CN103601779B - 7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷的合成方法；所述方法包括将下式(V)化合物在碱性条件下去甲基得到下式(I)化合物，即所述7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷；(I)，(V)，其中R₂为I、Br或Cl。本发明合成的7-去氮-7-碘-2’-脱氧鸟嘌呤核苷是在DNA测序、标记、延伸等生物学领域广泛使用的基本原料，目前其销售价格很高，且合成方法复杂；而本发明提供的合成方法所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

Description

7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷的合成方法

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷(简称鸟苷dG-X)的合成方法。

背景技术

DNA测序技术是现代生命科学和医学研究的重要手段之一。DNA测序从1977年的Sanger测序技术(一代测序)开始，在三十几年的时间里，飞速发展。测序的通量大幅提高而成本急剧下降，有人甚至认为其发展的速度打破了半导体工业界已有的摩尔定律预算的速度。二代高通量平行测序技术的出现是测序技术飞速发展的集中体现。采用第一代测序技术，人类基因组计划(HGP)耗资30亿美元完成人整个基因组(30亿个碱基)的序列测定。而目前的二代测序的最新技术仅需5000美元左右就能完成人整个基因组测序。

虽然如此，二代测序的成本和技术方面依然存在不足，不能满足基础科学和临床医学对测序的要求。单分子测序技术(三代测序技术)应运而生。三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，未能大规模应用。

目前市场上的高通量测序平台被少数几家国外产品所垄断，尤其令人忧虑的是，国外公司凭借对测序试剂的控制，几乎完全控制了国内的测序市场，即便是测序硬件上我们能有所突破，在测序试剂等配套产品上我们还将受制于人。因此，自主研发可适用于二代测序甚至是三代测序平台的测序试剂，将对改变目前的市场格局、建立我国自主的测序平台具有战略性的意义。为此，国家863、973和“十二五”生物技术发展规划都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展的对象。

用于测序的可逆终端一股都选取U，C，A，G四个碱基的核苷酸.我们在实际工作中发现用于合成四个不同碱基核苷酸的起始原料，即四个不同碱基(U，C，A，G)的含取代基核苷价格昂贵，尤其是7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷(简称鸟苷dG-X)不但非常昂贵而且合成方法很复杂，致使很多研究工作者尽量避免使用鸟苷(J.Org.Chem.2011，76，3457-3462)，这样使原本完美的研究工作变得有些遗憾。如果是在必须四个碱基的情况下，不得不花重金购买。本发明用一种简单方便的方法合成得到了该类化合物且合成方法简单，反应条件温和，反应过程可控，适合大规模生产。并且用我们自己合成的鸟苷成功地合成了7-去氮-7-丙炔胺-2’-脱氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷(简称鸟苷dG-X)的合成方法；该方法合成原料简单、便宜，反应条件温和，操作简单，可适合大规模生产。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括将下式(V)化合物在碱性条件下去甲基得到下式(I)化合物，即所述7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷；

(I)，

(V)，其中R₂为I、Br或Cl。

优选的，所述式(V)化合物通过在碱性条件下将式(IV)化合物去保护基制备而得：

(IV)，其中，R为保护羟基或氨基的保护基。

优选的，所述保护基为新戊酰基或异丁酰基。

优选的，所述式(IV)化合物通过在式(III)化合物的嘌呤碱基的7位接上卤素制备而得：

(III)。可采用用NIS或其它碘化试剂在嘌呤碱基的7位接上碘；也可采用NBS或NCS等试剂在嘌呤碱基的7位接上溴或者氯。

优选的，所述式(III)化合物通过在碱性条件下用保护基保护式(II)化合物的两个羟基和一个氨基制备而得：

(II)。该式(II)化合物名称为7-Deaza-2’-deoxy-6-methoxyguanosine，CAS号：86392-74-7，分子式：C₁₂H₁₆N₄0₄，分子量：280.29。

本发明还涉及一种7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，所述方法包括由前述的方法合成得到的7-去氮-2’-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷进一步合成所述7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸。

