KR102082315B1 - 부티릴 프락토올리고당을 포함하는 프리바이오틱스 조성물 - Google Patents

부티릴 프락토올리고당을 포함하는 프리바이오틱스 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 B-FOS는 프로바이오틱스의 선택적 생장을 촉진함으로써, 장내 미생물을 조절할 수 있으며, 장내 상피세포의 에너지원으로 생리적 기능에 기여할 수 있다.

Description

부티릴 프락토올리고당을 포함하는 프리바이오틱스 조성물 {Composition of prebiotics with butyryl-fructooligosaccharides}
본 발명은 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides, B-FOS)을 포함하는 프리바이오틱스 조성물에 관한 것이다.
사람의 위장(gastrointestinal track, GI) 내에는 수많은 미생물이 군집을 이루어 서식하고 있으며, 이와 같은 집단을 장내균총(enteric microbiota)이라고 한다. 이들은 장관 내부의 생태계를 구성하면서 면역 기능, 소화 및 신진대사에 있어서 중요한 역할을 하기 때문에 정상적인 위장의 생리와 기능에 필수적이다. 사람의 장내균총은 환경 변화에 상당히 저항적이지만 항생제, 스트레스, 식이 혹은 특정 질병 등과 같은 요인은 장내균총의 변화를 초래한다. 이러한, 장내균총의 구성과 기능의 변화를 장내 불균형(dysbiosis)이라 하며, 가장 일반적인 정의는 비피도박테리아, 락토바실러스와 같은 유익균과, 대장균과 같은 유해균의 불균형을 말한다. 이러한 불균형은 자가 면역 질환, 염증성 장 질환, 비만 등과 같은 다양한 질병들과 직간접적으로 연관되어 있다고 알려졌다.
프로바이오틱스(probiotics)는 사람의 장내균총의 균형을 유지시킴으로써 유익하게 작용하는 살아있는 미생물을 의미한다. 이들은 단쇄지방산(short chain fatty acids, SCFA)의 생산에 의한 장내 pH 감소 및 장내 영양소와 장벽 부착 부위에 관한 경쟁을 통해 유해균의 생장을 저해한다. 또한, 면역활성화 작용, 유당불내증의 경감 등 인체에 유익한 기능을 한다고 알려졌다. 프로바이오틱스로 사용되고 있는 대표적인 미생물로는 비피도박테리아와 젖산균(lactic acid bacteria, LAB)에 속하는 균이 있다. 젖산균은 탄수화물을 발효시켜 젖산을 생성하는 균으로 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 류코노스톡(Leuconostoc)과 같은 속이 포함된다. 한편, 비피도박테리아는 다양한 올리고당을 에너지원으로써 이용하는 균이며, 육탄당을 젖산이나 초산으로 바꾸는 과정에서 과당-6-인산포스포케톨라아제(fructose-6-phosphate phosphoketolase)라는 효소가 작용하고, 발효 과정에서 기체를 생성하지 않는 독특한 특징을 갖는다.
프리바이오틱스는 사람에 의해 소화되지 않으며, 장내 미생물에 의해 선택적으로 발효되어 이들의 성장과 대사 변화를 조절함으로써 숙주의 건강에 도움을 주는 물질을 의미한다. 그 중 하나인 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS)은 설탕에 과당분자가 β-1, 2로 결합한 형태의 올리고당이다. FOS는 락토바실러스와 비피도박테리아에 의해 발효가 가능하며 FOS의 섭취는 비피도박테리움과 락토바실러스 종들을 증가시킨다고 알려졌다. FOS는 장내 프로바이오틱스 균주를 증가시켜 사람에게 유익한 작용을 할 수 있지만, 장내 FOS의 대사가 가능한 유해균 및 프로바이오틱이 아닌 균주(non-probiotics)에 의해 역효과가 나타날 수도 있어, 이를 위한 해결책의 마련이 시급한 실정이다.
대한민국등록특허 제10-1628769호 (2016.06.02.)에는, 프락토올리고당이 포함된 혼합당 조성물의 제조방법에 관하여 기재되어 있다. 대한민국등록특허 제10-1670092호 (2016.10.21.)에는, 프럭토올리고당 조성물, 이것의 제조방법 및 용도에 관하여 기재되어 있다.
본 발명은 신규의 프락토올리고당계 프리바이오틱스 조성물을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides)을 포함하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물을 제공한다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 부티릴 프락토올리고당은, 바람직하게 글루코스에 프락토오스가 2~9개 결합하고 있고, 부티릴(butyryl) 작용기가 결합하고 있는 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 부티릴(butyryl) 작용기는, 바람직하게 상기 프락토올리고당에 1~4개가 결합한 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 조성물은, 바람직하게 장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 생육을 억제하는 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 유익균은, 바람직하게 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 유산간균 (Lactobacillus), 유산구균 (Lactococcus) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 중 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 비피도박테리움 (Bifidobacterium)은, 더욱 바람직하게 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum) 및 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis) 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 유산간균 (Lactobacillus)은, 더욱 바람직하게 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei) 및 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 중 선택되는 어느 하나인 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 스트렙토코커스 (Streptococcus)는, 더욱 바람직하게 스트렙토코커스 터모필러스 (Streptococcus thermophilus)인 것이 좋다.
본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물에 있어, 상기 유해균은, 바람직하게 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 프리보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) 및 클로스트리디움 라모숨 (Clostridium ramosum) 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides, B-FOS)은 프리바이오틱스로서, 프로바이오틱스의 선택적 생장을 촉진함으로써, 장내 미생물을 조절할 수 있으며, 장내 상피세포의 에너지원으로 생리적 기능에 기여할 수 있다.
도 1은 부티릴 프락토올리고당(B-FOS)의 박층크로마토그라피 결과이다.
도 2는 0~70%(v/v) 에탄올 수용액에서의 B-FOS의 박층크로마토그라피 결과이다.
도 3은 B-FOS의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 4는 FOS와 B-FOS의 MALDI-TOF 분석 결과이다 (A: FOS, B: B-FOS).
도 5는 산과 열처리에서 B-FOS의 안정성을 분석한 결과이다 (A: 끓는 물에서 15분간 열 처리된 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS)과 B-FOS, B: pH 2-4로 조정된 PBS에서 30분, 1시간, 3시간 노출된 B-FOS).
