CN103571793B - 一种调控诱导产生的视网膜前体细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分离的、诱导产生的视网膜前体细胞以及包含这种细胞的组合物，所述细胞移植到宿主视网膜的整合率和致瘤性得到极大改善。本发明还提供通过抑制经典Wnt信号通路来制备所述视网膜前体细胞的方法以及制备适合移植的视网膜前体细胞的方法。本发明还提供由(a)Tcf1蛋白，(b)β‑catenin蛋白和(c)Sox2蛋白组成的复合物以及所述复合物在筛选降低诱导产生的细胞致瘤性的药物中的应用。本发明还提供筛选降低诱导产生细胞的致瘤性的药物的方法。本发明为细胞治疗打开了新的途径。

Description

一种调控诱导产生的视网膜前体细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及调控诱导产生的视网膜前体细胞的方法。

背景技术

胚胎干细胞特有的自我更新和全能性，使其具有巨大的研究价值，能够为治疗各种变性类疾病的提供充足的细胞来源。但同时，ESC的这些特性，也成为其在临床治疗中的主要困难。已有报道，尽管移植的是经过预分化或预分选的ESC来源的细胞，但是仍有肿瘤形成。这为ESC来源的细胞在人类中应用提出了安全性的担忧。另一方面，移植分离自新生鼠的光感受器前体细胞有效的修复了视网膜的损伤而未产生任何肿瘤。这一事实强调了供体细胞的发育阶段在决定移植后细胞命运中的关键作用。因此，将ESC调控到一个合适的状态对于安全有效的细胞移植至关重要。

迄今为止，小鼠、猴子和人类来源的ESC在体外已经被成功诱导分化为视网膜细胞。Sasai的研究组研发了一种有效的视网膜前体细胞(RPC)的高效诱导策略：通过无血清悬浮培养获得高比例的表达眼域相关转录因子，甚至最近，获得了眼杯。但是，在体外将ESC高效的分化为各种视网膜细胞和视杯，在体内应用潜能如功能性整合和安全性的机制尚未阐述清楚。而根据已有的研究报道，iPS和胚胎干细胞具有相同的特性：自我更新和分化全能性(Induction ofPluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.Cell,2007年，131(5):861-872)。同时，iPS细胞也具有经诱导分化为RPC的潜能(J CellSci.2009年9月1日;122(Pt17):3169-79.)。

此外，在现阶段，胚胎干细胞或iPS诱导产生的视网膜前体细胞不仅具有较高的致瘤性，其在移植后的整合率也较低，从而无法获得令人满意的治疗效果。

因此，本领域急需能够在移植前鉴定和操作诱导产生的供体细胞的方法，从而为安全有效的细胞治疗奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离的、诱导产生的视网膜前体细胞以及包含这种细胞的组合物，所述细胞移植到宿主视网膜的整合率和致瘤性得到极大改善。本发明的另一目的是提供通过抑制经典Wnt信号通路来制备所述视网膜前体细胞的方法以及制备适合移植的视网膜前体细胞的方法。本发明还提供由(a)Tcf1蛋白，(b)β-catenin蛋白和(c)Sox2蛋白组成的复合物以及所述复合物在筛选降低诱导产生的细胞致瘤性的药物中的应用。本发明还提供筛选降低诱导产生细胞的致瘤性的药物的方法。

在第一方面，本发明提供一种体外诱导产生的视网膜前体细胞，所述前体细胞移植到宿主视网膜的整合率≥70%，优选地，≥90%。

在优选的实施方式中，所述视网膜前体细胞由胚胎干细胞或iPS诱导产生。

在优选的实施方式中，所述视网膜前体细胞为哺乳动物视网膜前体细胞，所述哺乳动物优选为人、小鼠。

在优选的实施方式中，所述诱导产生的视网膜前体细胞具有从胚胎分离得到的视网膜前体细胞的标志物表达谱。在进一步优选的实施方式中，Rax、Crx阳性细胞比例大于40%，较佳地，大于50%，更佳地，大于60%；Sox2、Pax6阳性细胞比例小于60%，较佳地，小于50%，更佳地，小于40%。

在另一优选的实施方式中，所述视网膜前体细胞是分离的。

在优选的实施方式中，所述前体细胞移植到宿主视网膜的的肿瘤发生率≤10%，优选地，≤5%。

在另一优选的实施方式中，所述视网膜前体细胞是通过以下方法制备的：对直接来源于胚胎干细胞的视网膜前体细胞进行处理，从而抑制Wnt信号通路。

在优选的实施方式中，所述诱导产生的视网膜前体细胞中Wnt信号通路是受抑制的。

在另一优选的实施方式中，所述抑制包括利用Wnt信号通路抑制剂处理初始状态的视网膜前体细胞。

在另一优选的实施方式中，所述Wnt信号通路抑制剂包括DKK1、Quercetin、XAV939、shTCF1、shSox2、shNestin。

在另一优选的实施方式中，所述抑制包括抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群。

在另一优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括抑制Tcf1、Sox2或Nestin基因的表达；敲除Tcf1、Sox2或Nestin基因；编码无活性的Tcf1、Sox2或Nestin蛋白；或抑制Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的活性。

在另一优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括用Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的抗体，或Tcf1、Sox2或Nestin基因的反义核酸进行抑制。

在另一优选的实施方式中，处理时间为4天。

在第二方面，本发明提供一种移植组合物，所述移植组合物包括药学上可接受的载体和本发明第一方面所述的诱导产生的视网膜前体细胞。

在优选的实施方式中，所述移植组合物可用于治疗视网膜退行性疾病。

在优选的实施方式中，所述视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑病变(AMD)、先天性黑蒙、格子样视网膜变性、Stargardt’s黄斑退变、视锥-视杆细胞营养不良、眼底血管样条纹、早产儿视网膜病变、卵黄性黄斑营养不良、中心性浆液性脉络膜病变。

在第三方面，本发明提供本发明第一方面所述的诱导产生的视网膜前体细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的用途。

在优选的实施方式中，所述视网膜退行性疾病包括视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑病变(AMD)、先天性黑蒙、格子样视网膜变性、Stargardt’s黄斑退变、视锥-视杆细胞营养不良、眼底血管样条纹、早产儿视网膜病变、卵黄性黄斑营养不良、中心性浆液性脉络膜病变。

在第四方面，本发明提供一种制备本发明第一方面所述分离的、诱导产生的视网膜前体细胞的方法，包括步骤：对诱导产生的初步状态的视网膜前体细胞进行处理，抑制其Wnt信号通路，从而制得本发明第一方面所述的视网膜前体细胞。

在优选的实施方式中，所述处理前视网膜前体细胞表达神经视网膜前体细胞和神经早期发育的标志物。在另一优选的实施方式中，Sox2、Pax6阳性细胞比例大于80%。

在优选的实施方式中，处理前视网膜前体细胞的诱导方法包括：利用羊膜和PA6基质细胞进行共培养诱导，通过遗传工程导入相关基因诱导分化，在单层培养条件下添加生长因子进行诱导分化，以及经典的经过拟胚体自发分化的诱导。

在优选的实施方式中，处理前视网膜前体细胞通过SFEB-CDM方法进行诱导分化。在另一优选的实施方式中，所述Wnt信号通路抑制剂包括DKK1、Quercetin、XAV939、TCF1shRNA、Sox2shRNA、NestinshRNA。

在优选的实施方式中，所述Wnt信号通路抑制包括抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群。

在另一优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括抑制Tcf1、Sox2或Nestin基因的表达；敲除Tcf1、Sox2或Nestin基因；编码无活性的Tcf1、Sox2或Nestin蛋白；或抑制Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的活性。

在另一优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括用Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的抗体，或Tcf1、Sox2或Nestin基因的反义核酸进行抑制。