优选的，包括如下步骤：

A、化合物dG(AP₃)的合成：在CuI、Pd(PPh₃)₄(四(三苯基膦)钯)和TEA(三乙胺)存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和式(I)化合物反应，得化合物dG(AP3)

B、化合物dGTP(AP₃)的合成：化合物dG(AP₃)与三正丁胺焦磷酸盐(E-4)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(E-3)在三乙胺和碘存在下反应，反应产物去保护，得化合物dGTP(AP₃)，即所述7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸。

优选的，步骤A中，所述式(I)化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1：(2～3)：0.072：0.025：(1.5～2)。

优选的，步骤B中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮和dG(AP₃)的摩尔比为2：2：1。

本发明还涉及一种前述的合成方法制得的7-去氮-7-卤素取代鸟嘌呤核苷在合成7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸中的用途。

本发明具有如下有益效果：本发明合成了7-去氮-7-卤素-2’-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-X)；该化合物是在DNA测序、标记、延伸等生物学领域广泛使用的基本原料，目前其销售价格很高，且合成方法复杂，难以控制。本发明的合成方法所需原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-I)的合成方法1的合成过程示意图。

图2为7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-I)的合成方法2的合成过程示意图。

图3为7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷(简称G-I)合成过程示意图。

图4为7-去氮-7-溴／氯-2’-去氧鸟嘌呤核苷(简称dG-G)合成过程示意图。

图5为7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-I在合成dGTP(AP₃)中的用途。

图6为7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成GTP(AP₃)中的用途。

图7为7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-I的1H-NMR。

图8为7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的¹H-NMR。

图9为7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的³¹P-NMR。

图10为7-去氮-7-丙炔胺-2’-去氧鸟嘌呤核苷酸dGTP(AP₃)的HRMS谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明所用的原料、试剂均为市售AR、CP级。本发明所得中间产物及最终产物采用NMR等进行表征；

实施例1、7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-I的合成方法之一

本实施例中dG-I的合成示意图如图1所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将化合物dG₁-A(0.20g；0.714mmol)溶解于无水吡啶中，0℃下缓慢滴加新戊酰氯(0.75mL；7.14mmol)，0℃下搅拌1h后，加入2ml甲醇，搅拌10min，旋出溶剂，加入乙酸乙酯(200ml)和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)萃取，分离有机相，依次加入饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]，得0.39g白色固体即化合物dG₁-B，产率92％。¹HNMR(400MHz，CD₃OD)δ7.28(d，J=3.7Hz，1H)，6.66(dd，J=5.9，8.6Hz，1H)，6.51(d，J=3.7Hz，1H)，5.41(m，1H)，4.33-4.36(m，2H)，4.22(m，1H)，4.08(s，3H)，2.83-2.96(m，2H)，2.54-2.70(m，2H)，2.48-2.54(ddd，J=2.0，5.9，14.2Hz，1H)，1.15-1.23(m，27H).

步骤二、

将化合物dG1-B(0.42g；0.84mmol)溶于无水DMF中，剧烈搅拌下，加入4-碘代丁二酰亚胺(220mg；0.9mmol)，室温搅拌22h，旋出溶剂，加入100ml***和50ml碳酸氢钠溶液萃取，分离出有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]，得0.5g白色固体即化合物dG₁-C，产率91％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.43(s，1H)，6.63(dd，J=6.0，8.2Hz，1H)，5.41(m，1H)，4.33-4.36(m，2H)，4.23(m，1H)，4.09(s，3H)，2.78-2.94(m，2H)，2.57-2.70(m，2H)，2.50-2.57(ddd，J=2.3，6.0，14.2Hz，1H)，1.17-1.24(m，27H).

