CN103555629A - 一种生产中低温β-甘露聚糖酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产中低温β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPUS-001，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7361。本发明的菌株培养方法简单，原料易得，菌株产酶性能强，所产碱性β-甘露聚糖酶制剂活力高且耐碱耐盐，在中低区间温度条件下对油田用瓜尔胶或改性瓜尔胶压裂液具有高效破胶能力，且与压裂液中绝大部分化学助剂无配伍禁忌，可满足油田压裂工程需求。

Description

一种生产中低温β-甘露聚糖酶的菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株产β-甘露聚糖酶的菌株及其发酵、酶分离提纯和该菌株在中低温井水力压裂破胶中的应用，以及利用该菌株制备β-甘露聚糖酶的方法。所述β-甘露聚糖酶具有嗜中低温、耐碱性的特点。

背景技术

水力压裂是油气井增产、水井增注的一项重要技术措施。当地面高压泵组将高粘液体以大大超过地层吸收能力的排量注入井中，在井底附近憋起超过井壁附近地应力及岩石抗张强度的压力后，即在地层中形成裂缝。随着带有支撑剂的液体注入裂缝中，裂缝逐渐向前延伸。这样在地层中形成了具有足够长度以及一定宽度和高度的填砂裂缝。由于人工裂缝具有很高的渗滤能力，使油气能够通畅流入井中，起到增产增注的作用。

在水基压裂液体系稠化剂选择方面，油田曾使用过田菁胶、魔芋胶、香豆胶等天然植物胶，但目前，主要使用的是瓜尔胶或其衍生物（羟丙基瓜尔胶HPG、羧甲基羟丙基瓜尔胶CMHPG，等）。这类植物胶除魔芋胶主要成分为葡萄甘露聚糖外，其他均属于半乳甘露聚糖类，经交联剂（中低温井用硼砂，中高温用有机硼）交联形成高强度的冻胶，具有很强的携砂能力。入井液连同支撑剂注入地缝后，为了不使改造的油层导流裂缝堵塞，必须降低粘度将胶体破胶后返排回地面，以保所造裂缝的高通透性。

目前油田主力破胶剂为过硫酸盐，如过硫酸铵，过硫酸钾等。作为化学物质，过硫酸盐的半衰期和释放游离氧的速率受温度影响极大；以过硫酸铵为例，其在100℃时的半衰期为0.17h，80℃为2.1h，60℃为38.5h，而在40℃时则长达1030h。这种特性决定其在操作上存在不可控性，即：过硫酸盐往往在高温环境下破胶过快，而在中低温时无法实现完全破胶，或必须添加激活剂方可部分起效。

在40-55℃中低温环境下，增大过硫酸盐的投加量，虽然可实现压裂液的最终水化破胶，但同时会导致压裂液粘度过低，从而影响压裂液携砂性能，施工安全性差；而且残渣量高、返排率低、压裂效果差，导致油气采出效率不高。若采用经修饰包装的胶囊破胶剂，虽可部分保障压裂液的流变性能，但过硫酸盐在井下低温环境下依然难以分离出使压裂液冻胶破胶水化所需的足够的游离氧；为了能满足快速破胶的施工目的，需要追加大量的胶囊破胶剂，最终导致成本大幅提高，同时增加了对地层的伤害风险。

而在低于40℃的低温环境下，过硫酸盐单独作用无法实现彻底破胶，必须添加激活剂物质。而这类激活剂通常具有强烈刺激性气味，因本身也是化学类物质，对地层存在伤害隐患；同时还可能存在水溶解性差、易被氧化、见光分解、稳定性差、成本高昂等缺点。

同时，过硫酸盐破胶后的残余聚合物分子量通常介于20-30万之间，虽然表观粘度下降，但实际对地层依然会造成一定的伤害。同时含硫过氧化物毒性大，腐蚀性强，对环境有一定的污染。

