CN103602726B - 同时对多种核酸样本进行测序的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了同时对多种核酸样本进行测序的方法,该方法包括:将多种核酸样本分别依次进行接头连接、第一PCR扩增、末端磷酸化和DNA连接;将多种DNA连接产物进行混合;将混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A;将3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头;将测序接头连接产物进行第二PCR扩增,以便获得多种核酸样本的混合测序文库;将混合测序文库进行测序;以及对所述测序结果进行分类,以便分别获得多种核酸样本各自的核酸序列。利用该方法能够同时对多种核酸样本进行测序,并且测序结果准确,可重复性好,成本低,效率高,对测序通量利用充分,该方法尤其适用于血液游离DNA样本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是测序技术领域,具体地,本发明涉及同时对多种核酸样本进行测序的方法。
背景技术
以Illumina Hiseq系列为代表的第二代深度测序技术在近年来得到了长足发展,其通过对上百万条DNA短片段的同时的平行测序,使得在短时间内就能够完成每个碱基的测序,且相对于传统测序成本大幅度降低、准确度提高。但是,至今仍没有成本更低且准确度高的同时对多个核酸样本进行测序的方法。
因而,目前同时对多种核酸样本进行测序的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种成本低、准确度高、重复性好的同时对多种核酸样本进行测序的方法。
根据本发明的一个方面,本发明提供了一种同时对多种核酸样本进行测序的方法。根据本发明的实施例,该方法包括以下步骤:将多种核酸样本分别进行接头连接,以便获得连接接头的核酸样本,其中,针对不同的核酸样本采用不同的接头;将所述连接接头的核酸样本分别进行第一PCR扩增,以便获得多种第一PCR扩增产物;将所述多种第一PCR扩增产物分别进行末端磷酸化,以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物;针对每一种核酸样本,分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接,以便获得多种DNA连接产物;将所述多种DNA连接产物进行混合,以便获得混合DNA连接产物;将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A,以便获得3’末端添加碱基A的连接产物;将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头,以便获得测序接头连接产物;将所述测序接头连接产物进行第二PCR扩增,以便获得第二PCR扩增产物,所述第二PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库;将所述混合测序文库进行测序,以便获得测序结果;以及基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列,对所述测序结果进行分类,以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。
发明人惊奇地发现,利用该方法能够同时对多种核酸样本进行测序,并且测序结果准确,可重复性好,成本低,效率高,对测序通量利用充分。此外,根据本发明的实施例,本发明的同时对多种核酸样本进行测序的方法尤其适用于血液游离DNA样本,进而该方法能够有效用于产前诊断,通过同时对多种血液游离DNA样本进行测序,实现低成本测序、跨平台兼容、软件自动化,提高可以开展产前诊断的范围。
另外,根据本发明上述实施例的同时对多种核酸样本进行测序的方法,还可以具有如下附加的技术特征:
根据本发明的实施例,所述核酸样本来源于哺乳动物,优选人,更优选人的外周血。
根据本发明的一些实施例,所述核酸为DNA或RNA。根据本发明的另一些实施例,所述核酸为游离DNA。
根据本发明的实施例,在进行所述接头连接之前,进一步包括:将所述多种核酸样本分别进行末端修复。根据本发明的实施例,所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的。由此,末端修复效果好,效率高,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,利用T4DNA连接酶进行所述接头连接。由此,能够高效地连接接头,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,利用T4多核苷酸激酶进行所述末端磷酸化。由此,提高了接头连接的效率,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,利用PE接头和T4DNA连接酶进行所述DNA连接。由此,能够高效地实现DNA连接,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,在获得多种DNA连接产物之后,以及将所述多种DNA连接产物进行混合之前,进一步包括对所述多种DNA连接产物进行片段选择。根据本发明的一些实施例,通过切胶回收或磁珠捕获进行所述片段选择。由此,能够有效地实现片段选择,获得目的片段。