步骤三、

将化合物dG₁-C溶解于0.5M的甲醇／甲醇钠(10ml)中，65℃下搅拌12h，再加入10ml饱和碳酸氢钠溶液，继续搅拌10min，旋出甲醇，加入50ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物硅胶柱层析[V(甲醇)：V(二氯甲烷)=1：10]，得0.24g白色固体即化合物dG₁-D，产率74％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.17(s，1H)，6.36(dd，J=6.0，8.4Hz，1H)，4.47(m，1H)，3.99(s，3H)，3.96(m，1H)，3.77(dd，J=3.4，12.0Hz，1H)，3.70(dd，J=3.7，12.0Hz，1H)，2.55-2.64(ddd，J=6.0，8.4，13.4Hz，1H)，2.20-2.26(ddd，J=2.4，5.9，13.4Hz，1H)。

步骤四、

将化合物dG₁-D置于氢氧化钠溶液(2N)中回流4h，冷却后加入2N盐酸溶液，调节溶液pH为6。浓缩，加入100ml二氯甲烷与甲醇混合液(V：V=1：1)洗涤，合并有机相，浓缩得255mg白色固体即dG-I，产率98％。dG-I的¹H-NMR如图7所示，¹HNMR(400MHz，MeOD)δ7.09(s，1H)，6.35(dd，J=6.0Hz，J=8.0Hz，1H)，4.42-4.44(m，1H)，3.89-3.92(m，1H)，3.65-3.74(m，2H)，2.43-2.50(m，1H)，2.19-2.24(m，1H).注：本方法同样适合7-去氮-7-溴和氯-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-Br／Cl的合成，不同之处在于第二步反应时，用NBS或BCS代替NIS即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例2、7-去氮-7-碘-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-I的合成方法之二

本实施例中dG-I的合成示意图如图2所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将Sm-1(27.3g，138mmol)加入到70mL水中后，再加入3.0mL浓盐酸于90℃下搅拌0.5h，冷却至室温后加入醋酸钠(13.6g，165mmol)搅拌，将Sm-2(20.0g，159mmol)和醋酸钠(7.0g，85.4mmol)溶于150mL水中并加入到反应中，于80℃下搅拌2h后移至零摄氏度下搅拌1.5h，过滤，并用冰水及丙酮洗涤，抽干得15.4g，产率74％。¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ=10.94(s，1H)，10.35(s，1H)，6.58(dd，J=3.4，2.2Hz，1H)，6.15(dd，J=3.4，2.1Hz，1H)，6.09(s，2H).

步骤二、

将G005(10.0g，66.6mmol)加入到100mLPOCl₃中，回流2h，冷却至室温后旋除溶剂后，将120mL冰水加入到反应中，并将固体过滤，将滤液用氨水调节至PH=2，并将沉淀物至于冰浴中2h后过滤，过滤的固体第一次用10mL冰水洗涤，第二次用30mL冰***洗涤，抽干后得8.7g，产率78％。¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ=11.43(s，1H，NH)，7.07(d，1H，NHCHCH)，6.46(s，2H，NH2)，6.22(d，1H，CHNH)。

步骤三、

将G006(8.5g，50.42mmol)加入到120mL无水吡啶中，再加入新戊酰氯(21.68mL，176.20mmol)并于室温下搅拌2h后旋除溶剂，溶于1.7L二氯甲烷，有机相用0.1M盐酸溶液(2*350mL)洗涤后，旋除溶剂后柱层析DCM：MeOH10：1得8.15g，产率64％。¹HNMR(400MHz，[D6]-DMSO)：δ=9.98(s，1H，NHC(0))，7.50(d，J=3.6Hz，1H，NHCHCH)，6.49(d，J=3.6Hz，1H，CHNH)，1.20(s，9H，C(CH3)3)。

步骤四、

将G007(3.10g，12.27mmol)溶于60mLTHF中，氮气保护，锡箔纸包裹后，加入NIS(3.04g，13.51mmol)于室温下搅拌1h，加入500mLDCM，用200mL水洗涤，旋除溶剂后，柱层析DCM：Me0H99：1得3.76g，产率81％。¹HNMR(400MHz，DMSO)：δ=12.65(s，1H，CHNH)，10.06(s，1H，NHC(0))，7.73(d，J=2.4Hz，1H，CH)，1.19(s，9H，C(CH₃)₃)。

步骤五、

将G008(1.5g，4.0mmol)和硫酸铵(15mg，0.11mmol)在六甲基二硅氮烷(15mL，72.76mmol)中回流20h于氩气的保护中，旋除溶剂后加入40mL二氯乙烷，加入Sm-1(2.304，6.0mmol)和TMSOTf(1.25mL，6.47mmol)并于室温下搅拌至澄清后于50摄氏度下搅拌24h，加入60mLDCM，并用30mL饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，旋除有机相后，柱层析得1.48g，产率45％。¹HNMR(400MHz，D6-DMSO)：δ=10.29(s，1H)，8.02(s，1H，)，7.90-7.41(m，10H)，6.35(s，1H)，6.26(d，J=0.8Hz，1H)，4.27(s，1H)，3.75(s，1H)，3.49(t，J=0.8Hz，1H)，2.35-2.28(m，1H)，2.09-2.01(m，1H)，1.15(s，9H).

