CN103184216B - 用于扩增免疫球蛋白重链cdr3编码序列的引物组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物，富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的方法，构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库的方法，确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法，确定个体免疫状态的方法，确定个体免疫状态的***。该引物组合物包括第一引物组，所述第一引物组由至少一种V区引物组成，所述至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及第二引物组，所述第二引物组由至少一种J区引物组成，所述至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。利用该引物组合物，能够有效地对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集，从而为对CDR3进行深入研究提供了便利的工具。

Description

用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地，本发明涉及用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物及其用途。更具体地，本发明涉及用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物，富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的方法，构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库的方法，确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法，确定个体免疫状态的方法，确定个体免疫状态的***。

背景技术

免疫球蛋白、T细胞受体和HLA(人类白细胞抗原)是人类基因组中最活跃的分子，决定和反映了人和环境的相互作用。免疫大分子的多样性使得机体能识别无数的外来物质和清除体内产生的部分代谢物。免疫大分子多样性产生的机制主要有基因重排、体细胞突变、非模板核苷酸的***与缺失等。免疫球蛋白重链重排指V、D、J三种基因片段重排形成多种CDR3编码序列，首先是DJ基因片段重排，重排后的基因片段再与V基因进行组合，得到编码CDR3的基因；在免疫球蛋白轻链中，先进行κ链基因重排，若重排失败，则λ链基因开始重排，由重排、非模板核苷酸的***与缺失等机制产生多种多样特异性的基因片段。由此，一个个体内可能产生1011个特异性的分子。免疫***是机体抵御病原菌入侵与免疫调节的重要***，对其研究有很重要的意义。

然而，目前对于CDR3的研究仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效地对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集的手段。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括第一引物组，所述第一引物组由至少一种V区引物组成，所述至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及第二引物组，所述第二引物组由至少一种J区引物组成，所述至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。利用该引物组合物，能够有效地对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集，从而为对CDR3进行深入研究提供了便利的工具。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库的方法。包括以下步骤：根据前面所述的方法，获得富集所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的扩增产物；以及针对所述扩增产物，构建DNA测序文库，所述DNA测序文库构成所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库。由此，可以在对重链CDR3编码序列进行富集的基础上，构建可以用于测序的测序文库。

根据本发明的再一方面，本发明提出了一种确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法。根据本发明的实施例，该确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法包括以下步骤：根据前面所述的方法，构建免疫球蛋白重链CDR3测序文库；以及对所述免疫球蛋白重链CDR3测序文库进行测序，以便确定所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息。

本发明再一方面提出了一种确定个体免疫状态的方法。根据本发明的实施例，该确定个体免疫状态的方法包括以下步骤：根据前面所述的方法，对所述个体的免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态。通过该方法，能够有效地获得个体的免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息，从而可以有效地确定个体免疫状态。

本发明的又一方面提出了一种确定个体免疫状态的***。根据本发明的实施例，该确定个体免疫状态的***包括：免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置，所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置中设置有前面所述的引物组合物，以便对所述个体的核酸样本富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列；文库构建装置，所述文库构建装置与所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置相连，以便针对所述经过富集的免疫球蛋白重链CDR3编码序列构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库；测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，用于对所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及分析装置，所述分析装置与所述测序装置相连，用于对基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态。由此，利用该***，能够有效地实施前述确定个体免疫状态的方法，从而能够有效地确定个体的免疫状态。

本发明的又一方面提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该所述试剂盒中设置有前面所述的引物组合物。由此，利用该试剂盒能够用于检测免疫球蛋白重链的V-J重排，或者用于检测免疫球蛋白重链CDR3的编码序列。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是免疫球蛋白重链中包含V_H、D_H和J_H构成的CDR3的结构示意图；

