，60℃ 31 sec，40循环；Dissociation Stage。数据分析由ABI 7300***软件自动完成，以PCR循环数对ΔRn作扩增曲线来确定Ct值(达到阈值所需循环数)。目的基因相对表达量以ACTB作为内参校正后按以下公式计算：2-ΔΔCt(ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(β-actin))。引物序列同前。
6、ELISA
(1)ELISA检测血清中DKK1浓度
DKK1ELISA检测方法按照R&D公司(货号DY1906)说明书操作，步骤简要如下：100μl鼠抗人单克隆包被抗体(4μg/ml)包被ELISA板，室温过夜；次日，用含1%BSA的PBS溶液于37℃封闭1.5h；加入梯度稀释的标准品(最高浓度4ng/ml，共7个稀释度)和用含10%小牛血清的PBS稀释的血清(100μl/孔)，37℃孵育1.5h；然后加入生物素标记的兔抗人DKK1检测抗体(50ng/ml)，37℃孵育1.5h；再加入链亲和素(streptavidin)偶联的IgG-HRP，37℃孵育20min；最后加入底物过氧化氢(H2O2)和3,3,5,5-四甲基联苯胺(Tetramethyl benzidine，TMB)，室温20min；1M硫酸终止反应，并于酶标仪测定450nm吸收波长和570nm参考波长。每步之间用含5‰Tween-20的PBS溶液洗三遍并拍干。以四参数回归法拟合标准曲线并计算DKK1浓度。
(2)ELISA检测血清AFP浓度
AFP ELISA检测血清方法按照上海科华生物工程有限公司AFP试剂盒说明书操作，简要步骤如下：加入标准品和血清样本(50μl/孔)于预包被板中，37℃孵育20min；加入过氧化物酶偶联的检测抗体(50μl/孔)，37℃孵育20min；加入底物过氧化氢(H2O2)和3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)，室温10min；1M硫酸终止反应，并于酶标仪测定450nm吸收波长和570nm参考波长。每步之间用含5‰Tween-20的PBS溶液洗三遍并拍干。拟合标准曲线并计算血清AFP浓度。
7、血清标本收集
(1)血清标本
测试集血清标本共831例，其中213例正常人(healthy controls，HC)血清、98例慢性肝炎患者(chronic hepatitis B，CHB)血清和96肝硬化患者(liver cirrhosis，LC)血清来自苏州大学第一附属医院感染科，424例肝细胞癌患者血清来自复旦大学附属中山医院肝外科；验证集血清标本共453例，包括99例正常人血清、73例慢性肝炎患者血清和72肝硬化患者、209例肝细胞癌患者血清，均来自第二军医大学附属东方肝胆外科医院。血清在临床诊断时即收取，收取时间自2008年10月至2011年6月。血清收集于促凝管内，2,000-3,000rpm离心18-20min，吸取上清于离心管中，-80℃分装保存。两组队列肝细胞癌患者、肝炎患者、肝硬化患者临床病理特征如表4-6所示。
表4、测试集和验证集中肝细胞癌患者临床特征
Figure BDA00001744984200151
Figure BDA00001744984200171
缩写：AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HbsAg：hepatitis B surface antigen，乙肝病毒表面抗原；HbeAg：hepatitis B e antigen，乙肝病毒核心抗原；ALT：alanineaminotransferase，丙氨酸转氨酶；GGT：gamma glutamyl transpeptidase，γ-谷酰转肽酶；BCLC：Barcelona Clinic Liver Cancer，巴塞罗那临床肝癌标准。
表5、测试集和验证集中慢性乙型肝炎患者临床特征
Figure BDA00001744984200172
缩写：HBV：hepatitis B virus，乙型肝炎病毒；AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HbsAg：hepatitis B surface antigen，乙肝病毒表面抗原；HbsAb：hepatitis B surfaceantibody，乙肝病毒表面抗体；HbeAg：hepatitis B e antigen，乙肝病毒e抗原；HBeAb，hepatitis B e antibody乙肝病毒e抗体；HbcAb：hepatitis B core antibody，乙肝病毒核心抗体。
a，测试集98例慢性乙型肝炎患者中，57例无AFP值者未纳入计算。
b，验证集73例慢性乙型肝炎患者中，18例无AFP值者未纳入计算。
Figure BDA00001744984200173
采用Fisher精确检验；其它差异分析采用Chi-square检验。
表6、测试集和验证集中肝硬化患者临床特征
Figure BDA00001744984200181
