CN103583949A

CN103583949A - 低聚果糖组合物

Info

Publication number: CN103583949A
Application number: CN201310534488.1A
Authority: CN
Inventors: 莉娜·德利恩希尔; 约瑟法·马莎·基姆·弗鲁宁克斯; 阿方斯·艾丽斯·弗朗索瓦·埃鲁福斯
Original assignee: Raffinerie Tirlemontoise SA
Current assignee: Raffinerie Tirlemontoise SA
Priority date: 2008-06-12
Filing date: 2009-06-12
Publication date: 2014-02-19
Also published as: CN102056947B; WO2009149940A1; BRPI0915092A2; US20110081449A1; KR101670092B1; EP2294093A1; CL2010001372A1; KR20160079926A; CN102056947A; ES2628979T3; EP2294093B1; KR20110015431A; PL2294093T3

Abstract

本发明涉及用于工业规模生产低聚果糖（FOS）组合物的方法，包括下列步骤：a）提供含有蔗糖的原料；b）使原料和酶在一起以形成混合物，其中酶具有菊粉内切酶活性和/或果糖基转移酶活性，并处于游离的非固定化的形式；c）将混合物置于使FOS形成可以发生一段时间的条件，以便混合物中的FOS构成混合物中碳水化合物总量的至少45wt%，从而形成FOS组合物；d）可选地使酶失活；e）回收FOS组合物。本发明还涉及一种低聚果糖组合物（FC），其中：FC中碳水化合物的至多2wt%的部分由具有聚合度（DP）7或更高的低聚果糖组成；及经HPLC测定，在FC中至少56wt%的低聚果糖具有聚合度3；及FC在酶促方法中从蔗糖获得，而且没有使用由转基因生物获得的酶。

Description

低聚果糖组合物

本申请为申请日是2009年6月12日、申请号是200980121551.0、发明名称是“低聚果糖组合物、其生产方法和应用”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种用于生产低聚果糖的方法、低聚果糖组合物及其应用。

背景技术

低聚果糖（fructooligosaccharide）本身是已知的，并发现在食品中使用增加，其中它们可以使用在例如它们的提供非蔗糖甜度的质量中，作为脂肪替代品，作为增稠剂，或因为它们的益生元特性。

低聚果糖的一个特点是它们适合自然和健康的饮食和生活的情形。不过，观察到低聚果糖的特性可以在这方面进一步得到改善，并且这个目标代表了本发明的目的。

发明内容

所述目标通过提供一种用于工业规模生产低聚果糖（fructooligosaccharide，FOS）组合物（FC）的方法实现，该方法包括以下步骤：

a)提供含有蔗糖的原料；

b)将原料和酶混合在一起形成混合物，酶具有菊粉内切酶活性（endo-inulinase activity）和/或果糖基转移酶活性（fructosyltransferase activity），并处于游离的、非固定化形式；

c)将混合物置于使低聚果糖形成可以发生一段时间的条件，以便在混合物中FOS构成混合物中碳水化合物总量的至少45%，从而形成了FOS组合物；

d)可选地使酶失活；

e)回收FOS组合物。

根据本发明的方法的一个优点是它可以以符合有关有机（Organic）食物成分生产的所有主要标准的方式实施。这样生产的FC因此可以作为有机（Organic）成分出售，因此不再代表在所有有机（Organic）食品制造中的一个阻碍因素，而是可以随时加入其中，可以在其中赋予甜度，口感和益生元特性。

在日本专利申请62-295299（公开号1-137974）中，披露了从蔗糖酶法制备FC。使用的酶必须进行固定。

在"The Production of Fructooligosaccharides from lnulin or Sucrose Using lnulinase orFructosyltransferase from Aspergillus ficuum",Barrie E.Norman&Birgitte

Denpun Kagaku vol36,No.2,pp103-111(1989)中，在对酶及其工作的基础研究框架中披露了从长链菊粉或从蔗糖至FC的实验室规模制备。

在"Synthesis of Fructooligosaccharides from Sucrose Using lnulinase from Kluyveromycesmarxianus",Andrelina M.P.Santos&Francisco Maugeri,Food Technol.Biotechnol.45(2)pp.181-186(2007)中，披露了FC的制备。该制备是酶促的；酶固定在海藻酸钙中。

在EP-A-0889134中，披露了一种用于生产特定的β-呋喃果糖苷酶的方法，包括培养转化了重组质粒的GMO（宿主细胞）的步骤。

低聚果糖（FOS）属于已知为菊粉的化合物。菊粉是一个通用的术语，涉及主要由通过β（2→1）型果糖基-果糖连接方式可选地与葡萄糖起始部分连接的果糖部分组成的碳水化合物材料。菊粉通常是多分散的，即各种链长的化合物的混合物，而单个化合物的聚合度（degreeof polymerisation，DP）可以从2到100或甚至更高。因此，术语fructooligosaccharide（低聚果糖）-缩写为FOS-表明菊粉材料的特定形状，或者是单分散的或者是多分散的，而单个化合物的DP从2到10，实际上往往是从2到9，或从2到8或从2到7。市售可得的FOS通常是具有平均聚合度（DP）约2至4的多分散的材料。