도 6은 비피도박테리아 균주 B. bifidum BGN4, B. longum BORI, B. catenulatum, B. animalis, B. adolescentis, B. longum RD47의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
도 7은 비피도박테리아 균주 B. longum RD72, B. thermophilum의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
도 8은 젖산균 L. casei, L. acidophilus, L.plantarum, S. thermophilus, L. lactis, L. bulgaricus의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
도 9는 비프로바이오틱 균주 L. monocytogenes, S. aureus, E.coli, E. faecalis, C.butyricum, P. intermedia의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
도 10은 비프로바이오틱 균주 C. perfringens, C. ramosum, E. coli DH5α, Bac. thetaiotaomicron의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
도 11은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)의 배양 상등액 TLC의 결과이다.
도 12는 FOS, B-FOS 반응 전 (A)과 후 (B)의 균체, 균 파쇄액, 균 배양액 TLC 분석 결과이다.
도 13은 포도당과 피루브산의 유무에 따라 NaB, FOS, B-FOS를 0~0.06%(w/v)의 농도로 첨가하여 4일 동안 배양한 후, 각 물질의 농도에 따른 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (A: Glu+Pyr+NaB+, B: Glu-Pyr-NaB+, C: Glu+Pyr+FOS+, D: Glu-Pyr-FOS+, E: Glu+Pyr+B-FOS+, F: Glu-Pyr-B-FOS+).
도 14는 FOS와 B-FOS가 포함된 배지에서 Caco-2 세포를 배양한 후 배양 상등액을 TLC로 분석한 결과이다.
도 15는 Caco-2 세포의 배양 상등액, 세포 현탁액, 세포 파쇄액에 FOS와 B-FOS를 각 반응시킨 후 TLC를 통해 확인한 결과이다.
도 16은 NaB, FOS, B-FOS가 Caco-2 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT 분석을 실시하여 세포독성을 확인한 결과이다.
도 17은 B-FOS에 노출된 후의 암컷 마우스 및 수컷 마우스의 혈청에서 생화학적 지표를 나타낸 결과이다.
도 18은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 심장 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 19는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 신장 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 20은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 간 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 21은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 폐 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 22는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 비장 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 23은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 위 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
도 24는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 고환과 난소 조직 염색 결과이다 ((A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
본 발명은 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides, B-FOS)을 포함하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물을 제공한다.
프락토올리고당(fructooligosaccharides, FOS)은 글루코오스(glucose) 1분자에 프락토오스(fructose)가 중합(polymerization)되어 형성된 것을 지칭하는데, 통상적으로 2~9개의 프락토오스가 결합한 것일 수 있다.
본 발명의 부티릴 프락토올리고당은, 상기에서 언급한 프락토올리고당에 있어 글루코오스 또는 프락토오스의 OH에 부티릴기(butyryl group)가 에스터결합으로 결합하고 있는 것을 지칭하는데, 바람직하게 상기 프락토올리고당에 부티릴기(butyryl group)가 1~4개가 결합한 것이 좋다.
장내 미생물 대부분은 탄수화물을 발효함으로써 에너지를 얻는 혐기성 균이며, 발효 산물로 유기산을 생성한다. FOS(fructooligosaccharides)는 사람의 위와 소장에서 소화되지 않기 때문에 대장에 도달하여 장내 미생물에 의해 이용될 수 있는 올리고당(oligosaccharides)으로, 장내에서 비피도박테리아와 락토바실러스의 특정 기질로써 이용된다고 알려졌다. FOS는 장내 프로바이오틱스 균주를 증가시켜 사람에게 유익한 작용을 할 수 있지만, 장내 FOS의 대사가 가능한 유해균 및 프로바이오틱이 아닌 균주(non-probiotics)에 의해 역효과가 나타날 수도 있다. 이에 본 발명에서는 이에 대한 해결책으로, 부티르산(butyrate)과 FOS(fructooligosaccharides)가 에스터결합으로 결합된, 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides, B-FOS)을 신규 합성하여 프리바이오티스로 제공하고자 하는 것이다.
상기 B-FOS는 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS) 수용액에 부티르산 (butyric acid)을 첨가하고 혼합하여 합성하였다. 프락토올리고당의 농도는 10%에서 70% (w/v)까지 가능하며, 프락토올리고당과 부티르산을 10:1에서 1:1까지 섞어주고 100℃ 이하의 온도에서 30분에서 3시간 동안 반응시킨 후, NaOH 용액으로 중화하여 반응을 종료하였다.
한편, 본 발명의 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물은, 바람직하게 장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 생육을 억제하는 것이 좋은데, 상기 유익균은, 바람직하게 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 유산간균 (Lactobacillus), 유산구균 ( Lactococcus) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 중 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum)과 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis), 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 및 스트렙토코커스 터모필러스 (Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것이 좋다.
또한, 상기 유해균은, 바람직하게 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 프리보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) 및 클로스트리디움 라모숨 (Clostridium ramosum) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에서는, 본 발명에서 개발한 신규 합성물질인 B-FOS가 유익균의 생장을 촉진하며, 유익균에 의해 소비되어 대사산물로 젖산, 초산, 부티르산을 생성하는 반면, 유해균을 포함한 비프로바이오틱(non-probiotic) 균주의 생장에는 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, B-FOS는 균체의 세포벽 혹은 세포 내에서 분해되어 FOS와 부티르산을 생성하는데 이에 따라 생성된 FOS와 부티르산은 세균의 생장을 저해하거나 촉진하는데 영향을 미쳤음을 유추할 수 있었다. 또한, B-FOS는 Caco-2세포의 증식을 촉진하며, 이는 B-FOS가 Caco-2 세포의 세포벽 혹은 세포 내, 외에서 분해되어 FOS와 부티르산을 생성하고 생성된 부티르산이 Caco-2 세포의 에너지원으로서 사용되었음을 유추할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
※ 하기 실험의 모든 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계분석은 Statistical Package for the Social Science (SPSS, Ver. 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였다. 통계처리는 일원분산분석(One-Way Analysis of Variance)을 실시하고 유의한 차이가 있는 경우 Duncan's multiple range test로 사후 검증하였으며 Caco-2 세포 단층의 전기 저항값(TEER)의 경우 최소 유의차 검정(LSD)에 의해 평균간의 유의차를 검정하였다. 등분산 가정을 충족하지 않을 경우에는 Welch's test로 분석하고, 유의한 차이가 있는 경우 Games-Howell test로 사후 검증하였다. 유의수준은 P값이 0.05 미만인 경우로 하였다.
