CN103547272A - 基于肽的体内siRNA递送*** - Google Patents

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Abstract

本发明是针对用于在体内将RNA干扰(RNAi)多核苷酸靶向递送至肝细胞的组合物。靶向性RNAi多核苷酸是与联合靶向的蜂毒素递送肽一起施用。递送肽提供用于将所述RNAi多核苷酸自该细胞外部移动至该细胞内部的膜渗透功能。可逆修饰提供对所述递送肽的生理响应。

Description

基于肽的体内siRNA递送***
背景技术
将多核苷酸及其它实质上细胞膜不可渗透性化合物向活细胞内的递送高度受限于细胞的复杂膜***。用于反义、RNAi及基因疗法的药物是相对较大的亲水性聚合物且常带较高负电荷。这两种物理特征都严重限制这些药物跨细胞膜直接扩散。因此，多核苷酸递送的主要障碍是多核苷酸跨细胞膜向细胞质或核的递送。
已用于体内递送小核酸的一种手段是将核酸连接于小靶向分子或者脂质或固醇。尽管用这些共轭物已观测到一定的递送及活性，但利用这些方法所需要的极大核酸剂量是不切实际的。
也已开发出能在体外实现适度有效递送多核苷酸至细胞内的众多转染试剂。然而，使用这些相同转染试剂在体内传递多核苷酸很复杂且因体内毒性、不利的血清相互作用或不良靶向而变得无效。在体外良好作用的转染试剂、阳离子聚合物及脂质通常形成较大的阳离子静电粒子且使细胞膜去稳定。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷-电荷(静电)相互作用与核酸缔合，由此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷亦有益于载体非特异性结合细胞且有益于膜融合、去稳定或破坏。膜的去稳定有助于实质上细胞膜不可渗透性多核苷酸跨细胞膜传递。尽管这些性质有助于体外核酸转移，但其会在体内引起毒性及无效靶向。阳离子电荷导致与血清组分相互作用，引起多核苷酸-转染试剂相互作用的去稳定、不良生物可用性及不良靶向。转染试剂在体外可有效的膜活性常常在体内导致毒性。
对于体内递送，载体(核酸及相关递送剂)应较小，直径小于100nm且优选小于50nm。小于20nm或小于10nm的更小的复合物将更有用。大于100nm的递送载体在体内极少达到除血管细胞以外的细胞。通过静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或分开。此外，体内递送载体上的阳离子电荷导致不利的血清相互作用且因此导致不良的生物可用性。有趣的是，高的负电荷亦可通过干扰靶向所必需的相互作用即靶向性配体与细胞受体的结合来抑制靶向性体内递送。因此，体内分布及靶向需要接近中性的载体。在不仔细调控的情况下，当体内使用时，膜破坏或去稳定活性是毒性的。在体外比在体内更易于平衡载体毒性与核酸递送。
Rozema等人在美国专利公开20040162260中说明一种可逆调控膜活性聚胺的膜破坏活性的手段。膜活性聚胺提供一种破坏细胞膜的手段。pH依赖性可逆调控提供一种限制进入靶细胞内体的活性由此限制毒性的手段。其方法依赖于聚胺上用2-丙酸-3-甲基顺丁烯二酸酐进行的胺修饰。
Figure BDA00003325521000021
此修饰通过将伯胺转化为成对羧基(β羧基及γ羧基)来使聚阳离子转化成聚阴离子且可逆地抑制聚胺的膜活性。Rozema等人(Bioconjugate Chem.2003,14,51-57)报导，β羧基不展现完全的表观负电荷且无法独自抑制膜活性。据报导，添加γ羧基是有效抑制膜活性所必需的。为能够进行核酸与递送载体的共递送，将核酸共价连接于递送聚合物。使用其生物不稳定的共轭物递送***，其能够显示在体外将多核苷酸递送至细胞中。然而，因为在核酸与经修饰聚合物两者均具有高负电荷密度的情况下，载体高度带负电荷，所以此***不可高效进行体内递送。负电荷可能抑制细胞特异性靶向且增强由网状内皮***(RES)进行的非特异性摄取。
Rozema等人在美国专利公开20080152661中通过消除经修饰膜活性聚合物的高负电荷密度，改良了美国专利公开20040162260的方法。通过用中性亲水性靶向型(半乳糖)及空间稳定性(PEG)基团取代2-丙酸-3-甲基顺丁烯二酸酐的γ羧基，Rozema等人能够保留总体水溶性及对膜活性的可逆抑制，同时纳入有效体内肝细胞靶向性。如以前一样，多核苷酸共价连接于转染聚合物。通过防止多核苷酸自转染聚合物解离来维持多核苷酸与转染聚合物的共价连接，以确保多核苷酸与转染聚合物在体内施用期间共递送至靶细胞。需要多核苷酸与转染聚合物的共递送，这是因为转染聚合物提供多核苷酸自细胞外部或自胞吞区室内部至细胞质的跨细胞膜转运。美国专利公开20080152661说明使用该新颖的经改良生理响应性聚共轭物，可在体内将多核苷酸，特别是RNAi寡核苷酸高效递送至肝脏细胞中。
然而，核酸与聚胺的共价连接具有固有局限。修饰转染聚合物以连接核酸与掩蔽剂两者因电荷相互作用而变得复杂。带负电荷核酸与带正电荷聚合物的连接倾向于聚集，从而限制混合物的浓度。可通过过量聚阳离子或聚阴离子的存在来克服聚集。然而，此解决方案限制了所能调配的核酸与聚合物的比率。此外，带负电荷核酸连接至未经修饰的阳离子聚合物上导致复合物的缩合及聚集且抑制聚合物修饰。形成带负电聚合物的聚合物修饰削弱核酸的连接。
Rozema等人在美国临时申请61/307,490中进一步改良了美国专利公开20080152661所述的技术。在美国临时申请61/307,490中，Rozema等人证明，通过仔细选择靶向分子，且将适当靶向分子独立地连接于siRNA与递送聚合物两者，可使siRNA及递送聚合物非偶联但仍保留两种成分在体内对于细胞的有效靶向且达成siRNA的高效功能性靶向递送。美国专利公开20080152661与美国临时申请61/307,490两者中使用的递送聚合物均为相对较大的合成聚合物聚(乙烯基醚)及聚(丙烯酸酯)。较大聚合物能够用靶向配体和PEG两者来修饰，靶向配体用于细胞特异性结合而PEG用于增加遮蔽。较大聚合物为有效递送所必需，可能是通过膜活性增加及改良对细胞内体内核酸的保护。较大聚阳离子更强烈地与膜及与阴离子型RNA相互作用。
我们在此开发出一种使用小得多的递送肽的经改良siRNA递送***。该改良***提供毒性减小且因此治疗窗较宽的有效siRNA递送。
发明内容
在一优选实施方式中，本发明的特征在于一种用于在体内将RNA干扰多核苷酸递送至肝脏细胞中的组合物，其包含：a)脱唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)受体(ASGPr)靶向的可逆掩蔽的蜂毒素(melittin)肽(递送肽)及b)与含有至少20个碳原子的疏水性基团共轭的RNA干扰多核苷酸(RNA共轭物)。递送肽及siRNA共轭物是分别合成且可供应于独立容器或单一容器中。RNA干扰多核苷酸不与递送肽共轭。
在另一优选实施方式中，本发明的特征在于一种用于在体内将RNA干扰多核苷酸递送至肝脏细胞中的组合物，其包含：a)ASGPr靶向的可逆掩蔽的蜂毒素肽(递送肽)及b)与半乳糖簇共轭的RNA干扰多核苷酸(RNA共轭物)。递送肽及siRNA共轭物是分别合成且可供应于独立容器或单一容器中。RNA干扰多核苷酸不与聚合物共轭。
在一优选实施方式中，ASGPr靶向的可逆掩蔽的蜂毒素肽包含通过经所述肽上的伯胺与含有ASGPr配体的掩蔽剂反应来可逆修饰的蜂毒素肽。若修饰基团的裂解使胺恢复，则所述胺为可逆修饰。本文所述的掩蔽剂对蜂毒素肽的可逆修饰能可逆地抑制蜂毒素肽的膜活性。在掩蔽状态下，可逆掩蔽的蜂毒素肽不展现膜破坏活性。需要可逆修饰蜂毒素肽上超过80%或超过90%的胺以抑制膜活性并提供细胞靶向功能，即形成可逆掩蔽的蜂毒素肽。
一种含有ASGPr配体的优选掩蔽剂具有中性电荷且包含具有双取代的顺丁烯二酸酐胺反应性基团的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。含有ASGPr配体的另一优选掩蔽剂包含具有肽酶可裂解的二肽-对酰胺基苯甲基胺反应性碳酸酯衍生物的半乳糖胺或半乳糖胺衍生物。胺反应性碳酸酯与胺的反应可逆地修饰所述胺以形成酰胺基苯甲基氨基甲酸酯键联。
在一优选实施方式中，蜂毒素肽包含小蜜蜂(Apis florea)(小蜜蜂或矮蜜蜂)蜂毒素、意大利蜂(Apis mellifera)(西方或欧洲蜜蜂或者大蜜蜂)、大蜜蜂(Apis dorsata)、中华蜜蜂(Apis cerana)(东方蜜蜂)或其衍生物。一种优选蜂毒素肽包含序列：Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Xaa18-Trp-Xaa20-Xaa21-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26，其中：
Xaa1为亮氨酸、D-亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、二甲基甘氨酸、甘氨酸、组氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸，
Xaa2为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa3为甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸，
Xaa5为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa7为赖氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
Xaa10为丙氨酸、苏氨酸或亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa12为甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，
Xaa15为苏氨酸或丙氨酸，
Xaa17为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa18为丝氨酸或半胱氨酸，
Xaa20为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa21为赖氨酸或丙氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，
Xaa23为赖氨酸或丙氨酸，
Xaa24为精氨酸或赖氨酸，
Xaa25为赖氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺，
Xaa26为视情况选用的且若存在，则为谷氨酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺-NH2或半胱氨酸-NH2；且，
且Xaa21、Xaa23及Xaa25中至少两者为赖氨酸。
一种更优选的蜂毒素包含序列：
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ala-Xaa5-Leu-Xaa7-Val-Leu-Xaa10-Xaa11-Xaa12-Leu-Pro-Xaa15-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：
