CN103547676B - 颗粒形式的免疫原性组合物和用于产生其的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学和疫苗开发的领域，特别涉及基于天然抗原低聚体的疫苗开发。提供的是颗粒形式的免疫原性组合物，包含病原体来源的或肿瘤来源的表面暴露的多肽或它们的抗原部分的低聚体，所述低聚体被非共价结合至颗粒载体，以及药用稀释剂或赋形剂。还提供的是重组多肽，该重组多肽包括（A）N‑端或C‑端的抗原结构域，其包含病原体来源或肿瘤来源的至少一种表面暴露的多肽、或它们的抗原部分，该抗原结构域被融合至（B）低聚化结构域（OMD），所述低聚化结构域通过（C）接头结构域被融合至（D）由能够介导多肽对由***获得的无活性细菌样颗粒（BLP）的非共价连接的单拷贝的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域（PBD）。

Description

颗粒形式的免疫原性组合物和用于产生其的方法
技术领域
本发明涉及免疫学和疫苗开发的领域，特别涉及基于天然抗原低聚体(寡聚体)的疫苗的开发。
背景技术
病原体和肿瘤细胞的许多表面暴露蛋白质以低聚体(寡聚体)起作用。例如，对于病原体的实例是以同源三聚体存在于病毒体(病毒颗粒，virions)中的流感病毒红血球凝聚素(HA)，和以同源四聚体存在于病毒体中的神经氨糖酸苷酶(NA)。同样，人类免疫缺陷病毒(HIV)糖蛋白gp140/gp120在其活性形式中是同源三聚体。同样地，呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G和F分别以四聚的和三聚的同源低聚体存在于病毒体中。同样地，如在人类呼吸道冠状病毒和SARS冠状病毒的病例中，冠状病毒刺突由同源三聚体组成。对于肿瘤细胞的实例是例如，受体酪氨酸激酶(RTK)。对于许多多肽生长因子、细胞因子和激素，RTK是高亲合性的细胞表面受体。生长因子受体包括：表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体和血小板源性生长因子受体。激素受体包括：雄激素受体和***受体。表皮生长因子受体(EGFR)的实例是四个结构上相关的RTK的ErbB蛋白质家族。ErbB蛋白质家族的四个成员能够形成同源二聚体、异源二聚体和在由一组潜在的生长因子配体激活时可能形成的更高阶的低聚体(higher-order oligomers)。在许多癌症中ErbB-1是过表达的。血小板源性生长因子受体(PDGF)家族包括PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D，其形成亦或同源二聚体亦或异源二聚体(PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)。这四种PDGF以它们的单体形式是非活性的。病原体和肿瘤细胞的这类低聚蛋白通常分别与发病实体(disease-causing entity)(病，细菌，寄生虫)的致病性和免疫原性或癌症发展有关，并因此成为用于疫苗开发的重要目标。
然而，在疫苗制备期间，这些低聚体结构的完整性和由此的抗原性可能被不利地影响，例如，如果制造方法包括病原体的灭活。可替代地，由于用于制造(重组)亚单位疫苗的的生产方法导致可能不能获得抗原的低聚状态。在两个情况中，这可以导致聚集或离解成为蛋白质的单体状态和/或错误折叠状态。
嵌入在低聚体的四级结构(quaternary structure)中的构象表位可以关键性地促成免疫原性(Weldon et al.PLoS One 5[2010],pii:e12466)。例如，Du等(Virology 395[2009],33-44)发现免疫兔子没有提供以下证据，即与缺少三聚化基序的gp140相比，三聚的gp140构建体诱导对几种HIV-1伪病毒显著增加的中和抗体。另一方面，Grundner等(Virology 331[2005]，33–46)示出使用gp140三聚体免疫兔子比使用亦或gp120亦或包含切割缺陷的Env的固相脂质体引起更高效力和幅度的中和抗体。同样Wei等(J.Virol.82[2008],6200-6208)证明三聚的病毒刺突作为最佳的蛋白质免疫原引起针对H5N1分离株的中和抗体。其他注意到的是，Bosch等(J.Virol.84[2010],10366-10374)提供了在佐剂的存在下流行性猪源2009A(H1N1)流感病毒的可溶性三聚HA和四聚NA的组合在雪貂中提供了针对感染的保护的证据。
因此，可以想象在疫苗中存在天然低聚蛋白质抗原对于它们的保护性能力是关键的。在许多实例中，由具有强烈的低聚化性质的亚结构域决定低聚化。同样在很多情况下，疫苗抗原的这种低聚化亚结构域是嵌入细胞膜中的。为了使疫苗亚单位抗原能够在没有脂质环境的情况下低聚化，可以由具有相似的构象诱导性质的异源卷曲螺旋基序代替天然的低聚化亚结构域。已经成功的应用于获得天然低聚蛋白质结构的这种基序的实例是GCN4转录因子(GCN)的32-氨基酸形式、来自T4噬菌体的次要纤维蛋白(纤维替代蛋白，fibritin)(T4F)的C-端的27-氨基酸三聚化结构域和鸡软骨基质(CART)蛋白的可溶性三聚化结构域(Selvarajah et al.,AIDSRes.Hum.Retrovir.24[2008]301–314；Yang et al.,J.Virol.74[2000],5716–5725；Yang et al.,J.Virol.76[2002],4634–4642)。
因此，用来产生天然低聚亚单位疫苗抗原的技术是可利用的。然而，已知的是可溶性亚单位疫苗抗原通常是弱免疫原性的并且需要佐剂和/或颗粒载体***以提高稳固的免疫应答。最近，在开发新的非复制性抗原呈递***以提高能够用作疫苗的抗原的免疫原性方面存在增强的兴趣。这些***中的许多是以将抗原作为多价颗粒结构来呈递该抗原的方式设计的。一些很好理解的实例是：遗传地融合至***病毒(FMDV)(Clarke et al.,Nature 330[1987],381-384)和HIV(Michel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85[1988],7957-7961；Schlienger et al.,J.Virol.66[1992],2570-2576)抗原的乙型肝炎病毒核心蛋白和表面蛋白；作为抗原载体的Ty病毒样颗粒(VLP)的开发(Adams et al.,Nature 329[1987],68-70)，其中将抗原遗传地融合至酵母反转座子Ty的TYA基因编码蛋白质的C末端以形成杂交的Ty-VLP、细小病毒样颗粒(Miyamura et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91[1994],8507-8511)。这些技术确保所讨论的抗原在相对大的颗粒中以多拷贝的形式存在。
用于抗原的其他已知的颗粒载体是病毒体，其是由体外方法生产的由脂质和至少一种病毒性包膜蛋白组成的复合物。该脂质是从亦或鸡蛋亦或植物中纯化的或合成产生的，并且源于病毒的脂质的部分提供包膜蛋白。基本上，病毒体表现再生的、空的病毒包膜，其缺少包括(一种或多种)源病毒的遗传物质的核衣壳。病毒体不能够复制，但是是纯的融合活性的囊泡。已知的用作抗原载体的病毒体包括命名为免疫增强型重组流感病毒体(immunopotentiating reconstituted influenza virosomes，IRIV)的病毒体。IRIV是球形的、单层的囊泡，该囊泡具有150nm的平均直径并且包括双层脂质膜，该脂质膜基本上由磷脂组成，优选地由卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)组成。IRIV可以包含***磷脂双层膜的功能性病毒性包膜糖蛋白HA和NA。生物学活性的HA不仅向病毒体制剂赋予结构稳定性和均一性，并且也通过维持病毒的融合活性显著地促进免疫性能。
尽管这些已知的技术可以提供提高疫苗制剂的免疫性能的颗粒载体，但是这些方法通常是相当地麻烦并且需要专业的设备和人员。此外，优选地避免将病毒材料用作载体。此外，没有已经报道过的在制造天然的低聚体亚单位疫苗中被成功应用现有的技术。
然而在本领域中(参见例如WO02/101026)已知通过将抗原融合至肽聚糖结合序列并结合至衍生自革兰氏阳性菌的颗粒来将抗原呈递至免疫***，这种颗粒载体技术迄今仅在关于单体抗原的呈递中被描述和应用。
WO 99/25836和Bosma等(Appl.Environ.Microbiol.72[2006],880-889)教导了一个LysM结构域足以介导抗原实现结合至革兰氏阳性微生物和/或肽聚糖微粒(BLP，以前称为GEMs)。随后由例如Raha等(Appl.Environ.Microbiol.68[2005],75-81)和Moeini等(Appl.Environ.Microbiol.90[2010],77-88)遵循了该方法。然而，仅通过单个LysM结构域结合抗原是相当受限的(Bosma等)并且是不太稳定的，如由Raha等(图6)示出的，Raha等测定了在5天的贮存期之后丢失了约30％至45％的最初结合抗原。与该观测结果一致，在图6中Moeini等示出在5天的贮存期之后丢失了约40％的通过单个LysM结构域结合的抗原。
疫苗的成功制造需要持续数月或者有时甚至持续数年的长期贮存。使用单个LysM结合结构域不仅导致低结合产率(Bosma等)而且也导致被结合抗原的低稳定性(Raha等，Moeini等)。因此，该方法不适合用于BLP类疫苗的经济可行的疫苗生产方法，BLP类疫苗需要抗原最适负荷至颗粒即高负荷产率与在延长的时期内保持稳定结合的抗原的组合。
发明内容
在本发明之前，通常持有的观点是：提高LysM结构域的数目以提高抗原结合的效力和稳定性。事实上，在本领域中证明了在单个构建体(成直线的2至3个结构域；顺式的/分子内)中的连续的LysM结构域提供最优的和最稳定的结合。参见Bosma等的图3，示出通过添加第二LysM结构域在结合亲合性方面显著的增加，并且该水平甚至高于包括3个顺式LysM结构域的野生型AcmA的结合亲合性。然而，本发明人观察到在低聚抗原结合的情况中在单个构建体中使用两个(或以上)连续的LysM结构域的方法不产生预期的结果。这是因为LysM串联重复介导了不仅将功能性的低聚体(寡聚体)而且也将非功能性的单体结合至载体的强结合。在疫苗中存在非功能性单体是高度不希望的，因为这种异源复合物使得表征所配制的疫苗变得更困难并且更麻烦。此外，包含LysM串联重复的非功能性单体与功能性低聚体强烈竞争BLP上的可利用的结合位点。最重要地，由于本领域中已知的非功能性的、不正确折叠的抗原可以诱导有害的免疫应答，疫苗中的非功能性单体可能对接种的受试者带来健康风险。
本发明人因此目标在于提供不仅具有改善的免疫原性而且也可以以相对容易并且经济上吸引人的方式生产的稳定的天然低聚亚单位疫苗。特别是，本申请的目的是以简单并且可靠的方式提高(当前)疫苗的安全性和效力同时避免使用致病的或其他不安全的起始材料。
令人惊奇地发现，如果仅将抗原融合至与低聚化结构域(寡聚化结构域，OMD)结合的单个LysM结构域，获得了优先结合的功能性低聚体(寡聚体)(参见图2)。通过接头(linker)序列将单个LysM结构域融合至低聚化结构域的结合使疫苗中不需要的非功能性不正确折叠的抗原的存在最少化，从而使疫苗的安全性提高。此外，具有产生自包含单个LysM结构域和OMD的抗原的BLP结合低聚体的疫苗在延长的贮存时显示出高的稳定性(参见图5)。
在不希望受到理论限制的情况下，似乎添加OMD增强了单个LysM结构域的结合特性，假设是通过低聚体中多个分子的分子间相互作用，达到与通过单个分子中的多个LysM结构域的分子内的相互作用所实现的类似的水平。推测地，当使用单个LysM结构域时，在功能性低聚体抗原和非功能性单体的混合物中，由于在单体构型中单个LysM结构域仅具有微弱的BLP结合特性，低聚体优先地结合至BLP。另一方面，将低聚体构型中的每个单独的分子的单个LysM结构域带入彼此如此紧密的接近度(反式)中(借助于OMD)，获得了与在单个分子中的两个以上LysM结构域可比的高的结合功能性。因此，本发明的出人意料的认知在于通过利用OMD当将每个亚单位单个LysM结构域组装到一个低聚分子中时使得能够优先结合期望的天然低聚体抗原，这是如果省去OMD或者使用两个以上(分子内的)LysM结构域所不可能的。