Figure BDA00001744984200191
缩写：HBV：hepatitis B virus，乙型肝炎病毒；AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HbsAg：hepatitis B surface antigen，乙肝病毒表面抗原；HbsAb：hepatitis B surfaceantibody，乙肝病毒表面抗体；HbeAg：hepatitis B e antigen，乙肝病毒e抗原；HBeAb，hepatitis B e antibody乙肝病毒e抗体；HbcAb：hepatitis B core antibody，乙肝病毒核心抗体。
*，测试集96例肝硬化患者中，22例无相关数据者未纳入计算。
(2)入选标准
正常人血清为自愿献血者血清，肝功能正常、无肝病史、无其它恶性疾病。慢性肝炎确诊标准按照慢性乙型肝炎诊疗指南(Lok AS,McMahon BJ.Chronic hepatitis B:update 2009.Hepatology 2009;50:661-2)。肝硬化诊断标准参照《实用内科学》第12版(陈灏珠主编)，包括影像学诊断、临床指标检测、病理确诊等。肝细胞癌诊断标准按照WHO标准进行((Bruix J,Sherman M.Management of hepatocellular carcinoma.Hepatology 2005;42:1208-36))，包括影像学诊断、临床指标检测、病理确诊等。
(3)各项临床指标的确定
(a)AFP阳性：以放射免疫法或酶免疫法检测血清AFP含量，以大于20ng/ml为阳性，小于20ng/ml为阴性。
肝功能分级标准按照Child-Pugh分级方法(Van Deusen MA,Abdalla EK,VautheyJN,Roh MS.Staging classifications for hepatocellular carcinoma.Expert Rev Mol Diagn2005;5:377-83)。
(b)肿瘤分期按照Barcelona Clinic Cancer(BCLC)分级标准(Llovet JM,DiBisceglie AM,Bruix J,et al.Design and endpoints of clinical trials in hepatocellularcarcinoma.J Natl Cancer Inst 2008;100:698-711)。BCLC stage 0+A为早期，BCLC stageB+C+D为晚期。
(c)肿瘤分化程度根据各个病例的组织标本诊断和复诊结果，并参照Edmondson标准(Wittekind C.[Pitfalls in the classification of liver tumors].Pathologe2006;27:289-93)，Edmondson Ⅰ-Ⅱ级为分化好，Ⅲ-Ⅳ级为分化差。
(d)癌栓根据对各个病例的组织病理切片进行复诊，有镜下癌栓者为镜下癌栓，术前CT/MRI提示有门静脉癌栓且在术中得到证实者为肉眼癌栓，两者皆有为癌栓阳性组，其余诊断为癌栓阴性。
8、统计学分析
数据分析采用SPSS 15.0软件(SPSS Inc.，USA)。连续变量采用中位数(Median)和平均值±标准差(Mean±SD)表示；计量资料组间差异比较采用Mann-Whitney Utest(非参数统计)或T-Test；计数资料比较采用卡方检验或Fisher精确检验。通过绘制受试者工作特征(Receiver operating characteristics，ROC)曲线和计算相应的曲线下面积(areas under the curves，AUC)来评价诊断能力。最佳Cutoff值选取为灵敏度与特异性之和最大、误差[(1-灵敏性)2+(1-特异性)2的平方根]最小所对应的值。采用MedCale10.4.7.0软件比较曲线下面积AUC差异性。P<0.05(双侧)为有统计学差异。采用R软件分析检验效能及样本大小，效能≥0.8为具有检验效能。
II.实施例
实施例1、DKK1和AFP在非癌肝组织和肝细胞癌组织及相应血清中表达情况的比较分析
本发明人平行比较分析了DKK1和AFP在12例非癌肝组织(4例为正常肝组织、8例为肝硬化组织)及16例肝细胞癌肝组织(其中8例患者血清AFP≤20ng/ml，另8例血清AFP>20ng/ml)中的表达情况。半定量逆转录聚合酶链式反应(semi-qPCR)和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验结果显示，和AFP相比，DKK1在4例正常人(healthy controls，HC)和8例肝硬化肝组织(liver corrhosis，LC)中，几乎检测不到表达，但在大多数肝细胞肝癌组织中高表达(图1A-B，1D-E)。