在上世纪晚期，油田工程师开始将生物酶应用于水力压裂破胶。其原理在于：特定的聚糖水解酶可与植物胶（主要为瓜尔胶及其衍生物）中的主要成分半乳甘露聚糖形成了远远低于糖键活化能的过渡物，使活化分子大大增多，从而显著提升糖键断裂速率。用于破胶的生物酶遵循酶配位催化动力学中的“锁钥”原理，只作用于瓜尔胶及其衍生物结构中的特定糖苷键，从而将聚合物降解为小分子量低聚糖，并可进一步在其他催化功能的复合酶的协同作用下，将低聚糖转化为非还原性的单糖和二糖。而生物酶本身在瓜尔胶及其衍生物降解前后不产生消耗，只是参与反应过程，反应后又恢复原状，继续发挥催化作用。所以在低浓度剂量下，在短时间内即可将大量的瓜尔胶及其衍生物彻底分解，此为其高效性的机制所在。

β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanmannanohydrolase，EC.3.2.l.78；以下简称β-甘露聚糖酶）是一类能水解以β-1,4-D-甘露糖为主链的多糖（包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘聚糖等）的内切酶，是目前被应用证明为最理想的压裂破胶用生物酶。

β-甘露聚糖酶用途广泛，目前被广泛应用在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料工业等领域。与上述应用领域不同的是，因油气藏的特殊环境，破胶用酶需要耐受较高的矿化度，同时由于油田措施用压裂液一般为碱性，要求生物酶需要在偏碱条件下（pH8.0-11.0）保持较高的活力。同时还要保证其具有与杀菌剂、表活类物质等油田化学助剂良好的配伍性能。

目前，碱性β-甘露聚糖酶在国外已广泛应用于油气田压裂工艺，尤其适于中低温油气井的压裂破胶（20-50℃），但尚无20℃以下低温条件下的应用报道。在国内，有关低温β-甘露聚糖酶报道较多，但多为通过天然诱变菌株或工程菌所产生的酸性、中性甘露聚糖酶，且大多是用作为饲料添加剂或洗涤剂和医药，不适应油藏的具体要求。在pH适应性方面，碱性β-甘露聚糖酶也有专利报道，但目前只是在洗涤剂和食品及饲料行业应用（马延和等公开：CN1266096）。

此外，低产和高成本限制了β-甘露聚糖酶在油气藏开发中的应用规模，能改变这种状况的最重要的途径之一是筛选和培育可产高活力的且耐碱性的β-甘露聚糖酶的高产酶菌株。

发明内容

本发明旨在提供一种可通过发酵生产中低温井水力压裂破胶用耐碱性β-甘露聚糖酶的微生物菌株，并提供该菌株的培养及发酵方法，以及发酵产物中β-甘露聚糖酶活性成份的分离纯化方法及应用。

本发明所提供的生产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPUS-001是由陕西省神木县红碱淖湖畔植物根部土壤样品中筛选获得的。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101）保藏，保藏号为CGMCC No.7361，保藏日期为2013年3月22日。

本发明的枯草芽孢杆菌OPUS-001的生理生化特性及遗传学特征为如下：

（1）菌体特征：单个细胞（0.7-0.8）×（2.0-3.0）μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢（0.6-0.9）×（1.0-1.5）μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

（2）菌落特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

（3）理化性质：革兰氏阳性菌，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

（4）遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于枯草芽孢杆菌属（Bacillussubtilis）相似但又有区别的类群，定名为OPUS-001，菌株OPUS-001的16S rDNA序列具体可见序列表。

本发明还提供利用所述枯草芽孢杆菌OPUS-001制备β-甘露聚糖酶的方法，包括如下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌OPUS-001菌种接种于瓜尔胶固体培养基上，30-37℃、培养1-2天；

（2）将固体培养基单菌落接于种子培养基内，30-37℃、震荡培养1-2天，成为种子液；

（3）将种子液接入发酵培养基中，30-37℃、培养2-5天，离心，得发酵液；

（4）发酵液经分离纯化，得β-甘露聚糖酶；

其中所述瓜尔胶固体培养基为：琼脂粉 20g/L，瓜尔胶 2-4g/L，酵母浸粉 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，补水至1L，pH 7.0-8.0；所述种子培养基为：瓜尔胶 2-4g/L，酵母浸粉 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO4.7H₂O 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L，KCl 0.5g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H²O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH 7.0-8.0；所述发酵培养基为：瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉 5g/L，NaNO₃ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH 7.0-8.0。