图2是根据本发明一个实施例的对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集和测序的流程示意图；

图3是根据本发明一个实施例的用于确定个体的免疫状态的***结构示意图；

图4是根据本发明一个实施例的多重PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果；

图5是根据本发明一个实施例的对免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序后，所得到的V-J基因片段配对分布及风度的结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。需要说明的是在本文中所使用的术语“第一”、“第二”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种用于扩增免疫球蛋白重链CDR3编码序列的引物组合物。根据本发明的实施例，该引物组合物包括第一引物组和第二引物组。其中，第一引物组由至少一种V区引物组成，所述第二引物组由至少一种J区引物组成。在本文中所使用的术语“V区引物”指的是这样的一种引物，其能够特异性地识别免疫球蛋白重链家族中的V基因片段，从而可以引导进行聚合酶链式反应，由此第一引物组中所包含的V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列。类似的，在本文中所使用的术语“J区引物”指的是这样的一种引物，其能够特异性地识别免疫球蛋白重链家族中的J基因片段，从而可以引导进行聚合酶链式反应，由此第一引物组中所包含的J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列。进而，在V区引物和J区引物的引导下，可以通过扩增反应例如PCR扩增，从含有重链编码基因的核酸样本中特异性地扩增包含V基因片段和J基因片段的编码序列。由于免疫球蛋白重链的CDR3是由V、D、J基因片段重排产物所编码的，因而通过特异性识别V和J基因片段引物，即第一引物组和第二引物组，能够有效地从包含CDR3编码序列的核酸样本中扩增获得CDR3编码序列的扩增产物，另外，基于CDR1、CDR2属于V基因，并没有参与重排过程；在重链中，CDR3是V-D-J重排的产物，因而通过采用根据本发明实施例的引物组合物，能够高特异性地从样本中扩增富集获得CDR3的编码序列，而不会存在其他的干扰序列。从而能够实现对重链CDR3编码序列的有效富集，进而为针对CDR3进行深入研究提供了便利的工具。

根据本发明的实施例，V区引物和J区引物在PCR扩增过程中的作用，并不受特别限制。根据本发明的一个具体示例，V区引物可以作为正义链引物，J区引物可以作为反义链引物。发明人发现，通过如此设置V区引物和J区引物，能够进一步提高将引物组合物用于富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列时的富集效率。根据本发明的实施例，上述引物组合物能够适用的免疫球蛋白类型，不受特别限制，本领域技术人员可以根据研究需要，选择适当的免疫球蛋白作为研究对象。根据本发明的一个实施例，所述免疫球蛋白为人类免疫球蛋白。由此，可以有效地将引物组合物用于对人类免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集，从而可以有效地用于对人体免疫状况进行研究。

另外，根据本发明的实施例，可以通过对V区引物和J区引物的序列进行选择，实现一条引物可以识别多种V基因片段，从而可以进一步提高扩增的效率，减少引物的数目，降低成本。根据本发明的一个实施例，第一引物组的至少一种引物包含与多个V基因片段的保守区互补的序列。由此，可以在减少引物的数量的同时，提高对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集的效率，发明人还发现，这样操作能够提高各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。类似的，根据本发明的一个实施例，第二引物组的至少一种包含与多个J基因片段的保守区互补的序列。由此，可以在减少引物的数量的同时，提高对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集的效率，发明人还发现，这样操作能够提高各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。另外，根据J基因片段的序列特点，第二引物组可以仅由一条引物构成。因而根据本发明的一个实施例，第二引物组由一种简并引物构成，该引物包含与多个J基因片段的保守区互补的序列。由此，可以在减少引物的数量的同时，提高对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行富集的效率，发明人还发现，这样操作能够提高各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。

具体地，根据本发明的实施例，针对人类免疫球蛋白重链CDR3的序列特征，本发明提出了一组V区引物，和一种J区引物，其序列和名称分别总结如下：

VH1.1	AGAGTCACCATAACCGCGGACA	SEQ ID NO：1
			VH1.2	GTCACCAGTACCAGGGACACG	SEQ ID NO：2
VH1.3	AGTCACCATTACCAGGGACACA	SEQ ID NO：3
			VH1.4	AGAGTCACCATGACCAGGAACA	SEQ ID NO：4
VH1.5	AGTCACCATGACCACAGACACA	SEQ ID NO：5
			VH1.6	AGAGTCACCATGACCGAGGACA	SEQ ID NO：6