根据本发明的实施例,利用Klenow(3’-5’exo-)进行所述3’端添加碱基A。由此,能够高效地实现3’端添加碱基A,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,通过二代测序平台进行所述测序。根据本发明的实施例,通过选自Illumina的Hiseq、GA系列测序仪、Life tech的Ion系列测序仪和罗氏公司的454系列测序仪的至少一种进行所述测序,优选Illumina Miseq。由此,能够有效降低测序成本,并提高测序质量。
根据本发明的实施例,所述测序接头连接产物的长度不大于测序仪的最长读长。由此,能够在保证测序准确度的前提下,充分利用测序仪的测序通量。
根据本发明的实施例,进一步包括:对测序之前的各步骤的产物进行纯化回收。由此,能够有效提高各步骤产物的纯度,减少杂质干扰,有利于后续步骤的进行,从而能够提高混合测序文库的质量,最终提高测序的准确性。根据本发明的一些具体示例,通过磁珠法或PCR纯化试剂盒进行所述纯化回收。由此,能够有效提高纯化回收的效率,获得高纯度的纯化产物。
此外,根据本发明的一些实施例,当核酸样本数多于接头数时,进一步包括:将所述核酸样本进行分组,以便使各组的核酸样本数不大于接头数;以及针对每一组核酸样本,分别进行各步骤。由此,利用较少的接头即可实现对数量众多的多种核酸样本的测序,从而既能够保证测序质量,提高测序效率,又能够有效降低测序成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了根据本发明一个实施例,本发明的同时对多种核酸样本进行测序的方法的流程示意图;
图2显示了根据本发明一个实施例的测序接头连接产物的结构示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多种”的含义是两种或两种以上。
如前所述,根据本发明的一个方面,本发明提供了一种同时对多种核酸样本进行测序的方法。根据本发明的实施例,参照图1,该方法包括以下步骤:
S100:针对每一种核酸样本,分别依次进行接头连接、第一PCR扩增、末端磷酸化和DNA连接,获得多种DNA连接产物
具体地:
首先,将多种核酸样本分别进行接头连接,以便获得连接接头的核酸样本,其中,针对不同的核酸样本采用不同的接头。由此,能够通过不同的接头对各核酸样本进行区分。
其中,根据本发明的实施例,所述核酸样本的来源不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,所述核酸样本可以来源于哺乳动物,优选人,更优选人的外周血。由此,利用本发明的方法能够有效实现同时对多种核酸样本的测序。
根据本发明的实施例,所述核酸的种类不受特别限制,DNA和RNA均适用本发明的方法。根据本发明的一些实施例,所述核酸为DNA或RNA。根据本发明的另一些实施例,优选地所述核酸为游离DNA(即血液游离DNA)。由此,本发明的方法能够有效用于血液游离DNA样本的测序,进而能够有效用于产前诊断,并且基于通过该方法能够同时对多种孕妇外周血游离DNA样本进行测序,从而将该方法用于产前诊断时能够在保证诊断结果准确性的前提下,有效提高产前诊断的效率,降低诊断成本。
此外,需要说明的是,在本文中所使用的术语“接头”是人造的序列,一般为18~20个碱基组成,通过互补的方式结合成双链的DNA接头,一般通过连接反应将接头连接到核酸样本两侧,然后通过PCR扩增的方法进行扩增,从而获得经过扩增的接头连接产物。如前所述,而当存在多种核酸样本时,针对不同的核酸样本连接不同的接头,由此,基于接头序列的不同,可以容易地区分各个核酸样本。根据本发明的一些具体示例,可以在接头序列两头引入12个碱基的随机序列,以便用于去除由于PCR扩增引入的偏倚(偏向性),由此,能够使每一个核酸样本都有一个唯一的序列标签,而且同一个分子的两侧标签序列是不同的,从而能够有效消除后续样本制备过程引入的偏倚(偏向性bias),以便控制由于增加了样本制备步骤而造成的问题,并充分发挥深度测序的优势。根据本发明一些具体示例,采用5对接头:M13(-20)、M13(-40)、M13(-47)、M13(-24)和M13(-48))进行所述接头连接,各接头的序列如SEQ ID NO:1-10所示,具体见下表:
由此,能够有效地实现接头连接,从而在后续测序后能够通过这些接头有效地区分各DNA样本的测序结果,获得各样本的序列信息。此外,连接上述接头后,能够有效消除后续文库制备过程例如PCR扩增步骤引入的偏倚,提高扩增效率,降低误差,从而能够提高文库质量,并充分利用深度测序的优势,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,在进行所述接头连接之前,进一步包括:将所述多种核酸样本分别进行末端修复。根据本发明的实施例,所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的。由此,末端修复效果好,效率高,有利于后续步骤的进行。