在上述方法中，步骤（2）中所述的震荡速率为150-200rpm/min。

在上述方法中，步骤（3）中所述的种子液与发酵培养基的体积比优选为1:20-50。

在上述方法中，步骤（4）所述的分离纯化包括如下步骤：

①将发酵液离心，取上清液滤去残渣得粗提液；

②粗提液中加入的饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，取上清液；上清液加入饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，得沉淀；沉淀溶于PBS，透析得到透析酶液；

③步骤（2）的透析酶液经Sepharose G-75柱层析分离，获得β-甘露聚糖酶洗脱峰组份，超滤膜浓缩，得液状β-甘露聚糖酶；

进一步，将步骤③得到的液状β-甘露聚糖酶经冷冻干燥，得粉状β-甘露聚糖酶。

进一步，步骤②中所述的饱和硫酸铵浓度为45-65%；粗提液与饱和硫酸铵的体积比为1:10,上清液与饱和硫酸铵的体积比为0.5:1。

本发明还提供枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPUS-001在中低温井水力压裂破胶中的应用。进一步，所述枯草芽孢杆菌OPUS-001用于发酵制备中低温井水力压裂破胶用耐碱性β-甘露聚糖酶。其应用方向还包括，但不限于，石油工业领域中的聚合物解堵、含聚废水及泥浆处理、原油品质改良；以及在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料工业等领域。本发明所述的中低温是指70℃以下的温度，尤其是指10-70℃，更好为20-50℃。

本发明的方法获得的β-甘露聚糖酶能够高效降解瓜尔胶及其衍生物，其pH耐受范围4.0-11.0，最适反应pH为6.8-9.2，温度耐受范围10-70℃，最适温度30-50℃；在上述温度和pH范围内，酶活力可保持85%以上。

本发明的OPUS-001发酵产物，以及经纯化的发酵液活力组份可制备中低温井水力压裂破胶用耐碱性β-甘露聚糖酶，其应用方向还包括，但不限于，石油工业领域中的聚合物解堵、含聚废水及泥浆处理、原油品质改良；以及在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料工业等领域。

本发明的有益效果：

本发明的枯草芽孢杆菌OPUS-001是一株高产β-甘露聚糖酶的菌株，所产β-甘露聚糖酶其pH耐受范围广，尤其是在碱性条件下还能保持较高的酶活力；其温度耐受范围广，尤其是在低温10-20℃下也能维持足以完成冻胶彻底水化的酶活力，是现有技术未能达到的温度极限。

本发明的菌株培养方法简单，培养基原料易得，菌株产酶性能强，发酵产物中β-甘露聚糖酶含量高，其产品得率高于3.2g/L，所产碱性β-甘露聚糖酶制剂活力高且耐碱耐盐，在中低区间温度条件下对油田用瓜尔胶或改性瓜尔胶压裂液具有高效破胶能力，且与压裂液中绝大部分化学助剂无配伍禁忌，可满足油田压裂工程需求。

附图说明

图1为实施例3得到的透析酶液的Sepharose G-75柱层析洗脱图，其中峰2为本发明的中低温β-甘露聚糖酶洗脱峰。

图2为实施例3得到的本发明中低温液态β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE电泳图。

图3为本发明的β-甘露聚糖酶温度适应性检测结果。

图4为本发明的β-甘露聚糖酶pH适应性检测结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例采用的培养基及其组成为如下：

瓜尔胶固体培养基：琼脂粉20g/L，瓜尔胶2.5g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，补水至1L；

种子培养基：瓜尔胶2.5g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L，KC1 0.5g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH7.0-8.0；

发酵培养基：瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉5g/L，NaNO₃ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O1.6×10^-8g/L，补水至1L,7.0-8.0。