VH1.7	AGTCACCATTACYAGGGACAGG	SEQ ID NO：7
			VH1.8	GTCACCATGACCAGGGACACG	SEQ ID NO：8
VH1.9	AGTCACCATTACCAGGGACATG	SEQ ID NO：9
			VH1.10	GAGTCACGATTACCRCGGACG	SEQ ID NO：10
VH1.11	GAGTCACGATTACCGCGGACA	SEQ ID NO：11
			VH2	ACCAGGCTCACCATYWCCAAGG	SEQ ID NO：12
VH3.1	GGCCGRTTCACCATCTCMAG	SEQ ID NO：13
			VH3.2	GGCMGATTCACCATCTCCAG	SEQ ID NO：14
VH3.3	GGCCGATTCGCCATCTCCAG	SEQ ID NO：15
			VH4.1	AGTCGAGTCACCATGTCAGTAG	SEQ ID NO：16
VH4.2	AGTCGAGTYACCATATCMGTAG	SEQ ID NO：17
			VH5	GGCCASGTCACCATCTCAGC	SEQ ID NO：18
VH6	AGTCGAATAACCATCAACCCAG	SEQ ID NO：19
			VH7	GGACGGTTTGTCTTCTCCTTGG	SEQ ID NO：20
JH	CTGAGGAGACGGTGACCAKKGT	SEQ ID NO：21

R＝A/G，Y＝C/T，M＝A/C，K＝G/T，S＝C/G，W＝A/T

上表中所列出的序列，可以至少识别一种V区或J区亚家族的编码序列，其所识别的代表性亚家族总结如下：

需要说明的是，上表中所列出的V区或J区亚家族并不是穷尽的，而仅仅是目前有报道的所有亚家族。事实上，发明人惊奇地发现，采用上述具体的引物序列，能够全面覆盖人类免疫球蛋白CDR3的全部亚家族，包括发现新的CDR3亚家族，从而能够全面的富集人类免疫球蛋白重链CDR3编码序列，另外，发明人还发现通过采用上述引物序列，能够同时在一个PCR反应体系中进行多重引物PCR(有时也称为“多重PCR”)，可以有效地对样本中所包含的CDR3编码序列进行扩增，并且能够保证各CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映CDR3编码序列在宿主中的分布比例。根据本发明的实施例，多重引物PCR的退火温度可以为60摄氏度。发明人惊奇地发现，当退火温度为60摄氏度时，多重引物PCR扩增CDR3的效率得到显著提高。

由此，现有技术相比，本发明含有可扩增IMGT数据库免疫球蛋白CDR3序列所有V区和J区的特异性引物，可以最全面的富集人类免疫球蛋白重链CDR3的编码序列，扩增出来的产物能够区分免疫球蛋白重链的各个亚家族，且同一模板不会被两组引物特异性结合扩增。本发明中的引物能更好的呈现机体免疫大分子的集合与分布，对找到与疾病相关的信息或者免疫***变化的信息具有更可靠的作用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：首先提供核酸样本，该核酸样本中包含编码免疫球蛋白重链CDR3的核酸序列；接下来，利用前面所述的引物组合物，以所提供的核酸样本作为模板，进行PCR扩增，如前所述，基于引物组合物的特点，可以通过PCR扩增获得扩增产物，该扩增产物中富集了免疫球蛋白重链CDR3编码序列。利用该方法，能够有效地对免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行扩增，从而有效地实现免疫球蛋白CDR3编码序列的富集。

