CN103966340B - 一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用，特点是所述的试剂盒包括一对多巴胺D4受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，其中上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，甲基化特异性测序引物如SEQ ID NO.3所示，优点是该诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以DRD4基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为阿尔茨海默病辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。

Description

一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病的辅助诊断技术领域，特别涉及一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用，尤其指一种能用于检测与阿尔茨海默病相关的多巴胺D4受体基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种***性神经退行性疾病，其临床表现为高级认知功能低下，主要特征包括脑细胞内神经纤维缠结及细胞外老年斑。AD患者需要终生护理，因此给社会和家庭带来极大的经济负担。AD是一种由遗传因素和环境因素共同作用而引起的复杂性疾病，寻找AD相关基因进而阐明痴呆症发病的遗传机制已经成为目前研究的热点。虽然有越来越多的医学研究机构重视并开展AD的病因研究，且研究多集中于相关候选基因的单核苷酸多态性与AD的关联性上，但其发病机理仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了AD预防及治疗水平的提高。
多巴胺D4受体基因（Dopamine receptor D4）编码多巴胺神经介质传递通路***中的一种重要的受体蛋白-多巴胺D4受体，与认知和情感行为密切相关。
目前，国内外还没有公开任何关于用于检测与阿尔茨海默病相关的多巴胺D4受体基因启动子区甲基化程度的试剂盒相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供检测效率高，针对性强的一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用，其中多巴胺D4受体基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对多巴胺D4受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：
5′-biotin-GGGAGGTTTTGTTAGATATTAGGT-3′；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5′-CCACCCTAAACCCAATATTTACTCATCTTA-3′；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5′-ACCAAACCAAACCCT-3′。
一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于阿尔茨海默病辅助诊断、检测或筛查药物。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒首次公开了用于检测与阿尔茨海默病相关的多巴胺D4受体基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，多巴胺D4受体基因启动子区域的高甲基化水平导致DRD4基因的低表达，从而影响阿尔茨海默病的发生和发展。因此，多巴胺D4受体基因启动子区甲基化水平与阿尔茨海默病的患病率呈正相关，以检测DRD4基因启动子区甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对阿尔茨海默病的检测，检测效率高，针对性强，同时，以DRD4基因启动子区甲基化为靶点的药物有望成为AD辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
附图说明
图1为被检测序列所在区域（具***置为chr11:637304 - 640705），以及所检测的4个CpG点之间的关联性分析结果图（例如CpG1与CpG2的相关系数为0.685，CpG2与CpG3的相关系数为0.718）；
图2为甲基化水平检测结果示例图（图中所示百分数为对应CpG位点的甲基化程度，如图示有CpG1到CpG4的甲基化程度分别为19%，15%，18%，13%）。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，所述的检测试剂盒内包括一对多巴胺D4受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物的核苷酸序列：
5′-biotin-GGGAGGTTTTGTTAGATATTAGGT-3′；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5′-CCACCCTAAACCCAATATTTACTCATCTTA-3′；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5′-ACCAAACCAAACCCT-3′。
一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒的应用，所述的检测试剂盒能用于阿尔茨海默病辅助诊断、检测或筛查药物。
1、研究对象的收集
从宁波市某三甲医院收集阿尔茨海默病患者，痴呆诊断标准依据世界卫生组织的国际疾病分类第10版 （ICD-10），阿尔茨海默病（AD）诊断标准采用NINCDS-ADRDA标准。排除血管性痴呆，路易体痴呆等疾病后，最后确定阿尔茨海默病人46例作为病例组（80.67±9.20岁），同时收集年龄匹配且无痴呆家族史的61名正常者作为对照组（79.54±7.87岁）。对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测载脂蛋白、同型半胱氨酸等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，以备用于标本统一提取基因组DNA。
