TWI400446B - 免疫分析晶片 - Google Patents

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TWI400446B
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Gwo Bin Lee
Huan Yao Lei
Yu Fang Lee
Kang Yi Lien
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Univ Nat Cheng Kung
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01F31/31—Mixers with shaking, oscillating, or vibrating mechanisms comprising a receptacle to only a part of which the shaking, oscillating, or vibrating movement is imparted using receptacles with deformable parts, e.g. membranes, to which a motion is imparted
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Description

免疫分析晶片
本發明係關於一種微流體檢測晶片，更特別地，本發明係關於一種將微流體元件以特殊設計進行連結應用的微流體檢測晶片。
近年來，由於許多重大傳染病如急性嚴重呼吸道症候群(severe acute respiratory sydrome，SARS)在全世界所造成的傷害，使國人深受其苦，致使「疾病的即時檢測」成為全世界注目焦點。而傳統的生化檢測須透過繁複的操作方可獲得成果，在血清學研究方面的酵素連結免疫吸附法(enzyme-linked immunosobent assay，ELISA)技術之建立後，使疾病或病原的診斷有突破性的發展，診斷的歷程可於數天內確認結果。血清學分析上用ELISA檢測感染時期為生物所誘導的抗體反應，主要透過偵測免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)兩種免疫球蛋白。其中IgM在感染前期會大量表現，而IgG是感染後期才出現，通常作為曾經感染的指標。
目前疾病的鑑定以使用ELISA最為普遍，此法的基本原理係利用抗原-抗體之專一性結合，將酵素標記於抗原或抗體上，使其與相對應之抗原或抗體接合形成可供偵測之產物。但ELISA有著繁瑣的人為操作程序，且需消耗大量時間。此外，一次反應只能檢測單一指標如IgM或IgG，無法同時測IgM和IgG，因此若是欲檢測多個反應指標，則必須耗費大量檢體且需分批次操作。此外，人為操作增加了不可控制和誤差，導致組間變異增大，資料之可靠性降低。
生物晶片並未有明確的定義與分類，一般而言係指以矽晶片、玻璃或高分子為基材，配合微小化技術整合微機電、光電、化學、生化、醫學工程及分子生物學等領域，用以執行醫療檢驗、環境檢測、食品檢驗、新藥開發、基礎研究、軍事防禦、化學合成等用途的精密微小化設備。目前市面上將生物晶片分為基因晶片(gene chip)、蛋白質晶片(protein chip)及縮徵實驗室晶片(lab-on-a-chip)三大類。其中縮微實驗室晶片的功能則依不同的需求進行設計，在微晶片上進行不同的反應，目前已知可在微縮實驗室晶片上進行的生化實驗包括具有基因增幅功能的聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)、核酸的定序反應、微流體操作、電泳(electrophoresis)、質譜分析(MS，mass spectrograph)、抗原-抗體結合或一般的酵素反應等。
藉由微機電製程技術所生產之微流體生醫檢測晶片，其具有高檢測效能、低樣品消耗量、低耗能、體積小以及成本低等優點，尤其以整合微流體系統及檢測機構於同一晶片上之設計，最具發展潛力以及市場價值，因此，除了具有微型化之優勢外，更免除了複雜及昂貴之檢測設備，使得單一晶片便具有完整之檢測功能。
本發明即嘗試開發新的微流體元件的結合設計，使微流體晶片得以進行複雜樣品之快速分析。
有鑑於先前技術之缺失，本發明之目的在開發新的微流體元件的結合設計，使微流體晶片得以進行複雜樣品之快速分析。
為達上述目的，本發明提供一種免疫分析晶片，其包含：一混合槽；一混合器，用以混合前述混合槽中之流體；一純化槽；一第一流道，用以連接前述混合槽及純化槽；一第一雙向流體控制單元，用以控制前述第一流道中流體之流動方向；一磁場產生單元，用以捕捉前述純化槽中之磁性物質：一螢光偵測單元，包含一螢光偵測流道、一螢光偵測區域及一單向流體控制單元，該螢光偵測流道係用以連接前述純化槽及螢光偵測區域，該單向流體控制單元係用以控制前述螢光偵測流道中流體流動方向由純化槽向螢光偵測區域；一廢液流道，其一端與前述純化槽連接；及一廢液控制單元，用以控制將純化槽中之流體沿前述廢液流道導出。