在实践中，FOS也称为果寡糖。如在这里所使用的，术语低聚果糖和果寡糖被认为是同义词。

根据本发明，FOS是组合物的部分。如这里所理解的，FOS组合物指含有FOS-或者是单分散的或者多分散的-且还可以含有其它化合物的组合物。这些其它化合物的例子有：水、蔗糖、果糖、葡萄糖、除了FOS的菊粉化合物、麦芽糖、有机盐和无机盐。然而，注意到，如在本发明的上下文中所使用的，当FOS组合物是用于人或动物消费时，术语FOS组合物作为一种用于食品的成分，而不是作为食品本身。食品创造因此是进一步的步骤，而FOS组合物作为一种食品成分。

根据本发明的方法以工业规模进行。众所周知，将实验室研究结果转化成大规模实践，这是非同小可的；尤其，已知这样做可能出现很多问题并可能需要得到解决。在碳水化合物方法领域中这些问题的例子包括缩放比例、混浊度、起泡性、病原微生物污染、及需要纯化步骤。如在这里所表示的，术语工业规模指方法在每24小时运作能够处理至少500kg原料的装置中进行；优选地，这个量为每24小时1000-1000000kg之间。在一主要具体实施例中，根据本发明的方法仅涉及FOS组合物的制备：在该主要具体实施例中，该方法没有结合另一食品的制备；优选地，FOS组合物不是在已经存在的食品中原位制备的，而是一种食品成分。

在根据本发明的方法的步骤a）中，提供了一种原料。该原料应包含蔗糖或优选地基本上由蔗糖组成。在一个具体实施例中，蔗糖是有机（Organic）蔗糖。

除非特别声明，术语“基本上由…组成”或“基本上仅”和相当术语具有，与组合物有关，通常含义：除了规定的化合物，也可能存在其它化合物，假如组合物的基本特征并没有被它们的存在而实质上受到影响。

有机（Organic）蔗糖本身是已知的，并且是市售可得的。有机（Organic）蔗糖的一个已知来源是来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖，由

（比利时）提供，通常以固体晶体形式供应。优选地，原料是根据目前生效的与有机（Organic）实践相关的规章（EU）或法规（US）至少之一所证明合格的。如果用于本有机（Organic）方法的原料除了蔗糖外还含有其它材料，那么这些其它原料也应该由有机（Organic）处理实践所允许。

在根据本发明的方法的步骤b）中，使原料和酶在一起，从而形成混合物。

酶的目的是催化从蔗糖至FOS的形成；这可以通过选择具有果糖基转移酶活性的酶实现。这种酶本身已知分类在例如酶分类编号EC2.4.1.99或者EC2.4.1.9下。这种酶的早期披露是在“The Production of Fructooligosaccharides from lnulin or Sucrose Using lnulinase orFructosyltransferase from Aspergillus ficuum”,Barrie E.Norman&Birgitte

Denpun Kagaku vol36,No.2,pp103-111(1989)中。此外，已知一些β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidases），即分类在EC3.2.1.26下的酶，也可以具有果糖基转移酶活性，因此适合根据本发明的方法。

令人惊讶地发现具有菊粉内切酶活性的酶-例如分类在EC3.2.1.7下的酶-还可以在蔗糖存在下导致FOS的形成，特别是如果它们作用在具有60°Bx或更高的高固体含量的混合物中。因此，在一个单独的主要具体实施例中，本发明还涉及一种用于从蔗糖酶法制备低聚果糖组合物的方法，其中酶含有菊粉内切酶或甚至基本由菊粉内切酶组成。

使用在本发明的步骤b）中的优选的酶的一个例子是菊粉内切酶Novozyme960（供应商：Novozymes）。使用在本发明的步骤b）中的优选的酶的另一个例子是Pectinex Ultra SP-L（供应商：Novozymes）。根据本发明也有可能酶构成两个或更多个的具有果糖基转移酶和/或菊粉内切酶活性的酶的组合。

在本发明的一个具体实施例中，在步骤b）中使用的酶是本身也出现在自然界的酶。在这个具体实施例中，没有采用基因工程活动去改变酶的氨基酸序列，或导致酶的形成的相关的DNA。更优选地，没有使用转基因生物（genetically modified organism，GMO）以商业规模制备酶，从而酶不是由转基因生物制造的。同样，优选地，在制备使用在根据本发明的方法中的酶的过程中，没有使用通过突变例如经过有目的的暴露于化学物质或辐射获得的微生物。

酶可以部分以固定形式使用，但也应部分或优选地甚至全部以非固定形式使用，而已知非固定化也被称为“游离”。如果酶部分以固定形式使用，优选不使用有机（Organic）生产实践所不允许的交联剂或其它物质进行固定。但是，在本发明的一个主要具体实施例中，酶根本没有进行固定。

在根据本发明的方法中需要的酶量依赖于各种本身已知的因素，例如处理温度、原料量、pH、允许的处理时间、期望的转化率。这些以及其它相关因素可以由本领域技术人员依据本领域普遍公认的程序进行确定。