根据本发明的实施例，核酸样本的来源不受特别限制。本领域技术人员可以根据研究需要，选择可以获得核酸样本的来源。例如为了研究某一组织的特有免疫状态，可以从该组织或其附近提取免疫细胞作为核酸样本的来源。根据本发明一个实施例，可以采用从人外周血能够分离含有上述核酸样本的单个核细胞，并且通过分离核酸来获得上述核酸样本。由此，提供核酸样本的步骤可以进一步包括：首先，从人外周血分离外周血单个核细胞；接下来，从外周血单个核细胞提取核酸样本。由此，可以有效地获得含有编码免疫球蛋白重链CDR3的核酸序列的核酸样本，从而，可以进一步提高富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的效率。本领域技术人员可以通过任何常规的手段从外周血中提取外周血单个核细胞。根据本发明的一个实施例，可以通过密度梯度离心分离所述外周血单个核细胞。并且可以采用常规的手段从所分离的外周血单个核细胞中提取基因组DNA和总RNA作为用于扩增的核酸样本。由此，可以方便快捷且低成本地获得核酸样本。本领域技术人员能够理解的是，当采用总RNA时作为核酸样本进行扩增时，根据试验需要，可以首先通过逆转录将总RNA转换为cDNA。

根据本发明的实施例，上述PCR的类型并不受特别限制，即可以依次进行多次PCR反应，也可以在一个PCR体系中完成多轮PCR扩增。根据本发明的一个实施例，PCR扩增为多重引物PCR扩增。由此，可以同时在一个反应体系中完成对目标序列，即多种免疫球蛋白重链CDR3编码序列的扩增，并且能够保证各免疫球蛋白重链CDR3编码序列扩增的均一性，从而能够真实地反映各免疫球蛋白重链CDR3编码序列的真实相对比例。在进行PCR扩增之后，可以进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所得到的扩增产物。由此，可以提高扩增产物的纯度，从而提高富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的效率。根据本发明的一个实施例，扩增产物的长度为140～280bp。由此，可以进一步提高扩增产物中CDR3编码序列的纯度，从而提高富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的效率。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库的方法。包括以下步骤：首先，根据前面所述的方法，获得富集所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的扩增产物。接下来，针对所得到的扩增产物，构建DNA测序文库，该DNA测序文库可以作为免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库。由此，可以在对重链CDR3编码序列进行富集的基础上，构建可以用于测序的测序文库。

根据本发明的实施例，针对扩增产物构建DNA测序文库的方法并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，针对扩增产物，构建DNA测序文库进一步包括：

首先，对扩增产物进行末端修复，以便获得经过末端修复的扩增产物。根据本发明的一个实施例，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性。由此，可以进一步提高末端修复的效率，从而可以进一步提高构建测序文库的效率。

接下来，对经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的扩增产物。根据本发明的一个实施例，利用Klenow(3’-5’exo-)对所述经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基A。由此，可以进一步提高在扩增产物的3’末端添加碱基A的效率，从而可以进一步提高构建测序文库的效率。

接着，将所得到的3’末端添加碱基A的扩增产物与接头相连，以便获得连接产物；对所得到的连接产物进行PCR扩增，以便获得第二扩增产物。根据本发明的一个实施例，将所述具有粘性末端A的扩增产物与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。由此，可以进一步提高扩增产物与接头连接的效率，进而可以进一步提高构建测序文库的效率。

最后，将所得到的第二扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所得到的回收产物构成所述测序文库。根据本发明的实施例，对第二扩增产物进行纯化回收的方法并不受特别限制，根据本发明的具体实例，可以通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所第二扩增产物。由此，可以进一步提高构建测序文库的效率。

由此，可以有效地构建测序文库，从而便于后续的测序及进一步分析。

根据本发明的再一方面，本发明提出了一种确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法。根据本发明的实施例，该确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法可以包括以下步骤：