在优选的实施方式中，处理时间为4天。

在优选的实施方式中，所述方法是体外方法，和/或所述方法是非治疗性和非诊断性的。

在第五方面，本发明提供一种制备适合移植的视网膜前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)对于诱导产生的视网膜前体细胞，测定所述诱导产生的视网膜前体细胞中wnt信号通路分子的表达水平，所述Wnt信号通路分子包括选自下组的基因：Wnt3a、Wnt2b、β-catenin、Gsk3β、APC、Dvl、Axin1、Axin2、Lef1、Tcf1、Tcf3、Tcf4、CyclinD2、c-myc、DKK1、Tcf1、Sox2和Nestin；

(b)选取wnt信号通路显著抑制的细胞，作为用于移植的视网膜前体细胞。

在优选的实施方式中，选取DKK1、Tcf1、Sox2或Nestin表达水平显著降低的前体细胞。

在另一优选的实施方式中，当以下分子表达水平下调时，则表示wnt信号通路显著抑制：Wnt3a、Wnt2b、β-catenin、Dvl、Axin1、Axin2、Lef1、Tcf1、Tcf3、Tcf4、CyclinD2、c-mycDKK1、Tcf1、Sox2和Nestin。

在另一优选的实施方式中，当以下分子表达水平上调时，则表示wnt信号通路显著抑制：Gsk3β、APC、Axin1。

在第六方面，本发明提供一种蛋白复合物，所述蛋白复合物是由以下三种蛋白组成的复合物：

(a)Tcf1蛋白；

(b)β-catenin蛋白；和

(c)Sox2蛋白。

在第七方面，本发明提供本发明第六方面所述的蛋白复合物的抑制剂的用途，所述抑制剂用于制备降低诱导产生的视网膜前体细胞致瘤性和/或提高其整合率的组合物。

在优选的实施方式中，所述组合物还用于提高所述诱导产生的视网膜前体细胞的整合率。

在第八方面，本发明提供一种筛选降低诱导产生的细胞的致瘤性和/或提高其整合率的试剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在测试组中，将待测物质加入包含Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的体系中；

(b)检测Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的三元复合物的形成情况，并与未加入所述待测物质的包含Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的对照体系相比；

如果与对照体系相比，所述三元复合物的形成显著减少，则评定所述待测物质可降低诱导产生的细胞的致瘤性，并选择该待测物质作为降低诱导产生的细胞的致瘤性的试剂。

在一优选的实施方式中，所述方法还包括步骤：对于选出的待测物质，进一步测试在其存在下诱导产生的细胞的致瘤性和/或整合率，或进一步测试经其处理的诱导产生的细胞的致瘤性和/或整合率。

在另一优选的实施方式中，所述诱导产生的细胞包括视网膜前体细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了ESC通过FACS分选过程和进一步谱系决定分化为RPC。(A)多步分化ESC为RPC的概略流程图。(B)小鼠ESC和分化3天(D3)的拟胚体(EB)的光镜图。荧光镜下可观察到EB中GFP+的神经亚群。比例尺，100μm。(C)神经分化7天时，FACS纯化Sox1-GFP+神经上皮。比例尺，100μm。(D)代表性的FCM散点图和直方图分群策略显示85.58%Pax6+细胞(红色)。(E)正常眼球(左)和ESC-RPC移植眼球(右二)大小的比较。(F)免疫荧光染色显示ESC-RPC(绿色)移植产生眼部肿瘤中Sox2、Nestin、Pax6和PCNA的表达(红色)。比例尺，100μm。(G)EGFP+细胞通过FACS从ESC-RPC来源的肿瘤中分离出并通过悬浮培养进行神经球形成实验。比例尺，100μm。(H)分选出的EGFP+的肿瘤细胞的BrdU侵入实验。比例尺，50μm。(I)分离自眼部肿瘤的细胞中Sox1、Nestin和Sox2(红色)的免疫染色结果提示肿瘤(绿色)的神经特性。比例尺，100μm。(J)移植眼和对照眼代表性的暗视ERG反应(蓝线)和OPs反应(红线)。激活光感受器的激发光强在右侧显示。右侧的标尺显示50uV/d和25ms/d。

图2显示仅有ESC-RPC移植产生眼部肿瘤。其中：(A)在14天的ESC-RPC中免疫荧光共染色Pax6和Nestin、Six3和Rax(上排)，在分化24天的ESC-RPC中共染色Pax6和Otx2、Nrl，和单标Opsin(下排)。DAPI被设为灰色。比例尺，25μm。(B)典型的RT-PCR结果显示视网膜标志物在ESC、P-RPC和ESC-RPC中的表达。(C)ESC-RPC中分别表达Pax6、Rax、Otx2和Nrl的亚群的FCM图谱。(D)ESC-RPC移植2周后眼部肿瘤切片的HE染色，比例尺为500μm。(E)(D)中肿瘤组织的放大图。(F)含有ESC-RPC(绿色)移植引起的眼部肿瘤的眼球冰冻切片，比例尺为100μm。(G)Westernblot比较一些标志物在肿瘤组织和正常成年视网膜中的蛋白表达水平。(H)ERG的b波显示移植小鼠视功能的恢复。图中所示为平均值±标准差；采用ANOVA进行统计分析；**代表P<0.01；每组n=10。

图3显示了Wnt/β-catenin信号在ESC-RPC移植的致瘤性和治疗性决定中起到的作用。(A)对ESC-RPC和P-RPC中显著区别表达的基因进行通路和GO分析。(B)Wnt信号通路组份的表达模式。(C)切片HE染色显示神经视网膜厚度。比例尺，10μm。柱状图是对相应染色的定量统计。图中所示为平均值±标准差；采用ANOVA进行统计分析；**代表P<0.01；n，动物数目。(D)典型的DKK1处理的ESC-RPC(绿色)整合入碘酸钠损伤的视网膜。DAPI被设为灰色。比例尺，25μm。其中白框内放大显示为(E)。(E)GFP+的供体细胞与Opsin(红色)共定位。比例尺，25μm。整合的供体细胞的典型形态：细胞核(实心箭头记号)，外突起(空心箭头记号)，内节(空心箭头)，外节(实心箭头)。(F)ERG检测细胞移植的治疗效果。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；**代表P<0.01；每组n=10。(G)免疫荧光染色显示DKK1对于增殖标志物和Sox2在ESC-RPC中表达水平的影响。DAPI被设为灰色。比例尺，50μm。柱状图是对相应染色的定量统计。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；**代表P<0.01。(H)流式分析显示DKK1处理后，在ESC-RPC中的表达Sox2、Pax6、Rax和Crx的比例变化。IgG为阴性对照。GCL：节细胞层，INL：内核层，ONL：外核层。

图4显示了抑制经典Wnt信号促进ESC-RPC成为更成熟的视网膜细胞。(A)共聚焦和免疫荧光染色显示β-catenin的核定位。比例尺，50μm。DAPI被设为灰色。(B)DKK1处理抑制神经前体细胞标志物和Wnt信号在ESC-RPC中的表达。未处理的ESC-RPC中相关基因的表达设为1.0。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；*代表P<0.05。(C、D)DKK1处理降低了Pax6阳性细胞比例，但是上调了Map2或Opsin的阳性细胞比例。DAPI被设为灰色。比例尺，50μm。柱状图是对相应染色的定量统计。图中所示为平均值±标准差；采用ttest进行统计分析；**代表P<0.01。(E)DKK1处理的ESC-RPC的BrdU和Nestin与Otx2和Nrl的代表性染色。箭头指示BrdU+/Nestin+细胞；箭头标记指示有丝***后Otx2+或Nrl+细胞。比例尺，25μm。(F)对应的视网膜染色。新生小鼠视网膜的BrdU、Sox2和Pax6与Otx2染色显示同样的表达谱。比例尺：25μm。(G)FCM分析验证了P-RPC中PCNA、Sox2和Pax6、Rax、Otx2和Crx。