本发现同样使得能够从低聚体和单体的混合物溶液中选择性结合期望的天然低聚体，由于具有单个LysM结构域的单体显示出非常弱的结合而具有单个LysM结构域的低聚体则非常有效地结合。如果使用两个或多个LysM结合结构域，这种从低聚体和单体的混合溶液中选择性结合低聚体是不可能的，由于在那些情况中观察到对于单体和低聚体两者均有效的结合，或者单体甚至更有效地结合。
作为实例，为了将低聚亚单位抗原以它们的天然构象形式结合至颗粒，将流感HA和NA抗原以及呼吸道合胞病毒F抗原各自融合至GCN4结构域并且通过接头融合至肽聚糖结合结构域(Protan)(从N-端至C-端：HA-GCN4-Protan和Protan-GCN4-NA；F-GCN4-Protan)。在人类胚肾(HEK293)细胞中产生的HA-GCN4-Protan、F-GCN4_Protan和Protan-GCN4-NA融合体分别呈递三聚体、三聚体和四聚体，它们也能够结合至所述肽聚糖载体颗粒(BLP)。使用中国仓鼠卵巢细胞和昆虫细胞完成了相似的生产。在使用所述颗粒进行的血细胞凝集分析中证明了固定在颗粒上的HA低聚体的功能性。在小鼠模型中证明了负载有所述HA低聚体的所述颗粒的免疫原性。在小鼠模型中证明了负载有F低聚体的颗粒的免疫原性并且在棉鼠(cotton rat)模型中证明了效力。
因此，本发明涉及重组多肽，包括：
A)N-端或C-端抗原结构域，包括至少一种表面暴露的多肽(例如，病原体的或肿瘤细胞来源的)或它们的抗原部分，该抗原结构域被融合至
B)低聚化结构域(OMD)，所述低聚化结构域经由
C)接头结构域被融合至
D)由能够介导多肽非共价连接至肽聚糖载体颗粒的单拷贝的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域(PBD)，该肽聚糖载体颗粒是从***获得的无活性细菌样颗粒(BLP)，并且其中该多肽作为整体仅包含单拷贝的LysM结构域。
特别地，本发明提供了颗粒形式的免疫原性组合物，包括：
i.由***获得的无活性细菌样颗粒(BLP)作为颗粒载体；
ii.非共价连接至所述BLP的重组产生的多肽的低聚体，其中该重组多肽包括：
A)N-端或C-端抗原结构域，包含病原体来源的或肿瘤来源的至少一种表面暴露的多肽、或它们的抗原部分，该抗原结构域被融合至B)低聚化结构域(OMD)，所述低聚化结构域通过
C)接头结构域被融合至
D)由介导多肽的非共价连接至BLP的单拷贝的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域(PBD)，并且其中该多肽整体上仅包含单拷贝的LysM结构域；以及
iii.药用稀释剂或赋形剂。
本发明的概念因此依赖于该意想不到的发现，即，对于将低聚融合蛋白对载体颗粒有效的并且选择性的结合，使用仅与单拷贝的结合结构域结合的低聚化结构域是有利的，该结合结构域其天然是包含多拷贝的结合结构域的重复结构的一部分。例如，对于结合至具有相似的结合伴侣(例如，源自降解这种颗粒的酶)的其他载体本体的颗粒，如病毒体、脂质体或基于糖类聚合物的颗粒，在低聚体构建体中可以改造融合蛋白以包含非重复结合结构域。其他重复结合结构域(由该结构域，可以使用单拷贝来结合至与低聚化结构域结合的载体本体)的实例包括以下：
-来自例如自溶素如肺炎链球菌的酶LytA(例如，Pfam PF01473)的胆碱结合结构域，用于结合至包含胆碱的载体。
-来自例如糖基转移酶如口腔链球菌的葡聚糖蔗糖酶(例如PfamPF08363)的葡聚糖结合结构域，用于结合至由含葡萄糖的聚合物组成的颗粒。
-磷脂酰肌醇脂质结合结构域，例如血小板白细胞C激酶底物蛋白(普列克底物蛋白，Pleckstrin)同源(PH)结构域(Pfam PF00169)。
抗原结构域
表述“表面暴露的多肽或它们的抗原部分”是指涉及任何伸出的氨基酸其被发现在其天然环境中是表面暴露的，例如作为病原体或肿瘤细胞的一部分，并且其能够发动(mounting)保护性免疫应答。在本发明中可以使用已知的或尚待发现的病原性的或肿瘤源性的抗原序列。表面暴露的致病多肽是例如病毒性的、细菌性的、或寄生生物源性的。在优选的实施方式中，它是病毒蛋白质。例如，病原体来源的表面暴露的多肽包括包膜病毒蛋白的胞外结构域、或其抗原部分。示例性的包膜病毒包括流感病毒、冠状病毒、人类呼吸道冠状病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、变性肺病毒(metapneumovirus)、副粘液病毒，特别是呼吸道合胞病毒(RSV)。在具体的方面中，表面暴露的多肽或其抗原部分选自由流感红血球凝聚素胞外结构域或其部分、流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分、冠状病毒刺突(S)蛋白胞外结构域或其部分、RSV糖蛋白F胞外结构域或其部分、HIVgp140或其部分和RSV糖蛋白G胞外结构域或其部分所组成的组中。
来自肿瘤细胞的示例性抗原包括受体酪氨酸激酶(RTK)。对于许多多肽生长因子、细胞因子和激素，RTK是高亲合性的细胞表面受体。生长因子受体包括：表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体和血小板源性生长因子受体。激素受体包括：雄激素受体和***受体。表皮生长因子受体(EGFR)的实例是四个结构上相关的RTK的ErbB蛋白质家族。ErbB蛋白质家族的四个成员能够形成同源二聚体、异源二聚体和在被一组潜在的生长因子配体激活时可能的更高阶的低聚体。ErbB-1在许多癌症中是过表达的。血小板源性生长因子受体(PDGF)家族由PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D组成，其形成亦或同源二聚体亦或异源二聚体(PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)。该四种PDGF以它们的单体形式是非活性的。
肽聚糖结合结构域
本发明的多肽的特征在于仅存在单拷贝的能够介导多肽结合至肽聚糖的LysM(溶解素基序)结构域。LysM结构域，在本领域中也称为“LysM重复”，为约45个残基长度。在多个参与细菌细胞壁降解的酶中发现LysM结构域(Joris et al.,FEMS Microbiol.Lett.70[1992],257-264；Andre et al.,J.Bacteriol.[2008],7079-7086)。LysM结构域被假定具有一般的肽聚糖结合功能。该结构域的结构是已知的(‘The structure of a LysM domain from E.coli membrane-bound lytic murein transglycosylase D(MltD).Bateman andBycroft,J.Mol.Biol.299[2000],1113-1119)。LysM结构域的存在不限于细菌蛋白质。它们也存在于许多真核蛋白质中，然而它们在古细菌蛋白质中缺乏。对于许多包含LysM结构域的蛋白质已经假定了细胞壁结合功能。部分纯化的希氏肠球菌(Enterococcus hirae)的溶菌酶-2，一种类似于AcmA并且包括六个LysM结构域的蛋白质，结合至相同菌株的肽聚糖片段。李斯特单核细胞增生菌(Listeria monocytogenes)的p60蛋白质包括两个LysM结构域并且显示出与细胞表面相关。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的穆勒肽酶(muropeptidases)LytE和LytF在它们的N-端分别具有三个和五个重复并且都是细胞壁结合的。
重要的是注意到，以前的研究，例如以申请人的名义的WO99/25836和Bosma等(Appl.Environm.Microbiol.72[2006],880-889)显示单个LysM结构域在与BLP结合方面非常弱，并且增加LysM结构域的数目增强与BLP的结合。这与以下事实一致即大多数天然存在的肽聚糖结合蛋白含有多个(例如2-6个)串联重复的LysM结构域。相反，在本发明中发现如果在与低聚化结构域(OMD)的结合中仅使用单个LysM结构域，天然低聚蛋白质抗原对颗粒载体的结合是最有效的，条件是接头序列存在于OMD与LysM结构域之间。
通过使用本领域中已知的方法在公共可利用的蛋白质序列数据库中进行基于同源性的(homology-based)搜索，技术人员将能够识别LysM结构域氨基酸序列(Buist et al.,Mol.Microbiol.68[2008],838-847；Visweswaran et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.92[2011],921-928)。PFAM网站提供了使用序列家族的一致性可以用于进行灵敏性数据库搜索的两个分布型隐马尔可夫模型(profile hidden Markov models，profile HMM)。HMMER是用于蛋白质序列分析的分布型HMM软件的自由分配的实施方式。如在本文中使用的，术语“LysM结构域”通常涉及与根据对于LysM结构域的PFAM登录号PF01476的序列显示出至少50％、优选至少60％、最优选至少70％的序列相似性的氨基酸序列(参见http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/Pfam/getacc？PF01476)。
在本领域中已经描述了许多结合分析，其使得技术人员能够测定LysM结构域是否具有所要求的肽聚糖结合能力。如在本文中以下描述的，可以使用构建体转染待评价的宿主细胞，在其后使得宿主细胞能够表达并在培养物上清液中分泌感兴趣的重组多肽。然后分析了分泌的蛋白质对于选择性结合至获自通过完善的酸处理方法所制备的***(细菌样颗粒或BLP)的肽聚糖颗粒。例如，将0.15mg BLP(干重)与过量的澄清的哺乳动物宿主细胞表达培养物上清液接触并且在室温下温育持续30分钟同时温和地混合。然后通过低速离心收集具有结合的蛋白质BLP。使用适当的抗血清通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法对于与BLP的多肽结合分析颗粒。使用例如纯化的BSA作为对照蛋白质，通过SDS-PAGE和随后的考马斯亮蓝染色可以测定并量化BLP结合蛋白质的量。
作为另一个实例，可以制备具有(绿色)荧光蛋白的融合体，可以分析该融合体对乳球菌的表面的结合行为。参见例如Hu et al.,Appl.Environ.Microbiol.8[2010],2410-2418。
在一个实施方式中，本发明的多肽仅包含单拷贝的在乳酸乳球菌的主要的自溶素AcmA的C-端区域内发现的LysM结构域，该AcmA包含由非同源序列(Protan)隔开的三个同源的LysM结构域。AcmA的C-端区域显示出介导自溶素的肽聚糖结合(Buist et al.,J.Bacteriol.177[1995],1554-1563)。针对三个AcmA LysM结构域的氨基酸序列，参见例如WO99/25836中的图2(其中由R1、R2和R3标识三个LysM结构域)，通过引用结合于此。
也包括了AcmA LysM结构域的精确的氨基酸序列内的变异体，条件是保持肽聚糖结合功能。因此，在不失去肽聚糖结合能力的情况下可以进行氨基酸取代、删除和/或***。AcmA LysM结构域的某些部分不适合变异，例如在大多数LysM结构域中发现的保守的GDTL、N和GQ基序。然而，在没有影响LysM结构域结合载体的效率的情况下可以改变其他序列。例如，可以修改AcmA的三个LysM结构域性质(极性、非极性、吸水性、疏水性)非常不同的处的氨基酸残基。优选地，本发明的多肽包括与乳酸乳球菌AcmA的三个LysM结构域之一至少70％、优选80％、更优选90％、以及92％，95％，97％或99％相同的序列。
