CN105524920B - 用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法 - Google Patents
用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法。其中,引物组包括用于接头包埋的SEQ ID NO:1‑3所示的序列,以及用于PCR扩增的SEQ ID NO:4‑5所示的序列。本发明提供的引物组使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库,构建的文库可以直接上机测序。不仅摒弃了原始的复杂文库构建程序,而且操作简单,测序结果稳定。
Description
技术领域
本发明涉及测序技术领域,尤其是一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法。
背景技术
生命技术(Life Technologies)公司研发的Ion ProtonTM基因测序仪采用了新一代半导体测序技术。该***拥有快速、简单及可扩展等特征,能有效推进临床研究在癌症及遗传性疾病等诊断中的发展。但是在上机文库构建中,依然需要传统的DNA片段化、加接头、修复、片段选择等操作,过程繁琐,耗时较长。并且所需要的DNA起始量较高,不适合微量体系(<10ng)建库。虽然该公司在后期开发了基于MuA转座子的MuSeekTM文库构建试剂盒(MuSeekTMLibrary Preparation Kit),但是依然需要较高的DNA起始量(>50ng),并且试剂中的酶需要存储在-70℃冰箱中,使得一些小型、简单的实验室无法保存利用。
高度活化变异的TN5转座酶能够随机介导双链DNA的片段化并短时间内添加寡核苷酸片段,这使得TN5能够应用于二代测序的文库制备中。但是目前商品化的TN5转座酶主要应用于Hiseq测序仪平台中,illumina公司生产的Nextera DNA kits即是此类快速高效制备文库的代表。其它平台未见其应用。因此,亟需开发一种技术,使得TN5转座酶能够适于Ion ProtonTM的文库构建。
发明内容
本发明提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法,使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库,构建的文库可以直接上机测序。
根据本发明的第一方面,本发明提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组,该引物组包括用于接头包埋的SEQ ID NO:1-3所示的序列,以及用于PCR扩增的SEQID NO:4-5所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案,上述引物组还包括用于PCR扩增的SEQ ID NO:6-7所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案,上述用于PCR扩增的SEQ ID NO:5所示的序列具体包括:SEQ ID NO:8-23所示的序列。
根据本发明的第二方面,本发明提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的试剂盒,该试剂盒包括第一方面的引物组。
作为本发明的进一步改进的方案,上述试剂盒还包括TN5转座酶,任选地还包括用于TN5转座酶的缓冲液。
作为本发明的进一步改进的方案,上述试剂盒还包括用于PCR扩增的聚合酶,任选地还包括用于上述聚合酶的缓冲液。
根据本发明的第三方面,本发明提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库方法,该方法包括:使用SEQ ID NO:1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋;使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理;使用SEQ ID NO:4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增;以及对PCR扩增产物进行纯化。
作为本发明的进一步改进的方案,上述方法还包括:在PCR扩增过程中还使用SEQID NO:6-7所示的序列。
作为本发明的进一步改进的方案,上述SEQ ID NO:5所示的序列具体包括:SEQ IDNO:8-23所示的序列。
作为本发明的优选方案,上述片段化处理的DNA的起始量是50ng以下。
本发明提供的引物组,使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于IonProton的文库,构建的文库可以直接上机测序。本发明不仅摒弃了原始的复杂文库构建程序,而且操作简单,测序结果稳定。文库构建可在1h内完成,特别是DNA建库起始量可以达到纳克级(1-10ng),极大地促进了Ion ProtonTM基因测序仪的应用和整体测序速度。
附图说明
图1为本发明一个实施方案的Ion Proton测序平台的TN5建库方法流程图;
图2为本发明实施例1得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图;
图3为本发明实施例1得到的文库的基因表达数量检测图;
图4为本发明比较例1的引物组一得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图;
图5为本发明比较例1的引物组二得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图;
图6为本发明比较例1的引物组三得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图;
图7为本发明比较例1的引物组四得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图;
图8为本发明比较例1的引物组五得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
发明人经深入研究和筛选得到一组可以用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组,使用该组引物能够使得TN5转座酶高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库,构建的文库可以直接上机测序。
需要说明的是,在实际应用中,需要经过反复试验筛选才能得到可用的引物,本发明的发明人还尝试使用其它序列作为引物用于Ion Proton测序平台的TN5建库,难以获得成功,而出乎意料地发现本发明的引物组不但能够实现基本的建库功能,而且具有高效、快速、微量的特点。
