CN103602722B - 可用于检测与精神***症相关的drd3基因甲基化程度的试剂盒及其应用 - Google Patents

可用于检测与精神***症相关的drd3基因甲基化程度的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是该试剂盒包括一对DRD3基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对精神***症及其亚型的检测，检测效率高，针对性强，同时，以DRD3基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为精神***症辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及一种个性化辅助诊断精神***症的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用。背景技术
精神***症（Schizophrenia）是重大的精神类疾病之一，其可引起思考方式及情绪反应的崩溃，具体表现有感觉、知觉、思维、情感以及意志行为等障碍。精神***症是一种遗传因素和环境心理因素共同作用引起的疾病。据了解，中国目前的精神***症患者数量高达1300万。全中国每100人中就有一名精神***症患者。当前，虽然精神病学研究主要致力于神经科学领域，但至今未找出合理的发病机制。因此，开展可行性的精神***症研究具有很大的前景。
多巴胺受体D3（DRD3）分布于中脑边缘区的伏隔核和Calleja岛，是由基因编码的一种G蛋白耦联受体，而DRD3基因位于3q13.3（第3号染色体长臂13区3带）。目前国内外的研究已经证明“精神***症的临床症状是由于中枢多巴胺活动过强造成的”。而且也有研究背景表明：基因的甲基化是在不改变DNA序列情况下，影响基因表达。基因甲基化和精神***症之间是否存在相关性有待进一步验证。目前，国内外还没有公开任何关于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用，该试剂盒通过各CpG点的差异显著性分析，可以方便快捷地在分子水平上实现对精神***症及精神***症亚型的检测，检测效率高，针对性强。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用，该试剂盒包括一对DRD3基因甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中
所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’- AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’（SEQ ID NO.1）；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’- GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’（SEQ ID NO.2）；
所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：
5’-Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3’（SEQ ID NO.3）。
一种可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒的应用，在外周血检测中，通过该试剂盒检测得到的DRD3基因CpG2点甲基化程度与正常组具有显著性差异，则判断男性患有未定型及偏执型精神***症，女性则患有未定型精神***症；通过该试剂盒检测得到的DRD3基因CpG3点甲基化程度与正常组具有显著性差异，则判断男性患有未定型及偏执型精神***症，女性则患有未定型精神***症；通过该试剂盒检测得到的DRD3基因CpG5点甲基化程度与正常组具有显著性差异，则判断女性组患有偏执型精神***症。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒及其应用，DRD3基因的高甲基化水平导致DRD3基因的低表达，从而影响DRD3在脑部通路转运的循环量减少，最后导致精神***症的发生和发展。因此DRD3基因甲基化水平在脑部与精神***症患病率呈负相关。以检测外周血DRD3基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒，可以方便快捷地在分子水平上实现对精神***症及精神***症亚型的检测，检测效率高，针对性强。该试剂盒可用于男女各人群精神***症亚型的辅助诊断、检测或筛查药物中，应用前景广泛。
附图说明
图1为DRD3基因被检测序列所在区域以及所检测的5个CpG点的关联分析结果；（例如CpG1与CpG2相关性为0.862，CpG3与CpG4相关性为0.193）
图2为甲基化水平检测结果示例：表示甲基化程度，如图示CpG1到CpG5的甲基化程度分别为13%，18%，13%，8%，8%。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
1、研究对象的收集
从某医院收集精神***症患者，总共354例，同时收集300名正常者作为对照组，经过年龄（最终选定样本的年龄均在30岁上下）、性别、知识背景以及DNA相关浓度这些数据的分析，筛选出匹配指数（年龄，学历，性别）较高的实验样本量： 30名精神***症患者（15名男性+15名女性），30名正常对照组（15名男性+15名女性）。
2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门致善生物科技有限公司，500ul体系）提取样本的全血基因组DNA，再通过核酸蛋白测定仪检测所得DNA的浓度，以供DRD3基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本研究采用重亚硫酸盐焦磷酸测序技术对DRD3基因启动子区的5个CpG位点（如图1）进行了DNA甲基化水平检测。此技术的基本原理：用试剂盒中的重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应（PCR）扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C）碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶（U），然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
（1）甲基化特异性上游引物（Forward primer）