图5显示了Tcf1介导了Wnt信号在移植的ESC-RPC中的作用。(A)通过qRT-PCR比较了fTcf1在ESC、ESC-RPC和P-RPC中的mRNA水平。ESC中的表达水平被设为1.0。图中所示为平均值±标准差；采用ANOVA进行统计分析；*代表P<0.05，**代表P<0.01。(B)Tcf1在ESC-RPC引起的肿瘤和正常成年视网膜中的蛋白水平。(C)FCM分析显示shControl和shTcf1ESC-RPC中Sox2、Pax6、Rax、Otx2和Crx的表达比例变化。(D)QRT-PCR检测显示ΔNTcf1过表达抑制ESC-RPC中神经前体细胞标志物和Wnt信号的表达。感染空载体的ESC-RPC中相关基因的表达设为1.0。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；*代表P<0.05，**代表P<0.01。(E)在ESC-RPC中过表达ΔNTcf1对神经前体和增殖标志物的影响。比例尺，50μm。柱状图是对相应染色的定量统计。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；**代表P<0.01。(F)ERG记录移植了ΔNTcf1和空载体感染的ESC-RPC的眼球功能恢复。图中所示为平均值±标准差；采用t test进行统计分析；**代表P<0.01；每组n=10。

图6显示了Tcf1在视网膜早期发育和ESC-RPC中扮演着关键作用。(A)ESC-RPC来源的肿瘤中fTcf1的表达。fTcf1+，红色；供体细胞，绿色。(B)DKK1处理对ESC-RPC中Nestin+/fTcf1+表达的影响。(C)Tcf/Lef在P1d的Nestin-EGFP转基因小鼠中的表达暗示了高表达的Tcf1可能参与了RPC的增殖。(D)shTcf1ESC-RPC效果验证。(E)TOPFlash验证Tcf1在经典wnt通路中的活性。(F)移植dnTcf过表达的ESC-RPC三周后，典型的整合情况。

图7显示了Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群决定ESC-RPC移植的功能性恢复。(A)显示小鼠Sox2基因上游5kb启动子(N-2增强子)上存在Tcf/Lef转录因子的结合位点。(B)在ESC-RPC中利用兔子IgG或Tcf1抗体进行ChIP分析检测。(C)Tcf1剂量依赖的激活Sox2的启动子。(D)Tcf1和β-catenin协同转录激活Sox2启动子。(E)在ESC-RPC中检测shSox2后，神经/视网膜前体标志物和Wnt信号通路的变化。感染了shControl的细胞mRNA的表达被设为1.0。(F)免疫荧光染色显示在ESC-RPC中shSox2后增殖和神经前体细胞标志物的变化。DAPI被设为灰色。比例尺，50μm。柱状图是对相应染色的定量统计。(G)显示了进化保守序列的Nestin基因启动子(第二内含子)包含了Sox2(棕色)Tcf/Lef结合位点(蓝色)。(H)显示ChIP分析结果。(I)Tcf1剂量依赖的激活Nestin启动子。(J)荧光素酶报告基因检测Tcf1、Sox2和β-catenin协同激活Nestin启动子。(K)典型的免疫共沉淀结果显示Tcf1、Sox2和β-catenin蛋白间相互作用。(L)免疫荧光染色显示Tcf1、Sox2和β-catenin共定位。比例尺，50μm。(M)ERG检测移植shSox2和shNestin处理的ESC-RPC后的视力恢复情况。图中所示为平均值±标准差；采用t test(B、E、F、H)，ANOVA(C、D、I、J、M)进行统计分析；**代表P<0.01；每组n=10。

图8显示了Nestin和Sox2被Tcf1直接调节并参与改变ESC-RPC的命运。(A)利用生物素标记的野生型和突变型Sox2启动子探针进行EMSA实验。(B)Wnt激动剂(Wnt3a和LiCl)和Wnt抑制剂(DKK1和Quercetin)对Sox2启动子的reporter实验。(C)在ESC-RPC中Sox2RNAi效果验证。(D)在shSox2ESC-RPC中免疫荧光染色分析GFAP、Map2和Opsin的表达。图中所示为平均值±标准差；采用ttest进行统计分析；**代表P<0.01。比例尺，100μm。DAPI被设为灰色。(E)利用生物素标记探针进行EMSA实验。(F)Nestin启动子活性被Wnt激活剂(Wnt3a和LiCl)激活和被Wnt抑制剂(DKK1和Quercetin)阻断。图中所示为平均值±标准差；采用ANOVA进行统计分析；*代表P<0.05，**代表P<0.01。

图9显示了Tcf1、Sox和Nestin与小鼠视网膜早期发育和人视网膜母细胞瘤的形成密切相关。(A)免疫荧光染色显示出生后1天到30天，Nestin-EGFP转基因小鼠视网膜中fTcf1和Sox2在时间上和空间上表达情况。DAPI被设为灰色。比例尺，50μm。*指非特异性染色。GCL：节细胞层，ONBL：外成神经细胞层，INL：内核层，ONL：外核层。(B)典型的Westernblot结果显示β-catenin、fTcf1、Tcf1、Sox2、Nestin和PCNA蛋白在小鼠从E14d到成年的视网膜中表达情况。(C)视网膜母细胞瘤样本的HE形态图。比例尺，50μm。(D)视网膜母细胞瘤样本切片对β-CATENIN、fTCF1、NESTIN和VIMENTIN的免疫荧光染色结果。DAPI被设为灰色。比例尺，50μm。(E)QRT-PCR检测Wnt信号和神经标志物在正常人视网膜和视网膜母细胞瘤样本中的转录水平。GAPDH在此作为实验的内参。

图10显示了代表性的免疫荧光染色抗体验证图。RB切片被小鼠IgG的阴性对照和β-CATENIN抗体分别染色。比例尺，25μm。DAPI被设为灰色。

图11显示了经典Wnt信号影响ESC来源的前体细胞移植后的命运决定。发明人提出一个假想模型来解释经典Wnt信号如何通过Tcf1来调控Sox2和Nestin的表达，进而决定ESC来源的前体细胞在体外的分化和增殖状态，以及在疾病模型内的致瘤性和治疗性。图中指示了抑制这条通路的可能靶基因。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现抑制Wnt通路明显降低诱导产生的细胞的致瘤性，从而能获得安全有效的细胞治疗。在此基础上完成了本发明。

本发明的细胞

本发明的细胞是分离的、诱导产生的视网膜前体细胞，所述细胞移植到宿主视网膜的整合率≥70%，优选地，≥90%。

本文所用的术语“分离的”是指细胞处于一种从其原始环境或天然环境中被分离出的状态。同样，本文所用的术语“分离的视网膜前体细胞”是指视网膜前体细胞(群)从天然环境中被分离和/或纯化，并且基本上不含天然与其共存的其他细胞。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞由胚胎干细胞或iPS诱导产生。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞为哺乳动物视网膜前体细胞，优选人、小鼠。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞具有从胚胎分离得到的视网膜前体细胞的标志物表达谱。在优选的实施方式中，Rax、Crx阳性细胞比例大于40%，较佳地，大于50%，更佳地，大于60%；Sox2、Pax6阳性细胞比例小于60%，较佳地，小于50%，更佳地，小于40%。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞的肿瘤发生率≤10%，优选地，≤5%。

在另一优选的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞通过以下方法制备：对直接来源于胚胎干细胞的视网膜前体细胞进行处理，从而抑制Wnt信号通路。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞中Wnt信号通路是受抑制的。

在优选的实施方式中，所述抑制包括利用Wnt信号通路抑制剂处理初始状态的视网膜前体细胞。

在优选的实施方式中，所述Wnt信号通路抑制剂包括但不限于DKK1、Quercetin、XAV939、shTCF1、shSox2、shNestin。

在优选的实施方式中，所述抑制包括抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群。

在优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括抑制Tcf1、Sox2或Nestin基因的表达；敲除Tcf1、Sox2或Nestin基因；编码无活性的Tcf1、Sox2或Nestin蛋白；或抑制Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的活性。

在优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括用Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的抗体，或Tcf1、Sox2或Nestin基因的反义核酸进行抑制。

在本发明的方法中，处理时间取决于细胞状态和P-RPC相关基因的表达水平。细胞分化的阶段和相对应的发育阶段是移植成功的关键。只有合适阶段的细胞才能与宿主视网膜细胞和大脑之间形成正确有效的连接。在优选的实施方式中，本发明方法的处理时间为4天。