2、基因组DNA的提取
应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fisher Scientific）检测所得DNA的浓度，以供DRD4基因启动子区DNA甲基化水平的检测。
3、DNA甲基化水平测定
本研究采用焦磷酸测序技术对DRD4基因启动子区的4个CpG位点（如图1）进行了DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶链反应（PCR）扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C）碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转变成了尿嘧啶（U），然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计，用于实验的PCR扩增引物和测序引物如下：
（1）甲基化特异性上游引物（Forward primer）
5′-biotin-GGGAGGTTTTGTTAGATATTAGGT-3′（SEQ ID NO.1）；
（2）甲基化特异性下游引物（Reverse primer）
5′-CCACCCTAAACCCAATATTTACTCATCTTA-3′（SEQ ID NO.2）；
（3）甲基化特异性测序引物（Sequencing primer）
5′-ACCAAACCAAACCCT-3′（SEQ ID NO.3）。
具体实验步骤：
A. 采用EZ DNA甲基化试剂盒-Gold（EZ DNA Methylation-GoldTM Kit; ZYMO RESEARCH）对样本DNA进行亚硫酸氢盐转化。
B．取步骤A中转化过的DNA样本20ng加入到Zymo TaqTM PreMix酶（Zymo TaqTM PreMix, ZYMO RESEARCH），并加入上述一对多巴胺D4受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物，进行PCR扩增，扩增条件：首先95℃ 10min的变性；接着95℃ 30s，Tm 40s，72℃ 50s，共45个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 7min。（注：Tm在实验中根据跑PCR梯度温度确定）
C. 焦磷酸测序的前期准备：在PSQ96板中预先加入45μl含有0.3μM上述甲基化特异性测序引物的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer; Qiagen）；将需要使用的混匀的琼脂糖珠总量（每样本3μl）转移到一个Eppendorf管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer; Qiagen），使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；将以上混合物加入PCR产物（50μl反应体积）中，每样本50μl；将PCR产物在常温下混匀10分钟，使得磁珠与生物素结合；在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯水、70％乙醇、洗涤缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen;）和120ml的变性缓冲液（PyroMark Denaturation Solution; Qiagen）；打开真空预备工作站的泵，将真空准备工具在高纯水中清洗30秒；然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen）移到PCR板中，抓取琼脂糖珠（在磁珠与PCR产物结合后三分钟内完成此操作）；拿起PCR板，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上；将真空准备工具放入70％乙醇中5秒；然后移到变性缓冲液中5秒；再移到洗涤缓冲液中清洗5－10秒；关掉泵；将真空准备工具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠（测序引物也可最后加入）；使用高纯水清洗真空准备工具；将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80℃ 2分钟，再冷却到室温，即可进行焦磷酸测序反应。
D.焦磷酸测序：在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒（Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen）对步骤C中的PSQ96板中的样本进行测序，然后应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2）。
4、数据分析
本次研究采用SPSS 16.0对数据进行整理分析，我们发现：被检测的4个CpG位点间存在显著关联（相关系数r > 0.442，p < 0.001，有统计学意义，见图1）（注：p < 0.05时表示有统计学意义，下同），所以我们把CpG1-CpG4求平均值后参与到后续的分析中，发现病例组和对照组之间的DNA甲基化水平存在显著差异（p = 4.69E-05，见表 1）。因此，我们分性别比较了病例组和对照组间DRD4基因启动子区甲基化水平的差异，结果（见表 2）发现在男性中，各个CpG位点均与阿尔茨海默病存在关联（CpG1：p = 0.013，CpG2：p = 0.012，CpG3：p = 1.51E-04，CpG4：p = 2.11E-05），而在女性中，仅发现CpG1与阿尔茨海默病相关（p = 0.009）。
本发明可用于检测与阿尔茨海默病相关的多巴胺D4受体基因启动子区甲基化程度的试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对DRD4基因启动子区甲基化水平进行检测，能够快速可靠地为阿尔茨海默病的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
