CN109423480B

CN109423480B - 一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法

Info

Publication number: CN109423480B
Application number: CN201711395957.0A
Authority: CN
Inventors: 葛坚; 罗子明; 钟秀风; 李凯婧
Original assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2037-12-21
Also published as: CN109423480A

Abstract

本发明公开了一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法。包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体。本发明能使视网膜组织的诱导分化以及获取成为流水线操作，可实现工厂化生产，以供大规模临床应用或药物筛选使用。

Description

一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法

技术领域：

本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体技术涉及一种人多能干细胞向三维视网膜组织分化的程控化的诱导方法。

背景技术：

人多能干细胞(Human pluripotent stem cell,hPSC)，包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)具有多向分化的潜能，即在特定条件下可以定向分化为几乎机体所有的细胞。干细胞再生技术的突破为难治性疾病的发病机制、新药开发和细胞治疗等研究带来了前所未有的机遇。其中，体外诱导hPSC向视网膜细胞甚至组织分化的关键技术先后取得突破，成为干细胞体外再生器官的领跑者，相关的临床实验也正在紧锣密鼓的进行.。尤其是从2006年，SasaiY团队(Sasai Y,Cell stem cell,2012)率先报道了ESC自组装为视泡结构的研究后，hPSC向视网膜组织分化的研究进入了新的发展阶段。进一步，Zhong XF等研究人员(NatureCommu.2014)采用特定的视网膜诱导分化液，以小片状的hiPSC为起始分化细胞，首先悬浮培养获得细胞凝聚体，第7天再贴壁培养以获得片状或环状分布的NR/RPE，后者机械分离后再悬浮培养，也获得了三维立体的视网膜组织。3D诱导技术获得的视网膜组织具有早期人胚胎视网膜的形态特征和层次结构，包含有主要视网膜细胞类型，在药物筛选以及临床移植供体方面具有广阔的应用前景和市场开发潜力。

但是，由于hPSC(包括ESC和hiPSC等)本身具有的异质性特征，诱导分化过程中的不同步和飘忽不定的成功率也极大地制约了这项技术在临床上的应用。目前制约视网膜组织大规模诱导分化及临床应用的关键点主要包括以下几个：1)目前常用的诱导分化方案都不是普遍适用于所有的干细胞系，个别细胞系无法成功分化，这严重制约了今后实现同种同体移植的应用；2)多数方案以小片状的(大小及数量难以控制)，而非单个的hPSC为起始分化细胞,导致实验重复性差，难以实现规模化同质化生产；3)所有方案在起始分化阶段都使用了大量的干细胞，培养液、诱导因子、培养板等消耗量大，导致成本高，效率低，无法满足今后供药物筛选应用的数量要求；4)研究人员需要较长的培训时间来掌握此分化技术。

发明内容：

本发明针对现有诱导分化方案的局限性，如不能普遍适用，实验重复性差，分化同质性差，学习时间长等缺点，而提供了一种能使视网膜组织的诱导分化以及获取成为流水线操作，可实现工厂化生产，以供大规模临床应用或药物筛选的人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法。

本发明的人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法，包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，

所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体。

所述收集细胞加入到培养容器中优选是收集细胞按150～300个细胞构成1个拟胚体的比例将细胞加入到培养容器中。

所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织优选在诱导分化过程中监测细胞的DKK-1表达情况，以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，如果DKK-1表达量在第3天-第28天基本满足对数增长，则无需额外添加DKK-1，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天。

所述的从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天，其DKK-1蛋白的补充量是每天一次，按每ml培养液补充100ng DKK-1蛋白的量补充。

所述的将hPSCs消化成单细胞是取生长80％融合度的hPSCs，刮除分化细胞，吸去培养液，PBS润洗后用0.5mM EDTA 37℃消化6min，再吸除EDTA，用mTeSR1吹落细胞，并吹打分散为单个细胞，离心收集细胞，用mTeSR1培养液重悬细胞，得到细胞悬液，按150～300个细胞构成1个拟胚体的比例，以琼脂微孔板作为培养容器，将琼脂微孔板置于24孔板中，每孔一个琼脂微孔板，按每个琼脂微孔板上的微孔制备1个拟胚体，每个微孔中加入含150～300个细胞的细胞悬液，37℃CO₂培养箱中培养，待细胞均匀沉入微孔底后，沿着24孔板的孔壁与微孔板之间缓慢添加1.5ml含有10μM Blebbistatin的mTeSR I培养液于每一孔继续培养。