在具体的实施方式中，本发明的视网膜前体细胞可用于治疗视网膜退行性疾病，包括但不限于视网膜色素变性(RP)、年龄相关性黄斑病变(AMD)、先天性黑蒙、格子样视网膜变性、Stargardt’s黄斑退变、视锥-视杆细胞营养不良、眼底血管样条纹、早产儿视网膜病变、卵黄性黄斑营养不良、中心性浆液性脉络膜病变，等等。

在本发明中，“诱导产生的视网膜前体细胞”是一种细胞群体，该细胞群体移植到宿主视网膜后的整合率≥70%，优选≥90%，而肿瘤发生率≤10%，优选≤5%。具体地说，本发明的“诱导产生的视网膜前体细胞”是至少包含10⁴个细胞的细胞群。

本发明方法

一方面，本发明提供制备以上所述诱导产生的视网膜前体细胞的方法，包括：对诱导产生的视网膜前体细胞进行处理，抑制Wnt信号通路，从而制得所述诱导产生的视网膜前体细胞。

在另一优选例中，所述的视网膜前体细胞是通过以下方法制备的：对诱导产生的初步状态视网膜前体细胞进行处理，从而抑制Wnt信号通路，得到进一步分化的视网膜前体细胞。

处理前视网膜前体细胞的诱导方法包括：利用羊膜和PA6基质细胞进行共培养诱导，通过遗传工程导入相关基因诱导分化，在单层培养条件下添加生长因子进行诱导分化，以及经典的经过拟胚体自发分化的诱导。

优选的实施方式利用SFEB-CDM进行分化。具体说，46C细胞系复苏后，首先在饲养层细胞上进行传代扩增，维持其未分化状态。进行分化实验前，在1%明胶包被的培养皿中去除饲养层细胞，然后以4×10⁵/100mm传代后使用。分化时，计数至5×10⁵，传到100mm的petri-dish中进行悬浮培养,记为D0。在悬浮培养基中，添加了SB431542以特异性抑制Activin受体样激酶家族(ALK4,5,7)来阻断Nodal(TGFβ家族)信号通路。然后将D3的EB贴于matrigel包被的细胞培养皿中加入不含RA的CDM贴壁培养。在D7时,共聚焦显微镜下可以观察到EB中有GFP表达。将EB消化后，标记PI以去除死细胞，在无菌条件下用流式细胞仪进行分选。分选后，Sox1阳性的细胞贴壁培养于PDL/Fibronectin/Laminin包被的培养皿中，在N2培养基中加入了DAPT，抑制Notch信号通路，促进RPC向PR细胞方向的分化。同时，还在培养基中加入了0.5μM的RA和20ng/ml bFGF。

在优选的实施方式中，所述处理前视网膜前体细胞表达神经视网膜前体细胞和神经早期发育的标志物。在一优选例中，Sox2、Pax6阳性细胞比例大于80%。

在优选的实施方式中，所述Wnt信号通路抑制剂包括DKK1、Quercetin、XAV939、TCF1shRNA、Sox2shRNA、NestinshRNA。

在优选的实施方式中，所述抑制包括抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群。

在优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括抑制Tcf1、Sox2或Nestin基因的表达；敲除Tcf1、Sox2或Nestin基因；编码无活性的Tcf1、Sox2或Nestin蛋白；或抑制Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的活性。在一优选例中，shTcf1处理后细胞中Sox2的表达比例降为32.74%，Pax6为54.23%，视网膜标志物Rax则上升为67.83%，Crx为50.31%。

在优选的实施方式中，所述抑制Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群包括用Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的抗体，或Tcf1、Sox2或Nestin基因的反义核酸进行抑制。

在优选的实施方式中，本发明的处理时间为4天。在利用慢病毒载体过表达截短型Tcf1蛋白和干扰基因表达后，检测了过表达和干扰效率及细胞状态。结果发现Wnt信号通路被抑制。另外，分化相关基因的检测结果表明神经发育早期的标志物表达水平下调，视网膜各种神经元前体细胞相关基因上调。

在另一优选的实施方式中，所述方法是体外方法，和/或所述方法是非治疗性和非诊断性的。

在另一方面，本发明提供制备适合移植的视网膜前体细胞的方法，所述方法包括：

(a)对于诱导产生的视网膜前体细胞，测定所述诱导产生的视网膜前体细胞中wnt信号通路分子的表达水平，所述Wnt信号通路分子包括选自下组的基因：Wnt3a、Wnt2b、β-catenin、Gsk3β、APC、Dvl、Axin1、Axin2、Lef1、Tcf1、Tcf3、Tcf4、CyclinD2、c-myc、DKK1、Tcf1、Sox2和Nestin；

(b)选取wnt信号通路显著抑制的细胞，作为用于移植的视网膜前体细胞。

在一优选例中，选取DKK1、Tcf1、Sox2或Nestin表达水平显著降低的前体细胞。

在本发明中，wnt信号通路分子水平上调或下调表示wnt信号通路受到抑制。在具体的实施方式中，与Wnt信号通路未抑制的正常细胞相比，wnt信号通路分子的表达水平上调或下调30%以上，优选50%以上，最优选70%以上。

Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群

本文所用的术语“基因群”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，一些有相互作用和相互联系的基因。本发明发现“Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群”对于ESC-RPC的移植效果：无论形成肿瘤还是成功的整合入宿主视网膜改善受损的视力，都是关键的决定因素。因此，通过抑制Tcf1、Sox2或Nestin基因或其编码蛋白的活性不仅降低ESC-RPC的致瘤性，还显著提高治疗性。

Wnt信号通路与Wnt信号通路抑制剂

本文所用的术语“Wnt信号通路”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，它是一种复杂的蛋白质作用网络，其功能最常见于胚胎发育和癌症，但也参与成年动物的正常生理过程。Wnt信号通路可包括许多可调控Wnt信号分子合成的蛋白质，它们与靶细胞上的受体相互作用，而靶细胞的生理反应则来源与细胞和胞外Wnt配体的相互作用。经典Wnt信号在各种类型的细胞命运决定过程中都扮演着重要的角色。同时，它的不合适激活经常与癌症发生相关。但是，ESC来源的供体细胞中的Wnt信号与它们的治疗效果和在疾病模型中移植后的致瘤性存在何种相关性尚未被研究。除此之外，介导Wnt信号在控制细胞命运决定的转录因子仍是未知。

本文所用的术语“Wnt信号通路抑制剂”指对于Wnt信号通路的功能具有抑制、拮抗、降低、减弱等作用的物质。在具体的实施方式中，本发明可用的Wnt信号通路抑制剂包括但不限于DKK1、Quercetin、XAV939。

在具体的实施方式中，抑制Wnt信号通路还包括抑制其下游关键分子，例如Tcf1、Sox2、Nestin等。在具体的实施方式中，利用Tcf1、Sox2或Nestin蛋白的抗体，或Tcf1、Sox2或Nestin基因的反义核酸进行抑制。在进一步的实施方式中，利用TCF1shRNA、Sox2shRNA、NestinshRNA进行抑制。

本发明采用的材料与方法

SI诱导的视网膜变性模型和视网膜下腔移植手术

本研究使用C57BL/6小鼠(8周龄，上海斯莱克实验动物有限责任公司)，饲养条件遵照视觉与眼科学研究协会(Association for Research in Vision andOphthalmology,ARVO)关于眼科和视觉研究饲养和使用动物的标准以及健康科学研究所的动物饲养和使用规定。建立视网膜损伤模型时，适当固定小鼠，通过尾静脉注射碘酸钠(Sigma)30mg/kg(单位体重)。所有的供体细胞在移植4天前，通过注射含有EGFP编码序列的慢病毒作标记。注射的细胞以8×10⁴/ul的密度悬浮在GMEM中(Gibco,USA)，按照之前的文献报道(MacLaren,R.E.,Pearson,R.A.,MacNeil,A.,Douglas,R.H.,Salt,T.E.,Akimoto,M.,Swaroop,A.,Sowden,J.C.,and Ali,R.R.2006.Retinal repair by transplantation of photoreceptorprecursors.Nature444:203-207.)在视网膜下腔中移植1μl细胞悬液。

