CN103543139B - 一种血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉一种利用表面增强拉曼光谱检测血浆中低丰度蛋白的方法。取血浆标准样品加入到疏水性聚合物的离心柱中，置于摇床震荡，离心得到低丰度蛋白溶液；与印迹固定化基质、血浆标准样品混合，孵育得到富集血浆低丰度蛋白印迹固定化基质，加冰醋酸再加入SERS活性金属纳米粒子，经孵育制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液；取混合液进行SERS检测，得到血浆低丰度蛋白的表面增强拉曼光谱数据。本发明具有检测时间短，所需功率低，固定化基质价格低廉，富集过程简单易行，具有良好的经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质分析检测领域，特别涉及一种利用表面增强拉曼光谱(SERS)检测血浆中低丰度蛋白的方法。
背景技术
拉曼光谱是一种分子振动光谱，是对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。拉曼光谱分析过程操作简单快速，灵敏度高，是一种无损检测，但是拉曼光谱信号微弱，易受自体荧光干扰，因此利用拉曼光谱技术直接进行检测存在一定局限性。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS)技术是一种常用的拉曼信号增强方法，当分子吸附于某些粗糙金属(如Au、Ag、Cu和Pt等)表面时，将产生局部电场增强或者电荷转移，使得这些分子的拉曼散射强度增加104～1014倍，这就是SERS效应。SERS技术能淬灭生物分子荧光，获得的信号理想，检测所需功率较低，对生物组织样品损伤小，灵敏度高，可实现单分子检测。
人体血浆蛋白含有来源于几乎所有细胞、组织、器官的蛋白，然而，血浆蛋白的丰度差异巨大，血浆中21种主要高丰度及中等丰度的蛋白，如白蛋白、IgG、α1抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、转铁蛋白等占血浆总蛋白含量的99％以上，而其余的1％则由为数众多的低丰度甚至极低丰度的蛋白质组成。人体组织器官发生病变时，来自病变组织或细胞的蛋白会进入到血液***，这些蛋白质与机体的病理、生理状况密切相关，因此，对这些蛋白质进行检测和分析是发现与各种疾病相关生物标志物的最有价值样本之一，这些蛋白质大部分都是低丰度蛋白，然而，低丰度蛋白难于检测，如何有效地检测和分析低丰度蛋白一直是分析科学领域具有挑战性的难题。难点主要在两个方面，一是低丰度蛋白的含量低于分析仪器的检测极限；另一方面，血浆蛋白中高、低丰度蛋白含量的差异巨大，往往可达1012之巨，低丰度蛋白的信号易被高丰度蛋白所掩盖。
目前对低丰度蛋白的检测方法主要有以下两种：第一种方法是先通过二维凝胶电泳分离高、低丰度蛋白，再将分离得到的低丰度蛋白酶解后用质谱进行检测分析；第二种方法是将高、低丰度蛋白先混合酶解后，色谱分离蛋白质酶解后的肽段，最后对肽段进行质谱检测分析。上述方法都存在所需样品量大，耗材昂贵，步骤繁复，耗时较长等问题。另外质谱分析易受洗脱液等因素的干扰，无法鉴定区分等质量蛋白质，而且质谱仪价格昂贵，难于广泛推广。
发明内容
本发明目的在于提出一种利用SERS技术检测血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的方法。本方法采用疏水性聚合物去除血浆中的高丰度蛋白后，利用印迹固定化基质富集低丰度蛋白，利用SERS技术检测获取血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱。本发明具有快速、操作简单、成本低廉等特点，可有效地检测到血浆中低丰度蛋白的表面增强拉曼光谱，从而克服了现有技术中的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
(1)去除血浆高丰度蛋白
取疏水性聚合物于套有离心柱的收集管中，加入洗脱液，充分混匀，3000～6000rpm离心1～5min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次得到经洗脱液洗脱的疏水性聚合物。取血浆标准样品，加入1～10倍体积量的洗脱液进行稀释，加入到含有经洗脱液洗脱的疏水性聚合物的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中200～350rpm震荡10～15min，2000～5000rpm离心，去除沉淀物，收集上层的低丰度蛋白溶液。
(2)富集血浆低丰度蛋白
取印迹固定化基质，按照印迹固定化基质︰血浆标准样品为(1～2)g︰(10～20)μl的比例，与步骤(1)收集到的低丰度蛋白溶液混合，孵育8～15min，然后将印迹固定化基质转入漂洗液中浸泡10～20min，取出在室温下吹干备用。
(3)低丰度蛋白SERS增强基质混合液的制备
将步骤(2)吹干的印迹固定化基质剪碎并收集于离心管中，加入冰醋酸进行溶解，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入SERS活性金属纳米粒子，充分搅拌，水浴42～65℃孵育15～30min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液。
(4)血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
取低丰度蛋白SERS增强基质混合液2～20μl进行SERS检测，得到血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱数据。
所述疏水性聚合物是指离子交换树脂或硅胶。
所述洗脱液是指磷酸盐缓冲液，磷酸根的浓度范围为25～60毫摩尔每升(mmol/L)，pH值为4。
所述的疏水性聚合物与洗脱液的用量比为(2～25)g︰(100～1000)μl的比例，
所述印迹固定化基质是指醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚偏二氟乙烯膜。
所述SERS活性金属纳米粒子是指银纳米粒子或金纳米粒子。
所述疏水性聚合物的使用量与血浆标准样品的用量比为(2～25)g：(10～100)μl。
所述的印迹固定化基质与冰醋酸的用量比为(0.2～2)g︰(150～1000)μl。