本发明的引物组包括表1所示的几条引物,其中SEQ ID NO:1-5所示的引物为必需引物,而SEQ ID NO:6-7为进一步可以包括的引物。在不包括SEQ ID NO:6-7的情况下,也能实现基本的PCR扩增功能;而在包括SEQ ID NO:6-7的情况下,能够实现嵌套式PCR扩增功能,增加敏感性和可靠性。
表1
表1中,SEQ ID NO:1-3所示的序列用于接头包埋,其中Tn5-M是短接头序列,而Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion是长接头序列,短接头序列分别与两条长接头序列形成配对,与TN5转座酶包埋形成包埋复合体。
本发明中,PCR扩增至少需要两条引物序列,即IonAdapter-P和IonAdapter-A,其中IonAdapter-P是序列固定的序列,而IonAdapter-A含有标签(Barcode)序列“[i-A]”,其中标签序列用于区分不同的样本,因此也可以称为“样本标签序列”。标签序列可以采用目前高通量测序中通用的标志(index)序列。一般只要能够区分出样本且不干扰测序即可,可以是一段连续的随机序列,长度一般大于6bp,比如8bp、10bp或12bp等。本发明一个实施例中使用的标签序列的长度是10bp,因此SEQ ID NO:5所示的IonAdapter-A序列中的[i-A]可以是10个连续的随机碱基,即“NNNNNNNNNN”,也就是说本发明中的SEQ ID NO:5所示的IonAdapter-A序列可以表示为如下序列:
5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGATGCTGGCTGACGGGAT-3′。
然而,应当理解的是,本发明中SEQ ID NO:5所示的序列并不局限于标签序列是“NNNNNNNNNN”的序列,而是任何只要标签序列互不相同、而其它部分序列相同的引物组。
因此,SEQ ID NO:5所示的序列实际上可以包括一组具有不同标签序列的引物组,其中引物的数量可以是2以上的任何自然数,具体可以根据具体应用需求确定。一般而言,十几条至几十条带有标签序列的序列即可满足本发明的应用需求。在本发明的一个实施例中,SEQ ID NO:5所示的序列实际上包括16条具体的序列,即表2所示的序列。
表2
表2中,带下划线的序列是标签序列,长度是10bp。
在本发明的引物组中包括SEQ ID NO:6所示的IonPrimer-P和SEQ ID NO:7所示的IonPrimer-A的情况下,SEQ ID NO:6所示的IonPrimer-P和SEQ ID NO:7所示的IonPrimer-A作为嵌套式PCR的外扩增引物,而SEQ ID NO:4所示的IonAdapter-P和SEQ ID NO:5所示的IonAdapter-A作为嵌套式PCR的内扩增引物,进行嵌套式PCR扩增。
本发明的试剂盒的特点在于,包括本发明的引物组。除此之外,还可以包括其它组分,例如,TN5转座酶,以及任选地用于TN5转座酶的缓冲液;用于PCR扩增的聚合酶,以及任选地用于上述聚合酶的缓冲液。
本发明还提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库方法,该方法使用SEQ IDNO:1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋;使用SEQ ID NO:4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增。在一个具体的实施方案中,本发明的方法包括:使用SEQ ID NO:1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋;使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理;使用SEQID NO:4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增;以及对PCR扩增产物进行纯化。
在进一步改进的方案中,本发明的方法还包括:在PCR扩增过程中还使用SEQ IDNO:6-7所示的序列。
在进一步改进的方案中,其中SEQ ID NO:5所示的序列具体包括:SEQ ID NO:8-23所示的序列。
如图1所示的流程图,在本发明的一个具体实施例中,用于Ion Proton测序平台的TN5建库方法包括步骤:TN5转座酶以及接头设计和制备;TN5转座酶与接头(Adapter Mix)包埋;DNA片段化;片段化反应终止;片段化产物PCR扩增;扩增产物纯化;以及文库质检。
采用本发明的建库方法,DNA的起始量能够在50ng以下。在本发明的一个实施例中,DNA的起始量是1ng。其中DNA可以是基因组DNA或cDNA扩增产物等。不同起始量的DNA可以使用不同量的TN5转座酶与接头序列的包埋产物来打断,一般而言DNA的起始量越低,需要的TN5转座酶与接头序列的包埋产物越少。本发明的方法中,由于提供的序列的高效性,能够实现低起始量DNA的建库,因此相应地,TN5转座酶和接头序列的用量也减少,大大节省了成本。
以下通过具体实施例详细描述本发明的实现,应当理解,实施例仅是示例性的,不能理解为对本发明的保护范围具有限定作用。
实施例1
根据以上技术方案,使用1ng Hela转录组cDNA扩增产物为模板进行文库构建。终产物纯化后,溶解于15μL中。
1、TN5转座酶及接头制备
TN5转座酶及5×Buffer(50mM TAPS-NaOH,pH8.5@RT,25mM MgCl2,50%DMF,试剂分别来自BBI公司)按照Simone Picelli等(Genome Res.2014.24:2033-2040)发表的方法进行制备。
a、设计合成表1所示的引物Tn5-M、Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion。
b、使用退火缓冲液(Annealing Buffer)溶解Tn5-M、Tn5-M-A-Ion、Tn5-M-P-Ion至100μM。
c、分别配制如表3的反应体系:
表3
d、分别将反应1和反应2涡旋震荡充分混匀,并短暂离心使溶液回到管底。置于PCR仪内,进行如表4的反应程序(热盖温度105℃):
表4
e、反应结束后,将反应1和反应2等体积混合,混匀,命名为接头混合物(AdapterMix),-20℃保存。
2、接头包埋
a、在灭菌PCR管中依次添加表5的各反应组分:
表5
b、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
c、将反应置于25℃反应1h。反应产物命名为TN5-Mix,置于-20℃储存。
3、DNA片段化
a、配置0.1%SDS(BBI公司)作为终止液,保存于室温,如有沉淀,可于37℃加热并剧烈震荡充分混匀沉淀即会溶解。
b、在灭菌PCR管中依次添加表6的各反应组分:
表6
组分 | 用量(μL) |
5×Buffer | 4 |