Xaa1为亮氨酸、D-亮氨酸、正亮氨酸或酪氨酸，
Xaa2为异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，
Xaa3为甘氨酸、亮氨酸或缬氨酸，
Xaa5为异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa7为赖氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、精氨酸或组氨酸，
Xaa10为丙氨酸、苏氨酸或亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa12为甘氨酸、亮氨酸或色氨酸，
Xaa15为苏氨酸或丙氨酸，
Xaa17为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa20为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，且
Xaa26为谷氨酰胺或半胱氨酸。
一种最优选的蜂毒素包含序列：
Xaa1-Xaa2-Gly-Ala-Xaa5-Leu-Lys-Val-Leu-Ala-Xaa11-Gly-Leu-Pro-Thr-Leu-Xaa17-Ser-Trp-Xaa20-Lys-Xaa22-Lys-Arg-Lys-Xaa26，其中：
Xaa1、Xaa2、Xaa5、Xaa17及Xaa20独立地为异亮氨酸、亮氨酸或正亮氨酸，
Xaa11为苏氨酸或半胱氨酸，
Xaa22为天冬酰胺或精氨酸，且
Xaa26为谷氨酰胺或半胱氨酸。
一种优选的掩蔽剂包含中性亲水性双取代烷基顺丁烯二酸酐：
Figure BDA00003325521000051
其中R1包含细胞靶向基团。一种优选的烷基为甲基或乙基。一种优选的靶向基团包含脱唾液酸糖蛋白受体配体。经取代的烷基顺丁烯二酸酐的一个示例由2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐衍生物组成。中性亲水性2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐衍生物通过将中性亲水性基团经2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐γ-羧基连接于2-丙酸-3-烷基顺丁烯二酸酐来形成：
其中R1包含中性ASGPr配体且n=0或1。在一个实施方式中，ASGPr配体通过短PEG连接子连接于该酸酐。
一种优选的掩蔽剂包含亲水性肽酶(蛋白酶)可裂解的二肽-对酰胺基苯甲基胺反应性碳酸酯衍生物。本发明的酶可裂解性连接子采用连接于酰胺基苯甲基活化的碳酸酯部分的二肽。ASGPr配体连接于二肽的氨基末端。酰胺基苯甲基活化的碳酸酯部分在该二肽的羧基末端。适于与本发明一起使用的肽酶可裂解性连接子具有结构：
Figure BDA00003325521000062
其中R4包含ASGPr配体且R3包含胺反应性碳酸酯部分，且R1及R2为氨基酸R基团。一优选的经活化碳酸酯为对硝基酚。然而，本领域中已知的其它胺反应性碳酸酯易于取代对硝基酚。经活化碳酸酯与蜂毒素胺的反应使靶向化合物脱唾液酸糖蛋白受体配体通过肽酶可裂解的二肽-酰胺基苯甲基氨基甲酸酯键联连接于蜂毒素肽。酶裂解二肽会自肽移除靶向配体且触发引起肽胺再生的消除反应。
实施例3中显示二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit("Cit"为氨基酸瓜氨酸)。尽管也允许带电荷的氨基酸，但优选中性氨基酸。
优选掩蔽剂通过对于细胞表面受体的亲和力来提供靶向功能，即，该掩蔽剂含有细胞表面受体的配体。优选掩蔽剂含有对ASGPr具有亲和力的糖，包括(但不限于)：半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺及半乳糖衍生物。本领域熟知对ASGPr具有亲和力的半乳糖衍生物。可逆修饰的蜂毒素的一个基本特征在于，超过80%的蜂毒素胺(在肽群体中)修饰有经生理上不稳定的可逆共价键连接的ASGPr配体。
在另一实施方式中，本发明的蜂毒素肽在氨基或羧基末端处进一步修饰有通过共价连接空间稳定剂或ASGPr配体-空间稳定剂共轭物。可使用本领域中的标准方法，在合成期间将氨基或羧基末端修饰连接于肽。或者，可通过修饰具有氨基或羧基末端半胱氨酸残基的蜂毒素肽上的半胱氨酸残基来进行氨基或羧基末端修饰。一优选空间稳定剂为聚乙二醇。优选聚乙二醇具有1至120个乙烯单元。在另一实施方式中，优选聚乙二醇的大小小于5kDa。对于ASGPr配体-空间稳定剂共轭物，优选空间稳定剂为具有1至24个乙烯单元的聚乙二醇。
RNAi多核苷酸共轭物及递送肽于药学上可接受的载体或稀释剂中向哺乳动物施用。在一个实施方式中，递送肽及RNAi多核苷酸共轭物可在向哺乳动物施用之前混合在溶液中。在另一实施方式中，递送肽及RNAi多核苷酸共轭物可以独立溶液形式向哺乳动物共施用。在又一实施方式中，递送肽及RNAi多核苷酸共轭物可依序向哺乳动物施用。对于依序施用，递送肽可在施用RNAi多核苷酸共轭物之前施用。或者，对于依序施用，RNAi多核苷酸共轭物可在施用递送肽之前施用。
当结合附图一起考虑时，本发明的其它目的、特征及优势将由以下详述而显见。
附图简要说明
图1列举适用于本发明中的蜂毒素肽的表。
图2绘图说明GalNAc簇与RNA的键联。
图3说明用可逆修饰的蜂毒素siRNA递送肽及siRNA-胆固醇共轭物处理的灵长类动物中的(A)血液尿素氮(BUN)水平及(B)肌酸酐水平的图。
图4说明用可逆修饰的蜂毒素siRNA递送肽及siRNA-胆固醇共轭物处理的灵长类动物中的(A)天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平及(B)丙氨酸转氨酶(ALT)水平的图。
图4说明用可逆修饰的蜂毒素siRNA递送肽及siRNA-胆固醇共轭物处理的灵长类动物中的内源性因子VII水平的敲减的图。
发明详述
本文描述一种用于在体内将RNA干扰(RNAi)多核苷酸递送至哺乳动物肝脏细胞中的改良方法。我们描述一种采用源于蜂毒肽的小递送肽蜂毒素以及独立靶向性RNAi多核苷酸的体内RNAi多核苷酸递送***。通过使用靶向肝脏的RNAi多核苷酸共轭物分子及靶向脱唾液酸糖蛋白受体的可逆抑制性蜂毒素肽，观测到RNAi多核苷酸向肝脏的高效递送。
因为蜂毒素及RNAi多核苷酸独立地靶向肝细胞，所以蜂毒素及多核苷酸的浓度及其之间的比率仅受限于各组分的溶解性，而不受限于相关复合物的溶解性或制造复合物的能力。此外，多核苷酸与蜂毒素可在施用之前任何时间混合，或甚至分别施用，因此允许各组分以溶液或干燥形式单独储存。
本发明包括具有以下组成的共轭物递送***：
Y-蜂毒素-(L-M)x加N-T,
其中N为RNAi多核苷酸，T为多核苷酸靶向部分(具有20个或超过20个碳原子的疏水性基团或半乳糖簇)，蜂毒素为如本文所述的源于蜂毒的蜂毒素肽或衍生物，且掩蔽剂M含有通过生理上不稳定的可逆键联L共价连接于蜂毒素的如本文所述的ASGPr配体。L的裂解使蜂毒素上未经修饰的胺恢复。Y为视情况选用的且若存在则包含连接于蜂毒素的氨基末端、羧基末端或者氨基或羧基末端半胱氨酸的聚乙二醇(PEG)或ASGPr配体-PEG共轭物。优选Y连接于氨基末端或者氨基末端半胱氨酸。x为大于1的整数。在未经修饰状态下，蜂毒素具有膜活性。然而，递送肽蜂毒素-(L-M)x不具有膜活性。通过连接M来对蜂毒素伯胺进行可逆修饰会使蜂毒素的膜活性受到可逆抑制或失活。修饰足够百分比的蜂毒素伯胺以抑制聚合物的膜活性且提供肝细胞靶向性。按不存在任何掩蔽剂下蜂毒素上胺的量所确定，优选地，x值大于蜂毒素上伯胺的80%且更优选大于90%。更具体地，x值大于蜂毒素上伯胺的80%且最多达100%。应注意蜂毒素通常含有3至5个伯胺(氨基末端(若未经修饰)及通常2至4个赖氨酸残基)。因此，一定百分比的胺的修饰意欲反映蜂毒素肽群体中胺上一定百分比的修饰。在裂解可逆键联L后，未经修饰的胺得以恢复，藉此将蜂毒素恢复成其未经修饰的膜活性状态。优选可逆键联为pH不稳定性键联。另一优选的可逆键联为蛋白酶可裂解的键联。靶向ASGPr的可逆掩蔽的膜活性聚合物蜂毒素-(L-M)x(递送肽)及多核苷酸共轭物T-N分别合成或制造。T及N均不直接或间接共价连接于蜂毒素、L或M。多核苷酸的体内肝脏递送不需要多核苷酸或多核苷酸共轭物与经掩蔽或未掩蔽聚合物的静电或疏水性缔合。经掩蔽聚合物及多核苷酸共轭物可于同一容器或于独立容器中供应。它们可在施用之前组合、共施用或依序施用。
亲水性基团以定性术语指示所述化学部分为喜水的。通常，这些化学基团可溶于水，且在水存在下为氢键供体或受体。亲水性基团可带电荷或不带电荷。带电荷基团可带正电荷(阴离子)或带负电荷(阳离子)或带两种电荷(两性离子)。亲水性基团的示例包括下列化学部分：碳水化合物、聚氧乙烯、某些肽、寡核苷酸、胺、酰胺、烷氧基酰胺、羧酸、硫及羟基。
疏水性基团以定性术语指示所述化学部分是忌水的。通常，这些化学基团不可溶于水，且不倾向于形成氢键。亲脂性基团溶于脂肪、油、脂质及非极性溶剂中且很少能甚至不能形成氢键。含有两(2)个或更多个碳原子的烃、某些经取代的烃、胆固醇及胆固醇衍生物为疏水性基团及化合物的示例。
疏水性基团优选为仅含有碳及氢原子的烃。然而，可允许维持疏水性的非极性取代或非极性杂原子且包括例如氟。该术语包括脂族基团、芳族基团、酰基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基，其各自可为直链、支链或环状。术语疏水性基团还包括：固醇、类固醇、胆固醇，以及类固醇及胆固醇衍生物。
如本文所用，膜活性肽为能够诱导以下一或多种针对生物膜的效应的表面活性、两亲性肽：改变或破坏膜以允许非膜可渗透的分子进入细胞或跨越膜、在膜中形成孔、使膜***或者破坏或溶解膜。如本文所用，膜或细胞膜包含脂质双层。膜的改变或破坏可通过肽在以下至少一种分析中的活性在功能上加以确定：红血球溶解(溶血)、脂质体渗漏、脂质体融合、细胞融合、细胞溶解及内体释放。可引起细胞膜溶解的膜活性肽亦称为膜溶解肽。相比质膜优先引起内体或溶酶体破坏的肽被认为具有内体溶解性。膜活性肽对细胞膜的影响可为短暂的。膜活性肽对膜具有亲和力且使双层结构变性或变形。
多核苷酸向细胞的递送由蜂毒素肽介导，该蜂毒素肽破坏质膜或内部小泡膜(诸如内体或溶酶体)或使其去稳定，包括在膜中形成孔或破坏内体或溶酶体小泡，藉此允许小泡的内含物释放入细胞质中。
内体溶解性肽为响应内体特异性环境因素(如pH值降低或存在溶解酶(蛋白酶))而能够引起内体破坏或溶解或提供通常不可渗透细胞膜的化合物(如多核苷酸或蛋白质)自细胞内膜封闭的小泡(如内体或溶酶体)释放的肽。内体溶解性聚合物在内体中经历其物理化学性质的改变。此改变可为由电荷、疏水性或亲水性的改变所致的聚合物的溶解性或与其它化合物或膜相互作用的能力的变化。示例性内体溶解性肽具有pH不稳定性或酶敏感性基团或键。因此，掩蔽剂通过pH不稳定性键连接于聚合物的可逆掩蔽的膜活性肽可视为内体溶解性聚合物。