当形成混合物时，如通常在这种类型的方法中，优选地，水存在或加入水，以便水在混合物中成为连续相。如果是这样，那么这可能也不过是作为后续步骤c）的部分进行。

在本发明的步骤c）中，在步骤b）中形成的混合物置于使FOS形成可以发生一段时间的条件，以便形成期望数量的FOS，从而形成FOS组合物。当尚未在步骤b）中完成时，优选在步骤c）中加入水，以便其在混合物中成为连续相。将混合物进行处理例如超高温处理（UHT）可能是有用的，或者甚至是必要地；这可能有助于确保基本上没有病原体包含在或留在该混合物中。在本发明的一个主要具体实施例中，混合物置于使FOS形成可以发生一段时间的条件，以便在这样形成的FOS混合物中的FOS构成混合物中碳水化合物总量的至少45%。优选地，FOS的所述量是混合物中碳水化合物总量的至少50、53、55、56或甚至至少57wt%。由于一定量的游离葡萄糖将通常在该方法中形成的情况，在混合物中可获得的FOS的最大量可能存在限制。因此，在本方法的这个阶段的混合物中的FOS的量优选地是碳水化合物总量的最多65、64或63wt%。

一般而言，混合物可以置于从而可以发生FOS形成的条件本身是已知的：这些条件优选地包括在30℃和75℃范围内的温度和在30°Bx和80°Bx之间的固体含量。众所周知，单位“白利（°Bx”-“白利糖度（degrees Brix）”的简称-是在制糖业广泛使用的术语用于表示糖溶液中的固体含量，如从它的折射率衍生出的。如这里所使用的，相同的方法使用在（有机（Organic））蔗糖样本上或在FOS组合物上。众所周知，°Bx数值非常接近，或者甚至基本相同于重量百分比；因此在本发明的可替换的表述中，在本说明书和权利要求书中提到的所有°Bx值读作干物质的重量百分比。

在步骤c）中的温度优选至少40、45、或者甚至50或55℃。令人惊讶的，发现当步骤c）中的温度位于60℃和75℃之间且固体含量位于61至75°Bx之间时，根据本发明的处理步骤c）可以显示意料不到的异常结果。与在这样的高温条件FOS形成与低于60℃的温度相比将恶化的预料相反，发现可以发生良好的或者甚至改善的FOS形成。

此外，发现当混合物的固体含量在50°Bx以上，优选55、58、58、60、61、62、63或64°Bx以上时，在根据本发明的方法中，用于微生物生长的条件越来越不利。所述条件甚至可以不利到这样的程度，以致不需要使用用于抑制微生物生长的加工助剂例如杀菌剂。另外，根据本发明的方法的特征在高效有机（Organic）实施它的情况下是有作用的。优选地，固体含量最多为78、76、75、74、73或72°Bx。优选地，温度在55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65℃和74、73、72或71℃之间。这种相对高温在实现符合有机（Organic）生产条件的方法的有效实施中也是非常有用的。

使用在本发明的方法中的酶或酶的组合可以部分以固定形式使用。但是，在根据本发明的方法的一主要具体实施例中，发现如果在步骤c）中酶根本没有固定，该方法可以以特别有效的方式进行。当在步骤c）中混合物的固体含量处于55、58、60、61、62、63或64和80、78、76、75、74、73、72°Bx之间时，该具体实施例是特别有利的。优选地，因此，温度位于55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65℃和76、75、74、73、72或71℃之间。

当混合物在步骤c）中置于如上所述的温度和浓度条件时，酶促作用将导致有机（Organic）FOS的形成；游离葡萄糖可以-而且往往-同时形成。在步骤c）进行期间控制pH可能是有用的或者甚至是必要的。本领域技术人员知道，pH的精确范围取决于几个因素，例如特别是使用的酶的选择和特性。pH的控制可以通过本身已知的方式进行，而优选地应注意为此使用的任何化合物在有机（Organic）生产的框架中是可接受的。在至少一种有机（Organic）规章/法律/标准中可接受的酸化化合物的例子是柠檬酸和硫酸。根据本发明的步骤c）进行的持续时间主要根据期望的FOS的量的函数来选择。本领域技术人员都知道，这个持续时间通常在1至72小时之间的范围内，优选5至50小时之间，更优选地在12至36小时之间，在此期间，FOS组合物形成。

一旦本发明的步骤c）完成，可能期望确保酶失活。如果是这样的话，那么可以实施酶失活步骤d）。由于使用的酶至少部分不固定的情况，步骤d）的实施也是优选的。酶的失活可以通过本身已知的且对于每种特定类型的酶可能不同的方法实现。这种失活的方法的一个例子是升高温度-至例如约80、85或90℃的水平-接着在这样升高的温度保持5至30分钟之间的停留时间。置于这样一个温度的另外的益处是任何可能存在的细菌量急剧减少。

步骤c）-或可能步骤d）-之后，在回收步骤e）回收FC。本发明的回收步骤e）可以可选择地包括加入化合物至FC中。发现当FC这样-即通常作为水溶液-回收后其已经适于作为成分后续使用在食品中或在动物饲料中。还可能利用一个后续处理步骤，而任何这样的后续步骤优选在有机（Organic）（成分）生产框架中是可接受的。这些后续步骤的例子有：

1.一个消毒步骤，例如，通过UHT方法；

2.一个过滤步骤，其中FC通过过滤器；所述过滤器可以可选择地具有目的去帮助确保FC成为或保持无菌；

3.一个加热步骤，例如至位于85℃和FC的沸点或更高之间的温度，例如目的是蒸发存在FC中的水的一部分。

优选地，从其优选的有机（Organic）特征角度看，根据本发明使用的方法的步骤没有使用一个或更多的下列物质：防垢剂、抗泡沫剂、杀菌剂、生物灭杀剂和絮凝剂。此外，优选地，色谱分离技术没有使用在根据本发明的方法的任何步骤中。同样，优选地，离子交换树脂没有使用在根据本发明的方法的任何步骤中。一般来说，优选地不使用精制步骤。尤其发现在工业规模实施本发明的方法时，在高温和高固体含量时方法的运作在使可能放弃上述物质和技术方面是有利的。