ERG检测(Electroretinogram,ERG)

利用重庆康华瑞明视觉电生理设备在细胞移植后的3周对动物进行视网膜电生理检查。ERG记录利用AVES软件依照之前的报道进行(Sauve,Y.,Pinilla,I.,and Lund,R.D.2006.Partial preservation of rod and cone ERG function followingsubretinal injection ofARPE-19cells in RCS rats.Vision Res46:1459-1472.)。

视网膜母细胞瘤样本收集

RB样本从五官科医院收集获得。正常视网膜收集自上海第十人民医院眼库。样本的收集和过程都依照中科院上海生命科学院健康所的伦理委员会的要求。

微阵列分析

收取如下样品：46C-ES细胞系分化获得的RPC；出生后1天小鼠原代分离培养的视网膜前体细胞(P-RPCs)。样品裂解于1ml TRIzol中，保存于-80℃。共收集三批重复试验的样品用于基因芯片(博豪公司的Affymetrix Mouse 4302.0芯片)检测分析。对每个样本，背景都被去除，数据利用MAS5.0进行标准化，利用Cluster3.0(Michael Eisen,Stanford University)进行样本的等级聚类，热图由Java Treeview软件(http://jtreeview.sourceforge.net under GPL)产生。

统计学分析

图中数据为平均值±标准差(mean±S.D.)，均为3次及以上独立实验结果的统计。所有的统计分析均利用SPSS11软件(SPSS,Chicago,IL)，制图利用SigmaPlot软件。统计学比较采用单向ANOVA(2组以上)、Student’s t-test检验(2组)。*p<0.05为差异有统计学意义，**p<0.01为差异具有显著的统计学意义。

ESC培养和视网膜祖细胞分化

按照Ying,Q.L.,Stavridis,M.,Griffiths,D.,Li,M.,和Smith,A.(2003.Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherentmonoculture.Nature biotechnology21:183-186)所述方法培养常规的小鼠胚胎干细胞Sox1/GFP reporter line46C)（US13/360326（公开号为20120157510），并用于RPC诱导实验,。

胚胎干细胞（ESC）在无血清同时添加了Nodal信号的抑制剂SB431542(Tocris)的分化培养基中悬浮培养3天以形成拟胚体。随后，EB在Matrigel包被的培养皿中，以CDM进行贴壁培养。经过7天的分化，Sox1阳性的神经上皮细胞(35.8%)利用FACS被富集。然后，这些细胞培养在添加了10μM DAPT(Calbiochem)和20ng/ml bFGF(peprotech)的N2培养基中继续视网膜定向分化直到第24天。随后，在ESC-RPC中，进行重组蛋白DKK1处理，过表达ΔNTcf1和沉默总Tcf1、Sox2或是Nestin，处理4天后，进行体外分析或是视网膜下腔移植实验。

分离视网膜组织

分离自出生后1天GFP转基因小鼠和C57BL/6小鼠的视网膜细胞在木瓜蛋白酶***(Roche)中消化为单细胞。然后将这些细胞悬浮在添加了DNase(0.005%)的GMEM中，并且在视网膜下腔移植、流式分析和收集在TRIzol中进行分析检测前放置在冰上。

流式细胞术

针对46C小鼠ES细胞，分化为视网膜定向的细胞团块在CDM中培养至第7天。针对视网膜肿瘤组织，这些组织被小心的分离并利用HBSS冲洗。然后，这些团块利用木瓜蛋白酶***消化为单细胞。GFP+和GFP-细胞利用FACS Aria细胞分离器(BD Biosciences).

利用流式分析，培养的细胞和神经视网膜利用TrypLE和papain***消化为单细胞悬液。然后按照相应抗体的说明书，我们对细胞标记后，利用BD AccuriC6流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测。

BrdU掺入分析

为了检测分化细胞的增殖能力，ESC-RPC铺在玻片上培养。BrdU以10um的终浓度加入培液中。4小时后，细胞被固定以进行进一步的免疫组化分析。

免疫荧光染色和定量测定

将小鼠脱颈处死，立即将眼球置于4%多聚甲醛中固定，4℃放置1小时。用组织包埋剂OCT于4℃平衡1小时后，液氮中包埋并保存于-80℃。冰冻切片机上进行连续切片，切片厚度为10μm，贴在APES处理过的载玻片上。室温电风扇吹4小时后，切片放于-80℃冰箱保存。

染色时，取出切片平衡至室温。用PBS洗去OCT后,加上0.25%Triton X-100室温透膜10分钟。用PBS洗去透膜液，三次，每次5分钟。10%山羊血清/PBS室温封闭30分钟。用封闭液稀释一抗至适当浓度,去除封闭液加一抗，4℃过夜。次日，用PBS洗去一抗，三次，每次5分钟。加上针对一抗的荧光二抗，室温反应1小时，用PBS洗去二抗，三次，每次5分钟。以300mM DAPI处理5分钟标记细胞核后,用封片剂封片，以倒置荧光显微镜下观察并照相，或置于4℃暗室中保存。

在所有分化细胞(DAPI标记)中，阳性细胞数利用Image-Pro plus软件(MediaCybernetics)进行统计。每次统计至少5个随机视野，并且每组统计3张玻片。

慢病毒介导的过表达

全长Tcf1按照标准分子操作由小鼠肾脏总cDNA克隆得到，然后进一步装入慢病毒载体pRRL中。引物为正向:5’-ATG CCG CAG CTG GAC TCG-3’(SEQID NO:1),反向:5’-CTA GAG CAC TGT CAT CGG-3’(SEQ ID NO:2)

截短型ΔNTcf1利用小鼠ES的cDNA为模版克隆得到，然后进一步装入慢病毒载体pCDF1-MCS2表达载体中。引物为正向:5’-ATG TAC AAA GAG ACT GTCTAC T-3’(SEQ ID NO:3),反向:5’-GAG CAC TGT CAT CGG AAG GAA C-3’(SEQ ID NO:4).

慢病毒介导的shRNA干扰

21个碱基的RNA干扰序列依照RNAi Consortium原则设计，然后克隆入pLKO.1克隆载体pLKO.1(10878，Addgene)。干扰序列为shTcfl:5’-TTC TCCACT CTA CGA ACA TTT-3’(SEQ ID NO:5);shSox2:5’-AAG CTG AGA ATTTGC CAA TAT-3’(SEQ ID NO:6);shNestin:5’-AGA AGA CCA GCA GGC GTTTAG-3’(SEQ ID NO:7)(上述干扰序列在细胞内以RNA形式进行干扰)。慢病毒感染24小时后，加入puromycin筛选稳定株细胞。4天后，RNAi的效率可通过qPCR和Western blot实验进行验证。

RNA样品制备、RT-PCR和qPCR分析

总RNA利用TRIzol(Invitrogen)按照说明书提取。RT-PCR利用RevertAid^TMM-MuLV RT试剂盒(Fermentas)按照说明书提取。PCR利用2×Taq PCR master mix(Tiangen)进行。实时定量PCR利用 Green qPCR Premix Ex Taq^TM II withROX(TaKaRa)按照说明书进行，信号利用ABI PRISM7900机器(AppliedBiosystems)收集。

蛋白质样品制备和蛋白质印迹分析

蛋白样本收集并裂解在冰浴的同时添加了PMSF(Shenergy BicolorBioscience Technology Company)和cocktail(sigma)的RIPA缓冲液中。冰浴30min后，离心取上清，利用蛋白定量试剂盒(Bio-Rad)定量。Western blot分析按照之前的报道进行(Li,L.,Sun,L.,Gao,F.,Jiang,J.,Yang,Y.,Li,C.,Gu,J.,Wei,Z.,Yang,A.,Lu,R.等,2010.Stk40links the pluripotency factor Oct4 to the Erk/MAPKpathway and controls extraembryonic endoderm differentiation.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 107:1402-1407.)信号利用荧光二抗(LI-COR)标记，并利用Odyssey 9120 Infrared Imaging System(LI-COR)收集。