如本文所用的蜂毒素为一种较小的两亲性膜活性肽，包含约23至约32个氨基酸，来源于天然存在的蜂毒肽蜂毒素。天然存在的蜂毒素含有26个氨基酸，且在氨基末端主要为疏水性的且在羧基末端主要为亲水性的(阳离子)。本发明的蜂毒素可分离自生物来源或可为合成的。合成聚合物是通过"人工"的化学过程调配或制造，且并非通过天然发生的生物过程产生。如本文所用，蜂毒素涵盖蜂毒素家族的天然存在的蜂毒肽，其可见于例如以下物种的毒液中：小蜜蜂、意大利蜂、中华蜜蜂、大蜜蜂、额斑黄胡蜂(Vespula maculifrons)、大胡蜂(Vespa magnifica)、黑胸胡蜂(Vespa velutina)、马蜂属(Polistes sp.)HQL-2001及亚非马蜂(Polistes hebraeus)。如本文所用，蜂毒素亦涵盖氨基酸序列与天然存在的蜂毒素肽一致或类似的合成肽。具体地，蜂毒素氨基酸序列涵盖图1中所示者。除保留蜂毒素固有的高膜活性的氨基酸外，还可添加1至8个氨基酸至肽的氨基或羧基末端。具体地，可添加半胱氨酸残基至氨基或羧基末端。图1中的清单并非意在穷举，因为易于设想其它保守性氨基酸取代。合成蜂毒素肽可含有天然存在的L型氨基酸或对映异构D型氨基酸(翻转(inverso))。然而，蜂毒素肽应含有基本上全部L型或全部D型氨基酸，但可在氨基末端或羧基末端处附加具有相反立体中心的氨基酸。蜂毒素氨基酸序列亦可经反转(反向(retro))。反向蜂毒素可具有L型氨基酸或D型氨基酸(反向翻转)。两个蜂毒素肽亦可共价连接以形成蜂毒素二聚物。蜂毒素可在具有掩蔽剂以外的增强组织靶向或促进体内循环的修饰基团，其连接于肽的氨基末端或羧基末端。然而，如本文所用，蜂毒素不包括含有彼此共价连接或共价连接于另一聚合物或骨架的超过两个蜂毒素肽的链或聚合物。
掩蔽
本发明的蜂毒素肽包含可逆修饰的蜂毒素肽，其中可逆修饰抑制膜活性，中和蜂毒素以减少正电荷并形成带接近中性电荷的聚合物，且提供细胞类型特异性靶向。所述蜂毒素通过可逆修饰该肽上的伯胺来得以可逆修饰。
本发明的蜂毒素肽能够破坏质膜或溶酶体/胞吞膜。然而，当体内施用肽时，膜活性会引起毒性。因此，可逆掩蔽蜂毒素的膜活性为体内使用所必需。此掩蔽是通过将掩蔽剂可逆连接于蜂毒素以形成可逆掩蔽的蜂毒素即递送肽来达成。除抑制膜活性外，掩蔽剂还提供细胞特异性相互作用，即靶向性。
掩蔽剂的一个基本特征为，在聚集状态下其抑制聚合物的膜活性且提供体内肝细胞靶向。蜂毒素在未经修饰(未掩蔽)状态下具有膜活性且在修饰(掩蔽)状态下不具有膜活性(失活)。足够数目的掩蔽剂连接于肽以达成所需的失活程度。通过连接掩蔽剂达成的所需蜂毒素修饰程度易于使用适当的肽活性分析来确定。举例而言，若蜂毒素在既定分析中具有膜活性，则将足够含量的掩蔽剂连接于肽以在该分析中达到所需的膜活性抑制程度。按不存在任何掩蔽剂下肽上伯胺的量所确定，优选蜂毒素肽群体上≥80%或≥90%的伯胺基团得到修饰。掩蔽剂的优选特征还在于，其连接于肽会减少聚合物的正电荷，由此形成更趋于中性的递送肽。理想的是掩蔽肽保留水溶性。
如本文所用，若经修饰蜂毒素不展现膜活性且展现体内细胞特异性(即，肝细胞)靶向，则该肽被掩蔽。若将掩蔽剂连接于肽的键裂解使得肽上的胺恢复，藉此恢复膜活性，则蜂毒素被可逆掩蔽。
另一基本特征为，掩蔽剂通过生理上不稳定的可逆键共价结合于蜂毒素。通过使用生理上不稳定的可逆键联或键，掩蔽剂可在体内自肽裂解，藉此使肽脱除掩蔽且恢复未掩蔽肽的活性。通过选择适当的可逆键联，有可能形成一种共轭物，其在已递送至或靶向所要细胞类型或细胞位置之后恢复蜂毒素的活性。键联的可逆性提供蜂毒素的选择性活化。可逆共价键联含有可选自下组的可逆或不稳定键：生理上不稳定的键、细胞生理上不稳定的键、pH不稳定的键、pH很不稳定的键、pH极端不稳定的键及蛋白酶可裂解的键。
如本文所用，掩蔽剂包含具有ASGPr配体及胺反应性基团的优选呈中性(不带电荷)的化合物，其中胺反应性基团与肽上胺的反应使得ASGPr配体通过生理上不稳定的可逆共价键与肽键联。胺反应性基团经选择以使响应适当生理条件(例如，pH值降低如在内体/溶酶体中，或如在内体/溶酶体中的酶促裂解)的裂解引起蜂毒素胺的再生。ASGPr配体为对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的基团，通常为糖。优选的本发明掩蔽剂能够在水溶液中修饰聚合物(与聚合物形成可逆键)。
优选胺反应性基团包含双取代的顺丁烯二酸酐。一优选掩蔽剂由以下结构表示：
Figure BDA00003325521000111
其中R1包含脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体且R2为烷基，如甲基(-CH3)、乙基(-CH2CH3)或丙基(-CH2CH2CH3)。
在一些实施方式中，半乳糖配体通过PEG连接子连接于胺反应性基团，如以下结构所说明：
Figure BDA00003325521000121
其中n为介于1与19之间的整数。
另一优选胺反应性基团包含由以下结构表示的二肽-酰胺基苯甲基胺反应性碳酸酯衍生物：
Figure BDA00003325521000122
其中：
R1为氨基酸1的R基团，
R2为氨基酸2的R基团，
R3为-CH2-O-C(O)-O-Z，其中Z为
卤化物，
Figure BDA00003325521000123
Figure BDA00003325521000131
且R4包含ASGPr配体。
经活化碳酸酯与蜂毒素胺的反应使ASGPr配体通过肽酶可裂解的二肽-酰胺基苯甲基氨基甲酸酯键联连接于蜂毒素肽。
Figure BDA00003325521000132
二肽的酶促裂解将靶向配体自肽移除且触发引起肽胺再生的消除反应。尽管以上结构显示单一掩蔽剂连接于蜂毒素肽，但在实践中，若干掩蔽剂连接于蜂毒素肽；优选使蜂毒素肽群体上超过80%的胺经修饰。
实施例3显示二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit("Cit"为氨基酸瓜氨酸)。就前述结构而言，Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit表示R2-R1。尽管允许带电荷的氨基酸，但优选中性氨基酸。其它氨基酸组合是可能的，只要其由内源性蛋白酶裂解。此外，可使用3至5个氨基酸作为酰胺基苯甲基与靶向配体之间的连接子。
如同基于顺丁烯二酸酐的掩蔽剂一样，ASGPr配体可通过PEG连接子连接于肽酶可裂解的二肽-酰胺基苯甲基碳酸酯。
膜活性聚胺可在过量掩蔽剂存在下共轭于掩蔽剂。过量的掩蔽剂可在施用递送肽之前自经共轭递送肽移除。
在另一实施方式中，本发明蜂毒素肽在氨基或羧基末端处通过共价连接空间稳定剂或ASGPr配体-空间稳定剂共轭物进一步修饰。优选修饰疏水性末端；即具有"正常序列"的蜂毒素的氨基末端以及反向蜂毒素的羧基末端。一优选空间稳定剂为聚乙二醇。可使用本领域中的标准方法，在合成期间将氨基或羧基末端修饰连接于肽。或者，可通过修饰具有氨基或羧基末端半胱氨酸残基的蜂毒素肽上的半胱氨酸残基进行氨基或羧基末端修饰。优选聚乙二醇具有1至120个乙烯单元。在另一实施方式中，优选聚乙二醇的大小小于5kDa。对于ASGPr配体-空间稳定剂共轭物(NAG-PEG修饰)，优选的空间稳定剂为具有1至24个乙烯单元的聚乙二醇。当末端PEG修饰与可逆掩蔽组合时，其进一步降低蜂毒素递送肽的毒性。末端NAG-PEG修饰会增强功效。
空间稳定剂
如本文所用，空间稳定剂为一种非离子型亲水性聚合物(天然、合成或非天然的)，相对于不含空间稳定剂的分子，空间稳定剂阻止或抑制其所连接分子的分子内或分子间相互作用。空间稳定剂阻碍其所连接的分子参加静电相互作用。静电相互作用为两种或两种以上物质由于正电荷与负电荷之间的吸引力而产生的非共价缔合。空间稳定剂可抑制与血液组分的相互作用且因此抑制由网状内皮***进行的调理、吞噬及摄取。因此，空间稳定剂可增加其所连接的分子的循环时间。空间稳定剂亦可抑制分子聚集。一优选空间稳定剂为聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。适于本发明的PEG分子具有约1至120个乙二醇单体。
ASGPr配体
靶向部分或基团增强其所连接的共轭物的药物动力学或生物分布性质，从而改良共轭物的细胞特异性分布及细胞特异性摄取。已使用半乳糖及半乳糖衍生物在体内使分子通过其与肝细胞表面上表达的脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)的结合来靶向肝细胞。如本文所用，ASGPr配体(或ASGPr配体)包含半乳糖及对ASGPr的亲和力等于或大于半乳糖对ASGPr的亲和力的半乳糖衍生物。半乳糖靶向部分与ASGPr的结合有助于递送肽以细胞特异性方式靶向肝细胞且将递送肽胞吞入肝细胞中。
ASGPr配体可选自包含下组：乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基-半乳糖胺(Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr配体可为单体(例如具有单一半乳糖胺)或多聚体(例如具有多个半乳糖胺)。
在一个实施方式中，通过使ASGPr配体掩蔽剂连接于肽上≥80%或≥90%的伯胺来可逆掩蔽蜂毒素肽。
不稳定键联
键联或连接子为两个原子之间的连接，其使一个相关化学基团或区段通过一或多个共价键连接于另一相关化学基团或区段。举例而言，键联可使掩蔽剂连接于肽。键联的形成可将两个独立分子连接形成单一分子，或其可连接同一分子中的两个原子。键联可为电中性的或可携带正电荷或负电荷。可逆或不稳定键联含有可逆或不稳定键。键联可视情况包括增加两个接合原子之间距离的间隔子。间隔子可进一步为键联添加挠性及/或长度。间隔子可包括但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基、芳炔基；其各自可含有一或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸及糖。本领域熟知间隔子基团，且前述清单不意欲限制本发明的范畴。
不稳定键为除与氢原子的共价键以外的共价键，其能够在不会破坏或裂解同一分子中的其它共价键的条件下被选择性地破坏或裂解。更具体地，不稳定键为在适当条件下相较于同一分子中的其它非不稳定共价键，稳定性(热力学上)较低或破坏较快速(动力学上)的共价键。分子内不稳定键的裂解可导致形成两个分子。对于本领域技术人员，键的裂解或不稳定性一般用键裂解的半衰期(t1/2)(半数键裂解所需的时间)来论述。因此，不稳定键涵盖可比分子的其它键更快速地选择性裂解的键。
适当条件由不稳定键的类型决定且在有机化学中是熟知的。不稳定键可对pH值、氧化或还原条件或试剂、温度、盐浓度、酶(诸如酯酶，包括核酸酶及蛋白酶)的存在，或添加试剂的存在敏感。举例而言，pH值升高或降低为pH不稳定的键的适当条件。
不稳定基团将经历转化的速率可通过改变含有不稳定基团的分子的化学成分来控制。举例而言，接近不稳定基团添加特定化学部分(例如电子受体或供体)可影响将要发生化学转化的特定条件(例如pH)。