本發明亦提供另一種免疫分析晶片，其包含：一混合槽；一混合器，用以混合前述混合槽中之流體；一純化槽；一第一流道，用以連接前述混合槽及純化槽；一第一雙向流體控制單元，用以控制前述第一流道中流體之流動方向；一磁場產生單元，用以捕捉前述純化槽中之磁性物質；一儲存槽；一第二流道，用以連接前述混合槽及儲存槽；一第二雙向流體控制單元，用以控制前述第二流道中流體之流動方向；至少二螢光偵測單元，該些螢光偵測單元各自獨立包含一螢光偵測流道、一螢光偵測區域及一單向流體控制單元，該螢光偵測流道係用以連接前述純化槽及螢光偵測區域，該單向流體控制單元係用以控制前述螢光偵測流道中流體流動方向由純化槽向螢光偵測區域；一廢液流道，其一端與前述純化槽連接；及一廢液控制單元，用以控制將純化槽中之流體沿前述廢液流道導出。
本發明同時提供使用本發明免疫分析晶片之方法，其包含：(a)將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽後，操作混合器使混合槽中之流體混合，其中，前述磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉待測樣品中之目標物；(b)操作第一雙向流體控制單元，使步驟(a)混合後之溶液流至純化槽；(c)操作磁場產生單元使步驟(b)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於純化槽之內壁；(d)操作廢液控制單元使步驟(c)純化槽中之溶液經廢液管道導出；(e)於純化槽中注入一回懸浮溶液並關閉磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(f)操作第一雙向流體控制單元，使前述第一溶液經第一流道流至混合槽；(g)將一含有呈色抗體之溶液注入混合槽後，操作混合器混合前述混合槽中之流體；其中，前述呈色抗體標記有螢光分子且可辨識前述目標物；(h)操作第一雙向流體控制單元使步驟(g)混合後之溶液由混合槽流至純化槽；(i)操作磁場產生單元使步驟(h)純化槽之溶液中的磁珠吸附於純化槽之內壁；(j)操作廢液控制單元使純化槽中之溶液經廢液管道導出；(k)於純化槽中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(l)操作螢光偵測單元之單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由純化槽經螢光偵測流道流至螢光偵測區；(m)進行螢光偵測判斷待測樣品中目標物之有無。
本發明又提供另一種使用本發明免疫分析晶片之方法，其包含：(a)將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽後，操作混合器使混合槽中之流體混合，其中，前述磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉一第一目標物及一第二目標物；(b)操作第一雙向流體控制單元，使步驟(a)混合後之溶液流至純化槽；(c)操作磁場產生單元，使步驟(b)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於純化槽之內壁；(d)操作廢液控制單元，使待測樣品經廢液管道導出；(e)於純化槽中注入一回懸浮溶液並關閉磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該第一溶液中；(f)操作第一雙向流體控制單元，使前述回懸浮溶液經第一流道流至混合槽；(g)操作第二雙向流體控制單元，使部分前述混合槽之溶液由混合槽流至儲存槽；(h)將一含有第一呈色抗體之溶液注入混合槽中後，操作混合器使混合槽中之流體混合；其中，前述第一呈色抗體係標記有一螢光分子且可辨識前述第一目標物；(i)操作第一雙向流體控制單元使步驟(h)混合後之溶液由混合槽流至純化槽；(j)操作磁場產生單元使前述步驟(i)純化槽之溶液中的磁珠吸附於純化槽之內壁；(k)操作廢液控制單元使純化槽中溶液經廢液管道導出；(l)於純化槽中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(m)操作前述至少二螢光偵測單元之其一螢光偵測單元中的單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由純化槽經螢光偵測流道流至螢光偵測區；(n)操作第二雙向流體控制單元，使步驟(g)之儲存槽中溶液由儲存槽流至混合槽；(o)將含有第二呈色抗體之溶液注入混合槽中後，操作混合器混合前述混合槽中之流體；其中，前述第二呈色抗體係標記有螢光分子且可辨識前述第二目標物；(p)操作第一雙向流體控制單元使步驟(o)混合後之溶液由混合槽流至純化槽；(q)操作磁場產生單元使前述步驟(p)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於純化槽之內壁；(r)操作廢液控制單元使純化槽中溶液經廢液管道導出；(s)於純化槽中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元，使磁場回懸浮於該回懸浮溶液中；(t)操作前述至少二螢光偵測單元之其二螢光偵測單元中的單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由純化槽經螢光偵測流道流至螢光偵測區；(u)偵測前述二螢光偵測單元中之螢光反應，以判斷待測樣品中目標物之有無。