步骤六、

将G009(1.056g，1.5mmol)加入到0.5MMeONa／MeOH(20.0mL)中，回流3h后用冰醋酸中和至中性后柱层析DCM：MeOH5：1得化合物dG1-D490mg，产率80％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.17(s，1H)，6.36(dd，J=6.0，8.4Hz，1H)，4.47(m，1H)，3.99(s，3H)，3.96(m，1H)，3.77(dd，J=3.4，12.0Hz，1H)，3.70(dd，J=3.7，12.0Hz，1H)，2.55-2.64(ddd，J=6.0，8.4，13.4Hz，1H)，2.20-2.26(ddd，J=2.4，5.9，13.4Hz，1H)。

步骤七、

将化合物dG₁-D置于氢氧化钠溶液(2N)中回流4h，冷却后加入2N盐酸溶液，调节溶液pH为6。浓缩，加入100ml二氯甲烷与甲醇混合液(V：V=1：1)洗涤，合并有机相，浓缩得255mg白色固体即dG-I，产率98％。¹HNMR(400MHz，MeOD)δ7.09(s，1H)，6.35(dd，J=6.0Hz，J=8.0Hz，1H)，4.42-4.44(m，1H)，3.89-3.92(m，1H)，3.65-3.74(m，2H)，2.43-2.50(m，1H)，2.19-2.24(m，1H).注：本方法同样适合7-去氮-7-溴和氯-2’-去氧鸟嘌呤核苷dG-Br／Cl的合成，不同之处在于第四步反应时，用NBS或BCS代替NIS即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例3、7-去氮-7-碘-鸟嘌呤核苷G-I的合成方法

本实施例中G-I的合成示意图如图3所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将G008(1.5g，4.0mmol)和硫酸铵(15mg，0.11mmo1)在六甲基二硅氮烷(15mL，72.76mmol)中回流20h于氩气的保护中，旋除溶剂后加入40mL二氯乙烷，加入G-I-0(6.0mmol)和TMSOTf(1.25mL，6.47mmol)并于室温下搅拌至澄清后于50摄氏度下搅拌24h，加入60mLDCM，并用30mL饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤，旋除有机相后，柱层析得G-I-B化合物1.6g。1HNMR(600MHz，DMSO)：δ=10.29(s，1H)，8.02(s，1H)，7.91-7.85(m，6H)，7.64-7.58(m，3H)，7.46-7.39(m，6H)，6.48(d，J=3.9Hz，1H)，6.41(t，J=6.1，6.1Hz，1H)，6.32(dd，J=6.0，4.0Hz，1H)，4.82(dd，J=10.7，5.0Hz，1H)，4.75(dd，J=11.8，4.4Hz，1H)，4.63(dd，J=11.8，5.7Hz，1H)，1.15(s，9H)。

步骤二、

将G-I-B(1.056g，1.5mmol)加入到0.5MMeONa／MeOH(20.0mL)中，回流3h后用冰醋酸中和至中性后柱层析DCM：MeOH5：1得G-I-A化合物490mg，产率80％。1H-NMR(DMSO-d6，250MHz)：δ3.49-3.57(m，2H，H-C(5’))，3.80-3.82(m，1H，H-C(4’))，3.93(s，3H，OMe)，4.01-4.03(m，1H，H-C(3’))，4.23-4.28(m，1H，H-C(2’))，5.01(t，J=5.5Hz，1H，0H-C(5’))，5.05(d，J=4.4Hz，1H，0H-C(3’))，5.25(d，J=6.2Hz，1H，0H-C(2’))，5.94(d，J=6.5Hz，1H，H-C(1’))，6.38(s，2H，NH2)，7.31(s，1H，H-C(6)).