如本文所用，生理上不稳定的键为在哺乳动物体内通常所遭遇的条件或在与哺乳动物体内所遭遇条件的类似条件下可裂解的不稳定键。选择生理上不稳定的键联基团以使其在存在于某些生理条件下时经历化学转化(例如裂解)。
如本文所用，细胞生理上不稳定的键为在哺乳动物胞内条件下可裂解的不稳定键。哺乳动物胞内条件包括在哺乳动物细胞中所见或与哺乳动物细胞中所遭遇条件类似的化学条件，如pH值、温度、氧化或还原条件或试剂，及盐浓度。哺乳动物胞内条件还包括存在通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性(如来自蛋白水解酶或水解酶的酶活性)的存在。细胞生理上不稳定的键还可响应药学上接受的外源试剂的施用而裂解。在适当条件下裂解的半衰期小于45分钟的生理上不稳定的键被视为很不稳定。在适当条件下裂解的半衰期小于15分钟的生理上不稳定的键被视为极端不稳定。
化学转化(不稳定键的裂解)可通过向细胞添加药学上可接受的试剂来引发，或当含有不稳定键的分子到达适当细胞内和/或胞外环境时可自发发生。举例而言，当分子进入酸性内体时，pH不稳定键会裂解。因此，pH不稳定键可视为内体可裂解键。酶可裂解的键会在暴露于酶如存在于内体或溶酶体或细胞质中的酶时裂解。当分子进入细胞质的还原性更高的环境时，二硫键会裂解。因此，二硫键可视为细胞质可裂解键。
如本文所用，pH不稳定键为在酸性条件(pH<7)下选择性破坏的不稳定键。这些键亦可称为内体不稳定键，因为细胞内体及溶酶体的pH值小于7。术语pH不稳定包括为pH不稳定、pH很不稳定及pH极端不稳定的键。
酸酐与胺反应形成酰胺及酸。对于许多酸酐，逆反应(形成酸酐及胺)极缓慢且在能量上不利。然而，若酸酐为环状酸酐，则与胺反应产生酰胺酸，即酰胺及酸处于同一分子中的分子。在同一分子中存在两个反应性基团(酰胺及羧酸)会加速逆反应。特定言之，伯胺与顺丁烯二酸酐及顺丁烯二酸酐衍生物的产物顺丁烯酰胺酸比其非环状类似物快1×109至1×1013倍恢复回胺及酸酐(Kirby1980)。
胺与酸酐形成酰胺及酸的反应。
Figure BDA00003325521000161
胺与环状酸酐形成酰胺酸的反应。
Figure BDA00003325521000162
酰胺酸裂解形成胺及酸酐为pH依赖性的且在酸性pH下大幅加速。可利用此pH依赖性反应性来形成可逆的pH不稳定键及连接子。已使用顺乌头酸作为此种pH敏感性连接子分子。γ-羧酸酯首先偶合于分子。在第二步骤中，α或β羧酸酯偶合于第二分子，形成两个分子的pH敏感性偶合。此连接子在pH5下裂解的半衰期介于8小时与24小时之间。
顺乌头酸酐及顺丁烯二酸酐的结构。
Figure BDA00003325521000171
乌头酸
Figure BDA00003325521000172
顺丁烯二酸酐
通过向不稳定部分添加化学成分来控制使裂解发生的pH。顺丁烯酰胺酸转化成胺及顺丁烯二酸酐的速率强烈取决于顺丁烯二酸酐***的取代(R2及R3)。当R2为甲基时，转化速率比当R2及R3为氢时高50倍。当在R2与R3两者处都存在烷基取代(例如2,3-二甲基顺丁烯二酸酐)时，该速率的增加很显著：比未经取代的顺丁烯二酸酐快10,000倍。在pH5下裂解由用2,3-二甲基顺丁烯二酸酐修饰胺所形成的顺丁烯酰胺酸键以恢复酸酐及胺的半衰期介于4分钟与10分钟之间。预期若R2及R3为大于氢的基团，则酰胺-酸转化成胺及酸酐的速率将快于R2和/或R3为氢的情形。
pH很不稳定键：pH很不稳定键在pH5下的裂解半衰期小于45分钟。pH很不稳定键的构造在化学技术中为熟知的。
pH极端不稳定键：pH极端不稳定键在pH5下的裂解半衰期小于15分钟。pH极端不稳定键的构造在化学技术中为熟知的。
双取代的环状酸酐特别适用于将掩蔽剂连接于本发明的蜂毒素肽。其提供生理pH不稳定的键联，易于修饰胺，且在细胞内体及溶酶体中所见的降低pH下裂解后恢复那些胺。其次，在与胺反应时产生的α或β羧酸基团似乎仅向聚合物贡献约1/20的预期负电荷(Rozema等人Bioconjugate Chemistry2003)。因此，用双取代的顺丁烯二酸酐修饰肽有效地中和肽的正电荷，而非产生具有高负电荷的肽。对于体内递送，优选接近中性的递送肽。
RNAi多核苷酸共轭物
我们已发现RNAi多核苷酸与多核苷酸靶向部分(疏水性基团或半乳糖簇)共轭及共施用RNAi多核苷酸共轭物与上述递送肽会提供RNAi多核苷酸至肝脏细胞特别是肝细胞的体内高效、功能性递送。功能性递送意谓RNAi多核苷酸递送至细胞中且具有预期的生物活性，对于基因表达的序列特异性抑制。向哺乳动物的血管结构施用的许多分子(包括多核苷酸)通常由肝脏自身体清除。以下由肝脏达成的多核苷酸清除不视为功能性递送：多核苷酸在其中被降解或以其它方式加工以自身体移除及其中多核苷酸不引起对于基因表达的序列特异性抑制。
RNAi多核苷酸共轭物是通过将RNAi多核苷酸共价连接于多核苷酸靶向部分来形成。合成或修饰多核苷酸以使其含有反应性基团A。还合成或修饰靶向部分以使其含有反应性基团B。选择反应性基团A及B以使其可使用本领域中已知的方法通过共价键联连接。
靶向部分可连接于RNAi多核苷酸的3'或5'端。对于siRNA多核苷酸，靶向部分可连接于有义链或反义链，但优选有义链。
在一个实施方式中，多核苷酸靶向部分由疏水性基团组成。更具体地，多核苷酸靶向性部分由具有至少20个碳原子的疏水性基团组成。用作多核苷酸靶向部分的疏水性基团在本文中称为疏水性靶向部分。示例性的合适的疏水性基团可选自下组：胆固醇、二胆固醇、生育酚(tocopherol)、二生育酚、二癸基、二(十二基)、二(十八基)、二(十二基)、二(十八基)、类异戊二烯及胆酰胺(choleamide)。具有6个或少于6个碳原子的疏水性基团不能有效作为多核苷酸靶向部分，而具有8至18个碳原子的疏水性基团随着疏水性基团的大小递增(即，碳原子数递增)而提供递增的多核苷酸递送。疏水性靶向部分与RNAi多核苷酸的连接在不存在递送肽共施用下不提供RNAi多核苷酸的高效功能性体内递送。尽管他人已报导siRNA-胆固醇共轭物可在不存在任何附加递送载体下将siRNA(siRNA-胆固醇)体内递送至肝脏细胞中，但需要高siRNA浓度且递送功效差。当与本文所述的递送肽组合时，多核苷酸的递送得以极大改良。通过连同本发明的递送肽一起提供siRNA-胆固醇，siRNA-胆固醇的功效增加约100倍。
适用作多核苷酸靶向部分的疏水性基团可选自下组：烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基及芳炔基(其各自可为直链、支链或环状)，胆固醇、胆固醇衍生物、固醇、类固醇及类固醇衍生物。疏水性靶向部分优选为仅含有碳及氢原子的烃。然而，可允许维持疏水性的取代或杂原子，例如氟。疏水性靶向部分可使用本领域中已知的方法连接于RNAi多核苷酸的3'或5'端。对于具有2条链的RNAi多核苷酸(诸如siRNA)，疏水性基团可连接于任一链。
在另一实施方式中，多核苷酸靶向部分包含半乳糖簇(半乳糖簇靶向部分)。如本文所用，半乳糖簇包含具有2至4个末端半乳糖衍生物的分子。如本文所用，术语半乳糖衍生物包括半乳糖和对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力等于或大于半乳糖对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力的半乳糖衍生物。末端半乳糖衍生物通过其C-1碳连接于分子。脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)为肝细胞所特有且结合分支的半乳糖末端糖蛋白。一优选半乳糖簇具有3个末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物，各自对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力。一更优选的半乳糖簇具有3个末端N-乙酰基-半乳糖胺。本领域中常用的其它术语包括三触角半乳糖、三价半乳糖及半乳糖三聚体。已知三触角半乳糖衍生物簇结合ASGPr的亲和力大于双触角或单触角半乳糖衍生物结构(Baenziger及Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly等人,1982,J.Biol.Chem.,257,939-945)。多价为达成nM亲和力所需。连接对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的单一半乳糖衍生物不能使RNAi多核苷酸在与递送肽共施用时体内功能性递送至肝细胞中。
Figure BDA00003325521000191
半乳糖
半乳糖簇含有3个半乳糖衍生物，各自连接于中心分支点。半乳糖衍生物通过糖的C-1碳连接于中心分支点。半乳糖衍生物优选通过连接子或间隔子连接于分支点。一优选间隔子为挠性亲水性间隔子(美国专利5885968；Biessen等人J.Med.Chem.1995第39卷第1538-1546页)。一优选挠性亲水性间隔子为PEG间隔子。一优选PEG间隔子为PEG3间隔子。分支点可为允许连接3个半乳糖衍生物且进一步允许分支点连接于RNAi多核苷酸的任何小分子。一示例性分支点基团为二赖氨酸。二赖氨酸分子含有3个胺基，3个半乳糖衍生物可得以连接；还有一个羧基反应性基团，二赖氨酸可得以连接于RNAi多核苷酸。分支点连接于RNAi多核苷酸可通过连接子或间隔子发生。一优选间隔子为挠性亲水性间隔子。一优选挠性亲水性间隔子为PEG间隔子。一优选PEG间隔子为PEG3间隔子(3个乙烯单元)。半乳糖簇可使用本领域中已知的方法连接于RNAi多核苷酸的3'或5'端。对于具有2条链的RNAi多核苷酸如siRNA，半乳糖簇可连接于任一链。
一优选半乳糖衍生物为N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)。对脱唾液酸糖蛋白受体具有亲和力的其它糖可选自包含下组：半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基半乳糖胺。众多半乳糖衍生物对脱唾液酸糖蛋白受体的亲和力已得到研究(参见例如：Iobst,S.T.和Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)或易于使用本领域中的典型方法测定。
Figure BDA00003325521000201
半乳糖簇的一个实施方式
Figure BDA00003325521000202
在分支点与核酸之间具有PEG间隔子的半乳糖簇