本發明之免疫分析晶片可參考如第一圖及第二圖。首先參考第一圖，其係為具有一螢光偵測單元70之免疫分析晶片100。該晶片100包含：一混合槽10；一混合器20，用以混合混合槽10中之流體；一純化槽30；一第一流道40，用以連接混合槽10及純化槽30；一第一雙向流體控制單元41，用以控制第一流道40中流體之流動方向；一磁場產生單元50，用以捕捉純化槽30中之磁性物質；一螢光偵測單元70，包含一螢光偵測流道71、一螢光偵測區域72及一單向流體控制單元73，該螢光偵測流道71係用以連接純化槽30及螢光偵測區域72，該單向流體控制單元73係用以控制螢光偵測流道71中流體流動方向由純化槽30向螢光偵測區域72；一廢液流道60，其一端與純化槽30連接；及一廢液控制單元61，用以控制將純化槽30中之流體沿廢液流道60導出。
本發明所稱之混合槽係用以盛裝待混合物質，透過混合器之作用使待混合物質於其中混合。適用於本發明之混合槽的形狀包含，但不限於圓柱狀型態。
本發明所稱之混合器係用以將混合槽中流體混合，在較佳實施態樣中，其為薄膜式混合器，其係利用可撓性材料之薄膜上下運作而將混合槽中流體混合。適用於本發明之混合器包含，但不限於葉片狀薄膜式混合器。
本發明葉片狀薄膜式混合器之操作可配合如第三圖及其元件符號說明之。首先將氣體由氣孔202進入，使第一片葉片狀薄膜201a鼓起，接著空氣進入氣體連接管道203a使第二片葉片狀薄膜201b鼓起，接著空氣進入氣體連接管道203b使第三片葉片狀薄膜201c鼓起，接著空氣進入氣體連接管道203c使第四片葉片狀薄膜201d鼓起。以此順序循環，使葉片狀薄膜混合器連續鼓動而使其中檢體混合。
本發明所稱之純化槽係與混合槽連接，其具有一內壁，當混合槽中的待測樣品與磁性物質混合後，可利用外加的磁場使磁性物質因磁場作用而吸附於純化槽之內壁。
本發明免疫分析晶片之第一流道係用以連接混合槽及純化槽，可使流體於其中流動。
本發明之第一雙向流體控制單元係用以控制第一流道中流體之流動方向，其可為任何本技術領域已知之控制流體方向之手段。具體態樣係可例如一泵浦及二氣孔之設置。
本發明第一雙向流體控制單元之操作方式可參考如第五圖所示，當欲使流體如413箭頭方向流動時，首先將氣體經由氣孔411a進入，此時泵浦412會自氣孔411a端到氣孔411b端依序作動，第一流道內之流體會隨此作動方向而依413之方向流動。當可輕易理解的是，欲使流體如414箭頭方向流動時，則將氣體經由氣孔411b進入，此時泵浦412會自411b端到氣孔411a端依序作動，第一流道內之流體會隨此作動方向而依414之方向流動。
本發明之第二雙向流體控制單元81之操作與第一雙向流體控制單元41之操作方式相同。
本發明所稱之磁場產生單元係用以使純化槽之內部產生磁場，其設置可例如，但不限於如第一圖及第二圖所示之位置，該圖中磁場產生單元50係位於反應槽30之側邊，可致使其中之磁性物質受磁場感應而吸附於純化槽之內壁，藉此純化物質，當可輕易理解的是，第一圖及第二圖所示之磁場產生單元50可依欲產生磁場之部位而調整磁場產生單元相之位置，其可設置於反應槽30之底部，使反應槽30之底部產生磁場而將磁性物質吸附於反應槽底部，以達到純化物質之功能。適用於本發明之磁場產生單元包含，但不限於如第四圖所示陣列式環形線圈50，其透過電極51通以電流使線圈52產生磁場。
本發明所稱之螢光偵測單元係用以偵測樣品中螢光分子的有無。其包含三組件：螢光偵測流道係用以連接純化槽及螢光偵測區域；單向流體控制單元係用以控制螢光偵測流道之流體中的流動方向，其可為任何已知之可控制流體單方向流動之操作手段，當可輕易理解的是，單向流體控制單元本身亦可為只進行單向控制之雙向流體控制單元，具體之單向流體控制單元係可為例如一泵浦及一氣孔之設置。
本發明之單向流體控制單元73之操作可參考如第六圖所示，首先氣體經由氣孔731進入，此時泵浦732會依733箭頭方向作動，進而使第一流道內之流體會隨此作動方向而依733箭頭方向流動。
本發明廢液控制單元61之操作方式與單向流體控制單元73相同。
本發明廢液流道係用以提供廢液自純化槽中排離該免疫分析晶片，一般微流體晶片中廢液流道可與一收集槽相接集中處理廢液。
本發明免疫分析晶片之廢液控制單元係用以控制廢液於廢液流道中流動方向，具體之廢液控制單元係可為例如一泵浦及一氣孔之設置。
第二圖係本發明另一免疫分析晶片100之態樣，其與第一圖之差異在於具有二螢光偵測單元70a及70b，以及儲存槽90。也因此該分析晶片具有本發明免疫分析晶片之第二流道80係用以連接混合槽及儲存槽，可使流體於其中流動，以及第二雙向流體控制單元81，其係用以控制第二流道中流體之流動方向，其可為任何已知可用以控制流體方向之手段。具體態樣例如，但不限於一泵浦及二氣孔之設置。
第二圖中元件符號與第一圖相同者，其功能說明係可參考前述。