首先，根据前面所述的方法，构建免疫球蛋白重链CDR3测序文库。

接下来，对所述免疫球蛋白重链CDR3测序文库进行测序，以便确定所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息。根据本发明的实施例，利用选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。由此，能够高通量高精度地对所得到的免疫球蛋白重链CDR3编码序列，从而进一步提高了确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息的方法的效率。

免疫组库作为多样性的免疫细胞在一个个体内某一时刻的总和，它反应了个体遗传因素、抗原接触史和个体时刻的免疫调控。免疫组库能用于疾病相关研究，对疾病机理进行探讨，可作为寻找生物标记物的一个有效手段，免疫组库的研究结果可以促进对更多疾病的早期诊断，治疗甚至预防。目前已有相关研究表明IgH、TCR与免疫***疾病的发生有一定关系，某一种克隆的增多或减少直接影响疾病的发生和进展，例如有研究表明特定IgH克隆的重排是非霍奇金淋巴瘤的生物标志物；特异性的B细胞单克隆增多是慢性淋巴细胞性白血病的首个生物标志物。由此，本发明再一方面提出了一种确定个体免疫状态的方法。根据本发明的实施例，该确定个体免疫状态的方法包括以下步骤：首先，根据前面所述的方法，对所述个体的免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及基于所得到的测序结果，确定该个体的免疫状态。通过该方法，能够有效地获得个体的免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息，从而可以有效地确定个体免疫状态。在本文中所使用的术语“免疫状态”应作广义理解，其是指任何可以通过免疫球蛋白重链CDR3编码序列的序列信息反映出的免疫信息。根据本发明的一个实施例，基于所得到的测序结果，确定个体的免疫状态可以进一步包括：将所得到的测序结果与对照序列进行比对，以便确定所述个体中所包含的免疫球蛋白重链CDR3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例。由此，可以有效地判断个体免疫***的组成和分布情况，从而有效地确定个体的免疫状态。另外，根据本发明的实施例，可以对个体进行多次监控，判断免疫球蛋白重链CDR3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例随时间的变化。为此，根据本发明的一个实施例，在多个不同的时间点，从相同的个体提取样品，并分别根据前面所述的方法对样品，获得多个测序结果；以及将所述多个测序结果进行比对，以便确定所述个体中免疫球蛋白重链CDR3亚家族类型以及相对比例的变化。由此，可以基于不同时间点的样品的测序结果的比对，有效地确定个体中免疫球蛋白重链CDR3亚家族类型以及相对比例的变化，从而更加有效地判断个体的免疫状态。由此，可以在不同时间对同一个体或多个体进行采样，分析例如疾病前后或某种特定事件、时期前后个体免疫组库的变化，了解个体对特定事件、在特定时期的免疫***变化。例如，能够从单一克隆水平知道当前样本的细致变化，从而寻找与疾病发生发展史相关的信息。

本发明的又一方面提出了一种确定个体免疫状态的***。根据本发明的实施例，参考图3，该确定个体免疫状态的***1000包括免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置100、文库构建装置200、测序装置300以及分析装置400。其中，免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置100中设置有前面所述的引物组合物，以便对个体的核酸样本富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列。文库构建装置200与免疫球蛋白重链CDR3编码序列富集装置100相连，以便针对经过富集的免疫球蛋白重链CDR3编码序列构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库。根据本发明的实施例，关于针对扩增产物，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample PreparationGuide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，既可以是直接相连，也可以是间接相连，只要能够实现上述功能上的衔接即可。测序装置300与文库构建装置200相连，用于对免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。分析装置400与测序装置300相连，用于基于测序结果，确定所述个体的免疫状态。由此，利用该***，能够有效地实施前述确定个体免疫状态的方法，从而有效地确定个体的免疫状态。根据本发明的一个实施例，分析装置400可以进一步包括比对单元，比对单元中存储有对照序列，用于将测序结果与对照序列进行比对，以便确定个体中所包含的免疫球蛋白重链CDR3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例。根据本发明的实施例，可以采用在分析装置300中预存有相关的序列信息，也可以采用分析装置300与远程数据库(图中未显示)相连，进行联网操作。由此，可以通过将测序结果与对照序列例如已知的免疫基因组数据库IMGT进行比对，确定免疫球蛋白CDR3的亚家族类型分布以及各亚家族类型的分布，从而进一步提高确定个体免疫状态的效率。