对于多肽，‘氨基酸序列相似性的百分比’，如70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性，可以通过在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列测定，其中对于两种氨基酸序列的最佳比对，在比较窗口中多肽序列的一部分与参考序列(其不包含添加或删除)相比可以包括添加或删除(即，缺口)。通过以下来计算百分比：(a)测定在两个序列中相同氨基酸出现的位置的数目以产生匹配位置的数目；(b)将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数；和(c)将结果乘以100以产生序列相似性的百分比。通过已知算法的计算化实施方式、或通过检查可以进行用于比较的序列的最佳对齐。容易利用的序列比较和多重序列比对算法分别是，Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215[1990],403；Altschul et al.,Nucleic Acid Res.25[1997],3389-3402)和ClustalW程序，两者在因特网上是可利用的。
作为另一个实施例，在本发明中也可以使用来自发酵乳杆菌噬菌体内溶菌素的LysM结构域序列(Hu et al.,Appl.Environ.Microbiol.,76[2010],2410-2418)或显示出与其至少70％序列同一性的序列。
低聚化结构域
如上文描述的，本发明的多肽的特征在于存在低聚化结构域(OMD)和单个LysM结构域。OMD是例如二聚化、三聚化或四聚化结构域。这种结构域在本领域中是已知的(O’Shea et al.,Science 243[1989],534-542；Harbury et al.,Science 262[1993],1401–1407)。例如，低聚化结构域是GCN4类的二聚化、三聚化或四聚化结构域。酵母转录激活因子GCN4的亮氨酸拉链区域包括具有氨基酸序列MKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER的GCN4-p1二聚化结构域。GCN4类的三聚化结构域(GCN4-pII)优选包括氨基酸序列MKQIEDKIEEIESKQKKIENEIARIKK。
将在本文中使用的术语“四聚化结构域”限定为介导四个单体蛋白质或其部分的四聚化的形成的结构域。合适的四聚化结构域包括但不限于：仙台病毒磷蛋白四聚化结构域和源自酵母GCN4二聚化结构域的突变的四聚化结构域(GCN4-pLI)。在优选的实施方式中，由GCN4类的四聚化结构域提供重组流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的四聚化。GCN4类的四聚化结构域优选地包括氨基酸序列MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGE。
对于在本发明中使用的其他有用的低聚化结构域包括：噬菌体T4次要纤维蛋白(纤维替代蛋白，fibritin)的C-端结构域序列(折叠核(折叠子)，foldon)或其功能部分或其类似物，特别是折叠核的C-端27至30个残基(Güthe et al.J.Mol.Biol.337[2004],905-915)，和鸡软骨基质(CART)蛋白的可溶性三聚化结构域。鸡软骨基质蛋白质的C-端低聚化结构域是由三个相同的43个残基组成的三聚的卷曲螺旋(Selvarajah et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses,24[2008],301-314)。
对于在本发明中使用的低聚化结构域可以进一步包括在抗原结构域与卷曲螺旋基序之间的双重半胱氨酸基序以进一步稳定低聚的蛋白质(Louis et al.,J.Biol.Chem.278[2003],20278-20286；Magro et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109[2012],3089-3094)。
接头结构域
本文中以下的实施例举例说明了接头结构域对于OMD和/或LysM结构域的最佳功能的重要性。因此，OMD和LysM优选被由10与60之间、优选地20-50、更优选地25-40个氨基酸残基组成的接头结构域隔开。将OMD直接融合至LysM结构域产生不利的结果。使用具有约30(例如28-32)个氨基酸长度的接头结构域获得了很好的结果。对于详细内容参见实施例2。
在一方面中，接头结构域包括在乳酸乳球菌AcmA的C-端中的LysM重复之间中找到的接头序列。例如，L1：GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST(29个氨基酸)；L2：GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ(31个氨基酸)或L3：QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS(30个氨基酸)。在优选的实施方式中，接头结构域由GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST、GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ或QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS组成。也可以使用正确长度(即约10与60个氨基酸残基之间)的其他接头结构域序列。技术人员基于以下示出的实施例和其常识将能够产生和评估特定接头序列的合适性。
此外发现可以通过末端“加帽结构域”的存在增强本发明的多肽的产生。例如，在添加C-端加帽结构域时，增强了从N-端至C-端由通过OMD和接头序列将HA融合至单个LysM结构域的构建体的表达(参见图2A)。因此，本发明的多肽可以进一步包括在N-端是抗原结构域的情况下的C-端加帽结构域，或在C-端是抗原结构域的情况下的N-端加帽结构域。加帽结构域可以在长度方面变化，例如从约10至约60个氨基酸、优选地20-50、更优选地25-40个氨基酸残基的长度。使用具有与将OMD连接至LysM结构域的接头结构域相同序列的加帽结构域获得了非常好的结果。换言之，本发明的多肽中的单拷贝LysM结构域与含有相同的或至少高度(>90％)相似的氨基酸序列侧接(flanked by)是有利地。因此，在具体的实施方式中，加帽结构域，并且优选地也是接头结构域，由选自由以下所组成的组中的氨基酸序列所组成：GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST、SASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ和QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS。
可以改变多肽内的各结构域的相对方位，条件是接头结构域序列总是位于OMD与LysM结构域之间。上文中描述了合适的接头结构域。
在一个实施方式中，LysM结构域位于来自病原源性的多肽或其抗原部分的C-端。例如，该结构特别适用于包含1型膜蛋白如流感病毒HA、HIV gp140、冠状病毒S和RSV F的物质。在另一个实施方式中，LysM结构域位于来自病原源性的多肽或其抗原部分的多肽的N-端。对于2型膜蛋白如流感病毒NA和RSV G优选后一种来源。多肽可以进一步包括促进在真核宿主细胞中的重组表达和/或由真核宿主细胞的分泌的一种或多种序列。有利的序列包括N-端信号序列。本文中将“信号序列”定义为信号肽，该信号肽引导蛋白质或其部分运输至真核细胞的内质网——这是分泌途径的进入位点。可以将信号序列定位于蛋白质或其部分的N-端。在将蛋白质嵌入内质网之后可以切除信号肽。例如，在一个实施方式中用于在果蝇细胞中表达重组蛋白质的pMT/BiP载体包括BiP信号序列。在另一个实施方式中，用于在哺乳动物细胞中表达重组蛋白质的pCD5载体包括信号序列MPMGSLQPLATLYLLGMLVA，例如CD5糖蛋白的信号肽序列。在又一个实施方式中，在蛋白质之前的天然信号序列被用于将前体多肽引导至分泌途径。
如在上文中描述的，产生的本发明的重组多肽适合用于制造颗粒形式的免疫原性组合物。因此，本发明的进一步的方面涉及颗粒形式的免疫原性组合物，包括作为颗粒载体的从***获得的无活性球形肽聚糖颗粒(GEM颗粒或细菌样颗粒(BLP))，其中将重组产生的多肽(每个多肽如在上文中限定)的低聚体被非共价连接至所述BLP，以及药用稀释剂或赋形剂。
BLP是无活性的、丧失了完整的表面蛋白质与胞内内含物，可以在没有机械破坏的情况下通过使用能够除去细胞壁成分如蛋白质、磷壁(脂质)酸((lipo)teichoic acid)或来自所述细胞壁材料的糖类的溶液处理完整的细胞获得BLP，并且其中厚的肽聚糖细胞壁保持完整。产生的基本上球形的肽聚糖微颗粒反映了***的尺寸和形状。优选地，该细菌是非病原性细菌，更优选地是食品级细菌。该细菌可以选自由乳球菌、乳杆菌、芽胞杆菌和分枝杆菌所组成的组中。
设想了多种实施方式，例如可以使用包含源自第一病原体的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的至少第一低聚体和使用包含源自例如相同的或第二种不同的病原体的不同的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的第二低聚体非共价地提供颗粒载体。不同的低聚体例如包含不同的HA血清型、HA和NA、HA和S和/或RSV F。在介导抗RSV保护性抗体响应方面，具有至少10个氨基酸残基的RSV F蛋白或其免疫原性的活性片段是优选的一种。F蛋白跨RSV的两种主要菌株(A亚族和B亚族)保持高度保守。以非融合性(non-fusogenic)67kDa前体(F0)合成该F蛋白，其经受弗林蛋白酶(furin)的蛋白水解性切割以产生两种二硫化物连接的多肽，F1和F2。F蛋白经由F1多肽的N-端进入细胞膜，然而跨膜片段定位在C-端附近。与这两个区域相邻的是两个七肽重复序列(heptad repeatsequences)，标识为HR-C和HR-N，其形成发夹样结构的稳定的三聚体，在病毒进入之前该发夹样结构经受构象变化以使病毒和细胞膜能够接近。在优选的实施方式中，F胞外结构域包含两个突变的切割位点导致锁定在预融合的构象中的未切割的多肽。
在优选的实施方式中，提供了颗粒形式的免疫原性组合物，包含流感病毒来源的表面暴露的多肽或其抗原部分的低聚体，所述低聚体被非共价结合至颗粒载体和药用稀释剂或赋形剂。根据本发明的免疫原性组合物例如包括一种重组的三聚的流感红血球凝聚素胞外结构域或其部分或一种重组的四聚的流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分。在抗流感病毒亚型或菌株、或一种以上相关的流感病毒亚型或菌株的个体中，这种免疫原性组合物特别适用于引起免疫应答。然而，在一些实施方式中，根据本发明的免疫原性组合物包括一种或多种三聚的红血球凝聚素胞外结构域或其部分、和/或一种或多种四聚的神经氨酸酶的胞外结构域或其部分的组合。
因此，例如，可以组合2、3、4、5、6、7、8、9或10个三聚的红血球凝聚素胞外结构域或其部分，如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16，或可以组合2、3、4、5、6、7、8、或9个四聚的神经氨酸酶胞外结构域或其部分，如N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、H9、和/或N9。另外，根据本发明的免疫原性组合物可以包括不同的流感亚型的一种或多种三聚的红血球凝聚素胞外结构域或其部分和一种或多种四聚的神经氨酸酶的胞外结构域或其部分的组合。例如，可以组合1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个三聚的红血球凝聚素胞外结构域或其部分和1、2、3、4、5、6、7、8、或9个四聚的神经氨酸酶胞外结构域或其部分，如H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8和/或N9。技术人员将会清楚该术语“一种或多种胞外结构域”包含来自一种或多种流感病毒亚型如例如甲型流感病毒和乙型流感病毒的一种或多种胞外结构域。因此，根据本发明的颗粒形式的免疫原性组合物可以是多价的组合物，与包含一种重组的三聚的流感红血球凝聚素胞外结构域或其部分或者一种重组的四聚的流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分的免疫原性组合物相比，使用该多价的组合物可以实现对流感病毒感染的增强的保护。另外，或可替代地，使用多价的组合物可以实现抗一种以上流感病毒型、或流感病毒亚型或菌株的更宽的保护。此外，根据本发明的免疫原性组合物对抗原变化的敏感性低于传统的灭活的或减活的流感病毒疫苗。