cDNA扩增产物(1ng) | 1 |
TN5-Mix | 0.2 |
H2O | 补齐20 |
c、使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。
d、将PCR管置于PCR仪中,设置如下表7的反应程序(热盖温度75℃):
表7
待样品温度降低至4℃后,取出PCR管。
e、向上述反应产物中加入5μL 0.1%SDS,使用移液器轻轻吹打20次充分混匀。置于室温放置5min。体系保持25μL用于后续PCR反应。
4、片段化产物PCR扩增
a、设计合成表1所示的引物:IonPrimer-P、IonPrimer-A、IonAdapter-P,以及表2所示的引物IonAdapter-A-1至IonAdapter-A-16。
b、将灭菌PCR管置于冰浴中,依次添加表8的各反应组分:
表8
c、使用移液器轻轻吹打10次充分混匀;
d、将PCR管置于PCR仪中,设置如下表9的反应程序(热盖温度105℃):
表9
5、扩增产物纯化
使用0.8×AgencourtAMPure XP beads(NEB公司),进行选择性纯化。起始PCR产物体积应补齐至50μL,否则分选长度会与预期不一致。
a、涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取35μL体积至50μL PCR产物中,使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
b.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心转移上清至干净EP管中,丢弃磁珠。
c.涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取7.5μL体积至上清中,使用移液器轻轻吹打10次充分混匀。室温孵育5分钟。
d.将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心移除上清。
e.保持EP管始终处于磁力架中,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒后小心移除上清。
f.重复上步,总计漂洗两次。
g.保持EP管始终处于磁力架中,开盖空气干燥磁珠10分钟。
h.将EP管从磁力架中取出,加入15μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5分钟)小心吸取上清至灭菌EP管中,于-20℃保存。
如需获得长度分布更集中的文库,扩增产物可使用胶回收试剂盒进行片段长度分选和纯化。
6、文库质检
使用安捷伦2100生物分析仪(2100Bioanalyzer)进行检测。图2示出了本实施例的2100生物分析仪检测结果图,其中峰1的峰值是50bp,质量浓度是4.20ng/μl,摩尔浓度是424.2nmol/l,表示最小分子量标记;峰2的峰值是346bp,质量浓度是8.29ng/μl,摩尔浓度是36.3nmol/l,表示产物;峰3的峰值是17000bp,质量浓度是2.10ng/μl,摩尔浓度是2.1nmol/l,表示最大分子量标记。
7、测序及数据分析
质检合格的文库Ion ProtonTM测序及数据分析。图3示出了本实施例的文库的基因表达数量检测图。图中,RPKM表示每百万个读段中来自于某基因每千碱基长度的读段数(Reads Per Kilo bases per Million reads),其中每个柱状图分为上、中、下三段,上段表示0<RPKM<1,中段表示1<RPKM<30,下段表示RPKM>30。
比较例1
按照与实施例1相同的实验方法(差别仅在于引物组不同),发明人研究了其它引物组在Ion Proton测序平台的TN5建库中的有效性,发现其它各组引物均不能有效地实现Ion Proton测序平台的TN5建库或者建库效果极差。
表10示出了不能有效地实现Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组的序列。
表10
图4至图8分别示出了引物组一至引物组五的2100生物分析仪检测结果图。结果显示:通常没有产物、产物浓度低或产物片段大小不稳定等。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组,其特征在于,所述引物组包括用于接头包埋的SEQ ID NO:1-3所示的序列,以及用于PCR扩增的SEQ ID NO:4-5所示的序列。
2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于,所述引物组还包括用于PCR扩增的SEQID NO:6-7所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的引物组,其特征在于,所述用于PCR扩增的SEQ ID NO:5所示的序列具体为:SEQ ID NO:8-23所示的序列。
4.一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括TN5转座酶,以及用于TN5转座酶的缓冲液。
6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括用于PCR扩增的聚合酶,以及用于所述聚合酶的缓冲液。
7.一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库方法,其特征在于,所述方法包括:使用SEQID NO:1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋;使用得到的包埋复合体对DNA进行片段化处理;使用SEQ ID NO:4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩增;以及对PCR扩增产物进行纯化。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述方法还包括:在PCR扩增过程中还使用SEQ ID NO:6-7所示的序列。
9.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述SEQ ID NO:5所示的序列具体为:SEQ ID NO:8-23所示的序列。
10.根据权利要求7或8所述的方法,其特征在于,所述片段化处理的DNA的起始量是1ng至50ng。
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REG | Reference to a national code |
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GR01 | Patent grant | ||
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