注意到不使用上述物质和技术是非同小可的，因为这些是在FOS制备工业中非常普通的物质和技术。因此存在非同小可，尤其对于本发明的方法的工业规模实施。在这方面，本领域技术人员可以，通过常规试验，改变处理条件，例如尤其处于上述给出的范围和优选范围内的固体含量和温度，以便达到条件，从而确实在工业规模，上述的不存在某些物质和技术是可能的。因此，在本发明的一具体实施例中，在步骤a）中处理的蔗糖的量位于每24小时500和500000公斤之间。采用这种方式，根据本发明的方法可以将每24小时500和500000公斤之间的蔗糖转化成FOS组合物。

当进行用于制备FOS组合物的方法时，将理解本领域技术人员具有自行支配许多可以改变的参数，以优化方法和由此产生的FOS组合物。在这些参数范围的最重要的参数中，如本领域技术人员所知道的：合成进行的温度、在步骤b）和c）中的混合物的固体含量、酶促反应的持续时间、和加入的酶量。

令人惊讶地发现这些参数的某些选择能够导致特定的具有期望特性的FOS组合物。特别是，组合：

-符合上面给出的指导方针的固体含量和温度的相对高值；

-使用游离的、非固定化酶，而且优选地所述酶不使用GMO制备；和

-进行常规实验，以尽可能减少酶量，同时仍然获得至少可接受的转换率，能够导致FOS组合物具有一个或更多个以下的特征：

-相对于低聚果糖总量，大量FOS具有聚合度（DP）3；和/或

-相对于低聚果糖总量，少量FOS具有DP7或更高；和/或

-在组合物作为整体中大量FOS，同时还保留了相对较高的蔗糖量。

优选地，在FC中碳水化合物的最多3、更优选地最多2、1、或甚至0.50、0.40、0.30或0.20wt%由具有聚合度（DP）7或更高的寡糖组成。在这个具体实施例中，可能存在量为或超过0.01、0.05或0.10wt%的具有聚合度（DP）7或更高的寡糖，同时具有上面给出的上限。

发现根据本发明的方法可以导致FC，其中经高效液相色谱测定，在FC中高百分含量的低聚果糖具有聚合度（DP）3。在根据本发明制备的FC中占主导地位的具有聚合度3的化合物是1-蔗果三糖（1-kestose）。令人惊讶地，发现具有大量的DP3的FOS的FC可以通过使用已知本身在自然界中出现的酶来实现。

因此本发明还涉及一种FC，其中：

·经HPLC测定，在FC中至少56wt%的低聚果糖具有聚合度3；及

·FC在酶促方法中从蔗糖获得，而且没有使用由转基因生物获得的酶。

优选地，在FC中碳水化合物的最多2wt%的部分由具有聚合度（DP）7或更高的寡糖组成。在一进一步的优选具体实施例中，具有DP3的FOS的量，根据FC中FOS的总量计算并在HPLC中测定，为至少57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、或者甚至至少70wt％。发现至少56wt%的低聚果糖具有DP3的情况具有FC在水中的溶解度增加和/或FC显示浊度的趋势降低的优点。

优选地，在FC中的碳水化合物含有至少11wt％、优选至少11.5、12.0、12.5、13.0、13.0、或者甚至至少14wt％的蔗糖-尽管FC应该在酶促方法中从蔗糖获得，没有GMO和优选地没有突变的微生物使用用于制备酶；酶优选地处于游离的、非固定化的形式。这具有减少不是FOS的且通常更少期望的碳水化合物的量的优点。在该具体实施例中，优选地FC没有进行分离技术例如色谱分离去从FC移除碳水化合物。

在本发明的一个相关的主要具体实施例中，本发明涉及一种FC，其中：

·在FC中至少55wt%的碳水化合物是低聚果糖；及

·在FC中至少11wt%的碳水化合物由蔗糖组成；及

在这个主要具体实施例中，在FC中的碳水化合物含有至少55wt%、优选至少56、57、58、59或甚至是在60wt%的大量的低聚果糖；同时，在FC中的碳水化合物含有至少11wt％、优选至少11.5、12.0、12.5、13.0、13.0、或者甚至至少14wt％的蔗糖-尽管FC应该在酶促方法中从蔗糖获得，没有GMO和优选地没有突变的微生物使用用于制备酶；酶优选地处于游离的、非固定化的形式。这具有减少不是FOS的且通常更少期望的碳水化合物的量的优点。在该具体实施例中，优选地FC没有进行分离技术例如色谱分离去从FC移除碳水化合物。

根据本发明的方法可以产生有机（Organic）产品。这意味着因此选择和进行根据本发明的方法步骤是这样的以致符合相关法规。

因此，本发明还涉及一种通过用于制备低聚果糖组合物的方法可获得的或获得的低聚果糖组合物（FC），其中所述方法符合有机（Organic）方法的标准。

如这里所使用的，术语“有机的（organic）”指与有机化学相关；术语“有机的（Organic）”–即具有大写“O”-指与农业、方法和产品有关，它们符合某些标准，且通常目的在于整合促进资源循环、促进生态平衡和保护生物多样性的栽培的、生物的和机械的实践。