所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织优选为：以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，第1天，24孔板孔内培养液替换为体积分数25％NIM+体积分数75％mTeSR1，共1.5ml/孔，第2天，培养液替换为体积分数50％NIM+体积分数50％mTeSR1，共1.5ml/孔，并在这一天用Matrigel包被六孔板，37℃过夜，第3天，吸取六孔板中的Matrigel，加入NIM培养液4ml/孔，用无菌镊夹起24孔板中的1个琼脂微孔板倒扣到六孔板的1个孔中，并用移液枪吹打琼脂微孔板的加样槽，将拟胚体吹落，六孔板放入37℃CO₂培养箱后，十字摇匀法摇匀，开始贴壁培养，第4-8天密切观察培养液性状，若无培养液发黄迹象可不更换培养液，第9天，全量更换NIM培养液，以去除死细胞，第10-15天，隔天更换NIM培养液，第16天，吸净NIM培养液，更换为RDM培养液，第17-28天，每日半量换RDM培养液，如果DKK-1(Dickkopf-1)表达量在第3天-第28天基本满足对数增长，则无需额外添加DKK-1，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始每天补充一次DKK-1蛋白到培养液中，按每ml培养液补充100ng DKK-1蛋白的量补充，直至第22天。

本发明相比于现有技术，具有以下优点：

1、以单个hPSC作为分化的起始细胞，限定细胞数进行诱导分化，以便实现机械化操作：诱导分化的效率及不同命运的细胞群数量主要由拟胚体的大小以及贴壁后的密度所决定。因此，现有的分化方案无法定量化控制拟胚体大小及贴壁密度，严重影响其分化的同质性及大规模生产的可能性。改变分化起始细胞的状态后，单个的hPSC在ROCK通道阻滞剂的作用下，可尽快聚集成团，不会因单细胞而死亡。而单细胞定量进入分化***这一特点为今后研发全机械操作的分化***提供了可能。通过流式分选技术可获取及计数单个细胞，并定量滴加进入分化所需的微孔板，开始定量同质分化。

2、增加DKK-1表达曲线绘制，按需补充DKK-1蛋白，以保证分化适用于绝大部分hPSC细胞系：本发明使用了6株细胞系，有3株无法通过现有诱导方案成功诱导分化，即使对于改良为单细胞起始分化的***，亦有3株无法成功分化。通过监测其DKK-1表达波动，发现这三株细胞的DKK-1表达水平在Day16天开始下降。通过补充DKK-1蛋白，这3株细胞的均实现成功分化。至此，这6株细胞均实现了成功的诱导分化为三维视网膜组织。由于这6株细胞包含了目前最常用的hiPSC来源，因此具有较好的代表性。(图7-8)

3、三维视网膜组织获取量大大提高，效率提高，成本下降：根据对本发明方案中三维视网膜组织形成效率的统计(统计量为：三维视网膜组织个数/万个细胞)，本发明的效率与各经典方案相比有显著提高，分别比Sasai的方案高约7倍，比Zhong(2014年)的方案高约80倍，比Goureau的方案高约149倍。

4、三维视网膜组织结构形成更好，分离便捷，可脱离对人工操作的依赖。改良后的诱导方案可形成结构清晰明确的三维视网膜组织。三维视网膜呈边界清晰的椭圆形，***有一圈细胞排列整齐紧密、折光性强的高亮环；或可呈现为自原拟胚体贴附处向外延伸的指状外爬结构，末端椭圆形***，边界较前一种略模糊，***亦有一圈高折光环。通过机械方法从贴壁条件刮起至悬浮培养后，非三维视网膜组织的细胞会自然凋亡，并随换液弃去，余下的视网膜组织结构清晰裸露，不需要在进行以往的人工挑取。

5、起始干细胞需要量大大减低，干细胞培养扩增的成本明显降低：根据文献中介绍，Sasai团队的方案中，9000个细胞组成1个拟胚体，可获得1-2个三维视网膜组织；Gourea的方案中，1个孔的ips细胞(约为2×10⁶个)可获得10-20个三维视网膜组织；Zhong的方案中，1个六孔板的ips细胞(约为1.2×10⁷个)可获得300个三维视网膜组织。而在本方案中，想要获得200-300个三维视网膜组织，只需要0.6×10⁶个ips细胞(不足1孔)。因而，起始细胞的需要量大大减低，日常维持培养的规模也大大减低，从而也可显著地减少了培养液及其他试剂耗材的消耗量。