5’- AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG -3’（SEQ ID NO.1），
（2）甲基化特异性下游引物（Reverse primer）
5’- GTTTAGGGTTTGTAGGG -3’（SEQ ID NO.2）；
（3）甲基化特异性测序引物（Sequencing primer）
5’-Biotin- ACCCAAAACCACCTCTAAACAT -3’ （SEQ ID NO.3）。
上述扩增的具体步骤为：
A. 采用QIAGEN EpiTect® 亚硫酸氢盐处理试剂盒（EpiTech Bisulfite Kits; Qiagen; #59104）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化；
B．取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Pyromark PCR试剂盒（Pyromark PCR Kit; Qiagen; #978703），并加入上述一对DRD3基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 15min的变性；接着95℃ 15s，Tm 30s，72℃ 20s，共50个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 5min（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）；
C. 焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen; #979009）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen; #979006），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen; #979008）和120ml的变性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen; #979007）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen; #979010）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应；
D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802）对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2）。
4、数据分析
本次研究采用SPSS 16.0对数据进行整理分析。我们发现：被检测的5个CpG位点中有4个位点（CpG1、CpG2、CpG4和CpG5）之间存在相关性（r > 0.6,且p < 0.001，见图1），因此我们用DRD3各CpG位点的甲基化程度，分别作了性别与亚型之间的比较。
结果（见表1，表2）发现： 在分亚型与性别及其CpG位点间的甲基化水平比较中，CpG2，CpG3在男性中与未定型及偏执型精神***症都存在关联（p < 0.05，但男性中偏执型与未定型差异不显著，无法进一步进行区分）；而CpG2在女性中与未定型精神***症患者存在关联（p = 0.004 < 0.05），CpG3在女性中与未定型精神***症也存在关联( p = 0.040 < 0.05)，而CpG5在女性中却与偏执型精神***症存在关联（p = 0.024 < 0.05）。
表1 男性亚型中CpG位点的甲基化情况
分组 未定型 偏执型 对照组 p1（未定型与对照组） p2（偏执型与对照组） p3（偏执型与未定型）
CpG1甲基化程度（%） 15.27±3.61 16.31±4.11 10.33±10.89 0.223 0.083 0.523
CpG2甲基化程度（%） 15.81±3.60 16.23±3.96 5.09±4.09 2.29×10-6 8.44×10-7 0.794
CpG3甲基化程度（%） 14.18±4.05 15.46±3.93 5.91±5.92 < 0.01 1.03×10-4 0.441
CpG4甲基化程度（%） 8.91±2.59 8.46±2.85 10.33±9.35 0.668 0.575 0.693
CpG5甲基化程度（%） 5.73±1.62 6.62±2.18 10.46±9.68 0.723 0.698 0.277
表2 女性各亚型中CpG位点甲基化情况
分组 未定型（14） 偏执型（15） 对照组（15） p1（未定型与对照组） p2（偏执型与对照组）
CpG1甲基化程度（%） 14.23±4.38 16.36±6.59 15.67±3.46 0.341 0.754
CpG2甲基化程度（%） 12.85±4.04 18.09±6.17 17.07±3.13 0.004 0.622
CpG3甲基化程度（%） 13.00±4.02 16.18±4.17 16.40±4.26 0.040 0.897
CpG4甲基化程度（%） 8.31±3.84 11.73±4.29 10.00±2.78 0.189 0.224
CpG5甲基化程度（%） 7.54±3.45 9.82±4.38 6.14±2.21 0.220 0.024
和其他技术相比，本发明设计的这种试剂盒可以从DRD3基因各位点甲基化程度的指标上，精确地对待测的样品进行精神***症的筛选，相比较一般采用的测量表，在定性上更具有说服力。同时，通过测定比较患者各CpG位点甲基化水平与正常值的关联强度，可以辅助判断是否患精神***症及其分型。更加有效、简便地对患者进行动态检测，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (1)

1.一种可用于检测与精神***症相关的DRD3基因甲基化程度的试剂盒,其特征在于：该试剂盒包括一对DRD3基因启动子区甲基化特异性扩增引物及甲基化特异性测序引物，其中所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-AGGGAGTTAAGAGTTTAGATATAAGG-3’；
所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-GTTTAGGGTTTGTAGGG-3’；
所述的甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示：
5’-Biotin-ACCCAAAACCACCTCTAAACAT-3’。
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