表 1 病例组与对照组间的比较 （n=107）
Characteristics Case （n = 46） Mean ± SD Control （n = 61） Mean ± SD p value
Age （years） 80.67±9.20 79.54±7.87 0.495
TP （g/L） 68.79±6.91 65.48±9.45 0.099
ALB （g/L） 38.32±3.83 36.86±3.61 0.090
GLB （g/L） 30.46±5.32 29.55±4.58 0.418
A/G 1.29±0.22 1.28±0.20 0.768
ALT （U/L） 13.87±10.68 18.20±13.46 0.193a
ALP （U/L） 78.00±24.30 96.82±63.34 0.113a
TBA （μmol/L） 6.91±3.84 6.07±5.86 0.503
AST （U/L） 20.52±7.22 23.58±11.70 0.258a
Glu （mmol/L） 5.23±1.58 5.53±2.71 0.444b
TG （mmol/L） 1.35±0.76 1.42±0.98 0.896a
TC （mmol/L） 4.48±1.04 4.28±1.22 0.378
HDL-C （mmol/L） 1.12±0.27 1.04±0.30 0.118
ApoA （g/L） 1.06±0.21 0.94±0.18 0.011
ApoB （g/L） 0.66±0.19 0.73±0.25 0.194
Lp（a） （g/L） 184.86±233.63 34.86±27.32 1.60E-04a
ApoE （mg/L） 37.73±17.44 36.69±10.37 0.800
UREA （mmol/L） 7.77±10.00 6.45±3.45 0.804b
CRE （μmol/L） 82.73±47.25 78.52±30.04 0.626
UA （μmol/L） 309.93±106.30 308.88±112.75 0.967
Hcy （μmol/L） 19.76±10.82 17.67±20.84 0.046a
CRP （mg/L） 6.20±11.72 15.00±26.21 0.016a
Mean DRD4 methylation （%） 14.67±4.12 11.44±3.72 4.69E-05
表 2分层后病例组与对照组间的比较 （n=108）
Characteristics Case Mean ± SD Control Mean ± SD p value
All      
CpG1 （%） 16.50±5.14 13.13±4.67 0.001# 
CpG2 （%） 12.26±4.84 10.13±3.92 0.013# 
CpG3 （%） 14.98±5.27 11.59±4.59 0.001# 
CpG4 （%） 14.96±4.22 10.92±4.90 1.96E-05#
Mean DRD4 methylation （%） 14.67±4.12 11.44±3.72 4.69E-05#
Male      
CpG1 （%） 16.74±4.92 13.68±4.55 0.013#
CpG2 （%） 12.87±3.94 10.39±3.62 0.012#
CpG3 （%） 15.61±4.35 11.16±4.27 1.51E-04#
CpG4 （%） 15.65±4.60 10.36±4.42 2.11E-05#
Mean DRD4 methylation （%） 15.22±3.72 11.40±3.47 9.17E-05#
Female      
CpG1 （%） 16.26±5.45 11.71±4.82 0.009# 
CpG2 （%） 11.65±5.63 9.47±4.67 0.201
CpG3 （%） 14.35±6.10 12.71±5.31 0.380
CpG4 （%） 14.26±3.78 12.35±5.88 0.220
Mean DRD4 methylation （%） 14.13±4.51 11.56±4.40 0.080
注：表1和表2中，n为样本数量；表格数据中，p值小于0.05，具有统计学意义；加#表示多重检测后p值依旧具有统计学意义；加a表示进行过对数转换；加b表示运用非参数秩和检验。
本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>  宁波大学
<120>  一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒及其应用
<130> 
<160>  3    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  24
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
biotin-gggaggttttgttagatattaggt                          
<210>  2
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
ccaccctaaacccaatatttactcatctta
<210>  3
<211>  15
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
accaaaccaaaccct

Claims (1)

1.一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的检测试剂盒，其特征是：所述的检测试剂盒内包括一对多巴胺D4受体基因启动子区甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物：
甲基化特异性上游引物为：
5′-biotin-GGGAGGTTTTGTTAGATATTAGGT-3′；
甲基化特异性下游引物的核苷酸序列：
5′-CCACCCTAAACCCAATATTTACTCATCTTA-3′；
甲基化特异性测序引物的核苷酸序列：
5′-ACCAAACCAAACCCT-3′。
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