根据本发明的FOS可以是有机的（Organic）。众所周知，方法或产品的特征“有机的（Organic）”在许多国家是一个法律保护术语，携带了一系列置于方法或产品上的要求。在农业中这些要求的例子有：

·回避/没有某些或所有的除草剂和杀虫剂。通常，合成制备的除草剂和杀虫剂是禁止的，除了位于准许名单上的。

·回避/没有某些或所有的化肥，与积极的土壤肥力管理相结合。通常，合成制备的化肥是禁止的，除了位于准许名单上的。

·最大限度地利用可再生资源；

·多年作物轮作；

·没有/不使用转基因生物；

·回避或不使用某些加工助剂或处理步骤，例如在从原料获得成分的过程中。例如，进行从有机（Organic）甘蔗或有机（Organic）甜菜获得有机（Organic）蔗糖，而不使用某些精制步骤例如色谱分离，优选地还不使用离子交换树脂。

此外，有机（Organic）加工产品应该优选地通过使用保证产品的有机（Organic）完整性和重要品质保留在产品链的所有阶段的加工方法进行生产。在这方面采取的措施的例子是避免使用由或使用GMO’s制造的酶。

正如从上面看是清楚的，术语有机的（Organic）可以适用于在各阶段和类型的产品和方法，比如例如：耕作方法、农作物、用于从农作物获得成分的方法、成分本身、包括各种成分的产品等等。

因此，尽管依赖于其涉及的方法或产品的类型，术语“有机的（Organic）”具有某些核心要素。与用于从农作物获得成分的方法有关，有机的（Organic）的含义包括使用有机（Organic）原料和有关的有机（Organic）制造实践。与从农作物获得的成分有关，有机的（Organic）的含义包括使用的原料的有机（Organic）性质的确实性，相关的有机（Organic）制造实践，和在提供的成分中没有某些化合物例如除草剂、杀虫剂和优选地还没有化肥。

术语有机的（Organic）的含义可以确认或添加至这个某些国家特定的元素，然后明确地纳入到标准、法律、指令、法规等等。两个广为人知的伴随术语有机的（Organic）的要求的实施细则：在欧洲是2007年6月28日的欧洲法规EC834/2007（在2007年7月20日公布于欧盟的官方公报，OJ L189，作为法规2092/91的后继者），在美国是美国有机食品生产法案（OFPA）。优选地，根据本发明的有机（Organic）FOS组合物符合所述欧洲法规和/或美国OFPA的所有适用部分。因此，根据本发明的有机（Organic）FOS组合物将还符合所述法规/法案的未来版本的相同、相似或等同部分。

在一个相关的具体实施例中，根据本发明的有机（Organic）FOS组合物是通过符合所述欧洲法规和/或美国OFPA的所有适用部分的方法获得的。

根据本发明的一种有机（Organic）FOS组合物（OFC）将优选地，并与其有机（Organic）特征一致，基本上不含有除草剂、杀虫剂或化肥，除了那些允许在有机（Organic）法规或法案下使用的。更优选地，根据本发明的一种OFC基本上含有根本无法检测到的除草剂、杀虫剂或化肥的量。

在本发明的一具体实施例中，用于制备OFC的方法以及根据本发明的OFC基本不含有显示在美国的允许的和禁止的物质的国家名单上的禁止的物质，该名单公布在由美国农业部农产品运销局主持的美国国家有机项目（US National Organic Program,NOP）的框架内。尤其，这涉及到联邦法规的标题7（农业）的205部分，具体涉及到§205.602，“在有机作物生产中禁止使用的非合成的（Nonsynthetic）物质”。此外，优选地，从有机（Organic）蔗糖作物来的任何物质进入本发明的方法和还可能进入根据本发明的OFC显示在所述的允许的和禁止的物质的国家名单的可适用的准许名单上，尤其§205.601“在有机作物生产中允许使用的合成物质”，§205.605“在标注“有机的”或“用有机的（指定的成分或食物组）制造的”加工产品中或上允许作为成分的非农业（非有机）物质”，和§205.606“在标注“有机的”加工产品中或上允许作为成分的非有机生产的农业产品”。

在本发明的一进一步的具体实施例中，用于制备OFC的方法以及根据本发明的OFC符合1993年1月29日的欧洲委员会法规207/93，和在1997年2月26日修改的（法规345/97）和在2000年9月26日修改的（法规2020/2000）。本法规规定附件VI的内容至上面提到的法规2092/91，参考该法规的第1条（1）（b），除葡萄酒之外，涵盖了可以使用在基本上由一个或多个植物来源的成分组成的食品的制备中的原料和加工助剂。

根据本发明的FOS组合物可以包含，如通常是对于在工业方法中回收的组合物的情况，少量的杂质。如在这里所表示的，术语杂质指除了碳水化合物或水之外的化合物。在FC的情况下，最重要的杂质是无机盐、有机酸和蛋白质。在根据本发明的FC中杂质的总量可以在FC作为整体的0.1-3wt％的范围中。如果根据本发明的FC是一种OFC，特别是如果根据本发明的方法使用来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖，则可能杂质的量介于0.5和5wt％之间；而在精制蔗糖为原料的情况下，杂质的量通常在0.1或0.2和0.5wt％之间的范围中。