根据本发明的实施例,利用T4DNA连接酶进行所述接头连接。由此,能够高效地连接接头,有利于后续步骤的进行。
其次,将所述连接接头的核酸样本分别进行第一PCR扩增,以便获得多种第一PCR扩增产物。根据本发明的实施例,所述第一PCR扩增采用与所述接头对应的扩增引物进行。由此,能够有效地对连接接头的核酸样本进行扩增。例如,如前所述,根据本发明一些实施例,采用5对接头:M13(-20)、M13(-40)、M13(-47)、M13(-24)和M13(-48)进行接头连接,各接头的序列如SEQ ID NO:1-10所示,进而,进行第一PCR扩增时采用的扩增引物与该连接接头的核酸样本所具有的接头对应,具体地,第一PCR扩增采用的与所述接头对应的扩增引物的序列SEQ ID NO:11-15所示(见下表):
从而,当连接接头的核酸样本上连接的接头为M13(-20)时,则采用SEQ ID NO:11所示的扩增引物将该连接接头的核酸样本进行第一PCR扩增;......;当连接接头的核酸样本上连接的接头为M13(-48)时,则采用SEQ ID NO:15所示的扩增引物将该连接接头的核酸样本进行第一PCR扩增。由此,能够有效地实现连接接头的核酸样本的扩增,扩增效率高,误差小,有利于后续步骤的进行。
接着,将所述多种第一PCR扩增产物分别进行末端磷酸化,以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物。根据本发明的实施例,进行末端磷酸化的方法和试剂不受特别限制,只要能够有效地实现第一PCR扩增产物的末端补平和末端磷酸化即可。根据本发明的实施例,利用T4多核苷酸激酶进行所述末端磷酸化。由此,提高了连接接头的效率,有利于后续步骤的进行。
然后,针对每一种核酸样本,分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接,以便获得多种DNA连接产物。根据本发明的实施例,利用PE接头和T4DNA连接酶进行所述DNA连接。由此,能够高效地实现DNA连接,有利于后续步骤的进行。
S200:将多种DNA连接产物进行混合
具体地,将所述多种DNA连接产物进行混合,以便获得混合DNA连接产物。
根据本发明的实施例,在获得多种DNA连接产物之后,以及将所述多种DNA连接产物进行混合之前,进一步包括对所述多种DNA连接产物进行片段选择。其中,进行片段选择的方法不受特别限制,只要能够有效筛选获得目的片段即可。根据本发明的一些实施例,通过切胶回收或磁珠捕获进行所述片段选择。由此,能够有效地实现片段选择,获得目的片段。
S300:将混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A
接着,将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A,以便获得3’末端添加碱基A的连接产物。根据本发明的实施例,利用Klenow(3’-5’exo-)进行所述3’端添加碱基A。由此,能够高效地实现3’端添加碱基A,有利于后续步骤的进行。
S400:将3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头
接下来,将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头,以便获得测序接头连接产物。根据本发明的实施例,根据欲采用的测序仪选择匹配的测序接头。
S500:将测序接头连接产物进行第二PCR扩增,获得混合测序文库
接下来,将所述测序接头连接产物进行第二PCR扩增,以便获得第二PCR扩增产物,所述第二PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库。
根据本发明的实施例,所述测序接头连接产物的长度不大于测序仪的最长读长。由此,能够在保证测序准确度的前提下,充分利用测序仪的测序通量。例如,当前述的多种核酸样本为游离DNA,且采用桌面型测序仪器进行测序时,游离DNA片段大小一般集中在140~180bp,而桌面型测序仪器的最长的读长为500bp,因而,如果将几个游离DNA的短片段连接起来,比如:将两个140~180bp的片段连接成一个分子,也就是280~360bp的DNA片段,测序读长可以涵盖,如果三个DNA片段连接,则为420~540bp,也可以通过测序涵盖,再加上接头及测序接头的长度,使总长度即测序接头连接产物的长度不大于该测序仪的最长读长500bp,即可通过一个测序read读取两条以上DNA的信息,从而利用长的读长补偿了reads数少的略势,将测序的reads数提高了2~3倍,最终实现了测序成本的降低,提高了效率。
根据本发明的实施例,进一步包括:对测序之前的各步骤的产物进行纯化回收。由此,能够有效提高各步骤产物的纯度,减少杂质干扰,有利于后续步骤的进行,从而能够提高混合测序文库的质量,最终提高测序的准确性。其中,进行纯化回收的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例,通过磁珠法或PCR纯化试剂盒进行所述纯化回收。由此,能够有效提高纯化回收的效率,获得高纯度的纯化产物。