<실시예 1: 부티릴 프락토올리고당(butyryl-fructooligosaccharides, B-FOS)의 정제 및 구조>
(1) B- FOS 합성
B-FOS는 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS) 수용액에 부티르산 (butyric acid)을 첨가하고 혼합하여 합성하였다. 프락토올리고당의 농도는 50%(w/v)로, 프락토올리고당과 부티르산을 10:1의 비율로 섞어주고 50℃에서 3시간 동안 반응시킨 후, NaOH 용액으로 중화하여 반응을 종료하였다.
(2) B- FOS 정제
상기에서 합성한 B-FOS의 정제는 합성흡착제인 Diaion HP20 (Mitsubishi, Tokyo, Japan)을 사용하여 컬럼 크로마토 그라피를 수행하였다. 50×5㎝의 Glass Econo-Column (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 정량의 Diaion HP20을 충전한 후 에탄올 용액과 3차 증류수로 세정하였다. 전개 용매로는 1-프로판올/3차 증류수/에틸 아세테이트(7:2:1, v/v)로 하여 정제된 B-FOS를 실리카겔 플레이트 60F254 (Merck, Darmstadt, Germany)에 점적하였다. 발색시약으로 황산/에탄올(1:9, v/v) 용액을 플레이트에 분무한 후 110℃ 건조 오븐에서 10분 동안 가열하였다 (도 1). 도 1은 B-FOS의 박층크로마토그라피 결과이다.
정제되지 않은 B-FOS 용액을 3차 증류수로 4배 희석하여 로딩한 후 0~70%(v/v) 농도의 에탄올 수용액으로 용리하였다. 컬럼 크로마토그라피를 이용한 정제과정에서 0~70%(v/v) 에탄올 수용액에 용리된 물질의 박층크로마토그라피(thin layer chromatography, TLC) 결과, 30~70%(v/v) 에탄올 수용액에서 정제된 B-FOS를 확인하였다 (도 2). 도 2는 0~70%(v/v) 에탄올 수용액에서의 B-FOS의 박층크로마토그라피 결과이다. 0~20%(v/v) 에탄올 수용액에 용리된 용액은 제외하고 30~70%(v/v) 에탄올 수용액에 용리된 부분을 수집하였다. 정제된 B-FOS는 고속진공농축기 ScanSpeed40 (Labogene, Lynge, Denmark)로 농축하여 동결 건조기 (Ilshin biobase, Yangju, korea)로 동결 건조하였다.
(3) B-FOS의 구조 분석
B-FOS의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR에 의한 활성기 연관분석(linkage analysis)과 MALDI_TOF에 의한 질량분석을 수행하였다. FT-IR 스펙트럼에서는 1720.45㎝-1에 있는 피크(peak)를 제외하고 B-FOS와 FOS의 화학결합이 아주 비슷한 것을 알 수 있었다. 상기 피크는 B-FOS에만 갖고 있으며, 에스터결합을 이룬다 (도 3). 도 3은 B-FOS의 FT-IR 스펙트럼 결과이다. 즉, B-FOS는 에스터결합으로 부티르산(butyrate)과 FOS(fructooligosaccharides)가 결합된 물질인 것이다.
MALDI-TOF 분석에서는 대조물질인 FOS가 글루코오스(glucose)에 프락토오스(fructose)가 결합된 GF2, GF3, GF4, GF5로 구성되어 있음을 확인하였다 (도 4의 A). B-FOS는 FOS의 구조에 부티릴(butyryl)기가 붙어있는 GF2-1B, GF2-2B, GF3-1B, GF3-2B, GF4-1B, GF4-2B, GF5-1B, GF5-2B로 구성되었다 (도 4의 B). 도 4는 FOS와 B-FOS의 MALDI-TOF 분석 결과이다 (A: FOS, B: B-FOS). 따라서, B-FOS는 FOS에 부티르산(butyrate) 분자가 한 개 또는 두 개가 에스터결합으로 결합된 물질로 확인되었다.
한편, 하기에서는 상기 GF2-1B, GF2-2B, GF3-1B, GF3-2B, GF4-1B, GF4-2B, GF5-1B, GF5-2B를 포함한 혼합물을 정제 분리하여 B-FOS로 사용하였으며, 프리바이오틱스로써의 B-FOS의 효과를 테스트하였다.
(4) 산성 및 열처리 조건에서 B-FOS의 변화
산성 조건에서의 B-FOS 분해 여부 확인을 위해 1N 염산용액으로 pH가 2, 3, 4로 조정된 900㎕의 인산완충용액 (phosphate buffer salin, PBS)과 100㎕의 10%(w/v) B-FOS 용액을 실온에서 30분, 1시간, 3시간 동안 반응시켰다. 열에 의한 분해 여부를 확인하기 위한 방법으로는 1%(w/v)의 B-FOS 용액 1㎖를 끓는 물에 15분 열처리하여 분해 여부를 확인하였다. B-FOS의 분해여부는 TLC를 통해 확인하였다. TLC 조건은 B-FOS 정제에서 사용된 조건과 동일하였다.
끓는 물에서 15분간 열 처리된 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS)과 B-FOS, pH 2-4로 조정된 PBS에서 30분, 1시간, 3시간 동안 노출된 B-FOS의 TLC 분석 결과, 열 처리된 FOS와 B-FOS는 TLC상 변화가 없는 것이 확인되었으며, 이와 같은 조건에서 안정한 것으로 보인다. 또한, 산성조건(pH 2-4)에서 B-FOS는 3시간까지 TLC상 변화가 없었으며, 이와 같은 조건에서 안정한 것으로 보인다 (도 5). 도 5는 산과 열처리에서 B-FOS의 안정성을 분석한 결과이다 (A: 끓는 물에서 15분간 열 처리된 프락토올리고당(fructo-oligosaccharides, FOS)과 B-FOS, B: pH 2-4로 조정된 PBS에서 30분, 1시간, 3시간 노출된 B-FOS).