本发明的进一步的实施方式涉及用于提供颗粒形式免疫原性组合物的方法，包括以下步骤：(a)提供根据本发明的重组多肽；(b)提供由***获得的非活性球形的肽聚糖颗粒(BLP)；(c)使得能够将所述多肽非共价结合至所述BLP以形成包含非共价结合至颗粒载体的病原体来源的或肿瘤来源的表面暴露多肽或其抗原部分的多肽的低聚体的免疫原性复合物，和(d)将该免疫原性复合物配制成免疫原性组合物。
对于步骤(b)，在本领域中描述了用于提供肽聚糖颗粒(BLP)的方式和方法。参见例如WO 02/101026和US 6,896,887公开了用于获得***的细胞壁材料的方法，包括使用能够除去来自所述细胞壁材料的细胞壁组分如蛋白质、磷壁(脂脂)酸或糖的溶液处理所述细胞壁材料，其中所述细胞壁材料基本上包括球形的肽聚糖颗粒。由此获得的颗粒可以简单地与包含重组产生的一种或多种多肽的制剂(例如细胞培养物上清液或纯化的多肽)混合。借助于它们的LysM结构域和OMD，多肽可以结合至载体，结合物被同时、先于和/或随后组装入它们的天然低聚体构型中。
也提供的是编码根据本发明的多肽的核苷酸序列，以及包含核苷酸序列的载体。如在本文中使用的术语“载体”被定义为能够将异源的核苷酸序列引入宿主细胞的核苷酸分子，如质粒、噬菌体或动物病毒。根据本发明的载体使得能够在宿主细胞中表达或产生由异源核苷酸序列编码的蛋白质或其部分。在根据本发明的方法中的合适的载体包括，但不限于，pCD5(Pouyani and Seed,Cell 83[1995],333-343)和pCAGGS(Niwa et al.,Gene 108[1991],193-199)。“宿主细胞”是由核苷酸分子如载体转化的、或能够被转化的细胞。本文中的术语“转化”被定义为将外源核苷酸引入受体细胞。受体细胞的转化可以产生由所述细胞瞬时表达重组蛋白质，意味着重组蛋白质仅表达限定的时间段。可替代地，转化受体细胞可以产生稳定的表达，意味着核苷酸被引入细胞的基因组并因此传递给下一代的细胞。另外，可以实现重组蛋白质的诱导型表达。诱导型表达***要求存在或不存在使得能够表达感兴趣的核苷酸序列的分子。诱导型表达***的实例包括，但不限于：Tet-On和Tet-Off表达***、激素诱导型基因表达***如例如蜕皮激素诱导型基因表达***、***糖诱导型基因表达***、和使用包含诱导型金属硫蛋白启动子的pMT/BiP载体(Invitrogen)的果蝇诱导型表达***。
进一步的实施方式涉及包含根据本发明的核苷酸序列或载体的宿主细胞。这种宿主细胞有利地用于重组产生本文中公开的多肽。
本发明的重组多肽在例如原核细胞中、或真核细胞如植物细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达。根据本发明的重组低聚体胞外结构域或其部分可以在植物中表达。原核细胞和真核细胞在本领域中是熟知的。原核细胞是例如大肠杆菌或乳酸乳球菌。植物和/或植物细胞的实例包括，但不限于：玉米(细胞)、水稻(细胞)、浮萍(细胞)、烟草(细胞，如BY-2或NT-1细胞)、和马铃薯(细胞)。酵母细胞的实例是酿酒酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母(Pichia)。昆虫细胞的实例包括，但不限于：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞如Tn5、SF-9和SF-21细胞，以及果蝇细胞如果蝇Schneider 2(S2)细胞。适用于表达根据本发明的重组蛋白质的哺乳动物细胞的实例包括，但不限于：非洲绿猴肾脏(Vero)细胞、幼崽仓鼠肾脏(如BHK-21)细胞、人类视网膜细胞(例如PerC6细胞)、人类胚肾细胞(如HEK293细胞)、马-达二氏(Madin Darby)犬科的肾脏(MDCK)细胞、鸡胚胎成纤维细胞(CEF)、鸡胚胎肾脏细胞(CEK细胞)、源自胚盘的胚胎干细胞(例如EB14)、小鼠胚胎成纤维细胞(如3T3细胞)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、和小鼠骨髓瘤(如NS0和SP2/0)、以及这些细胞类型的衍生型。在优选实施方式中使用哺乳动物CHO细胞或S2昆虫细胞。
因此，本发明也提供了用于提供根据本发明的重组多肽的方法，包括在合适的培养基中培养如上所述的宿主细胞、使得能够表达多肽并分离该物质。优选地，该方法使用真核宿主细胞，优选哺乳动物宿主细胞，例如MDCK、HEK、CHO或PerC6细胞，或昆虫细胞，例如S2细胞。
本发明进一步提供的是用于在哺乳动物个体中引起抗病原体的免疫应答的方法，包括将根据本发明的免疫原性组合物给予所述个体。
本发明提供了可以用作疫苗的免疫原性组合物。这些疫苗可以是亦或预防性的(即，为了防止感染)亦或治疗性的(即，为了治疗感染)，但将通常是预防性的。本发明也提供了用于在哺乳动物中提高免疫应答的方法，包括给予有效量的本发明的免疫原性组合物的步骤。免疫应答优选的是保护性的并且优选参与抗体和/或细胞介导的免疫。该方法可以提高加强应答(booster response)。哺乳动物优选是人类。其中该疫苗是用于预防性用途，人类优选是儿童(例如幼儿或婴儿)或青少年；其中疫苗是用于治疗性用途，人类优选是青少年或成年人。也可以将意在用于儿童的疫苗给予至成年人例如以评估安全性、剂量、免疫原性等。根据本发明制备的疫苗可以用于治疗儿童和成年人两者。因此，人类患者可以是1岁以下，5岁以下，1-5岁，5-15岁，15-55岁，或至少55岁。用于接受疫苗的优选的患者是老年人(例如>50岁，>60岁，并且优选>65岁)。然而，疫苗不仅适用于这些年龄组，并且可以更广泛地应用在人群中，包括用于年轻人(例如<5岁)、住院患者、保健工人、武装部队和军事人员、怀孕的女性、慢性疾病患者、或免疫缺陷性患者。
例如，本发明提供了用于在个体中引起抗病毒性疾病的免疫应答的方法，优选地其中病毒性疾病是由流感病毒、动物冠状病毒、人类呼吸道冠状病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)或副粘液病毒所引起的，特别是由呼吸道合胞病毒(RSV)或变性肺病毒所引起。该方法涉及给予所述个体本发明的天然低聚体亚单位疫苗，包括：
A)N-端或C-端抗原结构域，该结构域包括选自由流感红血球凝聚素(HA)胞外结构域或其部分、流感神经氨酸酶(NA)胞外结构域或其部分、冠状病毒刺突(S)蛋白胞外结构域或其部分、RSV糖蛋白F或G胞外结构域或其部分和HIV gp140胞外结构域或其部分所组成的组中的病原性来源的至少一种表面暴露的多肽或其抗原部分，该抗原结构域被融合至
B)低聚化结构域(OMD)，所述低聚化结构域通过
C)接头结构域被融合至
D)由单拷贝的能够介导多肽的非共价连接至由***获得的无活性细菌样颗粒(BLP)的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域(PBD)，并且其中该多肽作为整体仅包括单拷贝的LysM结构域。
可以由本领域技术人员通过任何已知的方法给予根据本发明的组合物，优选用于鼻腔的、舌下的、口服的或非肠道的给药途径。在优选的实施方式中，给药途径是鼻腔途径。本发明也提供了以本发明的免疫原性组合物预装的递送装置。合适的递送装置包括预装的(喷雾)的容器和注射器。本发明的组合物通常将直接给予至患者。可以通过非肠道的注射(例如皮下的、腹膜内的、静脉内的、肌内的、或至组织间隙的)，或粘膜地如通过直肠的、舌下的、口服的(例如片剂、喷雾)、***的、局部的、透皮的或经皮的、鼻内的、眼部的、耳内的、肺部的或其他粘膜的给药可以完成直接递送。如上文讨论的，肌内的给药是典型的。
本发明可以被用于引起全身的和/或粘膜的免疫，优选地引起增强的全身的和/或粘膜的免疫。
剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。可以在初级免疫(primaryimmunisation)方案中和/或加强免疫方案中使用多剂量。在多剂量方案中，可以通过相同的或不同的途径如非肠道的初免(prime)和粘膜的加强(boost)、粘膜的初免和非肠道的加强等给予多种剂量。通常以至少1星期间隔(例如约2星期、约3星期、约4星期、约6星期、约8星期、约10星期、约12星期、约16星期等)给予多剂量。可以将本发明的免疫原性组合物每年、每2年、每3年等给予至相同的患者。
也设想的是将不同的呼吸器官的疫苗同时共给予至受试者，例如与流感疫苗同时给予肺炎球菌疫苗。组合疫苗，其中以混合物给予两种或多种疫苗，如与呼吸道合胞病毒(RSV)抗原结合的肺炎球菌的糖类(结合的或非结合的)，并且还推测了可以添加许多其他抗原如流感病毒抗原。例如，本发明可以应用于制备包含RSV的融合蛋白(F)、粘附蛋白(G)和基质蛋白(M)与流感疫苗的结合的组合疫苗。
如上文描述的，本发明也涉及使用疫苗组合物或用于制备疫苗组合物的方法，用于使哺乳动物免疫抵抗天然构象的抗原，特别是抵抗流感或RSV感染，或涉及产生抵抗构象的抗原如HA、NA或RSV抗原的诱导的抗体。在一方面中，本发明提供了根据本发明的重组多肽用于制备意在预防或治疗流感或RSV感染的疫苗或免疫原性组合物的用途。
附图说明
图1.各种HA融合蛋白的：示意图(图片A和图片B)、对BLP的结合(图片C和图片D)、以及多聚化状态(E)。能够形成三聚体的线性HA-OMD-Protan(缩写为HA-P三)的示意图(图片A)和以单体存在的HA-Protan(缩写为HA-P单)的示意图(图片B)。OMD是GCN4-pII。融合体的Protan部分(＝PBD)在尺寸方面不同。在缩写的蛋白质融合体名称中的字母P之后的数字表示Protan部分中的LysM结构域的数目。L1-2：接头序列。在缩写的蛋白质融合体名称中的数字之后的L表示在最C-端LysM结构域之后存在C-端接头结构域。LysM1-2：LysM(肽聚糖结合)结构域。
图片C和图片D示出当HA-Protan融合蛋白包含GCN4结构域(OMD)时仅需要1个LysM结构域用于有效的结合至BLP。在HEK293S(GNTI-)细胞中表达不含GCN4三聚化基序的三个不同HA-Protan融合蛋白变异体和一个包含GCN4基序的这种融合蛋白。对于源自H1M(图片C)和源自X31(图片D)的HA蛋白质，加倍地完成表达。通过将150μg(干重)的颗粒与过量的约30-45μg的融合蛋白温育并且在温育之后收集颗粒使得获得的HA-Protan融合蛋白能够结合至BLP。然后通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色[图片I]分析50μg的每个BLP级分(BLP-fraction)。使用MAb PA90(α-Protan)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法[图片II]通过分析来自细胞培养物培养基的样品来检查对照表达。所有融合蛋白都很好的表达。这些实验共同显示与OMD结合的单个LysM结构域足以用于将蛋白质有效结合至BLP，然而当不存在OMD时需要两个LysM结构域用于有效的结合。图片E：包含OMD的HA-Protan融合蛋白主要是低聚的。通过蓝色非变性凝胶电泳随后使用Protan抗体α-PA90的蛋白质印迹分析不同的HA-GCN4-Protan变异体。在将每个变异体施加至凝胶之前，将等量的清澈的细胞培养物上清液煮沸持续10秒(10”)、30秒(30”)或3分钟(3')。分析的HA-Protan融合蛋白是H1M病毒衍生的HA-P1三和HA-P1L三蛋白质。在非常短暂的加热(10秒)之后所有这些HA蛋白质以相当于三聚体的迁移率迁移，但是在更长的煮沸时间之后离解成HA的二聚的和单体形式。即使在延长的煮沸样品之后HA-P1三和HA-P1L三三聚体依然是可检测的。所有等价的HA-P单变异体以单体的迁移率迁移。此外，大多数这些HA-P单蛋白质表现出变化的、但是有时是强烈的趋势以形成高分子量的聚集物(由星号标识)，很可能是这些非天然蛋白质的差的折叠和稳定性的结果。