荧光素酶分析

实验参照文献Identification of vimentin as a novel target of HSF4 in lensdevelopment and cataract by proteomic analysis.Mou L,Xu JY,Li W,Lei X,Wu Y,Xu G,Kong X,Xu GT.Invest Ophthalmol Vis Sci.2010年1月；51(1):396-404.的报道进行。

染色质免疫沉淀(ChIP)试验

实验参照文献Li,X.,Zhu,L.,Yang,A.,Lin,J.,Tang,F.,Jin,S.,Wei,Z.,Li,J.和Jin,Y.2011.Calcineurin-NFAT signaling critically regulates early lineage specificationin mouse embryonic stem cells and embryos.Cell stem cell8:46-58.的报道进行。

电泳迁移率改变分析(EMSA)

核浆分离采用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extract Kit(Pierce)，探针的标记采用Biotin3’End DNA Labeling Kit(Pierce)。凝胶迁移实验采用LightShiftChemiluminescent EMSA Kit(Pierce)。显色采用Chemiluminescent Nucleic AcidDetection Module(Thermo)。

本发明的优点

本发明首次将Wnt信号通路的激活和ESC-RPC的致瘤性联系在一起，第一次提出转录因子Tcf1直接调控Sox2和Nestin活跃参与神经发育和肿瘤形成的表达的证据，同时决定ESC-RPC的致瘤性和治疗效果。本发明首次提出在移植前对诱导产生的前体细胞关键的胞外信号和相关的胞内转录因子进行调控能避免肿瘤形成和提高治疗效果，从而为在移植前鉴定和操作ESC来源的供体细胞以获得安全有效的细胞治疗打开了新的途径。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1.ESC-RPC和原代RPC在移植眼内的致瘤性

首先，发明人利用化学优化的SFEB为基础的策略分化小鼠胚胎干细胞(ESC)(Sox1.GFP转基因的46C细胞系)为视网膜前体细胞(RPC)(见图1A-C和“本发明采用的材料与方法”部分)。基于这项策略，将第7天流式分选出来的Sox1.GFP⁺神经前体细胞经过进一步分化，在第24天得到了ESC-RPC。发明人利用3种方法鉴定了分化的细胞：免疫荧光染色显示在分化的早期阶段(第14天)，细胞表达多种神经前体细胞标志物，如Nestin，Pax6和Six3，和视网膜标记物Rax；在分化的末期(第24天)细胞表达光感受器前体标志物Otx2，和视杆细胞标志物Nrl和Opsin(图2A)。在分化第24天的ESC来源的RPC定义为ESC-RPC。接下来，比较了ESC、ESC-RPC和分离自出生后1天原代RPC(P-RPC)的不同标志物的转录水平。RT-PCR的结果显示在ESC-RPC和P-RPC中不能检测到全能性基因(Oct4，Nanog和Rex1)，但是在ESC-RPC和P-RPC中，发明人检测到各种视网膜细胞的标志物的表达(图2B)。进一步，发明人利用流式细胞术分析了ESC-RPC中的视网膜类型组成(图1D)。大部分ESC-RPC为Pax6⁺。一部分ESC-RPC为Rax⁺或Otx2⁺，有13.58%的细胞表达Nrl(图2C)。因此，ESC-RPC是由神经视网膜前体细胞和定向的视网膜光感受器组成的混合物。

然后，发明人通过动物实验检测了ESC-RPC的治疗潜能和致瘤性。8×10⁴的细胞注射到碘酸钠处理的成年小鼠视网膜下腔。实验中，发明人将分化第24天的ESC-RPC通过感染慢病毒标记EGFP，4天后，进行移植。同时，分离自EGFP转基因小鼠的P-RPC用作移植对照。三周后，在104个ESC-RPC的移植眼中，有63只眼有肿瘤发生。这些肿瘤外部结构完整，但是比正常眼球明显增大(图1E)。眼球的内部结构基本都被毁坏(图2D)。肿瘤质地均一，没有明显的组织结构(图2E)，且表达EGFP(图2F)，这暗示肿瘤来源于外部移植的细胞。肿瘤细胞表达Sox2，Nestin，Pax6和PCNA，暗示其中存在着未成熟的RPC(图2G和图1F)。进一步，FACS分选出的EGFP⁺肿瘤细胞能形成神经球同时具有很高的BrdU整合率(图1G和H)。免疫染色的结果显示分选出的肿瘤来源的细胞表达Sox1，Nestin和Sox2(图1I)，暗示肿瘤是神经前体细胞的特性。然而，大约33%的移植小鼠眼球中出现了ESC-RPCs的整合而不形成肿瘤。在这些眼睛中，视功能被部分恢复了。这些结果提示ESC-RPC存在能够整合入视网膜且发挥作用的潜能，但必须阻止肿瘤的形成。另一方面，在P-RPC的注射组中，没有肿瘤产生，而且在80只移植眼内有72只可以观察到有效的整合发生。

接受P-RPC和ESC-RPC移植的眼球(没有产生肿瘤的眼球)的视功能，发明人通过视网膜电图(ERG)来进行检测。ERG可以反映在光刺激下光感受器至下游神经元的功能性反应(图2H和图1J)。与之前的报道一致，碘酸钠处理导致ERG反应的完全丧失(对照组，n=10)，其a波、b波和震荡电位(OP)完全消失。其中，OP代表了视网膜中的血液循环和内核层中突触传导。但是，移植P-RPC后，模型鼠的ERG和OP的几乎完全恢复到了正常水平。

本实施例证明，控制ESC-RPC达到和P-RPC类似的状态，就可能实现完美的细胞移植。

实施例2.通过抑制经典Wnt信号使得ESC-RPC拥有P-RPC的特性

根据实施例1对于移植ESC-RPC和P-RPC的截然不同结果，发明人继续寻找其中的分子网络来区分这2种不同的供体细胞。发明人比较了ESC-RPC和P-RPC的全基因转录本。每种细胞类型发明人取了3组平行样本进行转录本分析。共有4488个基因显示出2倍以上差异(P<0.05)。这些基因主要是编码与神经分化、眼睛发育和Wnt信号相关的分子(图3A)。值得注意的是，许多编码Wnt通路相关的基因表现出表达水平的差异(图3B)。尤其是经典Wnt信号下游靶基因(Axin2、c-Myc和cyclin D2)和β-catenin的核定位(图3B和图4A)暗示ESC-RPC中Wnt信号维持在一个较高的水平。为了检测高水平的Wnt信号是否与ESC-RPC移植治疗SI诱导的视网膜变性模型的高致瘤性和低治疗性相关，发明人利用Wnt信号通路的胞外抑制剂(DKK1)在移植4天前对ESC-RPC进行了处理。非常显著的，在DKK1处理后，发明人在62只眼球中的58检测到了供体细胞的整合，并且只在其中的2只眼球观察到了肿瘤出现。

发明人还通过一系列实验观察到了DKK1处理的ESC-RPC能够成功的整合并且恢复变性视网膜视功能。首先，移植DKK1处理的ESC-RPC显著恢复了SI诱导的整个视网膜厚度的损失，及视网膜变性的典型症状-光感受器外节的损失(图3C)。其次，眼内注射DKK1处理的ESC-RPC多数迁移到视网膜的外核层并且表现出成熟光感受器的典型形态特征：拥有外突起、内节和外节(图3D和E)。第三，许多整合的EGFP+细胞表达光传感分子Opsin(图3E)暗示他们分化为视杆细胞。最后，DKK1处理的ESC-RPC有效的恢复了暗视ERG反应(n=10)。相反，未处理的ESC-RPC仅能部分恢复移植成功的眼睛ERG反应(n=10)(图3F)。综上，这些结果提示抑制Wnt信号使ESC-RPC拥有类似P-RPC的治疗效果。同时这与Wnt信号的高度激活和ESC-RPC的致瘤性相关的结果相一致。