6、本发明方案的视网膜诱导***有多种用途，如可用于视网膜发育疾病机制，疾病模型构建，药物筛选，基因操作等。

7、本发明方案获得的各级视网膜细胞和或组织可以制作成治疗制剂，如细胞悬液，给予视网膜退行疾病患者治疗。视网膜退行疾病指视网膜细胞变性死亡，功能丧失所致的多种疾病的总称，包括视网膜色素变性，老年黄斑变性，晚期青光眼，视神经病变等，全球有数千万患者。

附图说明：

图1是2％琼脂糖制成的35孔微孔板；

图2是形态均一、可控大小的拟胚体；

图3是视泡***过程；

图4是三维视网膜组织中含有与胚胎视网膜相同的各类细胞亚群；

图5是透射电镜下可见相当成熟的光感受器结构；

图6是诱导分化的主要流程以及既有方案与本方案机械化生产可操作性的比较；

图7是六株不同来源hPSC细胞系在既有方案及单细胞起始分化方案中DKK-1表达曲线(左侧为成功分化的细胞系及方法，右侧为无法成功分化的)；

图8是原本无法成功分化的三株细胞在添加DKK-1蛋白后可成功分化；

图9是三维视网膜组织形成效率的统计(统计量为：三维视网膜组织个数/万个细胞)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、人多能干细胞细的维持培养与传代

①细胞：SB细胞系(为皮肤成纤维细胞来源hiPSC细胞；Cellapy,CA4002106)

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL,#05851，4℃

2)EDTA：Invitrogen，15575-038，常温

3)PBS(1X)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温

4)Matrigel：Corning，354277，-20℃

5)六孔板：FALCON，353046

6)离心管：BD FALCON，352096

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C

2)倒置显微镜：Nikon，TS100

④步骤：hPSC细胞(SB细胞系)维持培养于mTeSR1培养基中，约4-5天克隆可生长至占满约80％孔底面积。传代前，在光学显微镜下将已分化的细胞刮除。吸去培养液，用无菌PBS润洗两遍。加入已复温至37℃的0.5mM EDTA 1ml，放入37℃CO₂培养箱中消化5-6min。吸去EDTA，取1ml mTeSR1轻轻吹落细胞，移入离心管中。向已用Matrigel过夜包被好的六孔板中加入mTeSR1培养基，每孔2ml。吸取细胞悬液，逐滴滴入六孔板的孔中，大约4-5滴/孔。将六孔板放入培养箱中，十字摇匀法摇匀，静置过夜。

2、微孔板的制作

①模具：

3D Petri

24-35-Large Spheroids

②试剂：

1)琼脂糖(UltraPure^TM Agarouse)：Invitrogen,16500-100

2)PBS(1X)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温

③仪器：

1)高压灭菌锅：HIRAYAMA，HVE-50

④步骤：

琼脂微孔板制作时用到的是

公司的35孔模具(

3D Petri

24-35-Large Spheroids)，按其说明书进行制作。简单地，琼脂粉末(Invitrogen,16500-100)溶解于1xPBS(吉诺生物医药技术有限公司，14111202)配成2％琼脂溶液，并进行高温灭菌。在超净工作台内，将灭菌后的琼脂溶液滴加入灭菌的模具中，避免气泡，待其冷却凝固，将琼脂块从模板中挤出，即制成35孔琼脂微孔板(图1)，而模具可以重复高压消毒使用，成本低。制作好的微孔板可浸泡于无菌PBS溶液中4℃保存待用。

3、构建拟胚体

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851，4℃

2)EDTA：Invitrogen，15575-038，常温

3)PBS(1X)：吉诺生物医药技术有限公司，14111202，常温

4)Blebbistatin：Sigma，B0560

准备微孔板：取步骤2制备好的琼脂微孔板，置于24孔板(FALCON)中(每孔1个微孔板)，加入1ml PBS润洗两次，再加入1ml mTeSR1润洗平衡20min待用。