图2.HA-P2L三和HA-P1L三变异体和这些变异体与BLP的结合用于产生疫苗的示意图。图片A：生产HA-P2L三和HA-P1L三的主要产生三聚变异体但是也产生少量的不需要的、不恰当折叠的、单体变异体。图片B：使单体的和三聚的HA-P2L三变异体结合至BLP，接下来是随后的洗涤，产生具有结合的天然低聚的HA和不需要的不恰当折叠的单体HA的BLP疫苗。将单体的与三聚的HA-P1L三变异体结合至BLP，接下来是随后的洗涤，产生具有结合的天然低聚的HA并且不含有不需要的不恰当折叠的单体HA的BLP疫苗。因此，使用与OMD如GCN4结合的单个LysM结构域将蛋白质结合至BLP使得能够选择性结合所期望的天然生物学活性的低聚蛋白质。
图3.具有和不具有OMD的HA-Protan变异体对BLP结合的量。使增加量的(0–4μg)HA-P1L三(H1-GCN4-P1L)和HA-P2L单(H1-P2L)能够结合至固定量(0.3mg)的BLP。结合之后测定结合的HA的量。重复进行该实验。明显地，在与用于HA-P2L单的相似的浓度下，更多的HA-P1L三结合至BLP。因此，使用与OMD如GCN4结合的单个LysM结构域将蛋白质结合至BLP比使用两个LysM结构域而没有OMD更有效。
图4.在凝集测试中低聚的HA(与单体HA对比)对BLP的结合是生物学功能的。A.血细胞凝集分析的示意图。图片1：与红血细胞(RBC；ery)混合的流感病毒能够结合至RBC并且能够形成引起凝集作用的网络。图片2：连接至BLP并且与RBC混合的HA三聚体(BLP-HA三)能够结合至RBC，并且能够形成引起凝集作用的网络。图片3：连接至BLP并且与RBC混合的HA单体(BLP-HA单)不能够结合至RBC，并且不能够形成引起凝集作用的网络；RBC在微孔板的孔中的沉积，其可见为圆点。图片4：与RBC混合的BLP不能够结合至RBC并且不引起凝集作用。图片5：HA三聚体(HA三)结合至RBC，但是不能够形成引起凝集作用的网络。
B.使用火鸡RBC的血细胞凝集分析。在融合体中使用的HA是H1M。孔道1：阴性对照，RBC+缓冲液。孔道2：RBC+BLP。孔道3：RBC+BLP与4μg结合的HA-P1L三。孔道4：RBC+BLP与2μg结合的HA-P1L三。孔道5：RBC+BLP与1μg结合的HA-P1L三。孔道6：RBC+BLP与0.5μg结合的HA-P1L三。孔道7：RBC+4μg HA-P1L三。孔道8：RBC+BLP与4μg结合的HA-P2L单。孔道9：RBC+BLP与2μg结合的HA-P2L单。孔道10：RBC+BLP与1μg结合的HA-P2L单。孔道11：RBC+BLP与0.5μg结合的HA-P2L单。孔道12：RBC+4μg HA-P2L单。该实验清楚地示出仅低聚的HA结合至BLP(BLP-HA三)是生物学功能的，而单体HA结合至BLP(BLP-HA三)不是生物学功能的。
图5.HA-P1L三结合至BLP的稳定性。图片A：结合至BLP的HA-P1L三(比率是3.3μg HA-P1L三结合至1mg BLP)被等分并且在2-8℃下保存。在配制之后在T＝0、3、6和9个月时，检测了一个等分用于分析结合至BLP的HA-P1L三的量(将在T＝0时测量的量设为100％)；并且图片B：在凝集测试中的生物学活性。AU；凝集单位。该实验清楚地显示在2-8℃下在PBS中上达至至少9个月的储存中HA-P1L三结合至BLP是完全稳定的并且是生物学功能的。
图6.以μg/ml为单位的抗H1M IgG抗体的平均量(图片A)；存在于血清中的HI效价(图片B)；以及存在于小鼠的鼻腔洗涤物中的S-IgA(图片C)，使用以下试剂鼻内免疫该小鼠三次：(i)可溶性三聚的HA(HA三)[0.33μg/剂量]；(ii)与BLP混合的可溶性三聚的HA(BLP+HA三)[0.33μgHA三和0.1mg BLP/剂量]；(iii)结合至BLP(BLP-HA三)的三聚的HA(HA-P1L三)[0.33μg HA三和0.1mg BLP/剂量]，以及(iv)结合至BLP(BLP-HA单)的单体HA(HA-P1L单)[0.33μg HA三和0.1mg BLP/剂量]。清楚地，与可溶性三聚的HA(HA三)以及与BLP混合的可溶性三聚的HA(BLP+HA三)相比，BLP-HA三颗粒制剂是最具免疫原性的制剂。关于功能性抗体分析(HI效价；图片B和S-IgA；图片C)，低聚的BLP-HA三颗粒制剂引起的比单体BLP-HA单颗粒制剂更高的应答显示生物学功能的HA三是最具免疫原性的构象。
图7.具有多个Protan部分的含GCN4(OMD)的融合蛋白HA三-Protan的表达和BLP结合特性。图片A：使用各自的表达质粒转染HEK293细胞并且温育，其后收集培养物上清液并且裂解细胞。使用针对Protan部分(α-PA90)的抗体通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析每个样品。示出产生一系列包含GCN4的HA蛋白(称为HA-P三以显示它们的三聚化潜力)的H3(X31)和H1(H1M)亚型。所有的HA-P三变异体被容易地表达并且被有效地分泌到细胞培养物培养基中，如由它们在细胞裂解物中有限的存在来判断的。X31HA-P三融合蛋白的产生稍微低于H1M HA-P三融合蛋白的丰度(abundant)，而通常融合至P1L和P2L的HA蛋白质似乎显示了在细胞中具有最有限的保留的最高的产生水平。图片B：在过量的融合蛋白的存在下通过温育等量的颗粒来比较不同的含GCN4的HA-Protan融合蛋白对BLP的结合并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析结合BLP的蛋白质的量。发现所有的HA-P三变异体均结合但是具有显著不同的效率。对于H1M和X31病毒衍生的HA蛋白质两者，变异体HA-P1三、HA-P1L三和HA-P2L三最有效地结合至BLP。对于H1M1和X31HA-P2三蛋白质观察到对BLP的低结合效率。该结果显示与OMD结合的1个LysM结构域足以使得能够优异地结合至BLP。图片C：使用抗HA(抗H1M)温育的蛋白质印迹。通道1：标记(marker)蛋白，在边缘中以kDa显示大小。通道2：BLP颗粒，30μg。通道3：HA三，其携带Strep标签(HA-Strep三)而不是Protan延伸部(40ng)。通道4：从使用HA-Strep三(840ng)的温育液中回收BLP(30μg)。通道5：HA-P1L三，44ng。通道6：从使用HA-P1L三(880ng)的温育液中回收BLP(30μg)。这些实验一起显示这些融合蛋白被很好地表达并由哺乳动物细胞分泌并且在C-端处的细菌Protan结构域的存在不干扰HA-低聚体融合蛋白的有效分泌(图片A)。此外，该实验清楚地显示1个LysM结构域足以获得对BLP的优异结合并且尽管需要GCN4结构域以增强单个LysM结构域的结合，但其不结合至BLP(图片C)。
图8.Protan-NA的示意图(A)、表达(B)、多聚化状态(C)和结合至BLP(D)。图片A：能够形成四聚体(缩写为P-NA四)的线性Protan-OMD-NA和以单体(缩写为P-NA单)融合体存在的Protan-NA的示意图。在NA构建体中OMD是GCN4-pLI。融合体的Protan部分(＝PBD)包含具有或不具有接头的1个LysM结构域。在缩写的蛋白质融合名称中的数字之后的L表示在LysM结构域后存在C-端接头结构域。图片B：示出具有或不具有GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白的表达。使用各自的表达质粒转染HEK293细胞并且温育，在温育之后收集培养物上清液并且裂解细胞。使用针对Protan部分的抗体(α-PA90)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析每个样品。与HA-Protan蛋白质相似，发现所有的Protan-NA变异体均被分泌到细胞培养物上清液中；对于包含GCN4四聚化基序的Protan-NA变异体观察到了少量的细胞内的保留。图片C：示出包含OMD的NA-Protan融合蛋白是低聚的。在此比较了有(+)与没有(-)GCN4的P1L-NA变异体的低聚状态。通过蓝色非变性凝胶电泳分析了这些P1L-NA变异体的样品。大多数P1L-NA单蛋白质以单体迁移而它们中的部分以二聚体迁移。然而，没有检测到四聚体。相反，P1L-NA四蛋白质依照四聚体迁移而没有检测到单体或二聚体。这些实验共同显示NA融合蛋白被良好的表达并由哺乳动物细胞分泌，并且在N-端处存在的细菌Protan结构域不干扰NA-低聚体融合蛋白(针对在C-端处具有Protan的HA低聚体融合蛋白同样观察到)的有效分泌。此外，GCN4基序诱导并稳定NA融合蛋白中的低聚状态，如对于HA融合蛋白所观察到的。图片D：分析了不同的NA-Protan融合蛋白的对BLP的结合特性。通过将150μg(干重)的颗粒与过量的约30-45μg的融合蛋白温育，之后收集该颗粒(用B标识的通道)，使得具有或不具有LysM结构域的接头C-端和具有与不具有OMD(GCN4)的Protan P1变异体能够结合至BLP。用S标识的通道显示在结合之后NA保留在培养基中。BLP与缓冲液的模拟温育作为阴性对照。然后使用兔抗PA90血清(抗Protan)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析5μg的BLP级分。对于缺少GCN4四聚化基序的P1L-NA单和P1-NA单融合蛋白没有获得结合或获得弱的结合，如对于HA-P1单构建体所观察到的。然而，使用P1L-NA四融合蛋白观察到了明显有效的BLP结合。相反，在LysM结构域与OMD结构域之间缺少接头的P1-NA四构建体，显示弱的结合。明显地，对于有效结合低聚体Protan形式单个LysM基序已经足够，条件是在LysM结构域与OMD之间存在接头结构域。
图9.NA变异体的神经氨酸酶活性。使用胎球蛋白类神经氨酸酶活性分析检测了不具有和具有GCN4的神经氨酸酶变异体P1和P1L两者的神经氨酸酶活性。使用100μl的5μg/ml胎球蛋白在4℃下过夜涂覆NuncMaxiSorp 96孔板。连续稀释包含相同量的NA(如通过蛋白质印迹法确认)的一百微升的细胞培养物培养基样品并且添加至胎球蛋白涂覆的孔中。在37℃下在温育1h之后，洗涤该板并且随后通过添加过氧化物酶标记的花生凝集素(2.5μg/ml；Sigma)测量神经氨酸酶活性，在室温下温育1h，洗涤该板，并且将100μl的过氧化物酶底物(TMB)添加至每个孔中。在5分钟之后，通过添加100μl的0.3M磷酸来终止反应，并且使用酶联免疫吸附分析(ELISA)仪(EL-808[BioTEK])在450nm下测量OD值。如通过曲线图显示的，包含GCN4四聚化基序的Protan-NA四蛋白质显示出浓度依赖性唾液酸酶活性。对于缺少GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白没有发现唾液酸酶活性。这些结果明显地证明Protan-NA的低聚形式是酶学功能的。