酶联免疫吸附实验检测肝细胞癌组织相对应的病人血清中DKK1和AFP的蛋白水平，以临床常用20ng/ml为AFP的cutoff值，以2.153ng/ml为DKK1的cutoff值(本专利所用cutoff值，具体确定方法见下文)，结果显示，在4例正常人(HC)中，两者均为阴性；在8例肝硬化患者(LC)中，均有1例为阳性；在8例AFP阴性肝细胞癌患者(HCC)中(血清AFP≤20ng/ml，编号1-8)，有7例显示血清DKK1阳性，在8例AFP阳性肝细胞癌患者中(血清AFP>20ng/ml，编号9-16)，有6例显示血清DKK1阳性(图1C-F)。
因此，DKK1可以检出AFP阴性的肝细胞癌。
实施例2、血清DKK1是诊断肝细胞癌的血清蛋白标志物
本发明人按照图2的研究设计流程来评估血清DKK1蛋白对AFP阴性肝细胞癌的诊断能力。
首先本发明人分析了血清DKK1和AFP在测试集各组中的表达情况。如图3A和表7所示，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组血清DKK1蛋白水平显著高于正常人对照组(healthy controls，HC)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)对照组和肝硬化(liver cirrhosis，LC)对照组(P<0.001)，其中位数(平均值±标准差)为3.08(3.48±2.33)ng/ml，而三个对照组间则无显著差异。提示血清DKK1可作为诊断肝细胞癌的血清蛋白标志物。肝细胞癌组血清AFP水平也高于其它三组(P<0.001)，但其在慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)组中的水平明显高于正常对照组(HC)(P<0.001)(图3B)。血清DKK1和AFP在各组中的浓度具体见表8。
表7、测试集和验证集中血清DKK1蛋白和血清AFP蛋白在各组中的水平
Figure BDA00001744984200211
缩写：DKK1：dickkopf-1；AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HC：healthy controls，正常对照；CHB：chronic hepatitis B，慢性乙型肝炎；LC：liver cirrhosis，肝硬化；HCC：hepatocellular carcinoma，肝细胞癌。
实施例3、血清DKK1对肝细胞癌具有诊断价值，尤其是AFP阴性肝细胞癌患者
随后本发明人以肝细胞癌(HCC)为病人组，以正常人(HC)、慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者为对照组制作ROC曲线，确定血清DKK1诊断肝细胞癌的cutoff值、敏感性(sensitivity)、特异性(specificity)和曲线下面积(aera under the curve，AUC)。如图4A及表5所示，DKK1最佳cutoff值为2.153ng/ml，敏感性为69.1%，特异性为90.6%，AUC为0.848(95%CI：0.820-0.875)。AFP最佳cutoff值为15.35ng/ml，敏感性为59.4%，特异性为87.4%；当AFP cutoff值为20ng/ml时敏感性为57.8%，特异性为88.0%，两者没有统计学差异(P=0.104)，因此本发明本发明人选择临床常用值20ng/ml作为AFP的cutoff值。以20ng/ml为AFP cutoff值时，AFP的AUC为0.830(95%CI：0.802-0.858)。血清DKK1诊断HCC的阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(+LR)、阴性似然比(-LR)分别为89.3%、70.6%，6.910和0.343，而AFP的这些诊断指标值分别为85.1%，63.2%，4.703和0.481(表5)。在肝细胞癌患者中，血清DKK1的阳性率为69.1%(293/424)，高于血清AFP的阳性率57.8%(245/424)(图4B)。
重要的是，在AFP阴性(AFP-，血清AFP≤20ng/ml)的肝细胞癌患者中，DKK1的阳性率高达70.4%(126/179)；在AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)的肝细胞患者中，DKK1的阳性率也达68.2%(167/245)(图4B)。同时，本发明人发现在AFP阴性肝细胞癌和AFP阳性肝细胞癌组中，血清DKK1无统计学差异(图4C)，并且，血清DKK1对于AFP阴性肝细胞癌和AFP阳性肝细胞癌都具有较好的诊断价值(图4D-E，表9)。
随后本发明人分析了血清DKK1水平与肝细胞癌患者的临床特征，结果发现测试集与验证集中血清DKK1与肿瘤大小都显著相关(P<0.05)(表10)。
表8、血清DKK1、AFP及两者联合对肝细胞癌的诊断价值*
Figure BDA00001744984200221
Figure BDA00001744984200231