< 실험예 1: 나트륨 부티르산(sodium butyrate, NaB ), FOS , B- FOS , 포도당이 장내 세균의 생장에 미치는 영향>
(1) 실험 배지 제조
본 실험에서 사용된 박테리아 균주는 하기 표 1에 나타내었다. 모든 균주는 균주 분양 공식 기관 또는 서울대학교 식품 미생물 연구실로부터 제공되었다. 비피도박테리아 8개 균주, 젖산균인 락토바실러스 균주 4개, lactis KCTC 2013 (Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 2013), 스트렙토코커스 터모필러스 (Streptococcus thermophilus) KCTC 3779는 0.05%(w/v)의 L-cysteine·HCl이 첨가된 MRS (de-Mann-Rogosa-Sharpe broth; Difco, Detroit, USA)에서 37℃, 18시간 마다 2회 계대배양 후 사용하였다. 그 외 균주는 BHIB (brain-heart infusion broth; Difco)에서 같은 배양조건으로 계대배양 후 사용하였다.
Test strains Abbreviation
Bifidobacteria
Bifidobacterium bifidum BGN4 B. bifidum BGN4
B. longum BORI B. longum BORI
B. catenulatum KCTC 3221 B. catenulatum
B. animalis KCTC 3219 B. animalis
B. adolescentis KCTC 3216 B. adolescentis
B. longum subsp. longum RD47 B. longum RD47
B. longum RD72 B. longum RD72
B. thermophilum KCCM 12097 B. thermophilum
Lactic acid bacteria
Lactobacillus casei KFRI 699 L. casei
L. acidophilus KCTC 3168 L. acidophilus
L. plantarum KFRI 708 L. plantarum
L. delbruekii subsp. bulgaricus KCTC 3635 L. bulgaricus
Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 2013 L. lactis
Streptococcus thermophilus KCTC 3779 S. thermophilus
Non- probiotic bacteria
Listeria monocytogenes ATCC 10115 L. monocytogenes
Staphylococcus aureus ACTC 6358 S. aureus
Escherichia coli KCTC 1039 E. coli
Clostridium butyricum KCTC 1871 C. butyricum
Enterococcus faecalis KCTC 3511 E. faecalis
Prevotella intermedia KCTC 5694 P. intermedia
Clostridium ramosum KCTC 3323 C. ramosum
Escherichia coli DH 5α E. coli DH 5α
Clostridium perfringens KCTC 3269 C. perfringens
Bacteroides thetaiotaomicron KCTC 5015 Bac . Thetaiotaomicron
균 생장 실험에 사용된 기본 배지는 당이 없는 BHIB (MB Cell, Los Angeles, CA, USA)이다. 기본 배지에 PBS와 NaB, FOS(BIFIDO), 포도당을 각각 첨가하여 B-FOS를 첨가한 배지와 비교하였다. NaB, FOS, B-FOS, 포도당은 멸균된 3차 증류수로 10%(w/v) 용액을 만든 후, 0.2㎛ 멤브레인 필터 (Pall Corporation, Michigan, USA)로 여과 후 사용하였다. 멸균된 당이 없는 BHIB에 각 물질의 농도가 1%, 0.5%(w/v)가 되도록 제조한 뒤 96-웰 플레이트에 198㎕씩 분주하였다.
(2) 미생물의 생장곡선 측정
활성화된 균의 배양 배지에 있는 포도당 혹은 다른 탄소원을 제거하기 위해, 배양균을 원심분리(15,000×g, 5분)하고 상등액을 버린 후 가라앉은 균체를 PBS(pH7.4)로 2번 세척하였다. PBS에 풀어진 균 현탁액을 96-웰 플레이트의 각 배지에 2㎕씩 접종한 후, Whitley jar gassing system (Don Whitley Scientific, Shipley, UK)을 사용하여 혐기 상태로 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 균의 증식은 배양액의 광학 밀도(optical density, OD) 값으로 확인하였으며, microplate reader (BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 600㎚에서 흡광도를 측정한 후 생장 곡선을 그렸다. 균의 생장은 물질의 농도가 1%(w/v)일 때 최대 OD600값을 비교하여 분석하였다. 균을 배양하지 않은 배지를 blank로 설정하였고, 3번 실험을 반복하여 평균으로 나타내었다. 배양된 균의 배양 상등액은 이후 실험에 사용하기 위하여 수집하였다.
물질의 농도가 1%(w/v)일 때, 14개 균주의 최대 OD600값을 비교하였다 (도 6 내지 10). 도 6은 비피도박테리아 균주 B. bifidum BGN4, B. longum BORI, B. catenulatum, B. animalis, B. adolescentis, B. longum RD47의 생장곡선을 측정한 결과이고, 도 7은 비피도박테리아 균주 B. longum RD72, B. thermophilum의 생장곡선을 측정한 결과이며, 도 8은 젖산균 L. casei, L. acidophilus, L.plantarum, S. thermophilus, L. lactis, L. bulgaricus의 생장곡선을 측정한 결과이고, 도 9는 비프로바이오틱 균주 L. monocytogenes, S. aureus, E.coli, E. faecalis, C.butyricum, P. intermedia의 생장곡선을 측정한 결과이며, 도 10은 비프로바이오틱 균주 C. perfringens, C. ramosum, E. coli DH5α, Bac. thetaiotaomicron의 생장곡선을 측정한 결과이다 (△: 0.5%(w/v) NaB, □: 0.5%(w/v) FOS, ○: 0.5%(w/v) B-FOS, ◇: 0.5%(w/v) glucose, ▲: 1%(w/v) NaB, ■: 1%(w/v) FOS, ●: 1%(w/v) B-FOS, ◆: 1%(w/v) glucose, ×: 증류수 (sterile DI water)).
실험 결과, 양성대조군으로 포함된 포도당은 실험에 사용된 모든 균에서 이용되었다. 탄소원이 없는 기본 배지는 음성대조군으로 사용되었으며, 음성대조군과 NaB가 포함된 배지에서 배양된 균은 양성대조군보다 낮은 수준으로, 대부분 잘 생장하지 못하였다. 특히, 음성대조군에서 프리바이오틱이 아닌 균주(non-probiotics)에 속하는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus, OD600=0.36)와 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum, OD600=0.49)은 1%(w/v)의 NaB가 존재할 때, 최대 OD600값이 각각 0.25, 0.42로 균의 생장이 유의하게 저해된 결과를 나타내었다.