消化细胞：取生长80％融合度的hPSC一孔，标记、刮除分化细胞，吸去培养液，PBS润洗后用1ml的0.5mM EDTA 37℃消化6min。吸除EDTA，用1ml mTeSR1吹落细胞终止消化，并轻轻吹打分散为单个细胞，离心收集细胞，用mTeSR1培养液重悬细胞，得到细胞悬液。在光学显微镜下用细胞计数板计数。每个拟胚体细胞数量设计需要150个hPSC细胞，共用3个微孔板构建拟胚体，每个琼脂微孔板可制备35个拟胚体。从细胞悬液中取适量，重悬为150μl，分别加入三个微孔板中(50μl/微孔板)。将24孔板放入37摄氏度CO₂培养箱中静置30min。待细胞均匀沉入微孔底后，沿着24孔板的孔壁与微孔板之间缓慢添加1.5ml含有10μMBlebbistatin(Sigma，B0560)的mTeSR I培养液于每一孔，注意避开微孔板，不要产生涡流和气泡。在已经测试的多个细胞系中，150-300个细胞构成1个拟胚体较为适宜。本实施例以150个细胞/拟胚体为例，每个微孔板加样槽需加50μl、含有5250(35×150)个hPSC细胞的干细胞悬液。(图2)

4.诱导分化

①细胞：SB细胞系(已构建好的拟胚体)

②试剂及耗材：

1)mTeSR1培养基：STEM CELL，#05851，4℃

2)NIM培养基(配方见附表)

3)Matrigel：Corning，354277，-20℃

4)RDM培养基(配方见附表)

5)六孔板：FALCON，353046

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C

④步骤：

消化干细胞构建拟胚体当天记为诱导分化第0天，次日记为第1天，以此类推。第1天，24孔板孔内培养液替换为25％NIM(配方见附表)+75％mTeSR1，共1.5ml/孔。第2天，培养液替换为50％NIM+50％mTeSR1，共1.5ml/孔；并在这一天用Matrigel包被六孔板，37℃过夜。第3天，吸取六孔板中的Matrigel，加入NIM培养液4ml/孔，用无菌镊夹起1个琼脂微孔板(含拟胚体)倒扣到六孔板的1个孔中，并用1ml移液枪轻轻吹打琼脂微孔板加样槽，将拟胚体吹落。六孔板放入培养箱后，十字摇匀法摇匀，开始贴壁培养。

第4-8天密切观察培养液性状，若无培养液发黄迹象可不更换培养液。第9天，全量更换NIM培养液，以去除死细胞。第10-15天，隔天更换NIM培养液。第16天，吸净NIM培养液，更换为4ml视网膜分化培养液(Retinal differentiation medium,RDM)(配方见附表)。此后每日半量换视网膜分化培养液。部分细胞系在此时期会有大量细胞脱落，应在换液时用1ml移液枪轻轻冲洗孔底，将死细胞充分吹落吸去。

多能干细胞诱导分化至第3-4周，拟胚体周围分化出假复层视网膜神经上皮(NR)，逐渐形成边界清晰，圆形或卵圆形，微***，***淡黄色折光性的三维视网膜组织结构。

5.DKK-1表达曲线监测

①细胞：SB细胞系(诱导分化过程中)

②试剂及耗材：

1)TRIzol：Sigma，4℃

2)PrimeScript^TM RT Master Kit：Takara，RR036A，-20℃

3)LightCycler 480 SYBR Green I Master：Roche，4887352001-1，-20℃

4)DKK-1：R&D,5439-DK-010(加入浓度为100ng/ml)

③仪器：

1)PCR仪：PTC-200 Thermal Cycler(Bio-Rad)

2)Real-time PCR仪：

480II system(Roche)

④步骤：

关键因子DKK-1检测及补充添加(该步骤是保证分化方案适用于绝大部分hPSC细胞系的关键步骤)

在第一次使用新的细胞系进行诱导分化时，拟胚体贴壁(Day3)后，每隔3天收集六孔板中1个孔的细胞提取RNA，用PrimeScript^TM RT Master Kit对获取的总RNA进行逆转录，并用LightCycler 480 SYBR Green I Master进行Real-time PCR相对定量测定DKK-1的表达量。绘制表达曲线。如表达曲线在Day3到Day28之间基本满足对数增长，则无需额外添加DKK-1即可成功分化；如表达曲线在Day22前开始出现下降，则需要从Day7开始补充DKK-1蛋白(100ng/ml)直至Day22。在本实施例中，DKK-1在Day12开始下降。因此，在此后的正式诱导分化中，从Day7起向培养液中添加一次100ng/ml的DKK-1蛋白(即按每ml培养液补充100ngDKK-1蛋白的量补充)，直至Day22。