缩写：DKK1：dickkopf-1；AFP：alpha-fetoprotein；AUC：area under the curve，曲线下面积；95%CI：95%confidence interval，95%置信区间；PPV：positive predictivevalue，阳性预测值；NPV：negative predictive value，阴性预测值；+LR：positivelikelihood ratio，阳性似然比；-LR：negative likelihood ratio，阴性似然比；HCC：hepatocellular carcinoma，肝细胞癌；Early-HCC：early-stage hepatocellular carcinoma，早期肝细胞癌；HC：正常对照；CHB：chronic hepatitis B，慢性乙肝；LC：liver cirrhosis，肝硬化；vs.：versus，比。
*，血清DKK1的cutoff值为2.153ng/ml，血清AFP的cutoff值为20ng/ml。
表9、血清DKK1对AFP阴性肝细胞癌和AFP阳性肝细胞癌的诊断价值*
Figure BDA00001744984200241
缩写：DKK1：dickkopf-1；AFP：alpha-fetoprotein；AUC：area under the curve，曲线下面积；95%CI：95%confidence interval，95%置信区间；PPV：positive predictivevalue，阳性预测值；NPV：negative predictive value，阴性预测值；+LR：positivelikelihood ratio，阳性似然比；-LR：negative likelihood ratio，阴性似然比；HCC：hepatocellular carcinoma，肝细胞癌；Early-HCC：early-stage hepatocellular carcinoma，早期肝细胞癌；CHB：chronic hepatitis B，慢性乙肝；LC：liver cirrhosis，肝硬化；vs.：versus 。
*，血清DKK1的cutoff值为2.153ng/ml，血清AFP的cutoff值为20ng/ml。
表10、血清DKK1与肝细胞癌患者临床指标的关系
Figure BDA00001744984200242
Figure BDA00001744984200251
缩写：HCC：hepatocellular carcinoma，肝细胞癌；DKK1：dickkopf-1；AFP：alpha-fetoprotein，甲胎蛋白；HbsAg：hepatitis B surface antigen，乙肝病毒表面抗原；HbeAg：hepatitis B e antigen，乙肝病毒核心抗原；ALT：alanine aminotransferase，丙氨酸氨基转移酶；GGT：gamma-glutamyl transpeptidase，γ谷酰转肽酶。
*，血清DKK1诊断肝癌的cutoff值为2.153ng/ml。
Figure BDA00001744984200252
Fisher精确检验；其它分析采用卡方检验。
实施例4、血清DKK1对肝细胞癌患者和慢性肝病的鉴别诊断能力
慢性乙肝患者和肝硬化患者是肝细胞癌的风险人群，而血清AFP在许多这些非肿瘤慢性肝病患者中升高，因此本发明人进一步评价了血清DKK1鉴别诊断肝细胞癌和慢性肝病的能力。
如图5A及表5所示，以2.153ng/ml为DKK1的cutoff值，其AUC为0.834(95%CI：0.798-0.871)，敏感性为69.1%，特异性为84.7%；以20ng/ml为AFP cutoff值，其AUC为0.675(95%CI：0.627-0.724)，敏感性为57.8%，特异性为69.3%。基于诊断指标AUC、敏感性、特异性、预测值及似然比，DKK1区分肝细胞癌和慢性肝病的能力优于AFP(P<0.001)。在慢性肝炎(CHB)和肝硬化(LC)患者中，AFP阳性率分别为61.0%(25/41)和18.8%(18/96)，而DKK1阳性率仅为22.0%(9/41)和12.5%(12/96)。特别是在AFP阳性的慢性肝炎患者(CHB)中，DKK1阴性率达76.0%(19/25)；在AFP阳性的肝硬化患者(LC)中，DKK1阴性率高达100%(18/18)(图5B)。
并且，本发明人发现对于AFP阴性肝细胞癌和慢性肝病，或者AFP阳性肝细胞癌和慢性肝病，血清DKK1都具有较好的鉴别诊断价值(图5C-D)。
实施例5、血清DKK1对早期肝细胞癌具有诊断价值，尤其是AFP阴性的早期肝细胞癌患者
早期发现、早期诊断对于提高癌症患者的生存率至关重要，因此本发明人进一步分析了血清DKK1对早期肝细胞癌患者的诊断能力。