第一圖所示之免疫分析晶片的使用方法係可參考以下步驟：(a)首先提供第一圖所示之免疫分析晶片100，接著將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽10後，操作混合器20使混合槽10中之流體混合。此時，由於磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉目標物，若待測樣品中含有目標物，如蛋白質或抗原時，將會被磁珠捕捉；接著進行步驟(b)，操作第一雙向流體控制單元41，使步驟(a)混合後之溶液流至純化槽30；接著(c)操作磁場產生單元50，使純化槽30中產生磁場，此時純化槽30中之溶液中的磁珠受到磁場的牽引作用將吸附於純化槽30之內壁，接著進行步驟(d)操作廢液控制單元61使步驟(c)純化槽30中之溶液經廢液管道60導出，而磁珠因受到磁場牽引將不會隨溶液被導出；接著進行步驟(e)於純化槽30中注入一回懸浮溶液並關閉磁場產生單元50，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；然後進行步驟(f)操作第一雙向流體控制單元41，使回懸浮溶液經第一流道40流至混合槽10；接著進行步驟(g)將一含有呈色之溶液注入混合槽10後，操作混合器20使混合槽10中之流體混合；其中，呈色抗體標記有螢光分子且可辨識目標物，此時呈色抗體將與目標物連結，形成磁珠-抓住抗體-目標物-呈色抗體-螢光分子此一複合型態之分子；然後進行步驟(h)操作第一雙向流體控制單元41使步驟(g)混合後之溶液由混合槽20流至純化槽30；接著進行步驟(i)操作磁場產生單元50使純化槽30之溶液中的磁珠吸附於純化槽30之內壁，此時過量的未與目標物結合的呈色抗體-螢光分子將留在溶液中；然後進行(j)操作廢液控制單元61使純化槽30中之溶液經廢液管道60導出，被導出的溶液中含有未與目標物結合的呈色抗體-螢光分子；之後進行步驟(k)於純化槽30中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元50，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；接著進行步驟(l)操作螢光偵測單元70之單向流體控制單元73，使回懸浮溶液由純化槽30經螢光偵測流道71流至螢光偵測區72；最後進行步驟(m)透過螢光偵測判讀螢光偵測區72之訊號，藉此評估待測樣品中目標物之有無及含量。
在上述方法中，抓住抗體係為用以辨識目標疾病之專一性抗體，且其與磁珠結合。
在本發明之檢測方法中所稱之目標物係為與特定疾病相關之抗原或已經與自體免疫抗體結合之抗原-抗體複合物。
在部分目標物為抗原之態樣中，該抗原之外部構造具有分別對抓住抗體專一結合性部分及對呈色抗體專一結合性部分，因此目標物對於抓住抗體及呈色抗體皆具有相互獨立而不互相干擾之專一結合性。目標物之對抓住抗體具專一結合性部分先與抓住抗體結合後，可再以對呈色抗體具專一結合性部分與呈色抗體結合；目標物之對呈色抗體具專一結合性部分先與呈色抗體結合後，可再以對抓住抗體具專一結合性部分與抓住抗體結合。
在部分目標物為抗原-抗體複合物之態樣中，其抗原部分對抓住抗體具有專一結合性，其抗原-抗體複合物中的抗體部分對呈色抗體具有專一結合性。因此目標物對於抓住抗體及呈色抗體皆具有相互獨立而不互相干擾之專一結合性。目標物之對抓住抗體具抗原部分先與抓住抗體結合後，可再以對抗體部分與呈色抗體結合。
在前揭方法中，呈色抗體係用以辨識目標物，且其帶有可供螢光偵測單元偵測之螢光分子。當目標物為抗原，則呈色抗體可辨識前述抗原，且呈色抗體與抗原結合之處異於抗原與抓住抗體結合之處，因此呈色抗體可與已與抓住抗體結合之抗原結合。當目標物為抗體-抗原複合物，則呈色抗體可辨識抗原-抗體複合物之抗體部分。以上兩種之呈色抗體皆具有可供螢光偵測單元偵測之螢光。
在前揭方法中，回懸浮溶液係用做使與磁珠結合之複合物回懸浮之用，其成分、pH值、濃度、溫度係以不使抗原、抗體或磁珠等物質失去活性為要求而依磁珠、抗體、抗原特性配製而無須限定之，例如PBS(磷酸鹽緩衝溶液)。
當操作如第二圖所示之免疫分析晶片時，其步驟係詳述如下：首先進行步驟(a)提供一第二圖所示之本發明免疫分析晶片100，並將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽100後，操作混合器20使混合槽10中之流體混合，其中，前述磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉一第一目標物及一第二目標物；接著進行步驟(b)操作第一雙向流體控制單元41，使步驟(a)混合後之溶液流至純化槽30；接著進行步驟(c)操作磁場產生單元50，使步驟(b)純化槽30中之溶液中的磁珠吸附於純化槽30之內壁；接著進行步驟(d)操作廢液控制單元61，使待測樣品經廢液管道60導出；然後進行步驟(e)於純化槽30中注入一回懸浮溶液並關閉磁場產生單元50，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；接著進行步驟(f)操作第一雙向流體控制單元41，使回懸浮溶液經第一流道40流至混合槽10；接著進行(g)操作第二雙向流體控制單元，使部分混合槽10之溶液由混合槽10流至儲存槽90；然後進行步驟(h)將一含有第一呈色抗體之溶液注入混合槽10中後，操作混合器20使混合槽10中之流體混合；其中，前述第一呈色抗體係標記有一螢光分子且可辨識第一目標物，此時會形成磁珠-抓住抗體-第一目標物-第一呈色抗體-螢光分子之複合體；接著進行步驟(i)操作第一雙向流體控制單元41混合後之溶液由混合槽10流至純化槽30；然後進行步