图10.各种F融合蛋白的示意图(A和B)和表达以及对BLP的结合(C)。能够形成三聚体的线性F-OMD-Protan(缩写为F-P三)(图片A)与作为单体存在的F-Protan(缩写为F-P单)(图片B)的示意图。该OMD是F构建体中的GCN4-pII序列。融合体的Protan部分(＝PBD)在尺寸方面是不同的。在缩写的蛋白质融合体名称中的字母P之后的数字表示Protan部分中的LysM结构域的数目。L1-3：接头序列。在缩写的蛋白质融合体名称中的数字之后的L表示在最C-端LysM结构域之后存在C-端接头结构域。LysM1-2：LysM(肽聚糖结合)结构域。在图片C中，在过量的融合蛋白的存在下通过温育等量的颗粒来比较具有和不具有GCN4的不同的F-Protan融合蛋白对BLP的结合并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析BLP结合的蛋白质的量。发现具有一个LysM和GCN4结构域的F-P三变异体和具有两个LysM结构域的F-P单变异体有效地结合至BLP。对于具有一个LysM结构域但缺少GCN4的F-P单变异体观察到对BLP的低效率结合。该结果表示与OMD结合的1个LysM结构域足以能够优异地将F蛋白质结合至BLP，对于HA和NA观察到了相似的结果。为了研究Protan-F融合蛋白的表达，使用各自的表达质粒转染HEK293细胞并且温育，在温育之后收集培养物上清液并且裂解细胞。使用针对Protan部分的抗体(α-PA90)通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析每个样品。与HA-Protan和Protan-NA蛋白质类似，发现所有的F-Protan变异体被分泌到细胞培养物上清液中。
图11.在鼻内给予之后结合至BLP的三聚的F蛋白(BLP-F三)在小鼠中诱导样抗体应答。图片A；竞争ELISA的示意图。使用F蛋白涂覆微孔板的孔。使用接种后小鼠的两倍连续稀释的血清温育这些孔。在温育之后通过洗涤去除血清稀释液并且随后使用非饱和量的温育该孔。在温育之后，将未结合的转移至第二板并且，在结合之后，使用第二抗体检测。检测的结合的量是接种的小鼠的血清中的样抗体的量的测量结果。图片B：竞争ELISA的结果，其清楚地显示在使用BLP-F三鼻内接种的小鼠的血清中得到样抗体。
图12.在使用BLP-F三鼻内接种棉鼠之后的疗效(图片A)、血清学检测(图片B)和安全性(图片C)。使用以下各项使用14天的间隔鼻内免疫棉鼠三次：(i)可溶性F(F单)[4μg/剂量]；和(ii)结合至BLP(BLP-F三)的三聚的F(F-P1L三)[4μgHA三和0.5mg BLP/剂量]，以及(iii)PBS作为阴性对照。将使用铝盐络合的肌内***灭活的RSV(FI-RSV)作为增强的疾病对照给予。在最后的接种之后的第14天使用RSV/a/Long激发(challenged)(i.n.)所有动物。在第0、28天和42天时对动物采血以用于病毒中和效价(VN)。在激发之后的第5天处死所有动物，并且收集整个肺脏以及将肺脏分成两部分用于病毒滴定和病理组织学以评价增强的疾病特性。图片A显示与F单或PBS接种相比，BLP-F三接种之后病毒效价方面的显著减少。在第28天和第42天时低病毒效价与最高水平的VN效价相符合(图片B)。明显地，与可溶性F(F单)和PBS相比BLP-F三颗粒制剂是最具免疫原性和保护性的制剂。图片C：针对间质性肺炎和肺泡炎评价接种的棉鼠的肺脏的组织病理学切片。与FI-RSV接种和随后的RSV激发之后所观察的评分相比，BLP-F三接种随后是RSV感染仅导致低的肺脏组织病理学评分。明显地，BLP-F三颗粒制剂在棉鼠中不诱导增强的疾病。
具体实施方式
材料和方法
1.1基因和表达载体
合成编码流感病毒A/Aichi/2/68H3N2(X31)与A/California/04/2009H1N1(H1M)的血细胞凝集素(HA)胞外结构域(a.a.17-522)、A/Mallard/Netherlands/2/2005H5N2(Taxonomy ID:571469)的神经氨酸酶(NA)头部结构域(a.a.75-469)、和呼吸道合胞病毒(RSV)A亚型的融合蛋白(F)胞外结构域，分离株GA7SA99VR360(a.a.26-513)的人类密码子优化的基因(GenScript)并且将它们克隆到pCD5载体中——该载体源自表达质粒S1-Ig(Li et al.,Nature 426[2003],450-454)——用于在HEK293T细胞中表达。
由编码N-端CD5信号序列和C-端人工GCN4三聚化序列(GCN4-pII)(Harbury et al.,Science 262[1993],1401-1407)的序列侧接HA基因、随后是四个Protan结构域变异体之一(图1A)。这些构建体中的三个证明了很好的表达和对BLP的结合并且对于这些变异体也构建了缺少三聚化序列的结构(图1B)。由编码N-端CD5信号序列随后是P1或P1L Protan结构域和人工GCN4四聚化序列(GCN4-pLI)(Harbury et al.,Science 262[1993],1401-1407)的序列侧接NA基因(图8A)。基于这些构建体，产生了缺少人工GCN4四聚化序列的两个另外的构建体(图8A)。由编码N-端CD5信号序列和C-端人工GCN4三聚化序列(GCN4-pII)(Harbury etal.,Science 262[1993],1401-1407)随后是一个Protan结构域(图10A)的序列侧接F基因。也构建了缺少三聚化序列随后一个或两个Protan结构域的两个构建体(图10B)。
1.2蛋白质表达并结合至BLP
使用聚乙烯亚胺(PEI)以1:5的比率(μgDNA:μgPEI)使用包含HA、F或NA编码序列的pCD5表达载体转染HEK293T细胞。在转染后6h时，由293SFM II表达培养基(Invitrogen)替代转染培养基，补充碳酸氢钠(3.7g/升)、葡萄糖(2.0g/升)、Primatone RL-UF(3.0g/升，KerryBio-Science，Zwijndrecht，荷兰)、青霉素(100单位/ml)、链霉素(100μg/ml)、glutaMAX(Gibco)和1.5％DMSO。在转染后5-6天收集组织培养物上清液。使用Protan(LysM)特异性多克隆兔抗血清α-PA90作为第一抗体、与辣根过氧化物酶连接的猪-α-兔(Dako)作为第二抗体并且使用ECLTM(AmershamTM，GE Healthcare)检测，通过蛋白质印迹法证实HA-Protan和Protan-NA蛋白表达。
通过将0.15mg BLP(干重)添加至过量的澄清的HEK293T表达培养物上清液将分泌的HA-Protan、F-Protan或Protan-NA蛋白质选择性地结合至BLP并且在室温下温育30分钟同时温和地混合。然后通过低速离心法收集结合蛋白质的BLP并且使用DPBS洗涤沉淀三次。最后在等于添加的BLP的原始体积的DPBS的体积中重悬沉淀。使用α-PA90抗血清通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法评估HA、F和NA融合蛋白对BLP的结合，而使用纯化的BSA作为对照蛋白通过SDS-PAGE和随后的考马斯亮蓝染色测定BLP结合蛋白质的量。
通过在蓝色非变性凝胶中的电泳和随后使用α-PA90的蛋白质印迹法测定融合蛋白的低聚状态。
1.3重组HA-Protan和Protan-NA融合蛋白的生物学特性。
通过使用鸡红细胞或火鸡红细胞的血细胞凝集分析评估BLP结合HA的生物学活性。仅有功能性三聚的HA蛋白质结合至它们的表面，BLP将介导交联的红细胞的网络(‘网’)的形成，该方法称为凝集。单独的三聚的HA或BLP将不交联红细胞。在该试验中，将25μl的可溶性HA-Protan、BLP结合的HA或BLP连续稀释在96孔中(V-形的Greiner Bio-One)的25μl的DPBS+1％BSA中。从最后的稀释液中弃去25ul以便在所有的孔中获得相同的体积。向所有的孔中添加等体积的0.5％鸡红细胞，温和地混合该悬浮液并且在4℃下温育45分钟以使得能够交联和/或沉淀红细胞。
使用胎球蛋白固相分析评估可溶性Protan-NA融合蛋白的功能(Lambre et al.Clin.Chim.Acta[1991]198:183-193)。使用100μl的1μg/ml胎球蛋白在4℃下过夜涂覆Nunc MaxiSorp 96孔板。将包含相似量的Protan-NA融合蛋白(基于通过蛋白质印迹法测定的Protan的量)的澄清的HEK293T表达培养物上清液连续稀释在PBS-Ca/Mg[0.901mM/0.493mM]中，之后将100μl的混合物添加至胎球蛋白涂覆的孔中。在37℃下在温育1h之后，洗涤该板并且通过添加过氧化物酶标记的花生凝集素(2.5μg/ml；Sigma)、在室温下温育1h、洗涤该板、并且将100μl的过氧化物酶底物(TMB)添加至每个孔随后测量神经氨酸酶活性。在5分钟之后，通过添加100μl的0.3M磷酸来终止反应，并且使用ELISA仪(EL-808[BioTEK])在450nm下测量OD值。
1.4使用低聚体蛋白质制剂免疫小鼠。
使用以下4种不同的HA制剂(H1M)以10天的间隔鼻内三次免疫6-8周龄的十只雌性Balb/c小鼠四组：(i)可溶性三聚的HA(HA三)[1μg/剂量]；(ii)与BLP混合的可溶性三聚的HA(BLP+HA三)[1μg HA三和0.3mg BLP/剂量]；(iii)三聚的HA(HA-P1L三)结合至BLP(BLP-HA三)[1μg HA三和0.3mg BLP/剂量]，以及(iv)单体HA(HA-P2L单)结合至BLP(BLP-HA单)[1μg HA单和0.3mg BLP/剂量]。在第3次免疫之后的十四天，采集血清和鼻腔洗涤物用于ELISA分析以测定抗H1M IgG(血清样品)和抗H1M S-IgA(鼻腔洗涤物)应答。为了该目的，使用200ng HA(H1M)/孔来涂覆孔板。将连续稀释的血清温育90分钟并且使用抗小鼠IgG和IgA-HRP结合物(Southern Biotech)分别检测H1M特异性的IgG和IgA的结合。对于校准曲线将小鼠IgG稀释成三份(第一孔0.5μg/ml)(小鼠IgG1，Sigma)(仅仅针对血清IgG)。在染色之后，在ELISA微孔板读数仪中测定492nm下的吸光度。使用校准曲线(通过4-参数拟合(4-parameterfit)测定曲线的参数)以计算血清中的特异的抗HA IgG抗体(以μg/ml表示)。为了计算鼻腔洗涤物中的特异的抗HA IgA抗体(以效价表示，其是计算的样品稀释液的倒数，在背景校正之后其对应于A492＝0.3)，通过4-参数拟合测定了曲线的参数。使用在34天时收集的每组的(每个个体动物)血清测定HA-特异的血细胞凝集抑制反应的滴定度(HI)。在56℃下持续30分钟灭活血清样品并且随后在室温下使用高岭土过夜温育以降低特异性血细胞凝集素抑制。使用多通道移液器一式两份以连续的两倍的稀释液将高岭土处理的样品应用到孔板上并且与合适的同源的灭活的流感病毒(A/California/07/2009(H1N1),4HAU；NIBSC,UK)混合并且在室温下温育40分钟。随后，将1％荷兰猪红细胞溶液添加至每个孔。允许血细胞凝集素持续两个小时并且评价观察到血细胞凝集的最高的稀释。
使用以下2种不同的BLP-F三制剂以10天的间隔鼻内三次免疫6-8周龄的十只雌性Balb/c小鼠两组：(i)结合至BLP的F(BLP-F三低)[0.6μgF三和0.5mg BLP/剂量]；和(ii)结合至BLP的F(BLP-F三高)[2.2μg F三和0.5mg BLP/剂量]。在第三次免疫之后十四天，采集血清样品并且集中每组用于竞争ELISA分析以测定诱导的样抗体的水平。对于该目的，使用100ng F/孔来涂覆孔板。将血清的连续稀释液(包括预免疫血清)温育持续90分钟，随后是洗涤。然后，以亚饱和量的温育该孔板。在温育之后，将未结合的转移至第二F涂覆的孔板并且，在结合之后，使用第二抗人类IgG抗体检测。在492nm下测量显色。
1.5使用低聚的F-Protan免疫棉鼠并且随后使用RSV激发。
使用以下4种不同的制剂以14天的间隔三次免疫5只年轻的成年棉鼠(6-8周龄)四组：(i)PBS(阴性对照)；(ii)可溶性单体F(F单)[4μg/剂量]；(iii)三聚的F(F-P1L三)结合至BLP(BLP-F三)[4μg HA三和0.5mgBLP/剂量]，和(iv)在铝盐中配制的***灭活的RSV疫苗(FI-RSV)[Lot#100(1:125)]。组1至组3鼻内接种并且组4肌内接种。