실험에 사용된 비피도박테리아는 양성 대조군인 포도당과 기존에 프리바이오틱스로 잘 알려진 FOS 첨가에 의하여 생장이 촉진되었다. 한편, B-FOS는 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum), 비피도박테리움 애니말리스 (B. animalis) 및 비피도박테리움 애덜레센티스 (B. adolesentis)의 생장을 현저하게 촉진하였다 (도 6 내지 7).
또한, B-FOS는 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)와 스트렙토코커스 터모필러스 (Streptococcus thermophilus)의 생장에 현저히 기여하였으며 다른 실험 유산균의 성장에도 어느 정도 도움이 되었다 (도 8).
한편, FOS는 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus)과 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)를 제외한 대다수의 비프로바이오틱(non-probiotic) 균주의 생장을 현저히 촉진하였다. 반면, B-FOS는 음성대조군과 비교하여 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 박테로이데스 테타이오타오마이크론 (Bacteroides thetaiotaomicron)을 제외한 대부분의 비프로바이오틱스 균의 성장에는 별로 기여하지 않았다. 결과적으로 B-FOS는 비피도박테리움 (Bifidobacterium)에 대하여 성장을 촉진하면서 비프로바이오틱스 균에 대하여는 이용이 미미한 프리바이오틱스 소재로서의 특성을 나타내었다 (도 9 내지 10).
< 실험예 2: 장내 균의 B- FOS 이용 및 분해>
(1) 배지의 탄소원 종류에 따른 균 배양 상등액 분석
비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)의 배양액을 박층크로마토그라피로 분석하여 균에 의해 소비된 탄소원을 비교하였다. TLC 조건은 B-FOS 정제에서 사용된 조건과 동일하다. 또한, 대사산물의 분석을 위하여 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis), 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum), 대장균 (E. coli), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RD47의 배양 상등액을 고성능액체크로마토그라피 (HPLC)로 분석하였다.
장내 세균이 B-FOS를 분해 및 발효하여 에너지원으로서 소비하였는지를 분석하기 위하여, 젖산(lactic acid)과 초산(acetic acid), 부티르산(butyric acid)의 생성 여부를 확인하였으며, 외부 표준물질들을 시료와 같은 조건에서 분석하여 각각 4가지 농도에서 검량곡선을 작성하였다. 대조군은 균을 넣지 않은 배지로 설정하였다. YL9100 HPLC system (Younglin, Anyang, South Korea)이 사용되었고, Aminex HPX-87H column, 300×7.8㎜ column (Bio-rad, California, USA)을 사용하였다. 이동상으로는 5mM 황산이 사용되었고 유속은 0.6㎖/min, 컬럼 온도는 50℃로 유지하였다. 모든 배양액은 PVDF Acrodisc syringe filter (0.2㎛, 13㎜, Pall Corporation, Michigan, USA)로 여과하고 20㎕를 주입하였다. 이후 실험의 모든 HPLC는 이와 같은 조건으로 행해졌다. 표 2는 젖산(lactic acid)과 초산(aceic acid), 부티르산(butyric acid)의 HPLC 분석 조건을 나타낸 것이다.
Instrument YL9100 HPLC system
Column Aminex HPX-87H column 300 ×7.8 ㎜
Mobile phase 5 mM H2SO4
Flow rate 0.6 mL/min
Temperature 50℃
Detection Refractive Index(RI)
Injection volume 20 ㎕
탄소원으로써 FOS, B-FOS, 포도당을 각각 포함한 배지에서 배양된 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)의 배양 상등액 TLC의 결과, 균을 접종하여 배양했을 때 균을 접종하지 않았을 때에 비하여 배양 상등액에서 탄소원인 FOS, B-FOS, 포도당의 밴드가 없어지거나 밴드의 세기가 약해지는 결과를 보였다 (도 11). 도 11은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)의 배양 상등액 TLC의 결과이다.
B-FOS는 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)보다 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 배양했을 때 밴드의 세기가 더 약해지는 결과를 나타냈다. 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) BORI를 포함하여 B-FOS 배지에서 생장이 촉진됐던, 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum) 균 4개와 생장이 촉진되지 않았던, 대장균 (E. coli), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RD47, 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)균 3개의 배양 상등액에 있는 젖산, 초산, 부티르산을 고성능액체크로마토그라피로 확인한 결과는 표 3에 나타내었다.
Figure 112018044874640-pat00001
NaB에서 배양된 모든 균주의 배양액에서는 부티르산이 검출된 반면, FOS와 포도당이 첨가된 배지에서는 모든 균주에서 많은 양의 초산과 젖산이 검출되었고 초산에 비해 젖산의 양이 더 많았다. B-FOS 배지는 FOS와 포도당이 첨가된 배지에서 검출되지 않은 부티르산이 대장균 (E. coli), 비피도박테리움 롱검 (B. longum) RD47을 제외한 모든 균주의 배양 상등액에서 검출되었다. 특히, B-FOS에 의해 생장이 촉진됐던 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum) 등의 B-FOS 이용균들은 B-FOS를 대사 및 분해하고 발효함으로써 에너지 생산 및 균체의 성장에 활용할 수 있음을 유추하였다.
(2) B- FOS와 균 배양 상등액, 균체, 균체 파쇄액의 반응
균에 의한 B-FOS의 가수분해 여부를 더욱 확인하기 위하여 사용된 균주는 비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)이다. 균 현탁액은 원심분리하여 균체와 배양액을 분리하였다. 균체는 PBS로 2회 세척한 후 PBS에 현탁한 현탁물을 사용하였다. 균체 파쇄액은 PBS에 현탁한 현탁물을 초음파 파쇄기 (Qsonica, Newtown, CT. USA)로 5분 간격으로 (amp 38%) 10분 동안 파쇄한 후 원심분리(15,000×g, 10분)하고 상등액을 균체 파쇄액으로 사용하였다. 대조군은 균이 들어가지 않은 그룹으로 설정하였다. 120㎕의 균 배양액, 균체 현탁액, 균체 파쇄액을 각각 10%(w/v)의 B-FOS, FOS 용액 20㎕와 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, 끓는 물에 10분 동안 가열하여 반응을 중지시켰다. TLC를 통해 반응 전, 후 결과를 비교하였으며, 부티르산의 분해 여부는 HPLC를 이용하여 분석하였다.