S600:将混合测序文库进行测序
接着,将所述混合测序文库进行测序,以便获得测序结果。
根据本发明的实施例,通过二代测序平台进行所述测序。根据本发明的实施例,通过选自Illumina的Hiseq、GA系列测序仪、Life tech的Ion系列测序仪和罗氏公司的454系列测序仪的至少一种进行所述测序,优选Illumina Miseq。由此,能够有效降低测序成本,并提高测序质量。这是因为,本发明的方法满足目前的二代测序平台对测序产物长度的限制(一般有效的读长在300-400bp),并且通过本发明的方法,可以根据测序仪的读长筛选适合长度的DNA连接产物,由此,即使测序仪读长升级,仍然可以达到很好的测序效果,从而避免了未来测序仪读长升级以后可能造成的测序读长浪费的问题。
S700:对测序结果进行分类,以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列
然后,基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列,对所述测序结果进行分类,以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。
此外,利用本发明的方法同时对多个核酸样本进行测序时,为了降低测序成本,可以控制接头的数量,即使核酸样本数多于接头数时。从而,根据本发明的一些实施例,当核酸样本数多于接头数时,本发明的方法可以进一步包括:将所述核酸样本进行分组,以便使各组的核酸样本数不大于接头数;以及针对每一组核酸样本,分别进行各步骤。由此,利用较少的接头即可实现对数量众多的多种核酸样本的测序,从而既能够保证测序质量,提高测序效率,又能够有效降低测序成本。
发明人惊奇地发现,利用本发明的同时对多种核酸样本进行测序的方法,能够有效地实现同时对多种核酸样本进行测序,并且测序结果准确,可重复性好,成本低,效率高,对测序通量利用充分。此外,根据本发明的实施例,本发明的同时对多种核酸样本进行测序的方法尤其适用于血液游离DNA样本,进而该方法能够有效用于产前诊断,通过同时对多种血液游离DNA样本进行测序,实现低成本测序、跨平台兼容、软件自动化,提高可以开展产前诊断的范围。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品,例如可以采购自Illumina公司。
实施例1:
根据本发明的同时对多种核酸样本进行测序的方法,参照图1,按照以下步骤进行测序:
1、样本提取
使用的游离DNA提取试剂,对游离DNA进行提取。主要步骤如下:将全血样本暂存于4℃冰葙中,开启高速冷冻离心机开关.将采血管放在4℃条件下1600g离心10分钟,去除残余细胞,再于4℃条件下16000g离心10分钟,去除残余细胞,并将上清转移至新的2ml离心管中。
在2mL离心管中加蛋白酶K600μL充分溶解并混匀的血浆,漩涡振荡器混匀10s,短暂离心。
加入600μL已混匀GB mix,短暂离心;于56℃水浴10分钟;取出离心管,室温冷却5分钟,短暂离心;加入300μL冰冻无水乙醇,轻轻颠倒混匀,室温放置5分钟,短暂离心;吸取730~750μL到吸附柱中,8000rmp离心30秒,弃废液,将管子晾干后,加入500μL GD,8000rmp离心30秒,弃废液;加入500μL溶液PW,8000rmp离心30秒,弃废液。12000rmp离心2分钟,将吸附柱转移到干净的1.5ml离心管上,室温晾干3分钟至乙醇挥发;在吸附柱中间位置加90μL TB,室温溶解5分钟,12000rmp离心2分钟,丢弃吸附柱,离心管内为DNA溶液。
由此,获得10份DNA。
2、末端修复和接头连接
把样本提取步骤中所得的10份DNA依次编号1-10,并分成2组,每组5份DNA样本,使用末端修复试剂盒进行DNA末端的修复,具体步骤:85μL DNA溶液,10X PNK buffer,dNTP2μL,T4DNA聚合酶1μL,Klenow片段1μL,T4多核苷酸激酶1μL,总体积100μL,20℃温浴30分钟.然后对末端修复后的产品进行纯化,溶解体积45μL。纯化完后对每组样本分别以下表1所示的一套接头序列(即接头:M13(-20)、M13(-40)、M13(-47)、M13(-24)和M13(-48),其序列如SEQ ID NO:1-10所示)进行接头连接,连接体系:DNA溶液45μL,2X连接缓冲液50μL,接头1μL,T4DNA连接酶,总体积100μL。20℃,温浴15分钟。取出后短暂离心。用磁珠纯化时,取150μL的磁珠进行产物纯化,回收的DNA溶于34.2μL体积Elution Buffer中。由此,获得各连接接头的核酸样本。实验的同时,记录下每个样本对应的样本组号信息和接头标签信息。
表1
3、第一PCR扩增