实施例1菌株OPUS-001的分离与鉴定

1.菌株OPUS-001的分离

（1）样品采集：自陕西省神木县红碱淖湖畔植物根部土壤；

（2）热处理：将土壤样品用无菌的去离子水制成悬浮液，在80℃条件下热处理10分钟，杀死菌体；

（3）富集培养：向经过热处理的悬浮液中添加营养源，在37℃条件下培养2天后，可以获得经过富集的产芽孢细菌；

（4）分离纯化：将经过富集培养的微生物培养液进行梯度稀释，选取稀释倍数为10^-5、10^-6和10^-7的三个梯度在固体培养基上进行平板划线，37℃培养过夜。挑取单菌落转接到种子培养基内，37℃、震荡培养1天，成为种子液；

（5）将种子液接入发酵培养基中，37℃、培养3天，选取最大限度能够利用瓜尔胶生长的单菌株，命名为菌株OPUS-001。

2.菌株OPUS-001的鉴定

（1）菌体特征：单个细胞（0.7-0.8）×（2.0-3.0）μm，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢（0.6-0.9）×（1.0-1.5）μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。

（2）菌落特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。

（3）理化性质：革兰氏阳性菌，需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。

（4）16S rDNA分析，表明其属于枯草芽孢杆菌属（Bacillus subtilis）相似但又有区别的类群，定名为OPUS-001,被分类于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.7361，保藏日期：2013年3月22日。

实施例2OPUS-001菌株的发酵

将OPUS-001菌种接种于瓜尔胶固体培养基上，在37℃培养2天；将固体培养基单菌落接于盛有1/5-1/4体积比的种子培养基内，于37℃下以150rpm震荡培养1天，成为种子液；将种子液按1/50体积比加入发酵培养基中，37℃下培养3天，获得发酵液。

实施例3β-甘露聚糖酶的分离纯化

用如下方法进行分离纯化OPUS-001菌株发酵液中的β-甘露聚糖酶：

（1）将实施例1的发酵液在3000rpm、4℃离心15min，取上清，过滤得粗提液；

（2）粗提液中加入10倍量的45-65%的饱和硫酸铵，将溶液放在磁力搅拌器上4℃过夜；20,000rpm、4℃离心30min，保留上清液；上清液再加饱和硫酸铵到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀；将沉淀溶于PBS，用PBS溶液透析除去硫酸氨，得透析酶液；

（3）步骤（2）的透析酶液用Sepharose G-75柱层析分离，上样后用0.1M NaCl水溶液洗脱，收集洗脱液，每馏分1.5mL，共收集30个馏分，经280nm检测，收集β-甘露聚糖酶的洗脱峰组份（如图1中峰2），用PBS溶液透析除盐后，用超滤浓缩的方法，在4℃下，15000rpm离心10min，得液状β-甘露聚糖酶；

（4）步骤（3）得到的液态β-甘露聚糖酶，冷冻干燥，得冻干β-甘露聚糖酶粉剂。

图2为步骤（3）得到的液态β-甘露聚糖酶的SDS-PAGE电泳图，分子量大小约为38KD。

实施例4β-甘露聚糖酶活力的测定

1.酶活检测所需试剂：1）0.38%瓜胶溶液，用pH4.8-5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制；2）1%甘露糖标准溶液；3）DNS试剂，取酒石酸钾钠182g，溶于500mL蒸馏水中加热，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21g，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色试剂瓶中，室温下放置15天以后使用，使用有效期一个半月；4）酶标准样品，取2mL纯化后的液态β-甘露聚糖酶加入蒸馏水溶解均匀后，定容至100mL；冻干冻干β-甘露聚糖酶粉剂以蒸馏水逐级稀释，控制OD₂₈₀值在0.5-1.0之间；

2.分别吸取1%甘露糖标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水制成每mL分别含甘露糖200，400，600，800，1000，1200μg的标准液。各取不同浓度标准液0.5mL于试管中，加2mL pH4.8-5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，加2.5mL DNS试剂煮沸5分钟。冷后加水5mL，摇匀，520nm处测定光密度，以0.5mL水代替标准液来作空白。以所得的光密度值为横坐标，以对应的标准甘露糖液浓度的二分之一的值（即：0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，0.600，此为每管中甘露糖的mg数）为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出回归方程;