术语多核苷酸或核酸或聚核酸为本领域中的一个术语，意指含有至少2个核苷酸的聚合物。核苷酸为多核苷酸聚合物的单体单元。具有不到120个单体单元的多核苷酸常称为寡核苷酸。天然核酸具有脱氧核糖磷酸酯或核糖磷酸酯主链。非天然或合成多核苷酸为在体外或在无细胞***中聚合且含有相同或类似碱基但可含有除核糖磷酸酯或脱氧核糖磷酸酯主链以外类型的主链的多核苷酸。多核苷酸可使用本领域中的任何已知技术合成。本领域中已知的多核苷酸主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷二酰胺、吗啉基(morpholino)，及天然核酸的磷酸酯主链的其它变体。碱基包括嘌呤及嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷及天然类似物。嘌呤及嘧啶的合成衍生物包括但不限于将新反应性基团例如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯及烷基卤化物置于核苷酸上的修饰。术语碱基涵盖DNA及RNA的任何已知碱基类似物。多核苷酸可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸或任何适合组合。多核苷酸可在体外聚合，其可为重组体，含有嵌合序列或这些基团的衍生物。多核苷酸可在5'端、3'端或5'端与3'端两者处包括末端帽部分。帽部分可为但不限于翻转的脱氧无碱基部分、翻转的脱氧胸苷部分、胸苷部分或3'甘油基修饰。
RNA干扰(RNAi)多核苷酸为一种能够通过与哺乳动物细胞的RNA干扰路径机制相互作用来诱导RNA干扰从而以序列特异性方式降解或抑制转基因的信使RNA(mRNA)转录物翻译的分子。两种主要的RNAi多核苷酸为小(或短)干扰RNA(siRNA)及微RNA(microRNA,miRNA)。RNAi多核苷酸可选自下组：siRNA、微RNA、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)及编码能够诱导RNA干扰的RNA的表达盒。siRNA包含双链结构，其通常含有15至50个碱基对且优选21至25个碱基对，且核苷酸序列与在细胞内表达的靶基因或RNA中的编码序列一致(完全互补)或接近一致(部分互补)。siRNA可具有二核苷酸3'突出端。siRNA可由两个退火的多核苷酸或形成发夹结构的单一多核苷酸构成。本发明的siRNA分子包含有义区域及反义区域。在一个实施方式中，共轭物的siRNA由两个寡核苷酸片段组装，其中一个片段包含siRNA分子的反义链的核苷酸序列且第二片段包含siRNA分子的有义区域的核苷酸序列。在另一实施方式中，有义链通过连接子分子如多核苷酸连接子或非核苷酸连接子连接于反义链。微RNA(miRNA)为长约22个核苷酸的小的非编码RNA基因产物，引导对其mRNA靶的破坏或翻译阻遏。若miRNA与靶mRNA之间为部分互补，则靶mRNA的翻译受阻遏。若互补性为广泛的，则靶mRNA裂解。对于miRNA，复合物结合于通常位于mRNA的3'UTR中的靶位点，该等mRNA通常仅与miRNA共有部分同源性。"种子区域"，即miRNA的5'端上与其靶形成完全碱基配对的约七(7)个连续核苷酸的一段，在miRNA特异性方面起关键作用。RISC/miRNA复合物结合于mRNA可导致蛋白质翻译的阻遏或mRNA的裂解及降解。新近数据指示，若沿miRNA及其靶的整个长度存在完全同源性而非仅在种子区域中显示完全碱基配对，则mRNA裂解优先发生(Pillai等人2007)。
RNAi多核苷酸表达盒可在细胞中转录以产生小发夹RNA，后者可充当siRNA、独立有义及反义链线性siRNA，或miRNA。RNA聚合酶III转录的DNA含有选自下组的启动子：U6启动子、H1启动子及tRNA启动子。RNA聚合酶II启动子包括U1、U2、U4及U5启动子、snRNA启动子、微RNA启动子及mRNA启动子。
已知miRNA序列的清单可见于由诸如以下研究组织所维护的数据库中：维尔康姆信托基金会桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)、宾夕法尼亚生物信息学中心(Penn Center for Bioinformatics)、纪念斯隆凯特琳癌症中心(Memorial SloanKettering Cancer Center)及欧洲分子生物学实验室(European Molecule BiologyLaboratory)等。已知的有效siRNA序列及同源结合位点亦在相关文献中得到充分阐述。RNAi分子易于通过本领域中已知的技术设计并产生。此外，存在增加有效及特异性序列基序的发现机会的计算工具(Pei等人2006，Reynolds等人2004，Khvorova等人2003，Schwarz等人2003，Ui-Tei等人2004，Heale等人2005，Chalk等人2004，Amarzguioui等人2004)。
本发明的多核苷酸可经化学修饰。这些化学修饰的非限制性示例包括：硫代磷酸酯核苷酸间键联、2'-O-甲基核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、"通用碱基"核苷酸、5-C-甲基核苷酸及翻转的脱氧无碱基残基并入。这些化学修饰在用于各种多核苷酸构建体中时显示会在细胞中保留多核苷酸活性，而同时增加这些化合物的血清稳定性。化学修饰的siRNA也可使人体中激活干扰素活性的可能性最小。
在一个实施方式中，本发明的化学修饰的RNAi多核苷酸包含具有两链的双链体，该两链其一或两者可经化学修饰，其中各链具有约19至约29个核苷酸。在一个实施方式中，本发明的RNAi多核苷酸包含一或多个经修饰核苷酸，同时维持在细胞或重建的体外***内部介导RNAi的能力。RNAi多核苷酸可经修饰，其中化学修饰包含一或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或超过10个)核苷酸。本发明的RNAi多核苷酸可包含占RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数某个百分比的经修饰核苷酸。因此，本发明的RNAi多核苷酸一般可包含占核苷酸位置约5%至约100%(例如核苷酸位置的5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%)的经修饰核苷酸。既定RNAi多核苷酸中存在的经修饰核苷酸的实际百分比取决于RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。若RNAi多核苷酸为单链，则修饰百分比可基于单链RNAi多核苷酸中存在的核苷酸总数。同样，若RNAi多核苷酸为双链，则修饰百分比可基于有义链、反义链或有义链与反义链两者中存在的核苷酸总数。此外，既定RNAi多核苷酸中存在的经修饰核苷酸的实际百分比也可取决于RNAi多核苷酸中存在的嘌呤及嘧啶核苷酸的总数。举例而言，其中RNAi多核苷酸中存在的所有嘧啶核苷酸和/或所有嘌呤核苷酸都经修饰。
RNAi多核苷酸调节由基因编码的RNA的表达。因为多个基因可彼此共有某一程度的序列同源性，所以RNAi多核苷酸可经设计以靶向具有足够序列同源性的一类基因。因此，RNAi多核苷酸可含有与不同基因靶的共有序列或特定基因靶的特有序列具有互补性的序列。因此，RNAi多核苷酸可经设计以靶向RNA序列在若干基因之间具有同源性的保守区域，藉此靶向基因家族中的若干基因(例如不同基因同功异型物、剪接变体、突变基因等)。在另一实施方式中，RNAi多核苷酸可经设计以靶向单一基因的特定RNA序列所特有的序列。
术语互补性指多核苷酸通过传统华生-克里克(Watson-Crick)类型或其它非传统类型与另一多核苷酸序列形成氢键的能力。就本发明的多核苷酸分子而言，多核苷酸分子与其靶(效应物结合位点)或互补序列的结合自由能足以使多核苷酸的相关功能得以进行，例如酶促mRNA裂解或翻译抑制。本领域熟知核酸分子的结合自由能的测定(Frier等人1986,Turner等人1987)。互补性百分比指示在第一多核苷酸分子中的邻接链中可与第二多核苷酸序列形成氢键(例如华生-克里克碱基配对)的碱基的百分比(例如10个中有5、6、7、8、9、10个为50%、60%、70%、80%、90%及100%互补)。完全互补意谓多核苷酸序列的邻接链中的所有碱基将与第二多核苷酸序列中相同数目的邻接碱基形成氢键。
抑制、下调或敲减(knockdown)基因表达是指，按自基因转录的RNA水平或自RNA翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基的水平所量测，基因表达降低至低于在不存在本发明的阻断性多核苷酸共轭物时所观测到的基因表达。用由本发明的组合物递送的多核苷酸来抑制、下调或敲减基因表达优选低于在对照无活性核酸(即具有乱序或具有非活性错配的核酸)存在下或在不存在多核苷酸与经掩蔽聚合物的共轭物下所观测到的程度。
体内施用
在药理学及毒理学中，施用途径为使药物、流体、毒物或其它物质与身体得以接触的路径。一般而言，用于治疗哺乳动物的药物及核酸的施用方法为本领域所熟知且可应用于施用本发明的组合物。本发明化合物可通过任何适合途径以根据该途径适当定制的制剂形式施用，最优选经胃肠道外施用。因此，本发明化合物可通过注射，例如静脉内注射、肌肉内注射、皮内注射、皮下注射或腹膜内注射来施用。因此，本发明还提供包含药学上可接受的载体或赋形剂的医药组合物。
经胃肠道外施用途径包括使用注射器及针或导管的血管内(静脉内、动脉内)、肌肉内、脑实质内、真皮内、真皮下、皮下、肿瘤内、腹膜内、鞘内、硬膜下、硬膜外及淋巴内的注射。本文中的血管内意谓在体内连接于组织或器官的称为脉管的管状结构内。在管状结构的腔内，体液流向身体部分或流出身体部分。体液的示例包括血液、脑脊髓液(CSF)、淋巴液或胆汁。脉管的示例包括动脉、小动脉、毛细血管、小静脉、窦状隙、静脉、***、胆管及唾液腺管或其它外分泌腺管。血管内途径包括通过如动脉或静脉的血管递送。血液循环***提供药物的全身性散布。
所述组合物以药学上可接受的载体溶液形式注射。药学上可接受指就药理学/毒理学观点看来，哺乳动物可接受的那些性质及/或物质。词组药学上可接受指向哺乳动物施用时生理上可耐受且通常不产生过敏或其它不利或毒性反应的分子实体、组合物及性质。优选地，如本文所用，术语药学上可接受意谓由联邦或州政府的管理机构批准或列入美国药典或其它一般认可的药典中用于动物中且更具体地用于人类中。
RNAi多核苷酸-靶向部分共轭物与递送肽共施用。共施用意谓向哺乳动物施用RNAi多核苷酸及递送肽以使两者同时存在于哺乳动物中。RNAi多核苷酸-靶向部分共轭物及递送肽可同时施用或它们可依序递送。对于同时施用，它们可在施用之前混合。对于依序施用，可首先施用RNAi多核苷酸-靶向部分共轭物或递送肽。
对于RNAi多核苷酸-疏水性靶向部分共轭物，RNAi共轭物可在施用递送肽之前最多达30分钟时施用。此外，对于RNAi多核苷酸-疏水性靶向部分共轭物，递送肽可在施用RNAi共轭物之前最多达两小时的时候施用。
对于RNAi多核苷酸-半乳糖簇靶向部分共轭物，RNAi共轭物可在施用递送肽之前最多达15分钟时施用。此外，对于RNAi多核苷酸-半乳糖簇靶向部分共轭物，递送肽可在施用RNAi共轭物之前最多达15分钟时施用。
治疗效应
RNAi多核苷酸可出于研究目的递送或可经递送以在细胞中产生治疗性变化。体内递送RNAi多核苷酸可用于研究试剂及多种治疗、诊断、靶验证、基因组发现、遗传工程及药物基因组学应用。我们已公开导致肝细胞中内源性基因表达受抑制的RNAi多核苷酸递送。在递送多核苷酸之后测定的报导子(标记物)基因表达水平指示在递送其它多核苷酸之后对基因表达类似水平的合理预期。本领域普通技术人员视为有益的治疗水平在疾病与疾病之间不同。举例而言，A型及B型血友病分别由X连接的凝血因子VIII及IX的缺陷所引起。其临床过程受因子VIII或IX的正常血清水平百分比的强烈影响：<2%，重度；2-5%，中度；及5-30%，轻度。因此，在重度患者中，自循环因子正常含量的1%增至2%可视为有益。含量水平大于6%会阻止自发出血，但不阻止手术或损伤的继发出血。类似地，对基因的抑制无需达到100%就能提供治疗益处。基因疗法领域的普通技术人员会基于标记基因结果的足够程度来合理预期某一疾病特定的基因表达的有益水平。在血友病示例中，若标记基因表达所产生的蛋白质水平在量上与因子VIII的正常水平的2%相当，则可合理地预期编码因子VIII的基因也会以类似水平表达。因此，报导基因或标记基因一般充当胞内蛋白质表达的有用范例。
