CN103575882B - 全血的标记免疫分析方法和即时检测*** - Google Patents

全血的标记免疫分析方法和即时检测*** Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及从全血中通过特异性结合反应快速采集目标物并通过标记技术对目标物进行标记和监测的全血的标记免疫分析方法，以及一种即时检测***。所述方法包括以下步骤：1）磁珠捕获；2）血液洗脱；3）检测抗体的标记；4）检测抗体的洗脱；和5）检测。所述***包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的磁珠、废液出口和洗脱液贮液池，所述微通道通过隔断机构阶段性隔离为第一反应区域、第二反应区域和检测区。本发明提供的技术方案具有灵敏度高、重复性好、***结构简单、成本低等特点，可以快速的从微量血液样本中定量检测出目标物。

Description

全血的标记免疫分析方法和即时检测***
技术领域
本发明属于快速标记免疫分析技术，具体涉及从全血中通过特异性结合反应快速采集目标物并通过标记技术对目标物进行标记和监测的方法，以及一种即时检测***。
背景技术
标记免疫技术具有选择性高、灵敏度高、普适性好等优点，主要包括放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术，采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。
即时检测（Point-of-caretesting,POCT）是指在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类方法。POCT中免疫分析方法目前已广泛用于医疗卫生、环境监测、反恐等领域的快速检测，POCT检测常用的对象是全血样本，并且样品量极少，其较常用的方法是通过毛细管作用驱动血液透过多孔膜实现血细胞与血浆的分离，分离得到的血浆进一步在毛细管作用下进入反应装置，完成免疫检测。
按照惯例，血浆可以通过离心法从全血中分离出来，但离心法很耗时，需要特种设备，不适合用于即时测试中。为了避免这个问题，一般采用具有微孔滤质的机械式过滤器分离血浆和红细胞，文献CN101918137A中公开了一种类似的采用过滤材料的分离装置，但由于微孔阻塞的问题，该分离方法会造成检测样品的损失，因此对于只有极少量样品的POCT并不适用。
POCT装置由于受到小体积、低成本和使用便捷等要求的限制，在极少的样品量的情况下，无法准确控制检测过程和剔除背景干扰，检测的可靠性与精度大大降低。例如，在用吸收膜做为样品和反应试剂载体的方法中难以准确控制控制反应试剂进入检测装置的流速以及在各个特定反应腔中停留的时间，并且常缺乏充分的洗脱以消除非特异性吸附造成的背景干扰。在基于微流控芯片的检测中，为了充分洗脱、准确控制样品及反应试剂的流速和反应时间常需要复杂的阀控结构，增加了装置的体积、成本和复杂度，同时降低了检测***的可靠性。
因此只有中心实验室的大型仪器才具有高灵敏度、高重复性以及准确定量的能力，可以获得准确的实验数据，但其与快速检测方法相比，设备体积大，成本高，检测时间长。
超顺磁性纳米微球（superparamagneticsnanospheres/particles/beads）简称磁珠，是由SenyeiAE在1978年首先研制出来的一种新型的功能性材料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；而微球外部是一层包覆层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联。用于生化分析的磁珠具有以下特点：1)超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象，文献CN102333595A中即公开一种使多个顺磁颗粒在小体积液体中团聚并随后均匀分布的方法；2)合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；3)具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是目前的即时检索方法灵敏度、稳定性和可重复性低，为了克服以上不足，提供了一种全血的快速免疫分析方法和即时检测***。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述全血的快速标记免疫分析方法，包括以下步骤：
1）磁珠捕获：抗凝剂处理的全血样本与负载捕获抗体的磁珠在第一反应区域混合，所述捕获抗体与全血样本中待测抗原结合形成一抗免疫复合物；
2）血液洗脱：施加磁场将一抗免疫复合物聚集、洗脱液替换掉流体；
3）检测抗体的标记：施加磁场将磁珠转移至第二反应区域，采用标记免疫技术，检测抗体与一抗免疫复合物的待测抗原反应形成二抗免疫复合物；
4）检测抗体的洗脱：施加磁场将二抗免疫复合物聚集，加入洗脱液将未结合的检测抗体洗脱；和