发明人进一步检测在DKK1处理后，ESC-RPC中分子信号的变化情况。QRT-PCR数据显示DKK1抑制神经前体细胞标志物的表达但是上调视网膜定向标志物的表达，同时下调Wnt信号通路中许多关键组分的表达(图4B)。从免疫染色的结果中也可看出BrdU、PCNA、Sox2(图3G)和Pax6(图4C)阳性的细胞在DKK1处理后显著减少，同时Map2、Opsin阳性细胞比例明显增加(图4D)。另外，Otx2⁺、Nrl⁺细胞和Nestin⁺、BrdU⁺细胞相互排斥，但是在同一细胞中发现了BrdU和Nestin的共表达(图4E)，暗示这些Nrl⁺/BrdU^-/Nestin^-细胞是分化完全的有丝***后的光感受器细胞。所用抗体的特异性在新生C57小鼠的视网膜切片上通过免疫荧光染色得到验证(图4F)。另外，FCM分析提示降低了Sox2和Pax6阳性细胞的比例，但是提高了Rax和Crx阳性细胞的比例(图3H)。与P-RPC的FCM结果相比(图4G)，发明人得出结论：DKK1处理诱导ESC-RPC成为更接近P-RPC的状态，从而提示它在眼部移植后具有治疗性。

发明人进一步研究了DKK1处理诱导不同时间的得到的ESC-RPC的特征及其移植治疗效果。研究结果表明，Rax和Crx阳性细胞比例大于40%、Sox2和Pax6阳性细胞比例小于60%时，即能得到较好的移植治疗结果，移植后肿瘤发生率小于30%、整合率大于50%；而在Rax和Crx阳性细胞比例大于60%、Sox2和Pax6阳性细胞比例小于40%时，能获得更佳的移植效果，移植后肿瘤发生率仅为5%左右、整合率达到90%左右。

该实施例说明应用Wnt信号通路阻断剂处理ESC-RPC，能将其诱导到更接近P-RPC的状态，处理后的细胞移植后能获得良好的治疗效果。

实施例3.Tcf1介导经典Wnt信号在ESC-RPC中的功能

发明人研究了哪些转录因子介导了经典Wnt信号在ESC-RPC中的功能。发明人注意到在ESC-RPC(图5A)和ESC-RPC注射引起的眼部肿瘤(图5B和图6A)中全长Tcf1(fTcf1)高表达。除此之外，DKK1处理显著降低了ESC-RPC中fTCF1+和Nestin+细胞比例(图6B)。另外，发明人发现，所有的Tcf/Lef因子中，Tcf1在发育中的小鼠视网膜内高表达，暗示它在视网膜发育中的重要作用(图6C)。基于这些观察和已知的β-catenin通常结合Tcf/Lef因子一同执行经典Wnt信号的功能，发明人预测Tcf1可能在调控ESC-RPC的分化和增殖中扮演了关键的作用，尽管从未有过Tcf1在神经发育和视网膜谱系决定中发挥作用的相关报道。

为了验证这一想法，发明人将shTcf1(特异针对Tcf1的RNA干扰载体)引入ESC-RPC中(图6D)。FCM分析的结果暗示沉默Tcf1有效降低Sox2和Pax6的阳性比例，同时提高了Rax、Otx2和Crx阳性比例(图5C)。因此，沉默Tcf1使ESC-RPC更加定向向视网膜分化并进一步成熟。

为了进一步证明Tcf1的功能，发明人利用天然存在的缺失N端的截短型Tcf1(dnTcf1)。因为Tcf/Lef因子的转录激活作用依赖于它们通过N端与β-catenin的连接，所以dnTcf1对Wnt信号产生抑制作用。发明人通过TOPFlash荧光素酶实验验证了dnTcf1的负调控作用(图6E)。在分子水平，在ESC-RPC中过表达dnTcf1(dnTcf1ESC-RPC)和DKK1处理或感染shTcf1所带来的改变很相似(图5，D和E)。在功能水平，移植dnTcf1 ESC-RPC不仅降低了肿瘤的发生为132中6个，同时增加整合的数目至132中102个眼球。移植的dnTcf1 ESC-RPC能够存活并迁移至宿主视网膜中。在宿主视网膜中，发明人观察到EGFP⁺的细胞具有OS和IS典型的视杆特征，提示移植的细胞整合和分化为光感受器细胞(图6F)。另外，移植手术也同样恢复了模型鼠的ERG(图5F)。

综上所述，本实施例证明，拮抗Tcf1的活性在分子水平和视功能水平都基本能够达到和DKK1处理相同的效果。

实施例4.Tcf1的直接靶基因Sox2和Nestin能调控植入的ESC-RPC的致瘤性和治疗性

发明人还研究了Tcf1如何调控神经分化和肿瘤形成。发明人发现，与Tcf1一样，Sox2在ESC-RPC中也是高表达的(图2G)，并且在DKK1处理(图3G和图4B)或是过表达dnTcf1(图5，D和E)后显著下调，暗示Tcf1和Sox2存在着联系。已知在体内Sox2和许多类型的肿瘤和神经发育相关，发明人设计了几个实验来检验在ESC-RPC中，Tcf1是否直接调节Sox2的表达。在Sox2转录起始位点上游5Kb的区域(Sox2-5Kb)存在许多保守的Tcf/Lef结合位点(图7A)。染色质免疫共沉淀(ChIP)实验显示Tcf1能够被招募到Sox2的启动子上(图7B)。凝胶迁移实验(EMSA)提示Tcf1与Sox2的启动子直接结合(图8A)。报告基因实验揭示fTcf1在Wnt3a的存在时，能够剂量依赖的激活Sox2的reporter，这种激活作用能被dnTcf1阻止(图7C)。这些结果清楚的证实Sox2是Tcf1的直接靶基因。除了Tcf1，已知的Wnt激动剂(Wnt3a和LiCl)和β-catenin(图8B和8D)显著激活Sox2reporter活性，提示经典Wnt信号对Sox2的调控。

为了研究Sox2在调控ESC-RPC性质中的作用，发明人利用Sox2特异的RNA干扰(shSox2)稳定沉默了Sox2的表达(图8C)。免疫荧光染色和qRT-PCR结果显示沉默Sox2显著降低神经前体相关基因的表达同时提高神经视网膜相关转录基因的表达(图7，E-F，和图8D)。值得注意的是，Wnt信号通路中的组分如β-catenin、fTcf1和Axin2的表达也被不同程度的下调，暗示了Sox2和Wnt信号之间存在负反馈。

此外，发明人在Nestin的第二个内含子中发现了2个进化保守的Tcf/Lef结合位点(图7G)。之前有报道称Nestin是Sox2的靶基因，并且最近Nestin被认为是肿瘤干细胞潜在的标志物，尤其是神经外胚层肿瘤的起源。ChIP、EMSA和Reporter实验结果都证实Tcf1通过与Nestin的第二内含子的直接结合正调控Nestin的表达(图7，H-I和图8E)。进一步reporter实验显示Wnt3a和LiCl也能够激活Nestin的表达(图8F)。Sox2和β-catenin或fTcf1共表达时能够更强的激活Nestin的reporter。相反，Sox2对Nestin reporter的激活能够被dnTcf1阻断，同时Tcf1的激活也能被shSox2的表达解除(图7J)，揭示了Sox2和Tcf1/β-catenin复合体之间存在着功能性的连接。为了验证Tcf1、β-catenin和Sox2蛋白之间的相互作用，发明人设计了免疫共沉淀和免疫共定位实验。结果证明了发明人对Tcf1、β-catenin和Sox2形成蛋白复合体共同调节Nestin表达的假设(图7，K和L)。