步骤三、

将化合物G-I-A置于氢氧化钠溶液(2N)中回流4h，冷却后加入2N盐酸溶液，调节溶液pH为6。浓缩，加入100ml二氯甲烷与甲醇混合液(V：V=1：1)洗涤，合并有机相，浓缩得255mg白色固体即G-I，产率98％。1HNMR(600MHz，DMSO)：4.99(brs，1H，5’-OH)，5.04(d，1H，J=3.2，3’-OH)，5.26(d，1H，J=5.9，2’-OH)，6.33(s，2H，NH2)，7.14(s，1H，6-H)，10.48(s，1H，NH).注：本方法同样适合7-去氮-7-溴和氯鸟嘌呤核苷G-Br／Cl的合成，不同之处在于第一步反应所用的原料G008的鸟嘌呤碱基的7位是溴或氯即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例4、7-去氮-7-溴/氯-2-脱氧鸟嘌呤核苷dG-I的合成方法之一

本实施例中dG-G的合成示意图如图4所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

将化合物dG1-A(0.20g；0.714mmol)溶解于无水吡啶中，0℃下缓慢滴加新戊酰氯(0.75mL；7.14mmol)，0℃下搅拌1h后，加入2ml甲醇，搅拌10min，旋出溶剂，加入乙酸乙酯(200ml)和饱和碳酸氢钠溶液(50ml)萃取，分离有机相，依次加入饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]，得0.39g白色固体即化合物dG₁-B，产率92％。¹HNMR(400MHz，CD₃OD)δ7.28(d，J=3.7Hz，1H)，6.66(dd，J=5.9，8.6Hz，1H)，6.51(d，J=3.7Hz，1H)，5.41(m，1H)，4.33-4.36(m，2H)，4.22(m，1H)，4.08(s，3H)，2.83-2.96(m，2H)，2.54-2.70(m，2H)，2.48-2.54(ddd，J=2.0，5.9，14.2Hz，1H)，1.15-1.23(m，27H).

步骤二、

将化合物dG₁-B(0.42g；0.84mmol)溶于无水DMF中，剧烈搅拌下，加入4-溴代丁二酰亚胺或者4-氯代丁二酰亚胺(220mg；0.9mmol)，室温搅拌22h，旋出溶剂，加入100ml***和50ml碳酸氢钠溶液萃取，分离出有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，旋出溶剂，硅胶柱层析[V(乙酸乙酯)：V(石油醚)=1：1]，得0.5g白色固体即化合物dG₁-E，产率91％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.43(s，1H)，6.63(dd，J=6.0，8.2Hz，1H)，5.41(m，1H)，4.33-4.36(m，2H)，4.23(m，1H)，4.09(s，3H)，2.78-2.94(m，2H)，2.57-2.70(m，2H)，2.50-2.57(ddd，J=2.3，6.0，14.2Hz，1H)，1.17-1.24(m，27H).

步骤三、

将化合物dG1-E溶解于0.5M的甲醇／甲醇钠(10ml)中，65℃下搅拌12h，再加入10ml饱和碳酸氢钠溶液，继续搅拌10min，旋出甲醇，加入50ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，残余物硅胶柱层析[V(甲醇)：V(二氯甲烷)=1：10]，得0.24g白色固体即化合物dG₁-F，产率74％。¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.17(s，1H)，6.36(dd，J=6.0，8.4Hz，1H)，4.47(m，1H)，3.99(s，3H)，3.96(m，1H)，3.77(dd，J=3.4，12.0Hz，1H)，3.70(dd，J=3.7，12.0Hz，1H)，2.55-2.64(ddd，J=6.0，8.4，13.4Hz，1H)，2.20-2.26(ddd，J=2.4，5.9，13.4Hz，1H)。

步骤四、

将化合物dG₁-F置于氢氧化钠溶液(2N)中回流4h，冷却后加入2N盐酸溶液，调节溶液pH为6。浓缩，加入100ml二氯甲烷与甲醇混合液(V：V=1：1)洗涤，合并有机相，浓缩得255mg白色固体即dG₁-G，产率98％。¹HNMR(400MHz，MeOD)δ7.09(s，1H)，6.35(dd，J=6.0Hz，J=8.0Hz，1H)，4.42-4.44(m，1H)，3.89-3.92(m，1H)，3.65-3.74(m，2H)，2.43-2.50(m，1H)，2.19-2.24(m，1H).