3.于试管A和B中加底物溶液2mL，50℃预热5分钟后在A管中加0.5mL酶液，50℃精确反应10分钟，取出各加2.5mL DNS试剂，B管中补加0.5mL酶液，立即煮沸5分钟，冷后各加水5mL，摇匀，520nm处测定光密度（B管为空白对照），并从标准曲线上查出相应的还原糖含量并折算成酶单位；

4.酶活定义：在特定温度及pH下（50℃、pH4.8-5.0），1min内分解瓜胶中β-甘露聚糖产生相当于1μmol甘露糖的还原集团所需的酶量，规定为1个酶活单位（实为国际单位IU），以μmol/min表示；

5.酶活力计算

按式（1）计算酶活力：

$X=\frac{K\×{10}^3}{W\×10\×180}---\left(1\right)$

式中，

X—酶活力（μmol甘露糖/min.mL）

K—从标液曲线查出的OD值相对的甘露糖mg数值

W—实际参与反应的酶量（0.5×1/n）

n—酶液稀释总倍数

180—为甘露糖的分子量

10—反应时间（min）

10³—1mmol=10³×1μmol

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的3%。

6.经测定，冻干制备的冻干β-甘露聚糖酶粉剂活力为5.5-6.5×10⁵IU/g；纯化得到的液态β-甘露聚糖酶按实际测量值最终调整到1.0×10⁶IU/L左右，用于后续的破胶性能检测。

实施例5β-甘露聚糖酶破胶性能检测

压裂液体系配方（中石化华北分公司低温井采用）包括:

基液配方：0.28%羟丙基瓜尔胶（HPG，一级）+1%KCl+0.3%CX307（破乳助排剂）+0.5%AS-6（粘土防膨剂），用0.05%Na₂CO₃（pH调节剂）调整体系pH为7.8左右；其中所述的组分的百分比是指各组分在基液中的终浓度。

交联液：1%硼砂溶液，交联比为100:4。

（1）基液的制备：称取2.8g羟丙基瓜尔胶粉剂，边搅拌边缓慢加入到1000mL水中，搅拌15分钟至溶解均匀后，常温溶胀4小时，按终浓度要求依次加入基液配方中的其他各组分，以0.05%Na₂CO₃调整pH值至7.5-8.0；

（2）将本发明的纯化得到的液态β-甘露聚糖酶（初始浓度1.0×10⁶IU/L）用自来水稀释100倍即为工作酶液，工作酶液应现配现用。

每个实验样品取100mL步骤（1）制备的基液，在各样品中分别加入0.10-0.30mL工作酶液使基液中酶终浓度为10-30mg/L（按初始浓度计），以不加入酶液的基液作为空白对照，搅拌均匀后，分别加入4mL1%交联剂硼砂水溶液（交联比100:4，v/v），快速搅拌60秒，使基液交联至挑挂状态。将各样品冻胶放入200mL容量瓶，置于50℃恒温水浴中，观察1-3h内冻胶破胶状态，测量破胶液粘度。破胶液粘度用品氏粘度计测定，取三次平均值。

经测定，10-30mg/L的β-甘露聚糖酶液可在45-90分钟内将所述压裂液体系粘度降低至5mPa.s以下，而未加入酶液的空白对照组仍保持高粘度。

实施例6β-甘露聚糖酶的温度适应性检测

按照实施例4的步骤（1）的方法，分别配置0.35%瓜尔胶基液和羟丙基瓜尔胶基液，基液中其他组分及其含量均与实施例4基液配方中所述的组分及其含量相同。各取100mL瓜尔胶基液，设实验组1、实验组2和对照组，每组13个样品。实验组1加入液态β-甘露聚糖酶液，终浓度为10mg/L；实验组2加入的液态β-甘露聚糖酶液，终浓度为30mg/L；对照组不加入β-甘露聚糖酶液。各样品，搅拌均匀后，加入6mL硼砂交联剂（1%硼砂水溶液，交联比100:6，v/v）搅拌交联至挑挂状态，放入恒温水浴槽，每组样品分别在10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70℃中进行破胶实验，观测2小时后的破胶状况，测量破胶液粘度，结果如图3。