如果根据本发明的FC是一种OFC，且用于制备OFC使用的原料含有来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖或者甚至由来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖组成，然后发现包含在有机（Organic）蔗糖中的各种非碳水化合物的混合物，在那里被认为是有价值的，因为它将有机（Organic）蔗糖从仅仅为“无营养价值卡路里（dead calories）”的提供者进行提升，可能也至少部分包含在OFC中。因此，本发明还涉及一种FC，其含有总量在0.1和5wt%之间的选自由矿物质、维生素、氨基酸和蛋白质组成的组合的一个或更多个化合物。优选地，所述化合物的总量是至少0.2、0.3、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或者甚至至少1wt％；这具有优势：在口味和/或健康中的另外的有益效果可以存在FC中或与FC有关。优选地，所述化合物的总量是至多4.5、4.0、3.5、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、或者甚至最多2.0wt%。

优选地，特别是在FC是一种OFC的情况下，存在的任何矿物质、维生素、氨基酸或蛋白质不是添加到FC中的，正相反要么已经完整地在包含在用于制备（O）FC的原料中，特别是在原料有机（Organic）蔗糖中，或来自在（O）FC制备中使用的加工助剂。

在根据本发明的FOS组合物中FOS的量优选地位于35wt%和99wt％之间，更优选地位于40wt%和98wt％之间，最优选地位于45wt%和97wt％之间。如果FC应该含有比在根据本发明的步骤a）至d）中达到的更多的FOS，那么后续的步骤是必要的，以增加在FC中的FOS的量；这样的后续的步骤的例子是-如本身已知的-色谱分离步骤。

在根据本发明的FOS组合物的一优选的具体实施例中，FC基本上不含有致病微生物，还基本上没有肠杆菌（Enterobacteriaceae）。如这里所表示的，条件“基本上没有致病微生物”指在1gFC中检测到0个病原微生物（表示为CFU，集落形成单位）。在1g样品中没有致病性微生物尤其对于金黄色葡萄球菌（Staphilococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens），肉毒梭菌（Clostridium botulinum），沙门氏菌（Salmonella）和李斯特氏菌（Listeria）是如此。如这里所表示的，条件“基本上没有肠杆菌”指在1gFC中检测到0个肠杆菌（表示为CFU，集落形成单位）。对于肠杆菌，这优选地使用VRBGA（***胆汁葡萄糖琼脂（Violet Red Bile Glucose Agar））并在37℃孵育24小时后通过在颜色上使用已知的评估进行确定。

更优选地，根据本发明的FC经过富集（enrichment）后不含有肠杆菌。如在这里所表示的，富集指一种材料样品首先在经选择以便它们适于存在的任何肠杆菌生长和繁殖的条件下孵育。这是首先把25g的材料样品和225毫升的蛋白胨水放在一起，让该混合物在35-37℃之间的温度孵育18-24小时。然后，1毫升这种混合物加入到9毫升肠杆菌富集（EnterobacteriaceaeEnrichment，EE）肉汤，然后在35-37℃之间的温度孵育18-24小时。这样就完成了富集。随后，使用VRBGA检测EE肉汤样品中肠杆菌的存在。在本发明的这个优选的具体实施例中，即使富集后，仍然没有检测到肠杆菌。

根据本发明获得有机（Organic）FOS组合物的一种有利方法从原料有机（Organic）蔗糖开始，原料有机（Organic）蔗糖优选地从有机（Organic）甘蔗或有机（Organic）甜菜制备。由于有机（Organic）蔗糖生产的特点，特别是缺少某些或甚至所有精制步骤，这种原料除了蔗糖外还可以包含已经指出的上面的导致特征颜色和味道的化合物；这特别对于来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖是如此。由于对适用于有机（Organic）蔗糖制备的有机（Organic）方法的精制的相同限制也适用于FOS组合物的制备的有机（Organic）方法，可能上述导致颜色和口味的化合物带入OFC。此外，用于制备OFC的方法本身可以引入除OFC之外的化合物进入OFC。由于这些因素，发现在根据本发明的OFC的一优选具体实施例中，OFC具有位于30和20000Icumsa units之间的颜色，优选75和15000之间，更优选100-10000之间，尤其125和9000之间或150和8000之间，最优选175和7000之间。在该具体实施例中，同时根据本发明，在根据本发明的单独的具体实施例中，OFC具有位于30和5000μS/cm的电导率，优选40或50或60和4000之间，更优选地70或80或100和3000之间，最优选地125或150或175和2000μS/cm之间。

用于指示颜色的Icumsa units是普遍已知的，并使用在蔗糖生产行业。一种用于确定Icumsa颜色的权威的测试方法是方法GS2/3-9（2005），其本质上是测量蔗糖水溶液在420nm波长的吸收，然后重新计算成在Icumsa值。低Icumsa值表示无色/白色，更高值是具有往往是黄色至棕色的颜色的产品的证据。该方法GS2/3-9（2005）也在这里使用用于确定OFC的颜色，并作以下解释/修改：