在第0、28天和42天时采集血清用于病毒中和分析。对于该目的，在96孔板中连续稀释热灭活的血清。向每个孔添加25至50个噬斑形成单位(PFU)。在25-30℃下温育该稀释的孔板持续1h以使得血清样品和病毒能够相互作用。然后将病毒血清混合物转移至HEp-2细胞用于病毒滴定。与混合物一起温育该细胞持续1h，随后添加甲基纤维素覆盖。在37℃下温育该细胞4天，在温育之后去除覆盖(overlay)。添加结晶紫色素并且允许在25-30℃下固定2至4个小时。通过使用冷水漂洗来去除色素。然后在读数之前允许该孔板完全的风干。使用解剖显微镜计算每孔的噬斑形成单位(PFU)的数目。在42天时，使用100μL的RSV/A/Long以105pfu/动物激发每个动物。在激发后第5天处死动物并且收集整个肺脏以及将肺脏分成两部分用于病毒滴定(左部分)和组织病理学(右部分)。对于间质性肺炎和肺泡炎对组织病理学部分评分。
实施例1.HA-Protan、F-Protan和Protan-NA融合蛋白的表达
为了在哺乳动物细胞中表达可溶性HA-Protan、F-Protan和Protan-NA嵌合蛋白质，将胞外结构域编码序列首先克隆入适当的表达载体中。在表达HA-Protan融合蛋白的pCD5载体中，由信号肽编码序列引导HA-胞外结构域序列，以使得能够有效分泌重组蛋白，并且随后是编码四种Protan结构域变异体之一的序列和在HA与Protan结构域变异体之间的人工GCN4四聚体基序(GCN4-pII；OMD)的序列(图1A)。对于最有效表达和分泌的三个HA-Protan融合蛋白变异体(参见下文)，我们也构建并表达了缺少GCN4三聚化序列的融合蛋白质(OMD；图1B)。
在表达Protan-NA嵌合蛋白的pCD5载体中，由信号肽编码序列引导NA-头部结构域序列，以使得能够有效分泌重组蛋白，并且随后是编码Protan结构域变异体(一个LysM结构域)的序列，该Protan结构域变异亦或具有亦或不具有置于Protan结构域与NA序列之间的人工GCN4四聚体基序(GCN4-pLI；OMD)(图8A)。
在表达F-Protan融合蛋白的pCD5载体中，由信号肽编码序列引导F-胞外结构域序列，以使得能够有效分泌重组蛋白，并且随后是编码一个LysM结构域变异体和在F与LysM结构域之间的人工GCN4四聚体基序(GCN4-pII；OMD)的序列(图10A)。我们也构建并表达了缺少GCN4三聚化序列(OMD)的两个F-Protan融合蛋白，它们分别具有一个和两个LysM结构域(图10B)。
通过将表达质粒转染入HEK293细胞中分别实现了具有或不具有人工三聚的、三聚的或四聚的GCN4多聚化基序(OMD)的HA-Protan、F-Protan和Protan-NA融合蛋白的表达。通过将细胞培养物上清液经受凝胶电泳随后使用针对Protan部分的抗体(α-PA90)通过蛋白质印迹法验证HA-Protan、F-Protan和Protan-NA蛋白质的表达和分泌。将包含GCN4结构域(OMD)的HA-Protan融合蛋白和F-Protan融合蛋白缩写为HA-P三和F-P三，分别表示这些融合蛋白的三聚化潜力。将缺少GCN4结构域(OMD)的HA-Protan和F-Protan融合体缩写为HA-P单和F-P单，分别表示蛋白质的单体状态。同样地，将Protan-NA融合体缩写为：对于包含GCN4结构域(OMD)的变异体缩写为P-NA四表示融合蛋白的四聚化潜力以及对于缺少GCN4结构域(OMD)的变异体缩写为P-NA单表示该蛋白质的单体状态。如在对于HA-P三变异体的图7A中示出的，X31和H1M流感病毒两者衍生的HA的所有HA-P变异体被容易地表达并且有效地分泌到细胞培养物培养基中，在细胞中仅具有最少保留的融合蛋白。与H1M的HA-P三蛋白质相比较，产生的X31HA-P三融合蛋白是稍微较低丰度的。虽然在表达水平方面可以发生HA种属差异，一般的似乎是分别与P1和P2变异体相比较，融合至P1L和P2L的HA显示了最高的生产水平，融合蛋白在细胞中具有最有限的保留。与HA-Protan蛋白质类似，发现所有的Protan-NA和F-Protan变异体被分泌到细胞培养物上清液中(图8B和图10C)。对于包含GCN4四聚化基序的Protan-NA变异体仅观察到一些有限的细胞内的保留(图8B)。
明显地，在细菌的Protan结构域变异体的N-端或C-端上的存在不干扰由哺乳动物表达细胞有效分泌HA低聚的融合蛋白和NA低聚的融合蛋白。
实施例2.HA-GCN-Protan、F-GCN-Protan和Protan-GCN-NA融合蛋白 对BLP的结合
在过量的各种Protan融合蛋白的存在下，通过比较对BLP的结合测定了各种HA-Protan、F-Protan和Protan-NA融合蛋白对BLP的结合特性。SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析证明所有HA-P三变异体的结合。GCN4结构域强烈地增强单个LysM结构域(1L)构建体的结合性。在使用几个结合至BLP的HA-P构建体的实验中证明了结合性。图1C和图1D示出以一式两份测试的缺少OMD GCN4的三个HA-Protan变异体：Protan变异体P2L单、Protan变异体P1L单和Protan变异体P1单与包含GCN4的具有Protan变异体P1L三的HA-Protan融合蛋白相比较。当在缺少GCN4结构域的单体构建体中延伸部仅包含一个LysM结构域(P1L单和P1单)时，考马斯染色的结果(图片I)一致地证明了弱的(H1M)或几乎没有(X31)结合。正如所期待的当单体融合蛋白具有2个LysM结构域(P2L单)时发生了更有效的结合。相反，在HA-Protan融合蛋白具有GCN4的情况下，使用1个LysM结构域(P1L三)已经实现了有效的结合。明显地，不同于单体的HA-Protan融合蛋白，对于有效结合三聚的HA-Protan形式，单个LysM基序已经足够。
在另一个实验中，将与OMD结合的具有单个LysM结构域的HA构建体(HA-GCN4-P1L或HA-P1L三)的结合效率与具有两个LysM结构域的单体的HA结构相比较(图3)。对于该目的，使递升量(0–4μg)的HA-P1L三和HA-P2L单(两者示出对BLP的有效结合(参见图1C/D))能够结合至固定量(0.3mg)的BLP。在与用于HA-P2L单相似的浓度下，更多的HA-P1L三结合至BLP。因此，在低聚的构建体中使用与OMD如GCN4结合的单个LysM结构域将蛋白质结合至BLP比在单体的构建体中使用两个LysM结构域更有效。
在另一个实验中(图5A)在2-8℃下在PBS中长期储存时评估HA-GCN4-P1L与BLP的结合的稳定性。该数据示出与OMD结合的具有单个LysM结构域的HA构建体保持对BLP的稳定结合持续至少9个月。这与Raha等(2005)和Moeini等(2010)的观察形成强烈对比，他们的实验示出在5天的存储期内对细菌使用单个LysM结构域的蛋白质结合超过40％的损失。
不同Protan-NA和F-Protan融合蛋白的BLP结合佐证了使用HA构建体的观察即与OMD结合的单个LysM结构域产生有效的结合。在图8D和图10C中，对于缺少GCN4多聚化基序的P1L-NA单、P1-NA单和P1L-F单融合蛋白没有获得或获得弱的结合，与对于HA-P1单构建体所观察的一致。然而，使用F-P1L三、F-P2L单和P1L-NA四融合蛋白观察到明显有效的BLP结合。
作为对照，我们示出OMD本身不能够结合至BLP颗粒。对于该目的，比较了HA-Strep三(其携带Strep标签而不是Protan延伸部)和HA-1L三对BLP颗粒的结合。图7C示出其中HA-Strep三(通道3)与BLP混合蛋白质印迹。回收BLP并且将其加载在凝胶上(通道4)。没有发生HA-Strep三的结合。相反，对于HA-1L三(比较通道5和6)观察到有效的结合。
此外，对于H1M(图1C)和对于X31病毒衍生的HA蛋白质(图7B)两者，变异体HA-P1三、HA-P1L三和HA-P2L三最有效地结合至BLP。对于H1M1与X31HA-P2三蛋白质对BLP观察到低结合效率。对于在LysM结构域与OMD结构域之间缺少接头的P1-NA四结构也观察到了，其示出了弱结合。明显地，对于正确结合至BLP，LysM结构域与OMD之间的连接结构域是需要的。
在天然的情形中如在单体的AcmA中观察到的，3个连续的分子内LysM结构域(顺式)促进有效的结合。将该数减少至1个LysM结构域导致结合效率的强烈降低(Bosma等[2006])和低的稳定性(Raha等[2005]和Moeini等[2010])。总之，我们的结果显示当将单个LysM结构域置于其中每个均包含单个LysM结构域的亚基被OMD多聚化的多聚的分子间构象中时(LysM结构域反式(in trans)相互作用)，单个LysM结构域可高效并稳定的对BLP的结合。此外，存在于LysM结构域与OMD之间的接头结构域进一步提高产量和结合效率。
使用单个LysM结构域具有一些优点：(i)它降低结合结构域的大小并且，(ii)它阻止了免疫原性差的单体融合蛋白的结合，当使用2个以上LysM结构域时仍可以结合(HA-P1L单不结合至BLP相比于HA-P2L单结合至BLP，参见图1C和图1D，图片I和II；F-P1L单不结合至BLP相比于HA-P2L单结合至BLP，参见图10C)。因此，单个LysM结构域促进选择性结合融合蛋白的免疫原性最相关的(即多聚的)形式(参见图2)。
实施例3.HA-GCN-Protan和Protan-GCN-NA融合蛋白的功能
融合蛋白的低聚状态
通过蓝色非变性凝胶电泳分别分析了具有或不具有人工OMD(其是四聚的GCN4多聚化基序的三聚体)的HA-Protan和Protan-NA蛋白质的低聚状态。已经显示结合至BLP的HA-Protan融合蛋白的样品，即源自H1M病毒的HA-P1三和HA-P1L三蛋白被煮沸持续10秒、30秒或3分钟以便离解HA三聚体。当短暂的加热时(煮沸持续10秒)所有HA-P三蛋白质依照三聚体的迁移率在凝胶中迁移，而在延长的样品煮沸之后这些HA三聚体离解成HA的二聚形式和单体形式(图1E，左图片)。即使在延长的样品煮沸之后HA-P1三和HA-P1L三三聚体仍然是可检测的。相反，所有等价的HA-P单变异体以单体的迁移率迁移。此外，大部分这些HA-P单蛋白显示出变化，但是有时强烈倾向于形成高分子量的聚集物(图1E，右图片，由星号显示)，很可能是这些非天然蛋白质的差的折叠和稳定性的结果。
通过蓝色非变性凝胶电泳分析了具有和不具有GCN4的P1L-NA变异体的样品(图8C)。大多数P1L-NA单蛋白以单体迁移，其部分以二聚体迁移，而没有检测四聚体。P1L-NA四蛋白依照四聚体迁移，没有检测到单体或二聚体。
这些数据清楚地证明需要存在OMD如GCN4基序以获得具有天然的四级结构的稳定的低聚蛋白质。
融合蛋白的生物学活性
通过使用红细胞的血细胞凝集分析可以评估存在于颗粒中的天然HA的生物学活性(图4A)。使用该分析评价HA蛋白的唾液酸受体结合功能——仅由三聚的HA表现出的生物学性能。为了证明在描述的分析中的凝集作用是关键性地取决于存在HA低聚体结合至BLP而不是HA单体结合至BLP，将HA-P1L三和HA-P2L单(均是H1M)结合至BLP。图4B清楚地显示HA-P1L三结合至BLP能够以浓度依赖性方式引起红血细胞的凝集作用(通道3-6)，而HA-P2L单结合至BLP不能够引起凝集作用(通道8-11)。这些结果清楚地显示仅低聚形式的HA结合至BLP是生物学活性的。
通过以具有唾液酸化血液糖蛋白胎球蛋白作为底物的固相结合分析测量了可溶性单体的和低聚的P1-NA与P1L-NA蛋白的唾液酸酶活性来研究它们的生物学功能。借助于PNA凝集素结合活性(如在材料和方法部分中详述的)测量了通过Protan-NA的去唾液酸化。如在图9中示出的，包含GCN4四聚化基序的Protan-NA四蛋白显示出浓度依赖性唾液酸酶活性。对于缺少GCN4四聚化基序的Protan-NA融合蛋白(P-NA单)没有发现唾液酸酶活性。这些结果清楚地证明了低聚(而不是单体)形式的Protan-NA是有功能的。
总之，在哺乳动物细胞中有效地产生了融合至不同的Protan变异体的生物学活性的可溶性三聚的HA和可溶性四聚的NA蛋白。使用1个LysM结构域已经实现了对BLP的有效的结合，条件是该融合蛋白包含OMD，如GCN4低聚化结构域；换言之，由单个LysM结构域介导的有效的结合取决于——并且选择针对——以低聚状态存在的蛋白质。此外，蛋白质以它们的低聚状态结合至BLP证明了与天然蛋白质相似的生物学活性。