图3的结果表明，本发明的β-甘露聚糖酶在10-70℃条件下均可有效降低压裂液冻胶粘度。在30mg/L用量下，冻胶粘度均可在2小时内接近或降至5mPa.s以下，其最适温度为30-50℃，更为特别的是在10-20℃低温区间内，也可维持足以完成冻胶彻底水化的酶活力，此处突破了原有β-甘露聚糖酶相关报道的耐受温度极限；本发明的β-甘露聚糖酶，在10mg/L用量下也表现出较好的破胶能力在其最适温度为35℃。对照组均保持高压裂液冻胶粘度，冻胶为挑挂粘度状态。

本发明的β-甘露聚糖酶在10-70℃条件下均可有效降低压裂液冻胶粘度，其适宜浓度范围为10-30mg/L。本发明的β-甘露聚糖酶在不同温度环境下，通过适当调节其添加量或作用时间，可实现冻胶压裂液彻底破胶，保证油田措施改造要求。

羟丙基瓜尔胶基液为实验组进行上述破胶实验，实验结果表明本发明的β-甘露聚糖酶在10-70℃条件下均可有效降低压裂液冻胶粘度，10-30mg/L的浓度范围内，冻胶粘度均可在2小时内接近或降至5mPa.s以下。

进一步的实验结果表明，本发明的β-甘露聚糖酶，对含有2.0-4.5g/L的瓜尔胶或羟丙基瓜尔胶基液的压裂液，均可有效降低冻胶粘度。

实施例7β-甘露聚糖酶的pH适应性检测

按照实施例4的步骤（1）的方法，分别配置0.28%瓜尔胶基液和羟丙基瓜尔胶，基液中其他组分及其含量均与实施例4基液配方中所述的组分及其含量相同。各取100mL瓜尔胶基液，设实验组1、实验组2和对照组，每组6个样品。将每组样品分别调至不同的pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0后，实验组1加入液态β-甘露聚糖酶液，终浓度为10mg/L；实验组2加入的液态β-甘露聚糖酶液，终浓度为30mg/L；对照组不加入β-甘露聚糖酶液。各样品，搅拌均匀后，加入4mL交联剂(1%硼砂水溶液,交联比100:4，v/v），搅拌交联至挑挂状态，放入50℃恒温水浴槽进行破胶实验，观测2小时后的破胶状况，测量破胶液粘度，结果如图4。

图4结果表明，本发明的β-甘露聚糖酶在pH6.0-11.0范围内均具有破胶能力；在pH7.0-9.0时，酶的破胶能力最强。通过继续调整酶的用量，在30mg/L用量以内，可进一步保证各实验组冻胶粘度均可在2小时内接近或降至5mPa.s以下。

本发明的β-甘露聚糖酶在较宽pH范围的普遍适用性，使之可满足油田各类压裂液体系的配方要求，最大限度的减少了因配伍禁忌带来的活力抑制。

羟丙基瓜尔胶基液为实验组进行上述破胶实验，实验结果表明本发明的β-甘露聚糖酶在pH6.0-11.0范围内均具有较好的破胶能力，10-30mg/L的浓度范围内，在pH7.0-9.0时冻胶粘度均可在2小时内接近或降至5mPa.s以下。

进一步的实验结果表明，本发明的β-甘露聚糖酶，对含有2.5-4.5g/L的瓜尔胶或羟丙基瓜尔胶的压裂液，均可有效降低冻胶粘度。

实施例8β-甘露聚糖酶的破胶液残渣量测定

（1）按照表1所示，将不同浓度的本发明的β-甘露聚糖酶，分别作用于以1%硼砂水溶液（交联比100:6，v/v）交联的3.8%瓜尔胶或羧甲基瓜尔胶基液，200mg/L APS作为对照，置于50℃电热恒温干燥箱中加热4小时，使基液完全破胶，将破胶液混合均匀，准确量取50mL转移至事先称量好的离心管，用1800rpm的转速离心20min后，置于电热恒温干燥箱中干燥至恒重后，称量，并计算残渣含量。结果如表1。

表1结果显示，加入不同浓度的β-甘露聚糖酶组（10，20，30，40，50mg/L），破胶液残渣量均小于400mg/L，低于行业标准SY/T6380-2008《压裂用破胶剂性能试验方法》中的规定值（500mg/L）；而APS组则高于600mg/L；