实施例5、7-去氮-7-碘-2’-脱氧鸟嘌呤核苷dG-I在合成dGTP(AP ₃ )中的用途

本实施例中dGTP(AP3)的合成示意图如图5所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

步骤一、

向一单口瓶中加入化合物dG-I(0.25g，0.4mmol)，再称取CuI(22mg；1mmol)和Pd(PPh3)4(48mg；0.04mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA(0.088g；0.8mmol)和三氟乙酰丙炔胺(0.2g；1.2mmol)，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(乙酸乙酯)：V(正己烷)=1：3]，得0.1g白色固体即dG(AP₃)，产率39％。¹HNMR(400MHz，MeOD)δ7.25(s，1H)，6.38-6.42(m，1H)，4.47-4.50(m，1H)，4.33(s，2H)，3.96(dd，J=3.6Hz，J=6.8Hz，1H)，3.70-3.80(m，2H)，2.48-2.55(m，1H)，2.26-2.32(m，1H).

步骤二、

将化合物dG(AP₃)真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物dG(AP₃)(30mg，0.072mmol)、三正丁胺焦磷酸盐(80mg，0.145mmol)、2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮(30mg，0.15mmol)置于三个反应管中。将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1，3，2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF(0.25mL)溶液中，常温搅拌半小时。然后将该混合液注入到2中，搅拌1.5h。加入1mL3％碘(9：1Py／H20)溶液，保持碘液颜色15min不退色。15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3MNaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，离心(20min，3200rpm)。倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌5小时。减压旋出溶剂，出现棕色固体，RP-HPLC分析[条件：柱子：C18，5μm，4.6×250mm；流速：1mL／min；流动相：20mMTEAA和EtOH，0-20％EtOH(35min)，可见检测器波长：650nm]，保留时间t=18min。RP-HPLC分离[条件：柱子：C18，5μm，9.4×250mm；流速：4mL／min；流动相：20mMTEAA和MeOH，0-15％MeOH(25min)，紫外检测器波长：254nm]，保留时间t=15min。NaCl／EtOH除去乙酸三乙胺盐，得12mg白色固体即dGTP(AP₃)。产率26％。dGTP(AP3)的¹H-NMR、³¹P-NMR、HRMS谱图分别如图8、9、10所示，¹HNMR(400MHz，D₂O)δ7.45(s，1H)，6.34(t，J=6.8Hz，1H)，4.73(s，1H)，4.11-4.20(m，3H)，4.06(s，2H)，2.53-2.58(m，1H)，2.41-2.46(m，1H)；³¹PNMR(D₂O，162MHz)：-10.59(t，J=9.9Hz，1P)，-11.24(d，J=17.3Hz，1P)，-22.98(d，J=20.7Hz，1P).ESI-HRMS：calcforC₁₄H₁₉N₅O₁₃P₃[M-H]^-558.0192，found558.0179.注：本方法同样适合7-去氮-7-溴／氯-2’-脱氧鸟嘌呤核苷dG-Br／Cl在合成dGTP(AP3)中的用途，不同之处在于第一步反应时，用dG-Br／Cl代替dG-I即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