本实施例的结果建立了Tcf1/β-catenin、Sox2和Nestin转录调节网络后，发明人进一步研究Sox2和Nestin是否能够介导Tcf1在肿瘤形成和视网膜修复中的调控。为此，shSox2和shNestin ESC-RPC被移植到同样的小鼠模型中。与dnTcf1ESC-RPC移植类似，相比于shRNA control ESC-RPC，发明人获得了更高的供体细胞整合率和更低的肿瘤发生率。功能水平上，ERG分析揭示了成功整合了shSox2和shNestin ESC-RPC的眼球，b波明显提高，而在对照组中则没有检测到(图7M)。因此，与DKK1处理和过表达dnTcf1类似，shSox2和shNestin显著降低了肿瘤的形成并提高了视功能，尽管他们的作用没有DKK1和dnTcf1那么显著。

综上所述，作为Tcf1的靶基因，Sox2和Nestin在决定ESC-RPC的特性和移植后的功能恢复中起到关键的作用。

实施例5.Tcf1、Sox2和Nestin与小鼠视网膜早期发育和人视网膜母细胞瘤的发生相关

之前的实施例已经显示Tcf1、Sox2和Nestin在决定移植的ESC-RPC的功能中扮演了重要角色，发明人进一步研究了它们的表达模式是否与视网膜早期发育相关。

发明人利用Nestin增强子驱动的EGFP表达的小鼠模型检查了它的时空表达模式。全视网膜染色显示，在出生后1天和3天(P1和P3，视杆细胞产生的高峰期)，fTcf1表达的细胞和Nestin驱动的EGFP+细胞在整个视网膜中都能观察到，但Sox2表达的细胞仅在视网膜内核层中存在。在P7，3个因子的信号都显著下降，fTcf1仅在内核层表达。在P14和P30，3个蛋白都只检测到微弱的信号(图9A)。与之一致，蛋白质印迹显示Tcf1、Sox2、Nestin和PCNA在胚胎2周(E2W)、P1和P3的视网膜中都高表达，但是在发育的后期和成年视网膜中基本检测不到。发明人注意到，dnTcf1和fTcf1的表达谱相反，暗示了dnTcf1和fTcf1的平衡对视网膜发育至关重要。fTCF1的下调和dnTcf1的上调伴随着Sox2和Nestin表达的下调和视网膜细胞的成熟。不同的是，β-catenin蛋白水平在检测的所有阶段都没有变化(图9B)。Tcf1、Sox2和Nestin的平行表达谱暗示他们可能受共同的调控并且在视网膜发育中拥有相关的功能。

由于Tcf1、Sox2和Nestin也参与肿瘤形成，发明人进一步检测了它们在视网膜肿瘤中的表达水平。发明人收集了11个最常见的视网膜肿瘤-视网膜母细胞瘤(RB)病人的临床样本，和3个正常的视网膜样本。RB样本的HE染色图片显示它和移植ESC-RPC所形成的眼部肿瘤具有相似的表型(图9C)。免疫荧光染色检测到β-CATENIN、TCF1、NESTIN和VIMENTIN在RB样本中过量表达(图9D和图10)。进一步，qRT-PCR分析证实Wnt信号组分(MYC,CYCLIN D1,β-CATENIN和TCF1)的表达和神经前体标志物(SOX1、SOX2和NESTIN)在RB样本中的表达明显高于正常组织。但是TCF家族的TCF4表达水平在2种样本中没有区别(图9E)。这些发现与RB是一种包含了不同亚群神经干细胞的异质肿瘤的特性相一致。

综上所述，Wnt相关的Tcf1-Sox2-Nestin基因群可能与正常神经前体和神经肿瘤细胞的生物学特性都密切相关。

表1.7种细胞的移植结果

失败＊：受体眼球中没有检测到EGFP+的供体细胞。

实施例7

利用人胚胎干细胞来源的前体细胞(人胚胎干细胞系H9，购自Wicell公司；人胚胎干细胞系shHES8-oct4，购自上海健康所干细胞平台)进行体外分化诱导及分子相关实验。

实验方案为：在体外通过30天前后的诱导分化，获得了神经视网膜定向的能够扩增培养的视网膜前体细胞。在分化的不同阶段，收集细胞样本进行免疫组化、流式分析和荧光实时定量检测相关基因的表达情况。同时，对分化获得的细胞进行BrdU侵入实验和增殖标志物PCNA的染色，对比小鼠胚胎干细胞的分化实验结果，提示我们获得细胞具有很强的增殖能力。同样，对人胚胎干细胞分化获得的RPC进行了抑制经典Wnt信号通路和干预β-catenin/Tcf1-Sox2-Nestin基因群的处理，并进一步检测了神经/视网膜分化基因及细胞增殖能力的变化，确认经过处理的细胞在增殖和分化中达到一个最佳的平衡，适于对于视网膜变性类疾病的治疗。

本实施例显示抑制Wnt信号传导通路或Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群能显著降低人胚胎干细胞来源的前体细胞的致瘤性并提高整合率，进而提高治疗性。

讨论

通过对7种细胞在视网膜变性模型中眼部移植的功能评价(表1)，发明人发现经典Wnt信号结合Tcf1/β-catenin-Sox2-Nestin基因群的持续激活对眼部移植ESC-RPC的致瘤性至关重要。移植前，在ESC-RPC中抑制这个基因群能极大降低移植入小鼠视网膜变性模型中后的致瘤性并显著提高治疗性(图11)。由于肿瘤形成是干细胞来源细胞的临床应用的主要障碍，该发现非常有意义，此外，本发明进一步强调了控制和监测供体细胞状态对于成功移植的重要性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种体外诱导产生的视网膜前体细胞，其特征在于，所述前体细胞移植到宿主视网膜的整合率≥70％；

所述前体细胞移植到宿主视网膜的的肿瘤发生率≤10％；

所述诱导产生的视网膜前体细胞是通过如下所述方法制备的，所述方法包括步骤：对诱导产生的初步状态的视网膜前体细胞进行处理，抑制其Wnt信号通路，从而制得所述的视网膜前体细胞。

2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述前体细胞移植到宿主视网膜的整合率≥90％；

所述前体细胞移植到宿主视网膜的的肿瘤发生率≤5％。

3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述诱导产生的视网膜前体细胞中Wnt信号通路是受抑制的。

4.一种移植组合物，其特征在于，所述移植组合物包括药学上可接受的载体和权利要求1-3中任一项所述的诱导产生的视网膜前体细胞。

5.如权利要求1-3中任一项所述的诱导产生的视网膜前体细胞在制备治疗视网膜退行性疾病的药物中的用途。

6.一种制备权利要求1所述分离的、诱导产生的视网膜前体细胞的方法，其特征在于，包括步骤：对诱导产生的初步状态的视网膜前体细胞进行处理，抑制其Wnt信号通路，从而制得权利要求1所述的视网膜前体细胞。

7.一种制备适合移植的视网膜前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)对于诱导产生的视网膜前体细胞，测定所述诱导产生的视网膜前体细胞中wnt信号通路分子的表达水平，所述Wnt信号通路分子包括选自下组的基因：Wnt3a、Wnt2b、β-catenin、Gsk3β、APC、Dvl、Axin1、Axin2、Lef1、Tcf1、Tcf3、Tcf4、CyclinD2、c-myc、DKK1、Tcf1、Sox2和Nestin；

(b)选取wnt信号通路显著抑制的细胞，作为用于移植的视网膜前体细胞。

8.一种蛋白复合物，其特征在于，所述蛋白复合物是由以下三种蛋白组成的复合物：

(a)Tcf1蛋白；

(b)β-catenin蛋白；和

(c)Sox2蛋白。

9.如权利要求8所述的蛋白复合物的抑制剂的用途，其特征在于，用于制备降低诱导产生的视网膜前体细胞致瘤性和/或提高其整合率的组合物。

10.一种筛选降低诱导产生的视网膜前体细胞的致瘤性和/或提高其整合率的试剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)在测试组中，将待测物质加入包含Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的体系中；

(b)检测Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的三元复合物的形成情况，并与未加入所述待测物质的包含Tcf1蛋白、β-catenin蛋白和Sox2蛋白的对照体系相比；

如果与对照体系相比，所述三元复合物的形成显著减少，则评定所述待测物质可降低诱导产生的视网膜前体细胞的致瘤性，并选择该待测物质作为降低诱导产生的视网膜前体细胞的致瘤性的试剂。