6.三维视网膜组织的获取

①细胞：诱导分化第28天的细胞

②试剂及耗材：

1)RC2培养液：配方见附表

2)无菌细胞刮

3)低吸附六孔板：Corning，

3471

③仪器：

1)CO₂培养箱：SANYO，MCO-20A1C

④步骤：

分化后第22-28天，主要由视网膜神经上皮构成的早期视泡结构初步形成，一些结构良好的视泡可直接从培养孔底表面突起，形成三维立体结构，类似于胚胎发育中的视泡向前膨出的过程。视泡样结构富有折光性，形态特征明显，易于与周围组织(图3)区别。具体在第22-24天时，三维视网膜组织可初步形成。至第28天，结构良好的三维视网膜可突出于培养孔底表面，在光学显微镜40倍放大下观察，三维视网膜呈边界清晰的椭圆形，***有一圈细胞排列整齐紧密、折光性强的高亮环；或可呈现为自原拟胚体贴附处向外延伸的指状外爬结构，末端椭圆形***，边界较前一种略模糊，***亦有一圈高折光环。用细胞刮紧贴孔板底将细胞全部刮起，并悬浮于培养液中。

可通过机械方法将贴壁的组织从孔板底刮起，随后更换培养液为视网膜条件培养液(Retinal condition medium，RC2)(配方见附表)，并在低吸附环境下悬浮培养，2－3天半量换液一次。一周后，裸露的三维视网膜组织悬浮于培养液中，肉眼可见。以SB细胞为例，本次诱导分化共获得59个形态结构清晰完整的三维视网膜组织(分化效率为37.5个每万个起始细胞)。于42天时，选取透光性好结构清晰的视泡转移至低吸附24孔板中，1个视泡/孔，加入1.5ml RC2培养液，每周换液三次，并从63天起添加1μM RA(视黄酸)，隔日新鲜加入培养液内避光培养。至第91天起，更换培养基为RC1，RA改为0.5μM，每周3次半量换液。随着不断的换液，原有的混杂组织将自然凋亡并随液体被吸走，留下裸露的形态结构完整的三维视网膜组织。

在后期的免疫荧光鉴定中可看到，本次从该诱导分化***获得的三维视网膜组织可分化出与胚胎视网膜组织相同的各类视网膜细胞，包括神经节细胞、光感受器、色素上皮细胞、双极细胞等(图4)。同时，其发育的时间、空间特点与胚胎视网膜发育相类似。经过35周以上的培养，可染色观察到形态结构清晰的视锥、视杆细胞，并且在透射电镜下可观察到早期的膜盘结构(图5)。因此，该组织可实现体外对胚胎视网膜发育的全过程模拟。

根据我们对本实施例中三维视网膜组织形成效率的统计(统计量为：三维视网膜组织个数/万个细胞)，本实施例的效率与各经典方案相比有显著提高，分别比Sasai的方案高约7倍，比Zhong(2014年)的方案高约80倍，比Goureau的方案高约149倍，具体见图9。

根据文献中介绍，Sasai团队的方案中，9000个细胞组成1个拟胚体，可获得1-2个三维视网膜组织；Gourea的方案中，1个孔的ips细胞(约为2×10⁶个)可获得10-20个三维视网膜组织；Zhong的方案中，1个六孔板的ips细胞(约为1.2×10⁷个)可获得300个三维视网膜组织。而在本方案中，想要获得200-300个三维视网膜组织，只需要0.6×10⁶个ips细胞(不足1孔)。因而，起始细胞的需要量大大减低，日常维持培养的规模也大大减低，从而也可显著地减少了培养液及其他试剂耗材的消耗量。

实施例2：

本发明最显著的技术改进包括两点：第一、以单个hPSC作为分化的起始细胞，限定细胞数进行诱导分化；第二、增加DKK-1表达曲线绘制，按需补充DKK-1蛋白，以保证分化适用于绝大部分hPSC细胞系。