在本研究测试集队列中，285例肝细胞癌患者为BCLC 0+A期(早期)。首先发现早期肝细胞癌组血清DKK1水平显著高于正常健康人组、慢性乙型肝炎组和肝硬化组(P<0.0001)(图3A)。随后本发明人通过绘制ROC曲线来评估血清DKK1诊断早期肝细胞癌的能力，如图6A和表8所示，DKK1从所有对照人群(正常人、慢性乙肝患者和肝硬化患者)中诊断早期肝硬化患者的AUC为0.865(95%CI：0.835-0.895)，敏感性为70.9%，特异性为90.5%；而AFP的AUC为0.819(95%CI：0.788-0.851)，敏感性为54.4%，特异性为87.9%。DKK1诊断早期肝细胞癌的能力优于AFP(P=0.04)。阳性/阴性预测值和阳性/阴性似然比值也显示DKK1诊断价值优于AFP。在早期肝细胞癌患者中，AFP阳性率仅为54.4%(155/285)，而DKK1阳性率为70.9%(202/285)(图6B)。
更重要的是，在AFP阴性(AFP-，血清AFP≤20ng/ml)的早期肝细胞癌患者中，DKK1阳性率达73.1%(95/130)，同时在AFP阳性(AFP+，血清AFP>20ng/ml)的早期肝细胞癌患者中，其阳性率为69.0%(107/155)(图6B)。并且，在AFP阳性早期肝细胞癌患者和AFP阴性早期肝细胞癌患者组，血清DKK1水平无统计学差异(P=0.1104)(图7A)。ROC曲线结果显示，血清DKK1对于AFP阳性早期肝细胞癌和AFP阴性早期肝细胞癌都具有较好的诊断价值(图7B-E和表8)。
实施例6、血清DKK1对单个肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌患者具有诊断能力
在当前临床实践中，诊断小肝细胞癌(单个肿瘤小于2cm的肝细胞癌)极其困难。因此本发明人随后分析了血清DKK1对单个肿瘤大小小于2cm的小肝细胞癌患者的诊断能力。
如图8A所示，血清DKK1的水平与肿瘤大小呈正相关。以单个肿瘤小于2cm的小肝癌患者为病人组，以所有非肝癌病人(正常人、慢性乙肝患者和肝硬化患者)为对照组绘制ROC曲线，DKK1的AUC为0.805(95%CI：0.740-0.869)，敏感性为58.5%，特异性为84.7%，相比于AFP并没有显著地提高(P=0.564)(图8B)。以单个肿瘤小于2cm的小肝癌患者为病人组，以慢性乙肝患者和肝硬化患者为对照组绘制ROC曲线，血清DKK1的AUC为0.794(95%CI：0.727-0.861)，明显大于AFP的AUC的(0.669，95%CI：0.589-0.748)(P=0.019)(图8C)。
实施例7、联合DKK1和AFP可提高对肝细胞癌的诊断能力
本发明人同时分析了联合DKK1和AFP后对肝细胞癌的诊断价值。如图4A、图5A和表8所示，两者联合后能显著提高对肝细胞癌的诊断能力。DKK1阳性或者AFP阳性的病人占总肝细胞癌人数的87.5%(371/424)(图4B)。并且，联合后对于早期肝细胞癌患者和单个肿瘤大小小于2cm的肝细胞癌患者的诊断能力同样显著提高(图6A-C，图8B-C)。
实施例8、血清DKK1对具有肝硬化背景或无肝硬化背景肝细胞癌患者和肝硬化患者的鉴别诊断能力
肝硬化患者是肝细胞癌的高风险人群，临床上推荐需对这部分病人进行跟踪监测。因此本发明人也单独分析了血清DKK1鉴别诊断具有肝硬化背景或无肝硬化背景的肝细胞癌患者及肝硬化患者的能力。如图9A所示，具有肝硬化背景的肝细胞癌患者血清DKK1水平显著高于肝硬化患者(P<0.0001)；具有肝硬化背景的早期肝细胞癌患者血清DKK1水平也同样升高(P<0.0001)。根据制作的ROC曲线结果，血清DKK1能鉴别诊断肝硬化患者与具有肝硬化背景的肝细胞癌患者或具有肝硬化背景的早期肝细胞癌患者，且其诊断效果优于AFP，联合诊断更可提高鉴别诊断价值(图9B-C)。同时，对于无肝硬化背景的肝细胞癌患者，其血清DKK1水平也高于肝硬化患者(P<0.0001)，并且高于具有肝硬化背景的肝细胞患者(P<0.05)(图9D-E)。此外，本发明人发现血清DKK1对具有肝硬化背景的肝细胞癌患者和肝硬化患者的鉴别能力与肝细胞癌患者血清AFP水平无关，对AFP阴性肝细胞患者和AFP阳性肝细胞癌患者都具有诊断价值(图10A-D)。
实施例9、血清DKK1对具有肝炎背景肝细胞癌患者和慢性乙肝患者的鉴别诊断能力
据统计，50-80%的肝细胞癌可能是由乙肝病毒造成的，全世界大约有3.5亿的乙肝病毒携带者。而AFP在15-58%的慢性乙肝患者中有所升高。因此，本发明人也评估了血清DKK1鉴别诊断慢性肝炎患者和具有肝炎背景肝细胞癌患者的能力。本发明研究队列中肝炎均由乙肝病毒引起。如图11A-B所示，血清DKK1能够鉴别诊断慢性肝炎患者和具有肝炎背景的肝细胞癌患者或具有肝炎背景的早期肝细胞癌患者，且其诊断效果优于AFP，两者联合更可提高鉴别诊断价值。同时分析发现，血清DKK1的这种鉴别能力与肝细胞癌患者血清AFP水平无关，对AFP阴性肝细胞患者和AFP阳性肝细胞癌患者都具有诊断价值(图12A-D)。
实施例10、诊断价值的独立样本验证
为了验证血清DKK1对肝细胞癌的诊断能力，本发明人检测了另一独立样本队列(n=453)中的血清DKK1浓度并分析了其临床诊断意义。以测试集中确立的DKK1cutoff值2.153ng/ml，本发明人验证了血清DKK1对于肝细胞癌，AFP阴性肝细胞癌、早期肝细胞癌、单个肿瘤小于2cm的小肝细胞癌的诊断能力及对于肝细胞癌和慢性肝病，尤其是AFP阳性慢性肝病患者的鉴别诊断能力，见图3、图5-图11及表7-10验证集结果。