5）检测：施加磁场将步骤4）清洗后的二抗免疫复合物移入检测区并进行检测。
本发明的分析方法中摒弃了血液的机械式过滤器分离方法，比如通过多孔过滤膜。虽然多孔过滤膜与离心分离技术相比更适合POCT的需求，但分离后的血浆一般不到初始血液体积的15%，大类目标物损失在分离过程中，因而降低了检测***的灵敏度，并且多孔过滤膜的使用增加了***的复杂度，降低了检测的可重复性。而本发明直接将负载捕获抗体的磁珠与抗凝血液混合，捕获抗体与血液中目标物相结合，然后通过磁场将其聚集固定，通过洗脱液将其从血液中分离出来，减少了分离过程中的目标物损失，大大提高了检测灵敏度。
优选地是，在步骤1）和/或步骤3)中，通过磁力变化使磁珠快速运动，促进捕获抗体与待测抗原之间和/或检测抗体与待测抗原之间的结合。通过磁力的变化，比如磁极的变化、磁场的施加与撤销等，从而磁珠在体系内快速运动。
优选地是，所述标记免疫技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术（CLIA）。所述酶免疫标记技术或化学发光免疫技术均可用于定量测定。
所述酶免疫标记技术是指酶标记抗体或酶标记抗体进行的抗原抗体反应，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。
所述化学发光免疫技术是利用化学或生物发光***作为抗原抗体反应的指示***，借以定量检测抗原或抗体的方法，发光物质可直接作为抗原抗体的标记物，也可以游离形式用于催化剂（酶）和辅助剂标记的抗原或抗体的发光反应中。
优选地是，所述全血样本的体积为2～20微升。由于采用了新的全血分离方法，使得全血样本的体积大大减少，非常有利于小型化的POCT检测。
本发明还提供了一种即时检测***，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的负载捕获抗体的磁珠、设置在微通道一端的废液出口和设置在微通道另一端的洗脱液贮液池，所述微通道通过隔断机构阶段性隔离为第一反应区域、第二反应区域和检测区，所述第一反应区域设置血液进样口，所述第二反应区域与标记所需物质相关的贮液池相连，所述检测装置对检测区内物质进行检测。
本发明提供的检测***不再依赖毛细管作用力驱动样本的流动。依赖毛细管驱动需对微通道进行表面处理，而这种表面处理往往难以准确控制样品流速及在各个特定位置的停留时间，并且这种表面改性难以长久保持，因而造成检测的可重复性和稳定性低。本发明通过磁场的控制来准确引导样本的移动和定位，通过隔断机构保证样本在特定位置的停留时间，避免了交叉干扰，***简单且控制简便，***稳定性和重复性好。
优选地是，所述隔断机构为阀或插片。隔断方法简单易行，效果显著。
优选地是，所述废液出口设置在微通道上第一反应区域所处一端，所述洗脱液贮液池设置在微通道上检测区所处一端。
优选地是，所述微通道内第一反应区域与第二反应区域之间还设置有物理斜坡，所述物理斜坡的垂直障碍高度为0.1-2mm。所述物理斜坡防止剩余的滞留物从第一反应区域的下部部分流入第二反应区域，只有通过磁场转移的磁珠可以顺利从第一反应区域进入第二反应区域，进一步降低了***的背景噪音。
优选地是，所述第一反应区域部分的所述第一反应区域部分的体积为2-40微升。
优选地是，所述磁场产生装置的磁场由永磁铁或电磁铁提供。
需要指出的是，虽然全血检测采用发明的技术方案的技术效果最为显著，但本领域技术人员可以了解，血清或血浆来源的样品同样适合本发明提供的技术方案。
本发明提供的技术方案具有灵敏度高、重复性好、成本低等特点，可以快速的从微量血液样本中定量检测出目标物。
附图说明
图1是本发明所述即时检测***一具体实施方式的结构示意图；
图2是本发明所述微通道一具体实施方式的结构示意图；
图3是本发明所述全血的标记免疫分析方法一具体实施方式中步骤1）的过程示意图；
图4是本发明所述全血的标记免疫分析方法一具体实施方式中步骤2）的过程示意图；
图5是本发明所述全血的标记免疫分析方法一具体实施方式中步骤3）的过程示意图；
图6是本发明所述全血的标记免疫分析方法一具体实施方式中步骤4）的过程示意图；
图7是本发明所述全血的标记免疫分析方法一具体实施方式中步骤5）的过程示意图。
图中所示：11-微通道，111-隔断机构，112-第一反应区域，113-第二反应区域，114-检测区，115-物理斜坡，116-检测抗体贮液池，117-发色底物贮液池，118-检测窗口，12-负载捕获抗体的磁珠，13-废液出口，14-洗脱液贮液池，15-血液进样口，21-上电磁铁，22-下电磁铁，31-全血样本，32-待测抗原，33-检测抗体，34-二抗免疫复合物,35-一抗免疫复合物。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述：
实施例中样品、反应试剂及检测仪器的来源如下：