鉴于肝脏在代谢(例如各种高胆固醇血症中的脂蛋白代谢)及分泌循环蛋白质(例如血友病中的凝血因子)中的重要作用，肝脏是基因疗法的最重要靶组织之一。此外，后天性病症如慢性肝炎(例如乙型肝炎病毒感染)及硬化的为常见的且也可能通过基于多核苷酸的肝脏疗法得以治疗。影响肝脏或受肝脏影响的许多疾病或病状都有可能通过肝脏中基因表达的敲减(抑制)得以治疗。这些肝疾病及病状可选自下组：肝癌(包括肝细胞癌HCC)、病毒感染(包括肝炎)、代谢病症(包括高脂血症及糖尿病)、纤维化及急性肝损伤。
递送肽及RNAi多核苷酸共轭物的待施用量(剂量)可凭经验确定。我们已显示，使用每公斤动物重量0.1至10mg siRNA共轭物及每公斤动物重量5至60mg递送肽使基因表达被有效敲减。小鼠中的优选量为0.25至2.5mg/kgsiRNA共轭物及10至40mg/kg递送肽。更优选地，施用约12.5至20mg/kg递送肽。易于增加RNAi多核苷酸共轭物的量，因为其在较大剂量下通常无毒。
如本文所用，体内意谓发生在生物体内部，且更具体指某一过程在完整的、活体多细胞生物体(动物)如哺乳动物的活组织之中或之上进行，而非部分或死亡的生物体。
实施例
实施例1.蜂毒素合成。所有蜂毒素肽皆使用本领域中的标准肽合成技术制备。适合蜂毒素肽可为全L型氨基酸、全D型氨基酸(翻转)。不管L型或D型，蜂毒素肽序列皆可经反转(反向)。
实施例2.蜂毒素修饰。
蜂毒素衍生物的氨基末端修饰。于dH2O中制备CKLK-蜂毒素(20mg/ml)、TCEP-HCl(28.7mg/ml，100mM)及MES-Na(21.7mg/ml，100mM)的溶液。在20ml闪烁管中，使CKLK-蜂毒素(0.030mmol，5ml)与1.7摩尔当量TCEP-HCl(0.051mmol，0.51ml)反应并在室温下搅拌30分钟。然后定量添加MES-Na(2ml)及水(1.88ml)以产生最终浓度为10mg/ml蜂毒素及20mM MES-Na。检查pH值且调整至pH6.5-7。于dH2O中制备NAG-PEG2-Br(100mg/ml)的溶液。添加NAG-PEG2-Br(4.75当量，0.142mmol，0.61ml)，且使溶液在室温下搅拌48小时。
或者，在20ml闪烁管中，使Cys-蜂毒素(0.006mmol，1ml)与1.7摩尔当量TCEP-HCl(0.010mmol，100μl)反应并在室温下搅拌30分钟。定量添加MES-Na(400μl)及水(390μl)以产生最终浓度为10mg/ml蜂毒素及20mM MES-Na。检查pH值且调整至pH6.5-7。于dH2O中制备NAG-PEG8-顺丁烯二酰亚胺(100mg/ml)的溶液。添加NAG-PEG8-顺丁烯二酰亚胺(2当量，0.012mmol，110μl)，且使溶液在室温下搅拌48小时。
在Luna10μC18
Figure BDA00003325521000261
21.2×250mm柱上纯化样品。缓冲液A：H2O0.1%TFA；及缓冲液B：MeCN，10%异丙醇，0.1%TFA。流速15ml/min，在20分钟内35%A至62.5%B。
使用类似手段进行其它氨基末端修饰。用具有羧基末端半胱氨酸的蜂毒素肽取代具有氨基末端半胱氨酸的蜂毒素来进行羧基末端修饰。
用于经修饰Cys-蜂毒素或蜂毒素-Cys的化合物：
Figure BDA00003325521000271
PEG顺丁烯二酰亚胺
n为1至120的整数(PEG分子量最多达约5kDa)
Figure BDA00003325521000272
NAG-PEG顺丁烯二酰亚胺
N-NAG-PEG溴乙酰胺
在肽合成期间，使用本领域中的典型方法在树脂上产生具有乙酰基、二甲基、硬脂酰基、肉豆蔻酰基及PEG氨基或羧基末端修饰而非末端半胱氨酸残基的肽。
实施例3.掩蔽剂合成。
A.pH不稳定掩蔽剂：空间稳定剂CDM-PEG及靶向性基团CDM-NAG(N-乙酰基半乳糖胺)合成。向含CDM(300mg，0.16mmol)的50mL二氯甲烷溶液中添加草酰氯(2g，10重量当量)及二甲基甲酰胺(5μl)。使反应进行过夜，此后通过旋转蒸发移除过量草酰氯及二氯甲烷，产生CDM酰氯。将酰氯溶解于1mL二氯甲烷中。向此溶液中添加含1.1摩尔当量聚乙二醇单甲基醚(平均MW550；对于CDM-PEG)或(氨基乙氧基)乙氧基-2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-β-D-半乳吡喃糖苷(即，氨基双乙氧基-乙基NAG；对于CDM-NAG)，以及吡啶(200μl，1.5当量)的10mL二氯甲烷。接着搅拌溶液1.5小时。然后去除溶剂且将所得固体溶解入5mL水中并使用逆相HPLC利用0.1%TFA水/乙腈梯度进行纯化。
CDM
Figure BDA00003325521000282
通用双取代的顺丁烯二酸酐掩蔽剂
R1包含中性ASGPr配体。掩蔽剂优选不带电荷。
Figure BDA00003325521000283
CDM-PEG
R为甲基或乙基，且n为2至100的整数。优选地，PEG含有5至20个乙烯单元(n为5至20的整数)。更佳地，PEG含有10至14个乙烯单元(n为10至14的整数)。PEG可具有可变长度且平均长度为5至20个或10至14个乙烯单元。或者，PEG可为单分散的、均一的或离散的；具有例如恰好11或13个乙烯单元。
Figure BDA00003325521000284
CDM-NAG
n为1至10的整数。如上所示，PEG间隔子可位于酸酐基团与ASGPr配体之间。优选PEG间隔子含有1至10个乙烯单元。
或者，可在酸酐与N-乙酰基半乳糖胺之间使用烷基间隔子。
Figure BDA00003325521000291
CDM-NAG(烷基间隔子)
n为0至6的整数。
可在酸酐与N-乙酰基-半乳糖胺之间使用其它间隔子或连接子。然而，优选亲水性、中性(优选不带电荷)的间隔子或连接子。
B.蛋白酶(肽酶)可裂解的掩蔽剂。蜂毒素肽也可使用特定酶可裂解性连接子来可逆修饰。这些酶可裂解性连接子采用连接于酰胺基苯甲基活化的碳酸酯部分的二肽。经活化碳酸酯与肽胺的反应将靶向性化合物如脱唾液酸糖蛋白受体配体通过肽酶可裂解的二肽-酰胺基苯甲基氨基甲酸酯键联连接于蜂毒素肽。二肽的酶裂解将靶向配体自肽移除且触发引起肽胺再生的消除反应。合成了下列酶可裂解性连接子：
Figure BDA00003325521000292
NAG-Ala-Cit-PABC-PNP
Figure BDA00003325521000293
NAG-Glu-Gly-PABC-PNP
Figure BDA00003325521000301
NAG-PEG4-Phe-Cit-PABC-PNP
Figure BDA00003325521000302
NAG-PEG7-Phe-Cit-PABC-PNP
显示二肽Glu-Gly、Ala-Cit、Phe-Cit("Cit"为氨基酸瓜氨酸)。可允许其它氨基酸组合。此外，3至5个氨基酸可用作酰胺基苯甲基与靶向配体之间的连接子。另外，本领域中已知的其它经活化碳酸酯易于取代以上化合物中使用的对硝基酚。
实施例4.可逆修饰/掩蔽蜂毒素。
A.用基于顺丁烯二酸酐的掩蔽剂修饰。在修饰之前，自0.1%冰乙酸水溶液冻干5×mg双取代的顺丁烯二酸酐掩蔽剂(例如CDM-NAG)。向干燥的双取代顺丁烯二酸酐掩蔽剂中添加含×mg蜂毒素的0.2×mL等张葡萄糖溶液及10×mg HEPES游离碱。在酸酐完全溶解之后，将溶液在室温下孵育至少30分钟，随后向动物施用。双取代的顺丁烯二酸酐掩蔽剂与肽反应产生：
Figure BDA00003325521000303
其中R为蜂毒素且R1包含ASGPr配体(例如NAG)。在酸酐与聚合物胺之间的反应中产生的酸酐羧基展现约1/20的预期电荷(Rozema等人BioconjugateChemistry2003)。因此，膜活性聚合物被有效中和而非转化成高度带负电荷的聚阴离子。
B.用蛋白酶可裂解的掩蔽剂修饰。1-10mg/mL肽的1×mg肽及10×mg HEPES碱通过添加含NAG的蛋白酶可裂解性底物的2-6×mg胺反应性对硝基苯基碳酸酯或N-羟基丁二酰亚胺碳酸酯衍生物来掩蔽。然后将溶液在室温(RT)下孵育至少1小时，随后注射入动物中。
实施例5.siRNA。siRNA具有下列序列：
因子VII-啮齿类
有义：(Chol)-5'GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)3'(Seq ID97)
反义：5'pdTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT3'(Seq ID98)
或
有义5'GGAUfCfAUfCfUfCfAAGUfCfUfUfACfdTsdT3'(Seq ID99)
反义5'GUfAAGACfUfUfGAGAUfGAUfCfCfdTsdT3'(Seq ID100)
因子VII=灵长类
有义(chol)-5'uuAGGfuUfgGfuGfaAfuGfgAfgCfuCfaGf(invdT)3'(Seq ID101)
反义5'pCfsUfgAfgCfuCfcAfuUfcAfcCfaAfcdTsdT3'(Seq ID102)
ApoB siRNA:
有义(cholC6SSC6)-5'GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA3'(Seq ID103)
反义5'uuGGAUcAAAuAuAAGAuUCcscsU3'(Seq ID104)
siLUC
有义(chol)5'-uAuCfuUfaCfgCfuGfaGfuAfcUfuCfgAf(invdT)-3'(Seq ID105)
反义5'-UfcGfaAfgUfaCfuCfaGfcGfuAfaGfdTsdT-3'(Seq ID106)
小写=2'-O-CH3取代
s=硫代磷酸酯键联
在核苷酸之后的f=2'-F取代
在核苷酸之前的d=2'-脱氧
在Oligopilot100(GE Healthcare公司，德国弗莱堡)上并以可控孔径玻璃(CPG)作为固体支撑物，通过常规氨基磷酸酯化学在固相上进行RNA合成。
实施例6.siRNA靶向性分子共轭物。
A.合成GalNAc簇。如美国专利公开20010207799中所述合成GalNAc簇多核苷酸靶向配体。
Figure BDA00003325521000321
B.GalNAc簇-siRNA共轭物。如图2中所示且如下所述，将以上实施例6A的GalNAc簇共轭于siRNA。