结论
作为一个新型肿瘤血清蛋白标志物，血清DKK1对肝细胞癌具有诊断价值，尤其是早期(BCLC 0+A)肝细胞癌和小肝细胞癌(小于2cm)，并且血清DKK1能够弥补AFP对肝细胞癌诊断能力的不足，能够诊断AFP阴性(AFP≤20ng/ml)的肝细胞癌，以及从AFP阳性(AFP>20ng/ml)的慢性肝病患者(如慢性乙型肝炎患者及肝硬化患者)中鉴别诊断肝细胞癌。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA00001744985000011
Figure IDA00001744985000021

Claims (12)

1.DKK1蛋白或其编码基因在制备诊断试剂或试剂盒中的用途，所述的诊断试剂或试剂盒用于诊断肝细胞癌。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断肝细胞癌包括：
诊断甲胎蛋白阴性肝细胞癌；
鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病；和/或
诊断早期肝细胞癌或小肝细胞癌。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的诊断试剂选自：
特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗DKK1蛋白的抗体。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物是引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的甲胎蛋白阴性肝细胞癌为甲胎蛋白不表达或血清甲胎蛋白含量小于20ng/ml的肝细胞癌；或
所述的慢性肝病选自：肝硬化，慢性乙型肝炎；或
所述的小肝细胞癌是肿瘤直径小于2cm的肝细胞癌；或
所述的早期肝细胞癌是BCLC 0+A级的肝细胞癌。
6.一种用于诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：
(1)检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂；和
(2)检测DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：
特异性扩增甲胎蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别甲胎蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗甲胎蛋白的抗体。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量的诊断试剂选自：
特异性扩增DKK1蛋白的编码基因的引物；或
特异性识别DKK1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或
特异性抗DKK1蛋白的抗体。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括：
核酸抽提试剂；和/或
聚合酶链反应试剂；和/或
蛋白免疫印迹试剂；和/或
酶链免疫反应试剂。
10.一种测定甲胎蛋白阴性肝细胞癌的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)检测待测样品中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和
(b)检测待测样品中的DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，当甲胎蛋白检测为阴性时，若检测为DKK1阳性，则该待测样品的提供者为肝细胞癌高危。
11.一种鉴别肝细胞癌和甲胎蛋白阳性慢性肝病的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)检测待测样品中甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；
(b)检测DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量，若甲胎蛋白检测为阳性时，DKK1表达为阴性则该待测样品的提供者为慢性肝病高危。
12.一种测定早期肝细胞癌或小肝细胞癌的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)检测待测样品中DKK1蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；和
(b)检测待测样品中的甲胎蛋白或其编码基因的表达情况或表达量；
DKK1可在早期肝细胞癌或小肝细胞癌中表达为阳性，但AFP为阳性或阴性。
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