驟(j)操作磁場產生單元50使純化槽30之溶液中的磁珠吸附於純化槽30之內壁，此時未與磁珠結合之第一呈色抗體-螢光分子會存在於純化槽30內之溶液中；接著進行步驟(k)操作廢液控制單元61使純化槽30中溶液經廢液管道60導出；之後進行步驟(l)於純化槽30中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元50，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；之後進行(m)操作螢光偵測單元70a中的單向流體控制單元73a，使純化槽30中之溶液由純化槽30經螢光偵測流道71a流至螢光偵測區72a；之後再進行步驟(n)操作第二雙向流體控制單元81，使儲存槽90中溶液由儲存槽90流至混合槽10；接著進行步驟(o)將含有第二呈色抗體之溶液注入混合槽10中後，操作混合器20使混合槽10中之流體混合；其中，前述第二呈色抗體係標記有螢光分子且可辨識前述第二目標物；接著進行步驟(p)操作第一雙向流體控制單元41使混合槽10中之溶液流至純化槽30；然後進行步驟(q)操作磁場產生單元50使純化槽30中之溶液中的磁珠吸附於純化槽30之內壁；接著進行步驟(r)操作廢液控制單元61使純化槽30中溶液經廢液管道60導出；之後進行步驟(s)於純化槽30中注入回懸浮溶液並關閉磁場產生單元50，使磁珠回懸浮於該溶液中；然後進行步驟(t)操作至螢光偵測單元70b中的單向流體控制單元73b，使回懸浮溶液由純化槽30經螢光偵測流道71b流至螢光偵測區72b；最後進行步驟(u)偵測螢光偵測區72a及72b之螢光反應，以判斷待測樣品中目標物之有無。
在前揭方法中，抓住抗體係為可辨識目標疾病之特定生物標記分子的抗體，第一目標物與第二目標物為不同之抗原-抗體複合物，其中抗原部分相同，抗體部分不同，抗原部分皆可為抓住抗體辨識。
其中，第一目標物之抗原部分對抓住抗體具有專一結合性，其抗原-抗體複合物中的抗體部分對第一呈色抗體具有專一結合性。因此第一目標物對於抓住抗體及第一呈色抗體皆具有相互獨立而不互相干擾之專一結合性。第一目標物之抓住抗體具抗原部分先與抓住抗體結合後，可再以對抗體部分與第一呈色抗體結合。
第二目標物之抗原部分對抓住抗體具有專一結合性，其抗原-抗體複合物中的抗體部分對第二呈色抗體具有專一結合性。因此第二目標物對於抓住抗體及第二呈色抗體皆具有相互獨立而不互相干擾之專一結合性。第二目標物抓住抗體具抗原部分先與抓住抗體結合後，可再以對抗體部分與第二呈色抗體結合。
當可輕易理解的是，凡前揭利用第二圖之免疫分析晶片所進行之免疫分析之方法與利用第一圖之免疫分析晶片所進行之免疫分析方法中相同名稱以及相同元件符號者，兩者即具有實質上相同的功能與定義。
本發明免疫分析晶片之使用方法中，第一呈色抗體係用以辨識第一目標物，且其具有可供螢光偵測單元偵測之螢光分子。第一呈色抗體可辨識第一目標物之抗原-抗體複合物的抗體部分。
本發明免疫分析晶片之使用方法中，第二呈色抗體係用以辨識第二目標物，且其具有可供螢光偵測單元偵測之螢光分子。第二呈色抗體可辨識第二目標物之抗原-抗體複合物的抗體部分。
本發明方法中，第一呈色抗體及第二呈色抗體為辨識不同免疫球蛋白之抗體，其螢光分子可為相同或不同，第一抗體及第二呈色抗體所辨識到的產物經過磁珠結合後，將分別流至第一螢光偵測單元及第二螢光偵測單元，進行螢光偵測以同時得知第一目標物及第二目標物存在與否。
以下實施態樣係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制本發明之申請專利範圍。
實施例1.利用本發明之免疫分析晶片進行登革熱病毒檢體之分析
為更具體瞭解本實施例之操作，係可參考第二圖。首先，先將登革熱病毒(dengue virus serotype I-IV型)，以及結合抗登革熱病毒抗體之微型磁珠(4.5μm)加入晶片中的檢體混合槽10並且將薄膜式檢體混合器20啟動，藉由薄膜式檢體混合器20的驅動下，位於混合槽10底部之薄膜會上下往復式的震動，使得磁珠及登革熱病毒在反應槽10內進行充分混合，藉由抗體跟抗原間之親和力作用的影響下，磁珠上之抗登革熱病毒抗體會和登革熱病毒結合。之後將混合好的檢體傳送至磁珠純化槽30內，此反應槽底部有一微型陣列式環形線圈50，藉由微型線圈通以特定電流產生微磁場，即可將鍵結有登革熱病毒之磁珠吸附於磁珠純化槽表面；接著再將1倍磷酸鹽緩衝溶液(1x phosphate buffer saline，PBS)由雙向式微流體幫浦41注入磁珠純化反應槽30中，將沒有吸附的登革熱病毒去除進入廢液流道60。其後，將臨床檢體(如血清)注入於檢體混合槽10，並將雙向微流體模組41啟動將純化後的磁珠傳輸至混合槽10中，再次藉由薄膜式檢體混合器20的驅動讓接有登革熱病毒的磁珠和血清在混合槽10內進行混合，藉由抗原抗體的結合接有登革熱病毒的磁珠和血清中的登革熱抗體會結合其後直接將混合完成之檢體傳輸至磁珠純化槽30中。同樣的藉由微型線圈50通以特定電流產生微磁場，即可將黏附有血清中的登革熱抗體之磁珠吸附在磁珠純化槽30表面；再將1倍磷酸鹽緩衝溶液(1x phosphate buffer saline,PBS)由雙向微流體控制注入微管道中，將沒有吸附的雜質去除進入廢液流道60。