所述SERS活性金属纳米粒子与印迹固定化基质的用量比为(5～50)毫摩尔：(0.2～2)g。
所述的漂洗液是指冰醋酸、95％乙醇、蒸馏水的混合物，其组成为冰醋酸：95％乙醇：蒸馏水的体积比为(1～3):(4～9):(8～12)；
所述的SERS检测，使用的激光功率为0.1～20mW，激光激发波长为450～800nm，光谱的测量范围为400～3500cm-1；
所述银纳米粒子的制备方法为：
采用盐酸羟胺还原制备银纳米粒子，将4.5ml氢氧化钠溶液(0.1M)与5ml盐酸羟胺溶液(0.06M)混合，加入到90ml AgNO3溶液(1.1×10-3M)中，涡旋搅拌1min，即可获得乳灰色银纳米粒子，粒径大约为40～60nm。将上述银纳米粒子以4000～5000rpm离心10min～15min，弃上清液，下层浓缩的银纳米粒子则在室温下避光封存备用。
所述金纳米粒子的制备方法为：
取含1mmol/L的氯金酸水溶液500毫升，加热至沸腾后在快速搅拌中加入50毫升38.8mmol/L的柠檬酸钠溶液。继续加热10分钟，等溶液的颜色从淡黄色变化深紫色后除去覆盖物再搅拌加热15分钟，得到金纳米粒子。粒径大约为35～45nm。将上述金纳米粒子以5000～8000rpm离心10min～15min，将上清液丢弃，下层浓缩的金纳米粒子则在室温下避光封存备用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明在SERS活性纳米材料与低丰度蛋白相混合时添加冰醋酸，使环境保持弱酸性，由于银或金纳米粒子等SERS活性纳米材料本身带负电荷，而血浆低丰度蛋白质的等电点都在PH 7.5以下，在酸性环境下血浆低丰度蛋白质蛋白质都带正电荷，这样待测的低丰度蛋白样品通过静电紧密吸附在SERS增强基质表面，并且促进胶体聚集，显著提高检测灵敏度。本发明使用SERS技术检测低丰度蛋白，检测时间仅需1～10s，检测所需激光功率低至0.1mW，因此，本发明具有快速、无损、灵敏的检测优势。
2、本发明选用醋酸纤维膜等固定化基质作为富集血浆低丰度蛋白的材料，材料本身价格低廉，富集过程简单易行，大大降低了成本，而且检测获得的低丰度蛋白的SERS光谱包含丰富的蛋白质结构信息，能有效弥补质谱法鉴定低丰度蛋白质的不足。
附图说明
图1是本发明测得的肝癌患者血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱图。
图2是本发明测得的鼻咽癌癌患者血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱图。
图3是本发明测得的胃癌患者血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱图。
具体实施方式
图1、图2和图3中纵坐标为谱线的强度，单位为任意单位(a.u)横坐标为各特征谱线的峰位置，以波数(cm-1)表示。
实施例1
1、基于银纳米粒子增强基底的肝癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
(1)去除肝癌患者血浆中的高丰度蛋白
取2g离子交换树脂于套有离心柱的收集管中，加入100μl洗脱液，混匀，3000rpm离心5min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次。取10μl肝癌患者血浆标准样品稀释于100μl的洗脱液中混匀，加入到含有离子交换树脂的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中200rpm震荡15min，2000rpm离心收集肝癌患者血浆低丰度蛋白溶液。
(2)富集肝癌患者血浆低丰度蛋白
取0.2g醋酸纤维膜与步骤(1)收集到的肝癌患者血浆低丰度蛋白溶液共同孵育15min，然后将醋酸纤维膜转入漂洗液中浸泡20min，取出在室温下吹干备用。
(3)低丰度蛋白SERS增强基质混合液的制备
将步骤(2)吹干的醋酸纤维膜剪碎并收集于1.5ml离心管中，加入冰醋酸150μl溶解醋酸纤维膜，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入银纳米粒子，充分搅拌，水浴42℃孵育30min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液
(4)肝癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
取肝癌患者血浆低丰度蛋白SERS增强基质混合液2μl进行SERS检测。检测到肝癌患者血浆低丰度蛋白的SERS光谱如图1所示。
实施例2
基于金纳米粒子增强基底的鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
(1)去除鼻咽癌患者血浆中的高丰度蛋白
取25g离子交换树脂于套有离心柱的收集管中，加入1000μl洗脱液与疏水性聚合物充分混匀，6000rpm离心1min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次。取100μl鼻咽癌患者血浆标准样品稀释于1000μl的洗脱液中混匀，加入到含有离子交换树脂的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中350rpm震荡10min，5000rpm离心收集鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白溶液。
(2)富集鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白
取2g聚偏二氟乙烯膜与步骤(2)收集到的鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白溶液共同孵育8min，然后将聚偏二氟乙烯膜转入漂洗液中浸泡10min，取出在室温下吹干备用。
(3)鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
将步骤(2)吹干的聚偏二氟乙烯膜剪碎并收集于7ml离心管中，加入冰醋酸1000μl溶解聚偏二氟乙烯膜，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入金纳米粒子，充分搅拌，水浴65℃孵育15min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液。