(1)将化合物1(150mg，0.082mmol，图2)溶解于无水甲醇(5.5ml)中且添加42μL甲醇钠(25%的甲醇溶液)。在室温下在氩气氛围下搅拌混合物2小时。添加等量甲醇以及数份阴离子交换物质安伯来特(Amberlite)IR-120以产生约7.0的pH值。通过过滤移除安伯来特。用Na2SO4干燥溶液，且在减压下去除溶剂。以定量产率获得呈白色泡沫形式的化合物2。TLC(SiO2，二氯甲烷(DCM)/MeOH5:1+0.1%CH3COOH)：Rf2=0.03，检测采用含硫酸(5%)的MeOH溶液随后加热。ESI-MS，直接注射，负离子模式；[M-H]-1 计算：1452.7；[M-H]1- 实测：1452.5。
(2)使化合物2(20mg，0.014mmol，图2)与吡啶及二氯甲烷共蒸发。将残余物溶解于无水DMF(0.9ml)中且在氩气氛围下搅拌的同时添加含N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的DMF溶液(1.6mg，0.014mmol)。在0℃下，缓慢添加含N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)的DMF溶液(3.2mg，0.016mmol)。使反应升温至室温且搅拌过夜。化合物3不经进一步纯化即用于与RNA共轭。
(3)合成氨基修饰的RNA。使用
Figure BDA00003325521000331
 Oligopilot100(GE Healthcare公司，德国弗莱堡)且以可控孔径玻璃作为固体支撑物，在1215μmol规模下通过标准亚磷酰胺化学在固相上产生在有义链的5'端处装备有C-6氨基连接子的RNA。采用相应亚磷酰胺、2'-O-甲基亚磷酰胺及TFA-己基氨基连接子酰胺(amidite)产生含有2'-O-甲基核苷酸的RNA。通过本领域已知的方法达成裂解及脱保护以及纯化(Wincott F.等人,NAR1995,23,14,2677-84)。
通过阴离子交换HPLC表征氨基修饰的RNA(纯度：96.1%)且通过ESI-MS确认身份([M+H]1+ 计算：6937.4；[M+H]1+ 实测：6939.0)。序列：
5′-(NH2C6)GGAAUCuuAuAuuuGAUCcAsA-3′；u、c：相应碱基的2′-O-甲基核苷酸，s：硫代磷酸酯。
(4)GalNAc簇共轭于RNA。将在5'端处装备有C-6氨基连接子的RNA(2.54μmol)冻干且将其溶解于250μL硼酸钠缓冲液(0.1mol/L硼酸钠，pH8.5，0.1mol/LKCl)及1.1mL DMSO中。在添加8μL N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)之后，在连续搅拌下缓慢添加含化合物3(理论上0.014mmol，图2)的DMF溶液至RNA溶液中。反应混合物在35℃下搅动过夜。使用RP-HPLC(Resource RPC3ml，缓冲液：A：含100mM乙酸三乙铵(TEAA，2.0M，pH7.0)的水，B：含100mM TEAA的95%乙腈，梯度：5%B至22%B，20个柱体积(CV))监测反应。在-20℃下使用含乙酸钠(3M)的EtOH沉淀RNA后，使用上述条件纯化RNA共轭物。汇集纯的部分，且使用乙酸钠/EtOH沉淀所要的共轭化合物4，产生纯RNA共轭物。分离出共轭物4，产率59%(1.50μmol)。通过阴离子交换HPLC分析共轭物4的纯度(纯度：85.5%)且通过ESI-MS确认身份([M+H]1+ 计算：8374.4；[M+H]1+ 实测：8376.0)。
(5)共轭物4(有义链)与2'-O-甲基修饰的反义链退火。将互补链于退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8，100mM氯化钠)中的等摩尔溶液混合，在85-90℃水浴中加热3分钟，且在3至4小时时间内冷却至室温，从而产生siRNA共轭物。通过天然凝胶电泳确认双链体形成。
C.疏水性基团-siRNA共轭物。
(1)siRNA共轭于烷基。采用来自Glen Research(美国弗吉尼亚州)的5'-羧基修饰剂C10酰胺制备siRNA的5'-C10-NHS酯修饰的有义链(NHSC10-siRNA或COC9-siRNA)。仍然连接于固体支撑物的活化RNA用于与下表1中所列亲脂性胺共轭。将100mg有义链CPG(装载60μmol/g，0.6μmol RNA)与0.25mmol的相应胺混合，所用胺获自Sigma Aldrich Chemie GmbH(德国陶夫基兴)或Fluka(Sigma-Aldrich,瑞士布克斯)。
表1.用于形成疏水性基团-siRNA共轭物的亲脂性胺
编号 亲脂性胺 mg mmol 溶剂
2 N-己胺 25 0.25 1mL CH2Cl2
3 十二胺 50 0.25 0.55mL CH3CN，0.45mL CH2Cl2
4 十八胺 67 0.25 1mL CH2Cl2
5 二癸胺 74 0.25 1mL CH2Cl2
6 二(十二胺) 88 0.25 1mL CH2Cl2
7 二(十八胺) 67 0.12 0.45mL CH2Cl2，0.45mL环己烷
混合物在40℃下振荡18小时。自固体支撑物裂解下RNA且用氢氧化铵水溶液(NH3，33%)在45℃下脱保护过夜。在65℃下用TEA×3HF去除2'-保护基，持续3.5小时。通过RP-HPLC(Resource RPC3ml，缓冲液：A：含100mM TEAA的水，B：含100mM TEAA的95%CH3CN，梯度：自3%B至70%B，15个柱体积；编号7是例外：自3%B至100%B，15个柱体积)纯化粗寡核糖核苷酸。
为了自RNA单链产生siRNA，将等摩尔量的互补有义链及反义链在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8；100mM氯化钠)中混合，在80℃下加热3分钟，且在3至4小时的时间内冷却至室温。通过凝胶电泳表征针对因子VII mRNA的siRNA。
(2)siRNA共轭于胆固醇—使用本领域中的标准方法合成siRNA-胆固醇共轭物。胆固醇可连接于siRNA的有义链或反义链的5'或3'末端。优选连接于siRNA的有义链的5'端。亦可利用本领域中的标准方法，使用含有反应性基团(例如硫醇、胺或羧基)的RNA链在siRNA合成后制备siRNA-胆固醇。
体内siRNA递送
实施例7.体内施用RNAi多核苷酸且递送至肝细胞。如上所述合成RNAi多核苷酸共轭物及经掩蔽蜂毒素肽。自Harlan Sprague Dawley(印第安纳州印第安纳波利斯)获得6至8周龄的小鼠(品系C57BL/6或ICR，各自约18至20g)。小鼠在注射之前圈养至少2天。用Harlan Teklad啮齿动物膳食(Harlan,威斯康辛州麦迪逊)进行随意喂养。将0.2mL递送肽溶液及0.2mL siRNA共轭物注射入小鼠的尾部静脉中。对于同时注射递送肽及siRNA，在注射之前添加siRNA共轭物至经修饰肽中且注射全部量。组合物在生理条件下为可溶及非聚集的。通过输注将溶液注射入尾部静脉中。预期注射入其它血管(例如眼眶后注射)同等有效。
自Charles River(马萨诸塞州威尔明顿)获得175至200g的Wistar Han大鼠。大鼠在注射之前圈养至少1周。大鼠的注射体积通常为1ml。
血清ApoB含量测定。在通过下颌下放血来收集血清之前，使小鼠禁食4小时(大鼠为16小时)。对于大鼠，自颈静脉收集血液。通过标准夹心式ELISA方法测定血清ApoB蛋白质含量。简言之，分别使用多克隆山羊抗小鼠ApoB抗体及兔抗小鼠ApoB抗体(Biodesign International)作为捕捉抗体及侦测抗体。之后施用共轭有HRP的山羊抗兔IgG抗体(Sigma)以结合ApoB/抗体复合物。接着通过TecanSafire2(欧洲奥地利)酶标仪在450nm下测量四甲基-联苯胺(TMB，Sigma)比色显色的吸光度。
血浆因子VII(F7)活性测量。遵循标准程序通过将血液(9体积)(对于小鼠，通过下颌下放血；或对于大鼠，自颈静脉放血)收集入含有0.109mol/L柠檬酸钠抗凝血剂(1体积)的微量离心管中，来制备来自动物的血浆样品。遵循制造商的推荐，使用BIOPHEN VII试剂盒(Hyphen BioMed/Aniara,俄亥俄州梅森)用显色法测量血浆中的F7活性。使用Tecan Safire2酶标仪在405nm下测量比色显色的吸光度。
实施例8.递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB含量的敲减—蜂毒素肽的剂量反应。如上所述用CDM-NAG可逆修饰蜂毒素。接着共注射指定量的蜂毒素与200μg ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。
表2.在用ApoB-siRNA-胆固醇共轭物及CDM-NAG与用CDM-PEG可逆抑制的蜂毒素肽处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性抑制的比较。
a相对于注射等张葡萄糖的动物的敲减
实施例9.大鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性因子VII含量的敲减。如上所述用5×CDM-NAG可逆修饰指定蜂毒素。接着共注射指定量的蜂毒素(以每公斤动物重量的毫克数计)与3mg/kg胆固醇-因子VII siRNA。如上所述确定对因子VII水平的影响。
表3.用因子VII-siRNA-胆固醇共轭物及CDM-NAG可逆抑制的蜂毒素处理的大鼠中正常肝脏细胞内因子VII活性的抑制。
Figure BDA00003325521000361
a每公斤动物重量的mg肽
b相对于注射等张葡萄糖的动物的敲减
实施例10.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，L型蜂毒素相对于D型蜂毒素。如上所述用CDM-NAG可逆修饰蜂毒素。接着共注射指定量的蜂毒素与50μg ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。
表4.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及指定CDM-NAG可逆抑制的蜂毒素肽处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
实施例11.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，正常序列相对于反转(反向)序列。如上所述用CDM-NAG(5×)可逆修饰蜂毒素。接着共注射指定量的蜂毒素与指定量的ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB含量的影响。
表5.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及指定CDM-NAG可逆抑制的蜂毒素肽处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
Figure BDA00003325521000371
a-反向翻转=正常蜂毒素氨基酸序列经反转且所有氨基酸皆为D型氨基酸(甘氨酸(G)为非手性的)