-pH调节至6（不是如在标准中的7）；

-用于测定样品的Icumsa颜色（Icumsa colour）的公式是：

IcumsaColour = \frac{100000 \times A}{Bx \times ρ \times b}

其中A是在420nm处的吸收，Bx是以糖度为单位的固体含量，ρ是样品的密度，和b是吸收路径的长度。

OFC的电导率用具有固体含量28°Bx的OFC水溶液测定，并用每厘米微西门子（microSiemens per centimetre，μS/cm）表示。

具体实施方式

本发明将通过以下的例子进行说明，而不进行限制。

实例1-3

在实验室实验中，来自甘蔗来源的有机（Organic）蔗糖（供应商Candico）与水和酶相结合形成一种混合物。固体含量为72°Bx。酶是菊粉内切酶Novozyme960，非固定化。酶的活性是470U/克。菊粉内切酶的一个单位（以下简称为U，也称为EU）是能够从菊粉样品每分钟释放1μmol还原糖的酶量（也可参见"The Production of Fructooligosaccharides from Inulinor Sucrose Using lnulinase or Fructosyltransferase from Aspergillus ficuum",Barrie E.Norman&Birgitte

Denpun Kagaku vol36,No.2,pp103-111(1989)的第108页的左栏）。混合物中使用的酶量为0.4U/克原料干物质。

混合物通过使用硫酸和/或氢氧化钠调节至pH6.25。将混合物加热到在下表中所示的温度，并反应20小时。在此期间，pH值非常轻微地下降至约6.12的水平。形成了有机（Organic）FC（OFC）。在所述20个小时后，反应停止；这是简单地用微波炉烹调OFC完成。没有对OFC进行进一步的精制步骤或纯化步骤。

OFC用HPLC进行分析。结果总结在下表1中。OFC还进行细菌计数，没有发现肠杆菌。

表1

实例编号	1	2	3
				温度	66	70	72
非低聚果糖
				-果糖	3.1	4.7	4.7

-葡萄糖	24.1	22.2	20.4
				-蔗糖	14.6	14.8	19.6
低聚果糖
				-DP2（除了蔗糖）	0.7	0.7	0.5
-DP3	37.5	37.5	39.2
				-DP4	18.0	18.2	14.2
-DP5和更高	1.9	1.9	1.2
				→总FOS	58.2	58.3	55.3
→具有DP3的FOS%	64	64	71

表1的说明

-各种化合物的量以总碳水化合物干物质的重量百分比给出；

-用语DP2、DP3、DP4和DP5表示分别具有聚合度2、3、4和5的化合物。

通过实例1-3清楚地表明OFC可以通过关于有机（Organic）生产原则的方法和使用非固定化菊粉内切酶获得。

实例4

在中试中，有机（Organic）FC（OFC）从起始量1000kg来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖（供应商Candico）进行生产。混合物通过将有机（Organic）蔗糖与水和酶相结合从而形成。水量是这样以便混合物的固体含量为60°Bx。酶（Novozyme960）以0.280U/克有机（Organic）蔗糖使用。酶是非固定化的。pH通过使用硫酸和/或氢氧化钠调节至6.2，温度加热至56℃。在这些条件下，混合物反应20小时，从而形成OFC。随后，通过将OFC的pH调节至8使得反应减慢直至停止。然后OFC通过18μ过滤器，OFC通过加热浓缩以便固体含量至75°Bx并将酶失活。然后回收的OFC具有350Icumsa units的颜色，电导率为400μS/cm。没有使用防垢剂、防泡剂、杀菌剂、生物杀灭剂、或絮凝剂。用HPLC分析的OFC的组成在表2中给出。表2中的用语具有与表1中相同的含义。

表2

实例编号	4
		温度	56
非低聚果糖
		-果糖	1.3
-葡萄糖	25.8
		-蔗糖	13.2
低聚果糖
		-DP2（除了蔗糖）	0.4
-DP3	37.7

-DP4	19.7
		-DP5和更高	1.9
→总FOS	59.6
		→具有DP3的FOS%	63

实例4也清楚表明尽管仍然根据本发明，在与实例1-3的条件显著不同的条件下，在最初FOS形成后加入各种后处理的方法中，可以制备根据本发明的OFC。

此外，这个例子表明根据本发明的方法可以确实在工业规模成功实施。

实例5；比较试验A

在两个实验室实验中，在使用固定化酶（比较试验A）和游离（即非固定化）酶（实例5）进行比较。在两种情况下，酶是Novozyme960。用于固定化酶的载体是海藻酸钙。在两种情况下，原料是来自甘蔗的有机（Organic）蔗糖（供应商：Candico），水的量是这样的以便混合物的固体含量为60°Bx。游离酶以0.3U/每克有机（Organic）蔗糖（干物质）使用；固定化酶以2.43U/每克有机（Organic）蔗糖（干物质）使用。其它条件如实例4。由此产生的有机（Organic）FC的组成用HPLC测定并总结在表3中，其中用语具有与表1中相同的含义。

表3

比较试验/实例编号	A	5
			温度	56	56
非低聚果糖
			-果糖	1.8	1.1
-葡萄糖	30.1	27.0
			-蔗糖	12.4	12.3
低聚果糖
			-DP2（除了蔗糖）	2.5	0.5
-DP3	28.4	36.5
			-DP4	18.3	20.8
-DP5和更高	6.5	1.9
			→总FOS	55.7	59.6
→具有DP3的FOS%	46	61