(4)鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
取鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白SERS增强基质混合液20μl进行SERS检测。检测到鼻咽癌患者血浆低丰度蛋白的SERS光谱如图2所示。
实施例3
1、基于银纳米粒子增强基底的胃癌患者血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
(1)去除胃癌患者血浆中的高丰度蛋白
取2g硅胶于套有离心柱的收集管中，加入150μl洗脱液，混匀，3000rpm离心5min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次。取10μl胃癌患者血浆标准样品稀释于100μl的洗脱液中混匀，加入到含有硅胶的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中200rpm震荡15min，2000rpm离心收集肝癌患者血浆低丰度蛋白溶液。
(2)富集胃癌患者血浆低丰度蛋白
取2g硝酸纤维素膜与步骤(1)收集到的胃癌患者血浆低丰度蛋白溶液共同孵育15min，然后将硝酸纤维膜转入漂洗液中浸泡20min，取出在室温下吹干备用。
(3)低丰度蛋白SERS增强基质混合液的制备
将步骤(2)吹干的硝酸纤维膜剪碎并收集于1.5ml离心管中，加入冰醋酸1000μl溶解硝酸纤维膜，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入银纳米粒子，充分搅拌，水浴52℃孵育18min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液。
(4)血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
取胃癌患者血浆低丰度蛋白SERS增强基质混合液2μl进行SERS检测。检测到胃癌患者血浆低丰度蛋白的SERS光谱如图3所示。
当然，本实施例的过程仅用于说明本发明的技术方案，本领域技术人员根据本发明的启示，亦可很容易想到对除血浆低丰度蛋白之外的其他多种低丰度蛋白，如组织低丰度蛋白、唾液低丰度蛋白、***低丰度蛋白以及尿液低丰度蛋白等，以类似的方法进行检测。但是， 凡本领域技术人员因本发明所涉及之技术启示，而采用等同替换或等效变形方式形成的技术方案均落在本发明的保护范围内。
Claims (11)
1.一种血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于：
(1)去除血浆高丰度蛋白
取疏水性聚合物于套有离心柱的收集管中，加入洗脱液，充分混匀，3000～6000rpm离心1～5min后，将收集管中的液体倒掉，重复三次得到经洗脱液洗脱的疏水性聚合物；
取血浆标准样品，加入1～10倍体积量的洗脱液进行稀释，加入到含有经洗脱液洗脱的疏水性聚合物的离心柱中，利用移液器反复抽吸充分混匀，置于摇床中200～350rpm震荡10～15min，2000～5000rpm离心，去除沉淀物，收集上层的低丰度蛋白溶液；
(2)富集血浆低丰度蛋白
取印迹固定化基质，与步骤(1)收集到的低丰度蛋白溶液混合，孵育8～15min，然后将印迹固定化基质转入漂洗液中浸泡10～20min，取出在室温下吹干备用；
(3)低丰度蛋白SERS增强基质混合液的制备
将步骤(2)吹干的印迹固定化基质剪碎并收集于离心管中，加入冰醋酸进行溶解，充分搅拌直至完全呈现为透明胶体状态时，加入SERS活性金属纳米粒子，充分搅拌，水浴42～65℃孵育15～30min，静置分层，直至固相杂质析出，制成低丰度蛋白SERS增强基质混合液；
(4)血浆低丰度蛋白SERS光谱检测
取低丰度蛋白SERS增强基质混合液2～20μl进行SERS检测，得到血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱数据。
2.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述的印迹固定化基质与血浆标准样品混合时，其比例为(0.2～2)g︰(10～100)μl。
3.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述疏水性聚合物是指离子交换树脂或硅胶。
4.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述洗脱液是指磷酸盐缓冲液，磷酸根的浓度范围为25～60毫摩尔每升，pH值为4。
5.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述的疏水性聚合物与洗脱液的用量比为(2～25)g︰(100～1000)μl。
6.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述印迹固定化基质是指醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜或聚偏二氟乙烯膜。
7.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述SERS活性金属纳米粒子是指银纳米粒子或金纳米粒子。
8.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述疏水性聚合物的使用量与血浆标准样品的用量比为(2～25)g：(10～100)μl。
9.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述的印迹固定化基质与冰醋酸的用量比为(0.2～2)g︰(150～1000)μl。
10.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述SERS活性金属纳米粒子与印迹固定化基质的用量比为(5～50)毫摩尔：(0.2～2)g。
11.根据权利要求1的所述的血浆低丰度蛋白表面增强拉曼光谱的检测方法，其特征在于所述的SERS检测，使用的激光功率为0.1～20mW，激光激发波长为450～800nm，光谱的测量范围为400～3500cm-1。
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