实施例4.以颗粒形式的低聚HA-Protan的免疫原性
在两次肌内给予小鼠之后评价结合至BLP(BLP-HA三)的三聚的HA(HA-P1L三)的免疫原性。使用的HA亚型是H1M。将BLP-HA三颗粒制剂与可溶性三聚的HA(HA三)和与BLP混合的可溶性三聚的HA(BLP+HA三)相比较。在制剂中的HA三的量是0.33μg/剂量。第二次免疫之后的第十天采集血清并且集中每组用于ELISA分析以测定抗H1M IgG应答。图6A中的结果清楚地示出了与可溶性三聚的HA(HA三)和与BLP混合的可溶性三聚的(BLP+HA三)相比较，在血清HA特异性IgG应答方面BLP-HA颗粒制剂是最具免疫原性的制剂。然而，高度相关的(图6B)是与结合至BLP的单体HA(BLP-HA单)相比较，结合至BLP的三聚的HA(BLP-HA三)引起更高功能性的抗体效价(以血凝抑制反应(HI)效价测定)的观察结果。此外，在鼻腔的粘膜分泌物中仅有结合至BLP的三聚的HA(BLP-HA三)引起HA特异性分泌的IgA(S-IgA)的显著水平(图6C)。这些结果最可能是结合至BLP的三聚的HA(BLP-HA三)的正确折叠和功能性的反映。
因此，通过使用OMD和单个LysM结构域所确定的包含结合的天然低聚的抗原组合物的颗粒BLP制剂是高度免疫原性的并且与可溶性低聚的和单体结合的制剂相比引起更有效的、以及性质上更相关的应答。
实施例5.以颗粒形式的低聚的F-Protan的免疫原性、功效和安全性
在三次鼻内给予小鼠之后评价了结合至BLP(BLP-F三)的三聚的HA(HA-P1L三)的免疫原性。使用了三次剂量(0.6μg/剂量和2.2μg/剂量)的BLP-F三颗粒制剂。在第三次免疫之后的第十天，采集血清并且集中每组用于竞争ELISA分析(图11A)以测定抗F抗体应答。在该分析中，由中和性抗体识别结合至的F表位的由疫苗在小鼠中引起的抗体，阻止了的结合。因此，在分析中未结合的的测量的量是由疫苗引起的样抗体的量。图11B中的结果清楚地示出结合至BLP的三聚的F(BLP-F三)以剂量依赖性方式引起样抗体。如所期望的，预免疫的血清是阴性的。
总之，通过使用OMD和单个LysM结构域所确定的包含结合的天然低聚的F抗原的颗粒BLP制剂是高度免疫原性的并且引起中和性类型的抗体。
该棉鼠接近地重演了破坏性的病理学结果，称为增强性疾病(enhanced disease)，其与1960年代的RSV-疫苗失败有关。在1960年代，使用在铝盐中配制的***灭活的RSV疫苗(FI-RSV)在美国进行了婴儿实验。在随后的天然RSV暴露期间，在接受该疫苗的婴儿中的病毒感染率并不低(并且可能甚至更高)于使用副流行性感冒疫苗免疫的对照组。最显著地，80％的RSV疫苗接种者需要住院治疗，然而在对照的副流行性感冒疫苗中仅5％的这种感染需要准许住院。两个接种的婴儿死亡。因此，FI-RSV是声名狼籍的疫苗候选物而非保护物，其在暴露至天然RSV感染时初免的幼小婴儿疾病恶化。将FI-RSV给予至棉鼠随后是RSV感染导致可比较的增强的(肺脏)病变(该病变的特征在于间质性肺炎和肺泡炎)。因此，在RSV疫苗开发中在棉鼠中的概念RSV疫苗的安全测试(没有增强性疾病)是必需的步骤。
在三次鼻内给予棉鼠之后评价了结合至BLP的三聚的F(HA-P1L三)(BLP-F三)的功效和安全性(没有增强性疾病症状)并且与单体F(F单)相比较。在病毒中和分析中以在每次疫苗给予之后的14天获取的样品测定由疫苗引起的血清抗体抑制RSV复制的能力。对于安全性的评价，将在铝盐中配制的***灭活的RSV疫苗(FI-RSV)肌内给予至另外一组动物。已知FI-RSV在棉鼠的肺脏中引起病状，该病状与增强性疾病(间质性肺炎和肺泡炎)的症候相关。在最终免疫之后的第十四天，使用RSV激发每个动物。在激发后第5天处死动物并且收集肺脏用于测定病毒效价、病毒中和效价和用于通过组织病理学对间质性肺炎和肺泡炎的评分。这些结果清楚地显示(图12A)与单体F(F单)相比较，结合至BLP的三聚的F(HA-P1L三)(BLP-F三)在减少肺脏病毒效价方面是更有效的。该观测结果与来自使用BLP-F三免疫的动物的血清的更高的病毒中和能力很好地相关联(与F单免疫的动物相比较)(图12B)。重要地，结合至BLP的三聚的F(HA-P1L三)(BLP-F三)的提高的功效与缺少增强性疾病(肺脏中的间质性肺炎和肺泡炎)的症候相关，对于在此模型中使用FI-RSV其是典型的(图12C)。
总之，通过使用OMD和单个LysM结构域所确定的包含结合的天然的低聚的F抗原的颗粒BLP制剂是高度有效的，引起病毒中和抗体并且具有有利的安全性曲线。

Claims (30)

1.一种颗粒形式的免疫原性组合物，包括：
i.由***获得的无活性细菌样颗粒作为颗粒载体；
ii.非共价连接至所述细菌样颗粒的重组产生的多肽的低聚体，其中所述重组多肽包括：
A)N-端或C-端的抗原结构域，包含病原体来源或肿瘤来源的至少一种表面暴露多肽或它们的抗原部分，所述抗原结构域被融合至
B)低聚化结构域，所述低聚化结构域通过
C)接头结构域被融合至
D)由介导将所述多肽非共价连接至所述细菌样颗粒的单拷贝的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域，并且其中所述多肽作为整体仅包含单拷贝的LysM结构域；以及
iii.药用稀释剂或赋形剂。
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，在所述重组多肽的所述抗原结构域中的所述表面暴露的多肽包含包膜病毒蛋白质的胞外结构域。
3.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述病毒是流感病毒、动物冠状病毒、人类呼吸道冠状病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、或副粘液病毒。
4.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)或变性肺病毒。
5.根据权利要求2所述的免疫原性组合物，其中，所述表面暴露的多肽或其抗原部分是选自由以下所组成的组中的一种或多种：流感红血球凝聚素胞外结构域或其部分、流感神经氨酸酶胞外结构域或其部分、冠状病毒刺突蛋白胞外结构域或其部分、RSV糖蛋白F或G胞外结构域或其部分和HIV gp140胞外结构域或其部分。
6.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽的所述接头结构域由10至60个氨基酸组成。
7.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽的所述接头结构域由20-50个氨基酸组成。
8.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽的所述接头结构域由25-40个氨基酸组成。
9.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽的所述接头结构域由约30个氨基酸组成。
10.根据权利要求6所述的免疫原性组合物，其中，所述接头结构域包含选自由以下组成的组中的氨基酸序列：GASSAGNTNSGGSTTTITNNNSGTNSSST、GSASSTNSGGSNNSASTTPTTSVTPAKPTSQ和QSAAASNPSTGSGSTATNNSNSTSSNSNAS。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽的所述低聚化结构域是二聚化的、三聚化的或四聚化的结构域。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中，所述低聚化结构域选自GCN4类二聚化的、三聚化的或四聚化的结构域；T4次要纤维蛋白的C-端折叠核结构域序列或其功能性部分或其类似物和鸡软骨基质蛋白的可溶性三聚化结构域。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述重组多肽进一步包括，在N-端是抗原结构域的情况下的C-端加帽序列，或在C-端是抗原结构域的情况下的N-端加帽序列。
14.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌是非病原性细菌。
15.根据权利要求14所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌是食品级细菌。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌选自由乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)、芽胞杆菌(Bacillus)和分枝杆菌(Mycobacterium ssp)所组成的组中。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的免疫原性组合物，其中，使用包含源自第一病原体的表面暴露的多肽或其抗原部分的至少第一低聚体和包含源自第二病原体的表面暴露的多肽或其抗原部分的第二低聚体非共价地连接至所述颗粒载体。
18.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其中，所述低聚化结构域由T4次要纤维蛋白的C-端的27至30个残基形成。
19.一种用于提供根据权利要求1至18中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供在权利要求1-13中任一项所述的重组多肽，包括在合适的培养基中培养包含编码所述多肽的表达载体的宿主细胞使得表达所述多肽，和分离所述多肽；
b)提供由***获得的无活性细菌样颗粒；
c)使得一个或多个所述多肽非共价结合至所述细菌样颗粒以形成包含非共价结合至颗粒载体的病原体来源的表面暴露的多肽或其抗原部分的低聚体的免疫原性复合物，以及
d)将所述免疫原性复合物配制成免疫原性组合物。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的免疫原性组合物在制备用于引起个体中抵抗病原体的免疫应答的药物中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述个体中抵抗病原体的免疫应答是个体中抵抗病毒性疾病的免疫应答。
22.根据权利要求21所述的应用，其中，所述病毒性疾病是由流感病毒、动物冠状病毒、人类呼吸道冠状病毒、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、或副粘液病毒所引起的。
23.根据权利要求21所述的应用，其中，所述病毒性疾病是由呼吸道合胞病毒(RSV)或变性肺病毒所引起的。
24.一种重组多肽，包括：
A)N-端或C-端的抗原结构域，包含至少一种表面暴露的多肽或它们的抗原部分，所述抗原结构域被融合至
B)低聚化结构域，所述低聚化结构域通过
C)接头结构域被融合至
D)由能够介导所述多肽的非共价连接至肽聚糖载体颗粒的单拷贝的LysM结构域组成的肽聚糖结合结构域，所述肽聚糖载体颗粒是由***获得的无活性细菌样颗粒，并且其中所述多肽作为整体仅包含单拷贝的LysM结构域。
25.根据权利要求24所述的重组多肽，其中，所述至少一种表面暴露的多肽是病原体来源或肿瘤细胞来源的多肽。
26.一种核苷酸序列，编码根据权利要求24所述的多肽。
27.一种载体，包含根据权利要求26所述的核苷酸序列。
28.一种宿主细胞，包含根据权利要求26所述的核苷酸序列或根据权利要求27所述的载体。
29.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核宿主细胞。
30.根据权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
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