根据本发明的实例5表明较好的结果可以通过游离酶获得，因为实例5中使用游离酶导致：

-FOS化合物的更高总产率；

-高于56％的更高量的低聚果糖具有DP3，以及更低量的FOS化合物具有DP5或更高，

当与在比较试验A中使用固定化酶相比较时。

实例6

在实验室实验中，来自甘蔗来源的有机（Organic）蔗糖（供应商：Candico）与水和酶相结合形成一种混合物。固体含量为59.7°Bx。酶是Pectinex Ultra SP-L（供应商：Novozymes）。尽管作为其主要应用领域，该酶具有果胶水解作用，已知其也具有果糖基转移酶活性-见例如"Immobilization of pectinex ultra SP-L pectinase and its application to production offructooligosaccharides"by Csanadi,Zs.and Sisak,Cs.in Acta Alimentaria Vol.35(2)pp205-212(2006)。在混合物中使用的酶量是162U/每克原料干物质。酶是非固定化的（即游离的）。

混合物通过使用硫酸和/或氢氧化钠调节至pH6.10。将混合物加热到56℃，并反应20小时。形成了有机（Organic）FC（OFC）。在所述20个小时后，反应停止；这是简单地用微波炉烹调OFC完成。没有对OFC进行进一步的精制步骤或纯化步骤。

OFC用HPLC进行分析。结果总结在下表4中。OFC还进行细菌计数，没有发现肠杆菌。

表4

实例编号	6
		非低聚果糖
-果糖	2.1
		-葡萄糖	26.1
-蔗糖	11.5
		低聚果糖
-DP2（除了蔗糖）	0.7
		-DP3	37.1
-DP4	20.8
		-DP5和更高	1.8
→总FOS	60.3
		→具有DP3的FOS%	61.5

实例7

在实验室实验中，来自有机（Organic）甜菜来源的有机（Organic）蔗糖（供应商：SüdzuckerAG）与水和酶相结合形成一种混合物。固体含量为60.0°Bx。酶是Novozyme960。在混合物中使用的酶量是0.64U/每克原料干物质。酶是非固定化的（即游离的）。

混合物通过使用硫酸和/或氢氧化钠调节至pH6.2。将混合物加热到56℃，并反应15小时。形成了有机（Organic）FC（OFC）。在所述15个小时后，反应停止；这是简单地用微波炉烹调OFC完成。没有对OFC进行进一步的精制步骤或纯化步骤。

OFC用HPLC进行分析。结果总结在下表5中。OFC还进行细菌计数，没有发现肠杆菌。OFC的颜色测定为40Icumsa units。OFC的电导率，在将OFC稀释至固体含量28°Bx后测定，为80μS/cm。

表5

实例编号	7
		非低聚果糖
-果糖	2.5
		-葡萄糖	29.5
-蔗糖	8.7
		低聚果糖
-DP2（除了蔗糖）	0.9
		-DP3	22.6
-DP4	28.2
		-DP5和更高	7.6
→总FOS	59.2

这个实例说明根据本发明的OFC也可以通过使用来自有机（Organic）甜菜来源的有机（Organic）蔗糖进行制备。注意到在这个实例7中，当考虑到该特定酶和这些特定的反应条件，使用的酶量，在0.64克/每克干物质原料，是相当高的。据推测，这种高剂量源于在OFC中具有DP3的FOS的重量百分比略低于其它实例的情况。

比较试验B

获得了市售可得的FC的一个样品。FC确定为Meioligo W。FC的供应商是Meiji FoodMateria Co，a Meiji Seika group company。样本用HPLC进行分析；结果提供在表6中。

表6

比较试验	B
		非低聚果糖
-果糖	3.8
		-葡萄糖	28.7
-蔗糖	11.3
		低聚果糖
-DP2（除了蔗糖）	0.8
		-DP3	27.8
-DP4	24.0
		-DP5和更高	3.5
→总FOS	56.2
		→具有DP3的FOS%	49

比较试验B表明在市售可得的FC中具有DP3的低聚果糖的量显著低于根据本发明的FC中具有DP3的低聚果糖的量。

Claims

1.一种低聚果糖组合物（FC），其特征在于，其中：

·经HPLC测定，在FC中至少56wt%的低聚果糖具有聚合度3；及

·FC在酶促方法中从蔗糖获得，而且没有使用由转基因生物获得的酶；及

·可选地FC中碳水化合物的至多2wt%的部分由具有聚合度（DP）7或更高的低聚果糖组成，

其中FC具有位于30和20000Icumsa units之间的颜色和位于30和2000μS/cm之间的电导率。

2.根据权利要求1所述的低聚果糖组合物（FC），其特征在于，其中组合物中至少11wt%的碳水化合物由蔗糖组成。

3.根据权利要求1-2任一所述的低聚果糖组合物（FC），其特征在于，其中FC含有总量在0.1和3wt%之间的选自由矿物质、维生素、氨基酸和蛋白质组成的组合的一个或更多个化合物。

4.根据权利要求1-3任一所述的低聚果糖组合物（FC），其特征在于，其中组合物含有在35和99wt%之间的FOS并基本上没有肠杆菌。

5.根据权利要求1-4任一所述的低聚果糖组合物（FC）在食品中或在动物饲料中的应用。