全血样本：30份带有***特异性抗原（PSA）的血液，抗原浓度分别为0pg/ml，5pg/ml，10pg/ml，50pg/ml，150pg/ml，500pg/ml，1.5ng/ml，5ng/ml，50ng/ml和150ng/ml，每种浓度3个样本，全血样本由不同量的***特异性抗原（PSA）标准品（美国R&DSystems公司）加入到经乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝处理后的健康人的血液中获得。可用的抗凝处理剂还包括柠檬酸、肝素等。
方法或***中采用的负载捕获抗体的磁珠为美国solulink公司的NanoLinkTMStreptavidinMagneticBeads（直径约0.8μm）与MagnaLinkTMStreptavidinMagneticBeads（直径约2.8μm），生物素化的针对PSA的捕获抗体（购自美国R&DSystems公司）通过与磁珠直接混合实现捕获抗体在磁珠上的负载，酶标检测抗体为辣根过氧化物酶标记的针对PSA的抗体同样购自美国R&DSystems公司，辣根过氧化物酶的发色底物（SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate）购自美国Pierce公司。
光电倍增管（PMT）购自日本滨松公司。
如图1和2所示，本发明所述一种即时检测***包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下两方的磁场产生装置以及检测装置（图中未示）。
所述微流控芯片包括微通道11、设置在微通道11内的负载捕获抗体的磁珠12、废液出口13和洗脱液贮液池14，所述微通道11从左到右通过隔断机构111阶段性隔离为第一反应区域112、第二反应区域113和检测区114，所述废液出口13设置在微通道11上第一反应区域112所处的左端，所述洗脱液贮液池14设置在微通道11上检测区114所处的右端，所述第一反应区域112与第二反应区域113之间设置了物理斜坡115。
所述第一反应区域112部分的微通道内宽1mm，内高0.5mm，长度20mm，物理斜坡115的垂直障碍高度为0.2mm，承载的血液量为10微升；另一个实施例中第一反应区域112部分的微通道内宽1mm，内高4mm，长度10mm，物理斜坡115的垂直障碍高度为2mm，承载的血液量为40微升；另一实施例中第一反应区域112部分的微通道内宽1mm，内高0.2mm，长度10mm，物理斜坡115的垂直障碍高度为0.1mm，承载的血液量为2微升。
所述第一反应区域112设置血液进样口15，所述第二反应区域113设置了检测抗体贮液池116和发色底物贮液池117，所述检测区114设置了检测窗口118。需要指出的是，检测抗体贮液池116和发色底物贮液池117均属于与标记所需物质相关的贮液池，该贮液池可以根据情况增加或者减少，比如化学发光免疫技术或荧光免疫技术时，可能仅需要发光物质标记或荧光标记的检测抗体贮液池，另外，发色底物贮液池117也可以设置在检测区114，当免疫复合物移入检测区114内再加入发色底物，显色后检测。
本领域技术人员都很清楚，废液出口13、洗脱液贮液池14、血液进样口15、检测抗体贮液池116和发色底物贮液池117均通过单向阀结构与微通道11相通，可实现单向液体的流动。
所述隔断机构111为插片，插片根据需要***微通道11阻隔相邻的两个区域，防止相互干扰，当样品和反应试剂转移需要相邻区域相通时，只需将插片抽出。相邻区域设置阀结构也可以实现相似的作用，插片结构更简单，成本更低。
所述磁场产生装置的磁场由电磁铁提供，其包括设置在微通道11上方的上电磁铁21和设置在微通道11下方的下电磁铁22，上电磁铁21对磁珠施加第一磁场，下电磁铁22对磁珠施加第二磁场，所述第一磁场的极轴与微通道平行或者垂直，第二磁场的极轴与微通道的夹角可在0～90°之间变化，所述上电磁铁21和下电磁铁22可延微通道11方向移动，从而驱动和控制磁珠在微通道11内按要求移动和定位。电磁铁可通过电流的控制快速的施加和撤销磁场，效果较好，但永磁铁也可以通过移动与微通道的相对位置，使磁珠处于或脱离永磁铁的磁场实现相似的技术效果。
所述检测装置包括光电倍增管（PMT）、荧光分光光度计、电荷耦合器件（CCD）图像传感器和CMOS图像传感器。
结合上述即时检测***说明本发明所述全血的标记免疫分析方法过程：
步骤1），如图3所示，***插片111，将第一反应区域112和第二反应区域隔离113，全血样本31加入到微通道11内，全血样本31中的待测抗原32(即PSA)与负载捕获抗体的磁珠12上的捕获抗体结合形成一抗免疫复合物35；通过上电磁铁21和下电磁铁22对磁珠12交替施加第一磁场和第二磁场，磁珠在微通道11内快速上下运动，加速了与待测抗原32的结合，图中所示，第一磁场的极轴与微通道11平行，第二磁场的极轴与微通道11平行。
步骤2），如图4所示，待测抗原32(即PSA)与负载捕获抗体的磁珠12上的捕获抗体结合完全后，施加第一磁场，一抗免疫复合物35被吸附聚集在微通道11的上侧，抽出插片111，从右到左通入洗脱液，所述洗脱液为TBS+0.05％Tween-20+0.05％BSA，洗脱液替换了全血样本中的流体，待测抗原32被保留下来。需要指出的，也可以施加第二磁场将一抗免疫复合物35聚集在下侧进行洗脱。