根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种试剂盒。利用该试剂盒可以有效地用于检测免疫球蛋白重链CDR3的编码序列，从而可以有效地确定个体的免疫状态。根据本发明的实施例，该试剂盒可以包含根据前面所述的引物组合物。由此，利用该试剂盒可以所述试剂盒用于检测免疫球蛋白重链的V-J重排。任选地，所述试剂盒用于检测免疫球蛋白重链CDR3的编码序列。根据本发明的实施例，在该试剂盒中，正向引物组和反向引物组可以设置在不同的容器中，也可以设置在相同的容器中以组合物的方式存在。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公职的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

一般方法

参考图2，在本发明实施例中采用的富集人免疫球蛋白重链CDR3编码序列、构建测序文库和测序的方法主要包括：

1、引物的设计

分别以IMGT数据库中的免疫球蛋白重链CDR3的序列为参考序列，在免疫球蛋白重链的FR3域设计引物，V区引物是位于V基因片段的保守区，J区引物位于J基因片段的保守区，设计的引物扩增出来的产物能够区分免疫球蛋白重链各个亚家族。所得到的序列如SEQID NO：1-21所示，前面已经对这些序列进行了详细描述，不再赘述。

2、文库制备

步骤一、密度梯度分离人外周血单个核细胞(PBMC)

用含抗凝剂的无菌采血管进行采血，利用Ficoll-Paque PLUS或Percoll淋巴细胞分离液进行密度梯度分离PBMC。

步骤二提取基因组DNA与总RNA，对于总RNA，首先，将RNA逆转录为cDNA。

蛋白酶K消化或者酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA；Trizol法提取RNA。

步骤三特异性扩增CDR3编码序列

使用上面步骤设计的引物，通过PCR方法扩增CDR3基因片段。

步骤四PCR产物末端修复

回收纯化的DNA通过T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶等酶的作用以dNTP为作用底物进行末端修复，形成补平的末端磷酸化的DNA片段。然后利用Klenow片段(3’-5’exo-)聚合酶及dATP在补平序列的3’末端加上“A”碱基。

步骤五接头连接

将所得到的3’末端加上“A”碱基的产物在T4DNA连接酶的作用下与接头进行连接，可用磁珠或者MiniElutePCR纯化试剂盒(Qiagen)回收纯化反应体系中的DNA。

步骤六PCR扩增目的产物，同时加入测序引物并纯化

以连接接头后的DNA为模板，加入通用PCR引物和测序引物，用Phusion酶进行PCR扩增。扩增产物可用三种方法进行纯化，分别为磁珠纯化、纯化柱纯化和琼脂糖胶电泳回收纯化。回收纯化的产物进行安捷伦2100检测和Q-PCR定量，然后待上机测序。

实施例1

1.分离人外周血单个核细胞

1)取健康人新鲜外周血10mL，注入含有抗凝剂的无菌试管中摇匀，并加入等量的无菌PBS摇匀。

2)取适量体积Percoll分层液(外周血和分层液的体积比为2∶1～3∶1)于试管中，将稀释的血液慢慢加到分层液液面上，形成清晰界面，置于水平离心机中离心，2000r/m，20分钟。

3)离心后，可见从离心管底部到液面分为四层，分别为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。用吸管***液面下，吸取单个核细胞层，置于另一个无菌试管中。

4)加入4倍体积的无菌PBS充分混匀，离心，1000r/m，10分钟；重复洗涤一次。

5)用PBS稀释，进行细胞计数，提取的单个核细胞保存于4℃备用。整个分离过程常温下进行。

2.DNA提取

DNA提取试剂盒提取PBMC DNA。(Qiagen)