一、以单个hPSC作为分化的起始细胞，限定细胞数进行诱导分化，以便实现机械化操作

诱导分化的效率及不同命运的细胞群数量主要由拟胚体的大小以及贴壁后的密度所决定。因此，现有的分化方案无法定量化控制拟胚体大小及贴壁密度，严重影响其分化的同质性及大规模生产的可能性。改变分化起始细胞的状态后，单个的hPSC在ROCK通道阻滞剂的作用下，可尽快聚集成团，不会因单细胞而死亡。而单细胞定量进入分化***这一特点为今后研发全机械操作的分化***提供了可能。通过流式分选技术可获取及计数单个细胞，并定量滴加进入分化所需的微孔板，开始定量同质分化。(图6)

二、增加DKK-1表达曲线绘制，按需补充DKK-1蛋白，以保证分化适用于绝大部分hPSC细胞系

本发明使用了6株hPSC细胞系，有3株无法通过现有诱导方案成功诱导分化，即使对于改良为单细胞起始分化的***(即按照实施例1中的步骤4的流程诱导分化，只是不加DKK-1蛋白)，亦有3株无法成功分化。通过监测其DKK-1表达波动，发现这三株细胞的DKK-1表达水平在Day16天开始下降。为此，从Day7起向培养液中添加100ng/ml(终浓度)的DKK-1蛋白，直至Day22。通过补充DKK-1蛋白，这3株细胞的均实现成功分化。至此，这6株细胞均实现了成功的诱导分化为三维视网膜组织。由于这6株细胞包含了目前最常用的hiPSC来源，因此具有较好的代表性。(图7-8)

附表：

Neural induction media(NIM)Day3-15

Retinal differentiation media(RDM)Day16-41

RC2 Day42-90

RC1 From Day90

Claims

1.一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法，包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，

所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体；

所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其在诱导分化过程中监测细胞的DKK-1表达情况，以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天；

所述收集细胞加入到培养容器中是收集细胞按150~300个细胞构成1个拟胚体的比例将细胞加入到培养容器中；

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的将hPSCs消化成单细胞是取生长80% 融合度的 hPSCs，刮除分化细胞，吸去培养液，PBS润洗后用0.5mM EDTA 37℃消化6min，再吸除EDTA，用mTeSR1吹落细胞，并吹打分散为单个细胞，离心收集细胞，用mTeSR1培养液重悬细胞，得到细胞悬液，按150~300个细胞构成1个拟胚体的比例，以琼脂微孔板作为培养容器，将琼脂微孔板置于24 孔板中，每孔一个琼脂微孔板，按每个琼脂微孔板上的微孔制备1个拟胚体，每个微孔中加入含150~300个细胞的细胞悬液，37 ℃ CO₂培养箱中培养，待细胞均匀沉入微孔底后，沿着24孔板的孔壁与微孔板之间缓慢添加1.5 ml含有10μMBlebbistatin的mTeSR I培养液于每一孔继续培养。

3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织具体为：以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，第1天，24孔板孔内培养液替换为体积分数25% NIM+体积分数75% mTeSR1，共1.5ml/孔，第2天，培养液替换为体积分数50% NIM+体积分数50% mTeSR1，共1.5ml/孔，并在这一天用Matrigel包被六孔板，37℃过夜，第3天，吸取六孔板中的Matrigel，加入NIM培养液4ml/孔，用无菌镊夹起24孔板中的1个琼脂微孔板倒扣到六孔板的1个孔中，并用移液枪吹打琼脂微孔板的加样槽，将拟胚体吹落，六孔板放入37 ℃ CO₂培养箱后，十字摇匀法摇匀，开始贴壁培养，第4-8天密切观察培养液性状，若无培养液发黄迹象可不更换培养液，第9天，全量更换NIM培养液，以去除死细胞，第10-15天，隔天更换NIM培养液，第16天，吸净NIM培养液，更换为RDM培养液，第17-28天，每日半量换RDM培养液，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始每天补充一次DKK-1蛋白到培养液中，按每ml培养液补充100ng DKK-1蛋白的量补充，直至第22天；

所述的NIM培养液为DMEM/F12 500ml、100× N2 5ml、2mg/ml Heparin 0.5ml、100×MEM-NEAA 5ml；

所述的RDM培养液为DMEM/F12 300ml、DMEM basic 200ml、50× B27 without vitaminA 10ml、100× antibiotic and antimycotic 5ml、100× MEM-NEAA 5ml。