实施例6、7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成G(AP ₃ )中的用途

本实施例中G(AP₃)的合成示意图如图6所示，具体合成方法分别包括如下步骤：

向一单口瓶中加入化合物G-I(0.25g，0.4mmol)，再称取CuI(22mg；1mmol)和Pd(PPh₃)₄(48mg；0.04mmol)加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA(0.088g；0.8mmol)和三氟乙酰丙炔胺(0.2g；1.2mmol)，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析[V(乙酸乙酯)：V(正己烷)=1：3]，得0.1g白色固体即G(AP₃)，产率39％。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ7.24(s，1H)，6.38(t，J=0.8Hz，1H)，4.49-4.46(m，1H)，4.31(s，2H)，3.94(d，J=1.6Hz，1H)，3.78-3.68(m，1H)，3.54-2.47(m，1H)，2.3-2.24(m，1H).注：本方法同样适合7-去氮-7-碘鸟嘌呤核苷G-I在合成G(AP₃)中的用途，不同之处在于第一步反应时，用G-Br／Cl代替G-I即可，其它所有反应步骤和方法均相同。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (4)

1.一种7-去氮-2'-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、

向一单口瓶中加入化合物dG-I0.4mmol，再称取CuI1mmol和Pd(PPh₃)₄0.04mmol加入反应瓶中，抽真空，氮气保护，铝箔包裹，加入10mlDMF，搅拌溶解，注入TEA0.8mmol和三氟乙酰丙炔胺1.2mmol，50℃搅拌13小时后，反应结束，旋出溶剂，将残余物溶于100ml乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，用体积比为1:3的乙酸乙酯-正己烷混合溶剂进行柱层析，得0.1g白色固体即dG(AP₃)，产率39％；

步骤二、

将化合物dG(AP₃)真空干燥12h，在手套箱中分别称取化合物dG(AP₃)0.072mmol、三正丁胺焦磷酸盐0.145mmol、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮0.15mmol置于三个反应管中；将三正丁胺焦磷酸盐溶于0.25mL无水DMF中，再加入0.3mL新蒸的三正丁胺，常温搅拌半小时后，把反应液注入2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮的无水DMF0.25mL溶液中，常温搅拌半小时；然后将该混合液注入到dG(AP₃)中，搅拌1.5h；加入1mL3％的碘的Py-H₂O溶液中，保持碘液颜色15min不退色，所述Py-H₂O溶液中，Py-H₂O的体积比为9:1；15min后加入2mL水，2h后，加入0.75mL3MNaCl溶液、20mL无水乙醇，-20℃冷冻12h，3200rpm下离心20min；倾去上清液，沉淀抽干溶剂后，加入浓氨水，室温搅拌5小时；减压旋出溶剂，出现棕色固体，进行RP-HPLC分析，该步RP-HPLC的条件为：柱子：C18,5μm,4.6×250mm；流速：1mL/min；流动相：20mMTEAA和EtOH，0-20％EtOH35min,可见检测器波长：650nm，保留时间t＝18min；进行RP-HPLC分离，该步RP-HPLC的条件为：柱子：C18,5μm,9.4×250mm；流速：4mL/min；流动相：20mMTEAA和MeOH，0-15％MeOH25min,紫外检测器波长：254nm，保留时间t＝15min，NaCl/EtOH除去乙酸三乙胺盐，得12mg白色固体即dGTP(AP₃)，产率26％。

2.如权利要求1所述的7-去氮-2'-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述化合物dG-I的制备具体步骤为：将下式(Ⅴ)化合物在碱性条件下去甲基得到下，即所述7-去氮-2'-脱氧-7-卤素取代鸟嘌呤核苷；

其中R₂为I；

所述式(Ⅴ)化合物通过在碱性条件下将式(Ⅳ)化合物去保护基制备而得：

其中，R为保护羟基或氨基的保护基；

所述保护基为新戊酰基或异丁酰基；

所述式(Ⅳ)化合物通过在式(Ⅲ)化合物的嘌呤碱基的7位接上卤素制备而得：

所述式(Ⅲ)化合物通过在碱性条件下用保护基保护式(Ⅱ)化合物的两个羟基和一个氨基制备而得：

3.如权利要求1所述的7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤一中，所述dG-I化合物、三氟乙酰丙炔胺、CuI、Pd(PPh₃)₄和TEA的摩尔比为1:(2～3):0.072:0.025:(1.5～2)。

4.如权利要求1所述的7-去氮-7-丙炔胺-2'-去氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤二中，所述三正丁胺焦磷酸盐、2-氯-4H-1,3,2-苯并二氧磷-4-酮和dG(AP₃)的摩尔比为2:2:1。