1)将20μL QIAGEN蛋白酶加入200μL样品中，混匀。

2)将200μL缓冲液AL加入样品中，充分混匀，56℃孵育10分钟。

3)加入200μL无水乙醇，充分混匀，将混合物转移到吸附柱上，离心，8000r/m，1分钟，弃废液。

4)加入500μL缓冲液AW1，离心，8000r/m，1分钟，弃废液。

5)加入500mL缓冲液AW2，离心，8000r/m，1分钟，弃废液。

6)全速(14000r/m)空甩1分钟。

7)加入200μL缓冲液AE，室温静置1分钟，离心，8000r/m，1分钟。DNA保存于-20℃备用。

3.多重PCR扩增CDR3

将上一步得到的DNA作为模板DNA进行多重PCR扩增。按下表在200μL的PCR管中配制4个PCR反应体系，分别为LX500，LX800，ZXJ500，ZXJ800，4个平行实验。

PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳，电压为4V/cm，电泳时间为2h。然后切胶，取140-280bp片段，用QIAquick Gel纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于30μL洗脱缓冲液。结果如图4所示，有多个扩增条带，在正式建库之前做过摸索实验，Sanger测序结果表明140-280bp条带才是目的产物即重链CDR3编码序列，建库时回收140-280bp条带。

4.PCR产物末端修复

将上一步得到的DNA分别按下表在1.5mL的离心管中配制4个末端修复反应体系

然后将管子放到调至20℃的Thermomixer(Eppendorf)上反应30min，反应结束后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于32μL洗脱缓冲液。

5.DNA片段3’末端添加碱基A

将上一步所得的DNA分别按下表在200μL的PCR管中配制4个3’末端添加碱基A反应体系

然后将管子放到调至37℃的Thermomixer(Eppendrof)上反应30min。反应结束后，用MiniElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于10μL洗脱缓冲液。

6.连接接头

将上一步得到的DNA分别按下表在1.5mL的离心管中配制4个末端修复反应体系

其中接头序列为：

接头1：5’GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG

接头2：5’TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

然后将管子放到调至20℃的Thermomixer(Eppendorf)上反应15min。反应结束后，用2％琼脂糖凝胶电泳分离，电压为120V，电泳时间为120分钟。电泳结束后切下目的条带，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于30μL洗脱缓冲液。

7.PCR扩增目的产物，并加入测序引物

将上一步得到的DNA分别按以下体系配制4个PCR反应体系

P1公用引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

IndexN：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

其中碱基N为A、T、C、G四个碱基的任意组合作为区别标识。

PCR反应条件为：

反应结束后，用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化，最后将样品溶于50μL洗脱缓冲液。

8.文库检测

Agilent 2100 Bioanalyzer analysis system检测文库***片段大小及含量；Q-PCR精确定量文库的浓度。

9.测序与数据分析

文库检测合格后将按照双末端151个碱基的读长在Hiseq2000测序仪上进行序列分析。

测序所得的原始数据的基本分析过程主要包括以下步骤：首先进行数据处理，通过接头或PCR引物上的序列标签区分不同样本的文库数据，对测序所得的原始数据进行去污染、去接头和去低质量过滤；然后将reads与IMGT数据库的参考序列进行V、D、J基因比对，分析。

过滤之后的测序原始数据进行比对分析的结果，见表1，我们平均得到的总序列有41.46兆条，特异性的克隆平均有2.27兆条。

表1

文库LX500测序后获得的各种V-J基因配对的序列的数量示于表2中。

表2

图5是基于表2中数据，作出的4个平行文库的V-J基因配对分布图，图5显示了所有的V基因亚家族与J基因亚家族重排后相互配对和各种VJ配对CDR3的丰度，图右侧坐标是J基因全部亚家族的分类，图中横坐标是V基因的每一种亚家族分类，两坐标相交点是V-J基因配对产生的一种CDR3序列，左侧坐标则是每种V-J配对的丰度。从表2及图5可以得出结论，使用本发明提供的引物能够全面地富集人类免疫球蛋白重链CDR3的编码序列，扩增出来的产物能够区分免疫球蛋白重链的各个亚家族，并且通过上述本发明的方法能够确定各种重链CDR3编码序列的相对比例，从而可以进一步基于这些编码序列的相对比例或该比例的变化，确定个体的免疫状态。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (22)