实施例12.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，蜂毒素修饰程度。如上所述用指定量的CDM-NAG可逆修饰蜂毒素。接着共注射50μg蜂毒素与100μg ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。
通过TNBS分析肽上的游离胺测定蜂毒素胺修饰百分比。将20μg肽吸移入含有190μL50mM BORAX缓冲液(pH9)及16μg TNBS的96孔透明板(NUNC96)中。使样品与TNBS在室温下反应约15分钟且接着在Safire酶标仪上测量A420。如下计算胺修饰%：(A对照-A样品)/(A对照-A空白)×100。修饰超过80%的胺提供最佳蜂毒素掩蔽及活性。
表6.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及经CDM-NAG以指定程度可逆修饰的蜂毒素处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
Figure BDA00003325521000381
a通过TNBS分析测定
实施例13.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，蜂毒素肽衍生物。如上所述用CDM-NAG(5×)可逆修饰具有指定序列的蜂毒素肽。接着共注射指定量的蜂毒素与指定量的ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。
表7.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及指定CDM-NAG可逆抑制的蜂毒素肽处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
Figure BDA00003325521000382
Figure BDA00003325521000391
Figure BDA00003325521000401
a每只小鼠的μg肽
b每只小鼠的μg siRNA
dMel=具有D型氨基酸的蜂毒素肽
实施例14.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，酶可裂解性掩蔽剂。如上所述用指定量的酶可裂解性掩蔽剂可逆修饰蜂毒素。接着共注射200至300μg经掩蔽蜂毒素与50至100μg ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。肽酶可裂解的二肽-酰胺基苯甲基氨基甲酸酯修饰的蜂毒素为有效的siRNA递送肽。优选与酶可裂解性掩蔽剂组合使用D型蜂毒素肽。尽管达成相同程度的靶基因敲减需要较多肽，但因为肽掩蔽更稳定，所以治疗指数不改变或得到改良(相较于用CDM-NAG掩蔽相同肽)。
表8.用因子VII-siRNA胆固醇共轭物及经指定酶可裂解性掩蔽剂可逆抑制的G1L-蜂毒素(D型)(Seq ID7)处理的小鼠中正常肝脏细胞内因子VII活性的抑制。
Figure BDA00003325521000402
Figure BDA00003325521000411
a用于掩蔽反应中的每个蜂毒素胺的掩蔽剂量。
实施例15.小鼠中递送ApoB siRNA与蜂毒素递送肽之后体内内源性ApoB水平的敲减，胺修饰的蜂毒素肽。如上所述合成含有指定PEG氨基末端修饰的蜂毒素肽。接着如上所述用5×CDM-NAG可逆修饰经PEG氨基末端修饰的蜂毒素肽。接着共注射指定量的蜂毒素与100至200μg ApoB siRNA-胆固醇共轭物。如上所述确定对ApoB水平的影响。添加大小低于5kDa的PEG使蜂毒素肽的毒性降低。用高于5kDa的PEG进行氨基末端修饰导致功效降低(数据未显示)。
表9.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及经指定CDM-NAG可逆抑制的蜂毒素肽处理的小鼠中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
Figure BDA00003325521000412
实施例16.已知具有膜活性的其它蜂毒素衍生物序列。
表10.具有膜活性的蜂毒素肽。
Figure BDA00003325521000421
实施例17.由蜂毒素递送肽递送因子VII siRNA之后灵长类动物中的因子VII敲减。如上所述通过与10×CDM-NAG反应来掩蔽NAG-PEG2-G1L蜂毒素。如上所述通过与5×CDM-NAG反应来掩蔽G1L蜂毒素。在第1天，将1mg/kg经掩蔽NAG-PEG2-G1L蜂毒素、1mg/kg经掩蔽G1L蜂毒素或3mg/kg经掩蔽G1L蜂毒素与2mg/kg胆固醇-因子VII siRNA一起共注射入食灵长类动物蟹猕猴(Cynomolgus macaque)(食蟹猴(Macaca fascicularis))(雄性，3.0至8.0kg)中。使用22至25号静脉内导管将2ml/kg注射入隐静脉中。作为对照，用10mg/kg G1L蜂毒素与2mg/kg对照siRNA胆固醇-荧光素酶siRNA共注射另一组灵长类动物。在指定时间点(指示于图3至5中)，抽取血液样品且分析因子VII及毒性标记物。自股静脉收集血液且在所有血液收集之前灵长类动物均禁食过夜。根据制造商的推荐，在Cobas Integra400(Roche Diagnostics)上进行关于血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及肌酸酐(creatinine)的血液测试。如上所述测定因子VII水平。在小于1mg/kg肽剂量下观测到因子VII的显著敲减。在10mg/kg的肽剂量下未观测到显著毒性。因此，经掩蔽蜂毒素肽的治疗指数为5至10。
实施例18.由蜂毒素递送肽递送ApoB siRNA之后灵长类动物中的ApoB敲减。如上所述通过与5×CDM-NAG反应来掩蔽G1L蜂毒素。在第1天，将2mg/kg经掩蔽G1L蜂毒素与2mg/kg胆固醇-ApoB siRNA一起共注射入灵长类动物食蟹猕猴(食蟹猴)中。在指定时间点(表11)，抽取血液样品且分析ApoB蛋白质水平及毒性标记物。根据制造商的推荐，在Cobas Integra400(Roche Diagnostics)上进行关于血液尿素氮(BUN)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及肌酸酐的血液测试。如上所述测定ApoB水平。未观测到BUN、肌酸酐或AST增加。仅在第2天(注射之后1天)观测到AST的短暂微小升高。ApoB的敲减在第11天达到接近100%且保持低量31天。
表11.用ApoB-siRNA胆固醇共轭物及经CDM-NAG掩蔽的G1L蜂毒素处理的灵长类动物中正常肝脏细胞内ApoB活性的抑制。
Figure BDA00003325521000431

Claims (20)

1.一种用于体内递送RNA干扰多核苷酸至肝脏细胞的共轭物递送***组合物，其包含：RNAi-A+蜂毒素-(L-Gal)x
其中，
蜂毒素是蜂毒素肽：
L是生理上不稳定的键，
Gal是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr)配体，
x是整数，数值大于蜂毒素伯胺的80%，
RNAi是RNA干扰多核苷酸，且
A为具有至少20个碳原子的疏水性基团或半乳糖簇。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述RNA干扰多核苷酸选自下组：DNA、RNA、dsRNA、siRNA及微RNA。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述肝脏细胞由肝细胞组成。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述ASGPr配体可逆连接于多个蜂毒素肽上至少90%的胺上。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述蜂毒素肽选自下组：Seq.ID1、Seq.ID7、Seq.ID11、Seq.ID51、Seq.ID57及Seq.ID58、Seq.ID92和Seq.ID96。
6.如权利要求1所述的组合物，其中该蜂毒素肽由D型氨基酸组成。
7.如权利要求1所述的组合物，其中L为双取代的顺丁烯酰胺酸酯。
8.如权利要求1所述的组合物，其中L为酰胺基苯甲基氨基甲酸酯。
9.如权利要求7所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的聚乙二醇(PEG)。
10.如权利要求7所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的ASGPr配体-PEG共轭物。
11.如权利要求8所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的聚乙二醇(PEG)。
12.如权利要求8所述的组合物，其还包含共价连接于所述蜂毒素肽的氨基末端的ASGPr配体-PEG共轭物。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述ASGPr配体选自下组：乳糖、半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-乙酰基-半乳糖胺、N-丙酰基半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺及N-异丁酰基半乳糖胺。
14.如权利要求1所述的组合物，其中所述RNAi是通过生理上不稳定的键L2连接于A。
15.如权利要求14所述的组合物，其中L2与L正交。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述半乳糖簇由N-乙酰基半乳糖胺三聚体组成。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述疏水性基团由胆固醇组成。
18.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是在药学上可接受的载体或稀释剂中提供。
19.一种抑制基因表达的方法，所述基因在哺乳动物肝脏细胞内表达，所述方法包括：
a)形成序列与所述基因的部分序列一致或接近一致的RNAi多核苷酸；以及
a)向所述哺乳动物的脉管内注射入权利要求1所述的组合物。
20.一种制造RNA干扰多核苷酸递送组合物的方法，所述方法包含：
a)形成蜂毒素肽：
b)形成多个不带电荷的掩蔽剂，其各自包含共价连接于双取代的顺丁烯二酸酐或二肽酰胺基苯甲基的胺反应性碳酸酯的ASGPr配体；
c)用步骤b所述掩蔽剂修饰蜂毒素肽群体上超过80%的伯胺，
d)将所述RNA干扰多核苷酸连接于具有至少20个碳原子的疏水性基团或半乳糖三聚体；
f)将所述RNA干扰多核苷酸及经修饰的蜂毒素肽以适于体内施用的溶液形式提供。
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