啟動雙向微流體模組41將純化後的磁珠全數傳輸至混合槽10中，再將一半的磁珠藉由單向式微流體幫浦81運送至檢體暫存區(儲存槽90)。之後將螢光偵測抗體(detection Ab,donkey anti-human IgM-PE)注入檢體混合區10藉由薄膜式檢體混合器20的驅動讓磁珠和偵測抗體做結合，再將混合完成之檢體傳輸至磁珠純化槽30中。同樣的藉由微型線圈50通以特定電流產生微磁場，即可將黏有偵測抗體之磁珠吸附在磁珠純化槽表面；再將PBS由雙向微流體控制注入微管道中，將沒有吸附偵測抗體去除進入廢液流道60，最後再注入生物緩衝液PBS回溶到適當體積，關閉微型線圈50電流，啟動單向式微流體幫浦73a將檢體運送到螢光偵測區72a。隨後，再將置於檢體暫存區90的磁珠運輸至檢體混合區10，將螢光偵測抗體(goat anti-human IgG-FITC)注入檢體混合區10藉由薄膜式檢體混合器20的驅動讓磁珠和偵測抗體做結合，再將混合完成之檢體傳輸至磁珠純化槽30中。同樣的藉由微型線圈50通以特定電流產生微磁場，即可將黏有偵測抗體之磁珠吸附在磁珠純化槽50表面；再將PBS由雙向微流體控制注入微管道中，將沒有吸附偵測抗體去除進入廢液流道60，最後再注入生物緩衝液PBS回溶到適當體積，關閉微型線圈50電流，啟動單向式微流體幫浦73b將檢體運送到螢光偵測區72b，即完成整個實驗流程。
實施例2.利用本發明免疫分析晶片可偵測之極限抗體濃度之試驗
如第七圖所示，其為偵測極限抗體濃度之試驗結果。先將5μl接有抗登革熱抗體(anti-DV antibody)的磁珠接上100μl病毒後，將已知濃度的二級抗體之濃度依序稀釋為8個不同濃度：45ng,22.5ng,11.25ng,5.625ng,1.406ng,8.76×10-2 ng,2.19×10-2 ng,及1.09×10-2 ng。接著，將前述稀釋後二級抗體各取100μl分別和上述的磁珠複合體混合，最後用螢光系統偵測訊號即得本系統的偵測極限濃度。
其中，第七A圖之橫軸為以分為單位之時間，縱軸為螢光強度中實驗組(Positive control)所表示為最高濃度(45ng)的二級螢光抗體接上有一級抗體的磁珠和病毒的磁珠複合體，而對照組(Negative contro)是接有一級抗體的磁珠直接加上最高濃度的二級抗體所測得的訊號，因此訊號為不含病毒之訊號，故二抗螢光抗體無法接到磁珠上，所得之訊號極低。
第七B圖之橫軸為以分為單位之時間，縱軸為螢光強度。21pg為濃度2.19×10-2 ng(21pg)的二級螢光抗體所測得知螢光強度與如第七a圖所述之對照組(Negative Control)之比較。以如第七a圖所述之8個不同濃度的檢體，經過螢光偵測後，利用s/n比與對照組(Negative Control)相較分析有效的偵測值，其s/n比要大於3才是有效數值，在濃度為2.19×10-2 ng時s/n比值為4.02，而濃度為1.09×10-2 ng的s/n比值為1.57，因此本系統的偵測極限為21pg。
實施例3.利用本發明免疫分析晶片所測得人體中IgG及IgM之濃度
將接有抗登革熱抗體的磁珠5μl和登革熱病毒100μl混合，再加入登革熱病人的血清100μl，經過清洗之後，分別加入二級螢光抗體100μl goat anti-human IgG-FITC以及100μl donkey anti-human IgM-PE，最後用本發明免疫分析晶片偵測螢光。其結果如第八圖所示，橫軸為以分為單位之時間，縱軸為螢光強度。其中對照組(Negative control)之不含血清的檢體所測得之螢光訊號，沒有任何訊號出現。而所測得之IgG及IgM螢光強度如圖中結果所示。
實施例4.利用本發明免疫分析晶片偵測登革熱病毒
先將5μl之接有抗登革熱抗體(anti-DV antibody)的磁珠接上檢體中可能有的登革熱病毒以此案例如100μl(106 pfu/ml)的登革熱病毒後，再加入100μl之接有螢光物質的二級抗體作為呈色抗體，經過混合攪拌之後，以螢光偵測單元偵測螢光訊號之存在與否，可得知病毒(抗原)的存在與否。其偵測結果如第九圖所示，其中橫軸為以分為單位之時間，縱軸為螢光強度，其對照組(negative control)是不加病毒的檢體所偵測之螢光訊號，而實驗組(positive control)為偵測此接有抗登革熱抗體之磁珠所得之螢光訊號。
綜上所述，本發明可以在30分鐘內同時偵測兩種免疫球蛋白IgG、IgM，可以短時間的檢測出是否為急性感染或慢性感染，並用磁珠取代傳統平面的ELISA偵測方法，其接合能力由於3D立體結構而增加後續抗原抗體的接合能力高了10-50倍。本晶片系統已成功整合並微小化，讓使用者可以方便攜帶以及登革熱之檢測。利用此微型元件之整合平台可以生物檢體自動化傳輸及混合，以取代傳統人工操作之不穩定性，提供一生物醫學檢測平台。本晶片系統的尺寸為37mm x 53mm，整組晶片所設計的優勢除了能同時偵測兩種免疫球蛋白、可攜式、價格低廉外，其自動化快速操作可大幅縮短萃取時間與實驗精準度。
其他實施態樣
在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，本說明書中所揭露的每一個特徵都可能選擇性的以相同、相等或相似目的特徵所取代，因此，除了特別顯著的特徵之外，所有的本說明書所揭露的特徵僅是相等或相似特徵中的一個例子。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