预先从-20℃保存的试剂盘取出dNTP Solution Set(10mM)、MgSO4(50mM),PCR引物(10Pmol/uL),与表1所示的一套接头(即接头:M13(-20)、M13(-40)、M13(-47)、M13(-24)和M13(-48))对应的PCR扩增引物(具体序列见表1,与接头对应的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO:11-15所示,)。置于离心管架上室温溶解,充分混匀后短暂离心;在1.5mL的离心管中配制反应mix,促匀后短暂离心,分装;MiX分装好后,混合后短暂离心。PCR反应体系如下:
连接接头的核酸样本 | 32.2μL |
Platinum Pfx DNA聚合酶 | 0.8μL |
引物 | 4μL |
MgSO4(50mM) | 2μL |
dNTP Solution Set | 2μL |
10X Pfx缓冲液 | 5μL |
ddH2O | 4μL |
总体积 | 50μL |
PCR反应程序为:
98℃ 30min
98℃ 10s→65℃30s→72℃30s(12个循环)
72℃ 5min
16℃ ∞
反应完成后,用磁珠法进行纯化,溶入50μL。
由此,获得各第一PCR扩增产物。
4、末端磷酸化、DNA连接和混合
在1.5ml的离心管中配制末端磷酸化反应体系:
第一PCR扩增产物 | 50μL |
10X PNK buffer | 10μL |
T4多核苷酸激酶 | 1μL |
ddH2O | 49μL |
总体积 | 100μL |
20℃温浴30min,用QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化反应体系中的DNA,用一个离心纯化柱进行纯化,溶于45μL的EB中。
连接体系:经过末端磷酸化的PCR扩增产物溶液45μL(取相同量的起始DNA),2X连接缓冲液50μL,PE接头1μL,T4DNA连接酶,总体积100μL。20℃,温浴15分钟。取出后短暂离心。用磁珠纯化时,取150uL的磁珠进行产物纯化,回收的DNA溶于10μL体积Elution Buffer中。定量,并将每组的5个文库(即DNA连接产物)取等量DNA进行混合,得到两组两管混合DNA连接产物的同时,记录下每个样本对应的样本组号信息和接头标签信息。
5、末端加“A”
1)预先从﹣20℃保存的试剂盒中取出10X blue buffer和1mM dATP(GE),将其置于冰盒上溶解并充分混匀。
2)在1.5ml的离心管中配制加“A”反应体系:
混合DNA连接产物 | 34μL |
10X blue buffer | 5μL |
1mM dATP | 10μL |
Klenow(3’-5’exo-) | 1μL |
总体积 | 50μL |
3)37℃温浴30min。
4)用QIAquick PCR纯化试剂盒回收纯化反应体系中的DNA,用一个离心纯化柱进行纯化,溶于47μL的EB中。
由此,获得3’末端添加碱基A的连接产物。
6、连接测序接头
1)预先从﹣20℃保存的试剂盒中取出2X Rapid连接缓冲液和自制PE标签接头,将其置于冰盒上溶解并使其充分混匀。
2)在1.5ml的离心管中配制末端配制接头连接反应体系:
3’末端添加碱基A的连接产物 | 45μL |
2X Rapid连接缓冲液 | 50μL |
PE标签接头(20μM,稀释50倍) | 1μL |
T4DNA连接酶(Rapid) | 4μL |
总体积 | 100μL |
3)20℃温浴15min。
4)用MiniElute PCR纯化试剂盒回收纯化反应体系中的DNA,用一个离心纯化柱进行纯化,溶于12μL的EB中。
备注:PE标签接头由以下序列退火而成
名称 | 序列(5’-3’,SEQ ID NO:) |
Index_adapter1.1 | TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(16) |
Index_adapter2.2 | 5-Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(17) |
由此,获得测序接头连接产物。其中,图2示出了测序接头连接产物的结构。
7、第二PCR扩增
1)预先从﹣20℃保存的试剂盒中取出Platinum Pfx DNA聚合酶、PCR Primer PE1.1(10μM)、PCR Primer PE2.1(10μM),将其置于冰盒上溶解并使其充分混匀。
2)在0.2ml的PCR管中配制反应体系:
测序接头连接产物 | 10μL |
Platinum Pfx DNA聚合酶 | 0.4μL |
PCR Primer PE1.1(10uM) | 2.5μL |
PCR Primer PE2.1(10uM) | 2.5μL |
MgSO4(50mM) | 1μL |
dNTP Solution Set(10mM) | 1μL |
10X Pfx扩增缓冲液 | 2.5μL |
ddH2O | 5.1μL |
总体积 | 25μL |
3)在热循环仪中运行下列程序:
实验的同时,记录下每个样本对应的样本组号信息和接头标签信息。
备注:
8、Miseq测序
取10pmol DNA用Illumina Miseq PE-250程序测序,具体操作流程详见Miseq操作说明书。
9、结果分析:
Illumina Miseq产出的测序结果是一系列DNA序列,通过测序文库标签、样本的ID标签可将这些测序序列对应到每份样本,同一个样本的序列按照产前诊断的流程进行分析,最终给出报告:阳性一个,阴性九个。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (21)
1.一种同时对多种核酸样本进行测序的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将多种核酸样本分别进行接头连接,以便获得连接接头的核酸样本,其中,针对不同的核酸样本采用不同的接头;
将所述连接接头的核酸样本分别进行第一PCR扩增,以便获得多种第一PCR扩增产物;
将所述多种第一PCR扩增产物分别进行末端磷酸化,以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物;
针对每一种核酸样本,分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接,以便获得多种DNA连接产物;
将所述多种DNA连接产物进行混合,以便获得混合DNA连接产物;
将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A,以便获得3’末端添加碱基A的连接产物;
将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头,以便获得测序接头连接产物;
将所述测序接头连接产物进行第二PCR扩增,以便获得第二PCR扩增产物,所述第二PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库;
将所述混合测序文库进行测序,以便获得测序结果;以及
基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列,对所述测序结果进行分类,以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸样本来源于哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述核酸样本来源于人。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述核酸样本来源于人的外周血。
5.根据权利要求1所述的方法,所述核酸为DNA或RNA。
6.根据权利要求5所述的方法,所述核酸为游离DNA。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在进行所述接头连接之前,进一步包括:
将所述多种核酸样本分别进行末端修复。
8.根据权利要求7所述的方法,所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的。
9.根据权利要求1所述的方法,利用T4DNA连接酶进行所述接头连接。
10.根据权利要求1所述的方法,利用T4多核苷酸激酶进行所述末端磷酸化。
11.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,利用PE接头和T4DNA连接酶进行所述DNA连接。
12.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在获得多种DNA连接产物之后,以及将所述多种DNA连接产物进行混合之前,进一步包括对所述多种DNA连接产物进行片段选择。
13.根据权利要求12所述的方法,通过切胶回收或磁珠捕获进行所述片段选择。
14.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,利用Klenow(3’-5’exo-)进行所述3’端添加碱基A。
15.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,通过二代测序平台进行所述测序。
16.根据权利要求15所述的方法,通过选自Illumina的Hiseq、GA系列测序仪、Life tech的Ion系列测序仪和罗氏公司的454系列测序仪的至少一种进行所述测序。
17.根据权利要求16所述的方法,通过Illumina Miseq进行所述测序。
18.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述测序接头连接产物的长度不大于测序仪的最长读长。
19.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进一步包括:
对测序之前的各步骤的产物进行纯化回收。
20.根据权利要求19所述的方法,其特征在于,通过磁珠法或PCR纯化试剂盒进行所述纯化回收。
21.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,当核酸样本数多于接头数时,进一步包括:
将所述核酸样本进行分组,以便使各组的核酸样本数不大于接头数;以及
针对每一组核酸样本,分别进行各步骤。
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