비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum) BGN4, 락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 엔테로코커스 패칼리스 (E. faecalis)의 균체, 균 파쇄액, 균 배양액을 FOS, B-FOS와 각각 반응시켜 봄으로써 균에 의한 B-FOS의 분해 여부를 TLC로 확인하였다 (도 12). 도 12는 FOS, B-FOS 반응 전 (A)과 후 (B)의 균체, 균 파쇄액, 균 배양액 TLC 분석 결과이다.
실험 결과, FOS는 모든 반응에서 반응 전, 후 TLC 상 변화가 없었다. 한편, 균체와 균 파쇄액을 B-FOS와 반응시켰을 때, 반응 전에 비하여 3개의 균주에서 모두 FOS의 밴드가 생성된 것을 확인할 수 있었고, 균 배양 상등액과 반응했을 때는 확인되지 않았다. HPLC를 통해 부티르산의 검출 여부를 분석한 결과는 표 4에 나타내었다.
Figure 112018044874640-pat00002
3개의 균주 모두 균체와 균 파쇄액이 B-FOS와 반응했을 때 부티르산이 검출되었지만, 균 배양 상등액과 반응했을 때는 검출되지 않았다. 또한, 분석된 균에 의하면 이러한 반응은 분석된 모든 균에서 발생하였음을 확인할 수 있었다. 따라서, B-FOS를 가수분해하는 요인은 균체의 세포벽 혹은 세포 내에 있는 것으로 사료된다. 이로써, B-FOS로부터 생성된 FOS와 부티르산이 균의 생장에 영향을 미쳤을 것으로 예측할 수 있다.
< 실험예 3: B- FOS가 장세포의 증식에 미치는 영향>
(1) 배지 조성에 따른 Caco -2 세포 생장의 변화
높은 농도의 포도당 (4.5g/L)을 함유한 Caco-2 세포의 표준 배양 배지에서 세포 생장의 에너지원으로써 포도당이 주로 사용되는 현상을 배제하기 위하여 포도당이 없는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 높은 농도의 포도당 (4.5g/L)과 피루브산이 존재하는 조건일 때의 세포 생장을 비교하였다.
NaB, FOS, B-FOS는 PBS를 이용하여 10%(w/v) 용액으로 만든 후, 0.2㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 높은 농도의 포도당 (4.5g/L)과 피루브산이 함유된 (Glu+Pyr+) DMEM 배지와 함유되지 않은 (Glu-Pyr-) DMEM 배지에 NaB, FOS, B-FOS가 각각 0.005~0.06%(w/v)가 되도록 제조한 후 실험에 사용하였다.
25㎠ 플라스크 (SPL Life Science, Pocheon, South Korea)에 5×105 세포로 1.5mL씩 접종하고 50%의 융합성(confluent)을 보일 때까지 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 이후, 0.005~0.06%(w/v)의 NaB, FOS, B-FOS가 첨가된 배지로 교체 후 같은 조건에서 4일 동안 배양하였다. 배양 상등액은 실험에 사용하기 위해 수집하였고 부착 세포는 PBS로 2회 세척하고, trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 플라스크에서 분리하였다. 분리된 세포는 0.4% trypan blue 용액으로 염색하여 hematocytometer (Marienfeld-Superior, Berlin, Germany)로 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 대조군은 PBS를 첨가한 배지로 설정하였고, 3회 실험을 반복하여 평균으로 나타내었다.
실험 결과, 높은 농도의 포도당 (4.5g/L)과 피루브산이 함유된 (Glu+Pyr+) 배지에 NaB를 첨가하였을 때는, 0.005%, 0.04%, 0.06%(w/v)의 농도에서 대조군에 비해 각각 약 30%, 50%, 65%의 세포 수가 유의하게 감소하였다 (도 13의 A). 한편, 포도당과 피루브산을 함유하지 않은 (Glu-Pyr-) 경우는 0.005%, 0.02%(w/v)에서 세포 수가 증가하는 양상을 보였지만, 0.04%(w/v)까지 대조군과 유의한 차이가 없었다. 하지만 0.06%(w/v)의 농도에서는 대조군보다 35% 감소하여 유의한 낮은 결과를 보였다 (도 13의 B). FOS를 첨가한 배지에서는 Glu+Pyr+배지와 Glu-Pyr-배지 모두에서 유의한 차이가 없었다 (도 13의 C, D). B-FOS를 첨가했을 때, Glu+Pyr+배지와 Glu-Pyr-배지는 모두 0.02%(w/v)까지 대조군과 유의한 차이를 보이지 않았으나, 0.06%(w/v)의 농도에서 각각 약 1.5배, 1.7배로 세포수가 유의하게 증가한 결과를 보였다 (도 13의 E, F). 도 13은 포도당과 피루브산의 유무에 따라 NaB, FOS, B-FOS를 0~0.06%(w/v)의 농도로 첨가하여 4일 동안 배양한 후, 각 물질의 농도에 따른 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다 (A: Glu+Pyr+NaB+, B: Glu-Pyr-NaB+, C: Glu+Pyr+FOS+, D: Glu-Pyr-FOS+, E: Glu+Pyr+B-FOS+, F: Glu-Pyr-B-FOS+). 이는, B-FOS가 Caco-2 세포의 에너지원으로써 이용되어 장 상피세포의 증식을 촉진했음을 의미한다.
(2) Caco -2 세포의 B- FOS 이용 및 분해 여부
대체 가능한 에너지원의 존재에 따른 Caco-2 세포의 B-FOS 이용 여부를 더욱 확인하기 위하여, 수집한 Caco-2 세포 배양액을 TLC로 분석하여 소비된 탄소원을 확인하였고, HPLC를 통해 부티르산의 존재 여부를 조사하였다 (도 14). 도 14는 FOS와 B-FOS가 포함된 배지에서 Caco-2 세포를 배양한 후 배양 상등액을 TLC로 분석한 결과이다.