1.一种用于扩增免疫球蛋白重链CDR3序列的引物组合物，其特征在于，包括：

第一引物组，所述第一引物组由至少一种V区引物组成，所述至少一种V区引物的每一种均包含与至少一个V基因片段互补的序列；以及

第二引物组，所述第二引物组由至少一种J区引物组成，所述至少一种J区引物的每一种均包含与至少一个J基因片段互补的序列，

其中，所述V区引物是正义链引物，所述J区引物是反义链引物，

所述免疫球蛋白为人类免疫球蛋白，

所述第一引物组的至少一种引物包含与多个V基因片段的保守区互补的序列，

所述V区引物的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：1-20所示，

所述第二引物组的至少一种包含与多个J基因片段的保守区互补的序列，

所述第二引物组由一种引物构成，该引物包含与多个J基因片段的保守区互补的序列，

所述J区引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。

2.一种富集免疫球蛋白重链CDR3编码序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供核酸样本，所述核酸样本中包含编码免疫球蛋白重链CDR3的核酸序列；以及

利用权利要求1所述的引物组合物，以所述核酸样本作为模板，进行PCR扩增，以便获得富集所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的扩增产物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括：

从人外周血分离外周血单个核细胞；以及

从所述外周血单个核细胞提取所述核酸样本。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过密度梯度离心分离所述外周血单个核细胞。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增为多重引物PCR扩增。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多重引物PCR扩增的退火温度为60摄氏度。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述扩增产物。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增产物的长度为140-280bp。

9.一种构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求2-8任一项所述的方法，获得富集所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的扩增产物；以及

针对所述扩增产物，构建DNA测序文库，所述DNA测序文库构成所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列的测序文库。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，针对所述扩增产物，构建DNA测序文库进一步包括：

对所述扩增产物进行末端修复，以便获得经过末端修复的扩增产物；

对所述经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的扩增产物；

将所述3’末端添加碱基A的扩增产物与接头相连，以便获得连接产物；

对所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第二扩增产物；以及

将所述第二扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述DNA测序文库。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，但缺少5’→3’外切酶活性。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，利用Klenow片段(3’-5’exo-)对所述经过末端修复的扩增产物进行3’端添加碱基A。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，将所述3’末端添加碱基A的扩增产物与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。

14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第二扩增产物。

15.一种确定免疫球蛋白重链CDR3编码序列信息的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求9-14任一项所述的方法，构建免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库；以及

对所述免疫球蛋白重链CDR3编码序列测序文库进行测序。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。

17.一种确定个体免疫状态的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

根据权利要求15或16所述的方法，对所述个体的免疫球蛋白重链CDR3编码序列进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；以及

基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，基于所述测序结果，确定所述个体的免疫状态进一步包括：

将所述测序结果与对照序列进行比对，以便确定所述个体中所包含的免疫球蛋白重链CDR3的亚家族类型，以及各亚家族类型的相对比例。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，在多个不同的时间点，从相同的个体提取样品，并分别根据权利要求15或16所述的方法，获得多个测序结果；以及

将所述多个测序结果进行比对，以便确定所述个体中免疫球蛋白重链CDR3亚家族类型以及相对比例的变化。

20.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中设置有权利要求1所述的引物组合物。

21.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测免疫球蛋白重链的V-J重排。

22.根据权利要求20所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测免疫球蛋白重链CDR3的编码序列。