步骤3），如图5所示，下电磁铁22对磁珠施加第二磁场，一抗免疫复合物35吸附聚集到微通道11的下侧，移动下电磁铁22沿微通道11从左到右移动，一抗免疫复合物35经过一段向上的物理斜坡115到达第二反应区域113，第二磁场的极轴与微通道11的夹角变为30°；进一步，***插片111，将第一反应区域112和第二反应区域113，以及第二反应区域113和检测区114之间进行隔断，通入酶标记的检测抗体33，检测抗体33与一抗免疫复合物35的待测抗原反应形成二抗免疫复合物34，移动上磁铁21和下电磁铁22到第二反应区域113，对磁珠交替施加第一磁场和第二磁场，磁珠在微通道11内快速上下运动，加速二抗免疫复合物34的形成。
步骤4），如图6所示，施加第二磁场，二抗免疫复合物34被吸附聚集在微通道11的下侧，抽出插片111，通入洗脱液将未反应的检测抗体33从体系中脱除，经过反复洗脱后，通入发色底物，与酶作用显色。
步骤5），如图7所示，移动下电磁铁22沿微通道11从左到右移动，二抗免疫复合物34到达检测区114，第二磁场的极轴与微通道11的夹角变为30°，检测装置通过检测窗口118进行化学发光检测，完成整个分析过程。
采用本发明所述分析方法和即时检测***对35份全血样本进行检测，每种浓度的全血样本的样品量均为20微升。
在全血样本中PSA的结果如下表1所示。检测灵敏度可低至10pg/ml，检测的动态范围为10pg/ml至150ng/ml，在50pg/ml以上的范围内检测CV值低于15%，在500pg/ml以上的的范围内检测CV值低于10%。
表1
浓度(pg/ml) 相对光单位(RLU) 校正值 变异系数(CV)
0 3.8
5 42.4 4.4 30.2％
10 42.6 4.6 25.2％
50 68.3 30.3 14.8％
100 130.3 92.3 11.1％
500 361.4 323.4 9.8%
1500 1208.8 1170.8 7.3%
5000 3892.2 3854.2 7.1%
50000 11177.1 11139.1 3.3%
150000 15409.4 15371.4 4.6%

Claims (10)

1.一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)磁珠捕获：抗凝剂处理的全血样本与负载捕获抗体的磁珠在第一反应区域混合，所述捕获抗体与全血样本中待测抗原结合形成一抗免疫复合物；
2)血液洗脱：施加磁场将一抗免疫复合物聚集、洗脱液替换掉流体；
3)检测抗体的标记：施加磁场将磁珠转移至第二反应区域，采用标记免疫技术，检测抗体与一抗免疫复合物的待测抗原反应形成二抗免疫复合物；
4)检测抗体的洗脱：施加磁场将二抗免疫复合物聚集，加入洗脱液将未结合的检测抗体洗脱；和
5)检测：施加磁场将步骤4)清洗后的二抗免疫复合物移入检测区并进行检测。
2.根据权利要求1所述一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，在步骤1)和/或步骤3)中，通过磁力变化使磁珠快速运动，促进捕获抗体与待测抗原之间和/或检测抗体与待测抗原之间的结合。
3.根据权利要求1或2所述一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，所述标记免疫技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术(CLIA)。
4.根据权利要求1或2所述一种全血的快速标记免疫分析方法，其特征在于，所述全血样本的体积为2～20微升。
5.一种即时检测***，其特征在于，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的负载捕获抗体的磁珠、设置在微通道一端的废液出口和设置在微通道另一端的洗脱液贮液池，所述微通道通过隔断机构阶段性隔离为第一反应区域、第二反应区域和检测区，所述第一反应区域设置血液进样口，所述第二反应区域与标记所需物质相关的贮液池相连，所述检测装置对检测区内物质进行检测。
6.根据权利要求5所述一种即时检测***，其特征在于，所述隔断机构为阀或插片。
7.根据权利要求5或6所述一种即时检测***，其特征在于，所述微通道内第一反应区域与第二反应区域之间还设置有物理斜坡，所述物理斜坡的垂直障碍高度为0.1-2mm。
8.根据权利要求7所述一种即时检测***，其特征在于，所述第一反应区域部分的体积为2-40微升。
9.根据权利要求5、6或8所述一种即时检测***，其特征在于，所述废液出口设置在微通道上第一反应区域所处一端，所述洗脱液贮液池设置在微通道上检测区所处一端。
10.根据权利要求9所述一种即时检测***，其特征在于，所述磁场产生装置的磁场由永磁铁或电磁铁提供。
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