10．．．混合槽
20．．．混合器
201a、201b、201c、201d．．．葉片狀薄膜
202．．．氣孔
203．．．連接氣體管道
30．．．純化槽
40．．．第一流道
41．．．第一雙向流體控制單元
411a．．．氣孔1
411b．．．氣孔2
412．．．泵浦
413．．．流體流動方向
414．．．流體流動方向
50．．．磁場產生器
51．．．電極
52．．．線圈
60．．．廢液流道
61．．．廢液控制單元
70、70a、70b．．．螢光偵測單元
71、71a、71b．．．螢光偵測流道
72、72a、72b．．．螢光偵測區域
73、73a、73b．．．單向流體控制單元
731．．．氣孔
732．．．泵浦
733．．．流體流動方向
80．．．第二流道
81．．．第二雙向流體控制單元
90．．．儲存槽
100．．．免疫分析晶片
第一圖本發明免疫分析晶片，其僅具有一螢光偵測單元。
第二圖本發明免疫分析晶片，其具有二螢光偵測單元。
第三圖本發明免疫分析晶片之葉片狀薄膜混和器。
第四圖本發明免疫分析晶片之陣列式環形線圈。
第五圖本發明免疫分析晶片之第一雙向流體控制單元。
第六圖本發明免疫分析晶片之單向流體控制單元。
第七圖利用本發明免疫分析晶片可偵測之極限抗體濃度的試驗結果。
第八圖利用本發明免疫分析晶片所測得人體中IgG及IgM之螢光強度。
第九圖利用本發明免疫分析晶片偵測病毒之存在與否。
10．．．混合槽
20．．．混合器
201a、201b、201c、201d．．．葉片狀薄膜
202．．．氣孔
203．．．連接氣體管道
30．．．純化槽
40．．．第一流道
41．．．第一雙向流體控制單元
411a．．．氣孔1
411b．．．氣孔2
412．．．泵浦
413．．．流體流動方向
414．．．流體流動方向
50．．．磁場產生器
51．．．電極
52．．．線圈
60．．．廢液流道
61．．．廢液控制單元
70．．．螢光偵測單元
71．．．螢光偵測流道
72．．．螢光偵測區域
73．．．單向流體控制單元
731．．．氣孔
732．．．泵浦
733．．．流體流動方向
80．．．第二流道
81．．．第二雙向流體控制單元
90．．．儲存槽
100．．．免疫分析晶片

Claims (15)

  1. 一種免疫分析晶片，其包含：一混合槽；一混合器，其係一薄膜式混合器，設於該混合槽，用以混合前述混合槽中之流體；一純化槽；一第一流道，用以連接前述混合槽及純化槽；一第一雙向流體控制單元，設於該第一流道，用以控制前述第一流道中流體之流動方向；一磁場產生單元，設於該純化槽側邊，用以捕捉前述純化槽中之磁性物質；一螢光偵測單元，包含一螢光偵測流道、一螢光偵測區域及一單向流體控制單元，該螢光偵測流道係用以連接前述純化槽及螢光偵測區域，該單向流體控制單元係設於該螢光偵測流道，用以控制前述螢光偵測流道中流體流動方向由純化槽向螢光偵測區域；一廢液流道，其一端與前述純化槽連接；及一廢液控制單元，設於該廢液流道，用以控制將純化槽中之流體沿前述廢液流道導出。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之晶片，其中前述雙向流體控制單元具有二氣孔及一泵浦。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之晶片，其中前述單向流體控制單元具有一氣孔及一泵浦。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之晶片，其中前述磁場產生單元為陣列式環形磁場產生線圈。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之晶片，其中前述廢液控制單 元具有一氣孔及一泵浦。
  6. 一種免疫分析晶片，其包含：一混合槽；一混合器，其係一薄膜式混合器，設於該混合槽，用以混合前述混合槽中之流體；一純化槽；一第一流道，用以連接前述混合槽及純化槽；一第一雙向流體控制單元，設於該第一流道，用以控制前述第一流道中流體之流動方向；一磁場產生單元，設於該純化槽側邊，用以捕捉前述純化槽中之磁性物質；一儲存槽；一第二流道，用以連接前述混合槽及儲存槽；一第二雙向流體控制單元，設於該第二流道，用以控制前述第二流道中流體之流動方向；至少二螢光偵測單元，該些螢光偵測單元各自獨立包含一螢光偵測流道、一螢光偵測區域及一單向流體控制單元，該螢光偵測流道係用以連接前述純化槽及螢光偵測區域，該單向流體控制單元設於該螢光偵測流道，係用以控制前述螢光偵測流道中流體流動方向由純化槽向螢光偵測區域；一廢液流道，其一端與前述純化槽連接；及一廢液控制單元，設於該廢液流道，用以控制將純化槽中之流體沿前述廢液流道導出。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之晶片，其中前述雙向流體控制單元具有二氣孔及一泵浦。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之晶片，其中前述單向流體控制單元具有一氣孔及一泵浦。
  9. 如申請專利範圍第6項所述之晶片，其中前述磁場產生單元為為陣列式環形磁線圈。
  10. 如申請專利範圍第6項所述之晶片，其中前述廢液控制單元具有一氣孔及一泵浦。