（2）步骤（1）的破胶液进行过滤，从过滤情况来看，加入过硫酸铵（APS）的对照组过滤速度（12h不能过滤完）远远低于加入本发明β-甘露聚糖酶的破胶液过滤速度（过滤速度＜1h），说明本发明β-甘露聚糖酶能够有效降低压裂液的粘滞力；观察滤液中残渣状态，仅加APS的对照组中残渣呈聚集状态，远不如加入本发明β-甘露聚糖酶作用后的残渣分散，也表明本发明β-甘露聚糖酶能够彻底降解压裂液中的高分子聚合物，从而有利于压裂液残渣返排。

表1.本发明β-甘露聚糖酶与过硫酸铵破胶后残渣量比对

实施例9β-甘露聚糖酶的破胶液岩心伤害实验

选择不同渗透率的人工岩心进行物模实验，在50℃恒温下，驱替模拟地层水并计算岩心初始渗透率K₀；以压裂液（实施例4所述的压裂液，其中基液pH为8.0）饱和岩心，破胶酶组加入终浓度20mg/L的本发明β-甘露聚糖酶，对照组加入终浓度300mg/L的APS，关闭***恒温作用3h；

1.反应结束后以模拟地层水进行反向驱替直至压力恒定，计算返排后的各组岩心的渗透率K₁；

2.岩心伤害率计算，伤害率（λ；%）数值计算公式：λ=（K₀-K₁）/K₀；结果如表2；

3.表2结果显示，破胶酶组对岩心的伤害率大大低于APS组；提示本发明β-甘露聚糖酶可有效避免植物胶残渣滞留地层，形成滤饼堵塞孔隙。

表2.本发明β-甘露聚糖酶与过硫酸铵岩心伤害率比对结果

Claims (9)

1.一种生产β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OPUS-001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7361。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌OPUS-001在中低温井水力压裂破胶中的应用。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌OPUS-001用于发酵制备中低温井水力压裂破胶用β-甘露聚糖酶。

4.一种β-甘露聚糖酶的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将枯草芽孢杆菌OPUS-001菌种接种于瓜尔胶固体培养基上，30-37℃、培养1-2天；

（2）将固体培养基单菌落接于种子培养基内，30-37℃、震荡培养1-2天，成为种子液；

（3）将种子液接入发酵培养基中，30-37℃、培养2-5天，离心，得发酵液；

（4）发酵液经分离纯化，得β-甘露聚糖酶；

其中所述瓜尔胶固体培养基为：琼脂粉20g/L，瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，补水至1L，pH7.0-8.0；所述种子培养基为：瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO4.7H₂O 0.2g/L,L-谷氨酸 5.0g/L，KCl 0.5g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H²O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH7.0-8.0；所述发酵培养基为：瓜尔胶2-4g/L，酵母浸粉 5g/L，NaNO₃ 5g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄ 5×10^-5g/L，FeSO₄·7H₂O 1.5×10^-6g/L，CuSO₄·5H₂O 1.6×10^-8g/L，补水至1L，pH7.0-8.0。

5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（2）中所述震荡速率为150-200rpm/min。

6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）中种子液与发酵培养基的体积比为1:20-50。

7.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）所述的分离纯化包括如下步骤：

①将发酵液离心，取上清液滤去残渣得粗提液；

②粗提液中加入的饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，取上清液；上清液加入饱和硫酸铵，经放置沉淀后离心，得沉淀；沉淀溶于PBS，透析得到透析酶液；

③步骤（2）的透析酶液经Sepharose G-75柱层析分离，获得β-甘露聚糖酶洗脱峰组份，超滤膜浓缩，得液状β-甘露聚糖酶。

8.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，在步骤③得到的液状β-甘露聚糖酶冷冻干燥，得粉状β-甘露聚糖酶。

9.根据权利要求7所述的生产方法，其特征在于，步骤②中所述的饱和硫酸铵浓度为45-65%；粗提液与饱和硫酸铵的体积比为1:10，上清液与饱和硫酸铵的体积比为0.5:1。

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