실험 결과, Glu+Pyr+ 배지에 존재하는 포도당 밴드는 배양한 후 모든 배지에서 완전히 사라졌으나 FOS는 Glu+Pyr+ 배지와 Glu-Pyr- 배지에서 모두 TLC 상 변화가 없었다. B-FOS가 포함된 Glu+Pyr+ 배지와 Glu-Pyr- 배지의 배양 상등액에서는 FOS 밴드가 생성됨을 확인하였고, Glu+Pyr+ 배지보다 Glu-Pyr- 배지일 때 더 뚜렷한 밴드를 나타내었다. B-FOS 밴드는 Glu-Pyr- 배지에서 다소 사라지는 결과를 볼 수 있었다. 따라서, B-FOS는 Caco-2 세포에 의해 이용되었음을 확인할 수 있었고, 이용 결과 FOS가 생성됨을 확인할 수 있었다. 배양 후 수집한 세포 배양액과 세포 파쇄액에서 부티르산 존재 여부를 확인한 결과에서는 두 경우 모두 부티르산이 검출되지 않았다. 이는, 배양 시 분해된 부티르산은 배양과정에서 세포에 의해 이용된 것으로 판단된다.
Caco-2 세포에 의한 B-FOS의 분해 여부를 확인하기 위하여 일반 배지에서 배양된 Caco-2 세포의 배양 상등액을 세포 배양액으로 사용하였다. 세포 현탁액은 trypsin/EDTA를 처리하여 분리된 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS에 현탁한 현탁물을 사용하였고, 현탁물을 초음파 파쇄기를 이용하여 4분 간격으로(amp 25%) 8분 동안 파쇄하여, 원심분리 후 얻은 상등액을 세포 파쇄액으로 사용하였다. 450㎕의 세포 배양액, 현탁액, 파쇄액은 10%(w/v) FOS, B-FOS 50㎕와 3시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 분해 여부는 TLC를 통해 반응 전과 후를 비교하였으며, HPLC를 이용하여 B-FOS로부터 부티르산의 분해 여부를 분석하였다 (도 15). 도 15는 Caco-2 세포의 배양 상등액, 세포 현탁액, 세포 파쇄액에 FOS와 B-FOS를 각 반응시킨 후 TLC를 통해 확인한 결과이다.
실험 결과, FOS는 모든 반응에서 반응 전, 후 TLC 상 변화가 없었다. 한편, B-FOS와 반응시킨 세포 배양 상등액, 세포 현탁액, 세포 파쇄액에서 모두 FOS 밴드의 생성이 확인되었다. HPLC를 통해 B-FOS로부터 부티르산의 분해 여부를 확인하기 위해 분석한 결과, B-FOS와 반응한 세포 배양액, 세포 현탁액, 세포 파쇄액에서 미량의 부티르산이 확인되었다.
(3) MTT (3-(4, 5- dimethylthiazol -2- yl ) 2, 5- diphenyltetrazolium bromide) 분석에 의한 세포 생존율 측정
B-FOS로 유도되는 세포독성을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. Caco-2 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2,000 세포의 농도로 100㎕씩 분주하여 48시간 동안 37℃로 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 이후, 기존 배지를 제거하고, 0.02~0.1%(w/v) 농도의 NaB, FOS, B-FOS가 첨가된 배지 180㎕로 교체하고 24시간, 48시간, 72시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후 5mg/mL MTT 용액 20㎕를 각 웰에 가하여 다시 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 제거하였다. 형성된 결정은 100㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 가하여 용해시키고 750㎚에서 microplate sperctrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 물질을 처리하지 않은 대조군에 대한 백분율로 산출하였고 4회 실험을 반복하여 평균을 나타내었다 (도 16). 도 16은 NaB, FOS, B-FOS가 Caco-2 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT 분석을 실시하여 세포독성을 확인한 결과이다.
실험 결과, NaB는 48시간 후 0.1%(w/v)의 농도에서 세포 생존율이 81±15%로 유의하게 감소하였다. 또한, 72시간 후 0.1%(w/v) 농도에서는 45±6.9%까지 유의하게 감소하였다. 반면, FOS와 B-FOS는 72시간 동안 실험된 모든 농도에서 대조군과 유의한 차이가 나타나지 않았으며, 0.1%(w/v)의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다.
< 실험예 4: ICR 마우스 경구투여 시, B- FOS의 급성독성실험>
B-FOS의 급성독성실험을 위하여, 마우스 총 40마리를 8군으로 나누어 실험을 진행하였다. 반입 후에 1주간의 적응기간을 거쳤으며, B-FOS을 경구투여하기 전 3~4시간 동안과, 투여 후 1~2시간 동안 금식시켰다. B-FOS는 한 번만 투여하였으며, 투여 후 14일 동안 관찰하였다. 각 8군이 섭취하는 물질은 다음과 같다.
1군: 대조군 (암컷 5마리); 2군: 대조군 (수컷 5마리); 3군: 500mg/kg B-FOS 경구투여 (암컷 5마리); 4군: 500mg/kg B-FOS 경구투여 (수컷 5마리); 5군: 1000mg/kg B-FOS 경구투여 (암컷 5마리); 6군: 1000mg/kg B-FOS 경구투여 (수컷 5마리); 7군: 2000mg/kg B-FOS 경구투여 (암컷 5마리); 8군: 2000mg/kg B-FOS 경구투여 (수컷 5마리). 실험 종료일인 3주 후에 이산화탄소 과호흡으로 안락사를 유도하여 해부하였다. 마우스 무게와 간장, 신장, 비장의 계수를 측정하고, 혈액 화학 분석 및 조직 분석을 진행하였으며, 각각의 무게를 표 5에 나타내었다.