  11. 一種利用申請專利範圍第1項所述之晶片鑑定待測樣品中目標物有無之方法，其包含下列步驟：(a)將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽後，操作混合器混合前述混合槽中之流體，其中，前述磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉目標物；(b)操作第一雙向流體控制單元，使步驟(a)混合後之溶液流至純化槽；(c)操作磁場產生單元使步驟(b)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於前述純化槽之內壁；(d)操作廢液控制單元使步驟(c)純化槽中之溶液經廢液管道導出；(e)於前述純化槽中注入一回懸浮溶液並關閉前述磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(f)操作前述第一雙向流體控制單元，使前述回懸浮溶液經前述第一流道流至前述混合槽；(g)將一含有呈色抗體之溶液注入前述混合槽後，操作混合器混合前述混合槽中之流體；其中，前述呈色抗體標記有螢光分子且可辨識前述目標物；(h)操作前述第一雙向流體控制單元使步驟(g)混合 後之溶液由前述混合槽流至前述純化槽；(i)操作前述磁場產生單元使步驟(h)純化槽之溶液中的磁珠吸附於前述純化槽之內壁；(j)操作前述廢液控制單元使前述純化槽中之溶液經前述廢液管道導出；(k)於前述純化槽中注入回懸浮溶液並關閉前述磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(l)操作螢光偵測單元之單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由前述純化槽經前述螢光偵測流道流至前述螢光偵測區；及(m)進行螢光偵測判斷待測樣品中目標物之有無。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中前述目標物為抗原-抗體複合物。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中前述目標物為抗原。
  14. 一種利用申請專利範圍第6項所述之晶片鑑定待測樣品中目標物有無之方法，其包含下列步驟：(a)將待測樣品與一含有磁珠之溶液共同注入混合槽後，操作混合器混合前述混合槽中之流體，其中，前述磁珠表面衍生有一抓住抗體，該抓住抗體係用以辨識捕捉一第一目標物及第二目標物；(b)操作第一雙向流體控制單元，使步驟(a)混合後之溶液流至前述純化槽；(c)操作磁場產生單元，使步驟(b)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於前述純化槽之內壁；(d)操作廢液控制單元，使待測樣品經廢液管道導 出；(e)於前述純化槽中注入一回懸浮溶液並關閉前述磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(f)操作前述第一雙向流體控制單元，使前述回懸浮溶液經前述第一流道流至前述混合槽；(g)操作第二雙向流體控制單元，使部分前述混合槽之溶液由前述混合槽流至儲存槽；(h)將一含有第一呈色抗體之溶液注入前述混合槽中後，操作前述混合器混合前述混合槽中之流體；其中，前述第一呈色抗體係標記有一螢光分子且可辨識前述第一目標物；(i)操作前述第一雙向流體控制單元使步驟(h)混合後之溶液由前述混合槽流至前述純化槽；(j)操作前述磁場產生單元使前述步驟(i)純化槽之溶液中的磁珠吸附於前述純化槽之內壁；(k)操作前述廢液控制單元使前述純化槽中溶液經前述廢液管道導出；(l)於前述純化槽中注入回懸浮溶液並關閉前述磁場產生單元，使磁珠回懸浮於該回懸浮溶液中；(m)操作至少二螢光偵測單元之其一螢光偵測單元中的單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由前述純化槽經螢光偵測流道流至螢光偵測區；(n)操作前述第二雙向流體控制單元，使步驟(g)之儲存槽中溶液由前述儲存槽流至前述混合槽；(o)將含有第二呈色抗體之溶液注入前述混合槽中後，操作前述混合器混合前述混合槽中之流體；其中，前 述第二呈色抗體係標記有螢光分子且可辨識前述第二目標物；(p)操作前述第一雙向流體控制單元使步驟(o)混合後之溶液由前述混合槽流至前述純化槽；(q)操作前述磁場產生單元使前述步驟(p)純化槽中之溶液中的磁珠吸附於前述純化槽之內壁；(r)操作前述廢液控制單元使前述純化槽中溶液經前述廢液管道導出；(s)於前述純化槽中注入回懸浮溶液並關閉前述磁場產生單元，使磁場回懸浮於該回懸浮溶液中；(t)操作前述至少二螢光偵測單元之其二螢光偵測單元中的單向流體控制單元，使前述回懸浮溶液由前述純化槽經前述螢光偵測流道流至前述螢光偵測區；及(u)偵測前述二螢光偵測單元中之螢光反應，以判斷待測樣品中目標物之有無。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中前述第一目標物與前述第二目標物為不同之抗原-抗體複合物。
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