Groups Body weight (g) Liver (mg/g) Spleen (mg/g) Kidney (mg/g)
Before After
Male
Control 35.04 ±4.17 41.06 ±6.55 41.06 ±9.51 3.84 ±1.02 7.18 ±1.54
500 mg/kg 34.80 ±0.67 39.58 ±2.32 39.58 ±7.09 3.57 ±1.48 7.55 ±1.55
1000 mg/kg 34.04 ±1.25 38.72 ±1.61 38.72 ±5.12 4.66 ±1.20 7.76 ±0.33
2000 mg/kg 36.28 ±4.65 42.14 ±5.98 42.14 ±4.13 4.25 ±0.90 7.52 ±1.32
Female
Control 27.96 ±1.47 31.56 ±0.79 45.67 ±3.34 3.79 ±1.33 7.59 ±1.66
500 mg/kg 27.86 ±2.67 32.18 ±3.00 47.90 ±2.53 4.32 ±1.52 6.86 ±1.30
1000 mg/kg 26.94 ±1.78 30.20 ±1.48 47.07 ±4.54 4.00 ±1.60 6.65 ±2.46
2000 mg/kg 26.60 ±1.76 30.82 ±1.65 46.34 ±7.89 3.91 ±1.48 7.16 ±1.52
측정 결과, 수컷 그룹이나 암컷그룹 내에서 체중에 유의한 차이는 없었다. 또한, 수컷 그룹 또는 암컷 그룹 내에서 간, 비장 및 신장의 계수에서 유의한 차이는 발견되지 않았다. 계수가 유의하게 증가하였다는 것은, 염증이 유발될 수 있음을 의미한다.
감염이나 질병의 존재와 관련된 몸의 기능적 변화지수는 혈청의 생화학적 변수로 평가할 수 있다. 따라서, 본 실험에서는 0, 500, 1000 및 2000㎎/㎏의 투여량으로 B-FOS에 노출된 후의 암컷 마우스 및 수컷 마우스의 혈청에서 생화학적 지표를 나타냈다 (도 17). 도 17은 B-FOS에 노출된 후의 암컷 마우스 및 수컷 마우스의 혈청에서 생화학적 지표를 나타낸 결과이다. 구강 투여 후 알부민, TBIL 및 AST와 ALP 효소 (p>0.05)의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이 변수는 간 기능과 관련이 있다. 신장 독성은 BUN과 Cr로 알 수 있는데, Bun과 Cr의 상승이 관찰되지 않은 것으로 보아 신장에 의한 손상은 없는 것으로 예측할 수 있다. 세포막 손상 및 조직 손상은 LDH로 평가하였는데, 암컷이나 수컷 군에서 LDH의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
심장, 간, 신장, 폐, 비장, 위, 고환 및 난소 조직의 조직 병리학적 결과는 도 18 내지 24에서 확인할 수 있듯이, 조직에 비정상적인 병리학적 변화는 없었다. 도 18은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 심장 조직 염색 결과이고, 도 19는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 신장 조직 염색 결과이며, 도 20은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 간 조직 염색 결과이고, 도 21은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 폐 조직 염색 결과이며, 도 22는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 비장 조직 염색 결과이고, 도 23은 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 위 조직 염색 결과이며, 도 24는 B-FOS를 투여한 ICR 마우스의 고환과 난소 조직 염색 결과이다 ( (A)~(D): 수컷 마우스, (E)~(H): 암컷 마우스, 왼쪽에서부터 대조군(control), 500㎎/㎏, 1000㎎/㎏, 2000㎎/㎏).
< 실험예 5: B- FOS가 ICR 마우스의 변 속 균과 맹장 속 단쇄지방산 (short chain fatty acid) 함량에 미치는 영향>
B-FOS가 ICR 마우스의 변 속 균과 맹장 속 단쇄지방산(short chain fatty acid) 함량에 미치는 영향을 살펴보기 위하여, 마우스 총 16마리를 2군으로 나누어 실험을 진행하였다. 반입 후에 1주간의 적응기간을 거친 다음, 2주차부터는 각 그룹에 해당하는 식이를 1주일간 섭취시킨 후, 변을 채취하였다. 이 과정을 총 4주간에 걸쳐서 시행하였다. 실험동물의 관찰 빈도는 식이섭취량 조사와 동물상태를 관찰하기 위해 최소 1일1회 방문하여 관찰하였다. 각 2군이 섭취하는 물질은 다음과 같다. 1군: 일반식이; 2군: 일반식이 및 0.5% B-FOS.
마우스 맹장의 변에 short chain fatty acid 분석하기 위하여, YL9100 HPLC system(Younglin, Anyang, South Korea)을 사용하였고, Aminex HPX-87H column, 300 ×7.8 ㎜ column (Bio-rad, California, USA)을 사용하였다. 이동상으로는 5mM 황산이 사용하였고, 유속은 0.6 mL/min, 컬럼 온도는 50℃로 유지하였다. 모든 배양액은 PVDF Acrodisc syringe filter (0.2 μm, 13 mm, Pall Corporation, Michigan, USA)로 여과하고 20 ㎕ 주입하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
Lactic acid(mM) acetic acid (mM) butyrate (mM)
Control 4.39±0.80 4.33±1.61 0
B-FOS 5.66±2.45 6.30±2.84 18.36±2.99
실험결과, B-FOS가 없는 일반식이 (control)군과 비교하면 B-FOS 실험군의 단쇄지방산 농도가 높았다. 젖산(Lactic acid), 아세트산(acetic acid), 부티레이트(butyrate) 모두가 증가하였고, 특히, 부티레이트는 대조군에 비하여 B-FOS 실험군에서 현저히 높은 농도 (18.36±2.99mM)로 검출되었다.

Claims (9)

  1. 부티릴 프락토올리고당 (butyryl-fructooligosaccharides)을 포함하며,
    상기 부티릴 프락토올리고당은 글루코오스에 프락토오스가 2 ~ 5개 결합한 프락토올리고당에 부티릴(butyryl) 작용기가 1 ~ 2개 결합한 것이며,
    상기 부티릴 작용기는 상기 글루코오스 또는 프락토오스의 수산화(hydroxy)기에 에스터결합(ester bond)으로 결합한 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은,
    장내 유익균의 증식을 촉진하고 장내 유해균의 생육을 억제하는 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유익균은,
    비피도박테리움 (Bifidobacterium), 유산간균 (Lactobacillus), 유산구균 ( Lactococcus) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 중 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 비피도박테리움 (Bifidobacterium)은,
    비피도박테리움 비피덤 (Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 카테눌라텀 (Bifidobacterium catenulatum)과 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 유산간균 (Lactobacillus)은,
    락토바실러스 카세이 (Lactobacillus casei), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 스트렙토코커스 (Streptococcus)는,
    스트렙토코커스 터모필러스 (Streptococcus thermophilus)인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
  9. 제4항에 있어서,
    상기 유해균은,
    스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum), 프리보텔라 인터메디아 (Prevotella intermedia) 및 클로스트리디움 라모숨 (Clostridium ramosum) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
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