CN103524619B - 针对αVβ6的抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
描述了针对抗原αVβ6的靶向结合剂,例如抗体,以及这些结合剂的应用。特别的,公开了针对抗原αVβ6的全人单克隆抗体。公开了编码核苷酸序列,以及氨基酸序列,所述氨基酸序列包括重链和轻链免疫球蛋白分子,特别地对应形成框架区和/或互补性决定区(CDR)的连续重链和轻链序列的序列,特别是从FR1到FR4,或者CDR到CDR3。还公开了表达这些免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤或者其他细胞系。
Description
本申请是2007年8月2日提交的题为“针对αVβ6的抗体及其应用”的国家申请号为200780037251.5(PCT/US2007/075120)的发明专利申请的分案申请。
本申请要求2006年8月3日提交的美国临时申请60/835,559的优先权,通过参照将其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及针对αVβ6整合蛋白(αVβ6)的单克隆抗体,以及这些抗体的应用。在某些实施方式中,本发明涉及针对αVβ6的全人单克隆抗体。所描述的抗体可以用作诊断剂,以及用于治疗与αVβ6的活性和/或生产过量相关的疾病。
背景技术
整合蛋白超家族包括至少24种由异源二聚体构成的家族成员,其中所述异源二聚体利用18条α链和8条β链(Hynes,(2002)Cell 110:673-87)。该受体家族表达在细胞表面上,并介导细胞-细胞和细胞-胞外基质相互作用,其调节细胞存活、增殖、迁移和分化以及肿瘤侵入和转移(ffrench-Constant and Colognato,(2004)Trends Cell Biol.14:678-86)。整合蛋白结合其他细胞受体、生长因子和胞外基质蛋白质,对于特定的蛋白质,与许多家族成员具有重叠的结合特异性。这种冗余性可以确保在缺失特定的整合蛋白时,重要的功能能够继续(Koivisto等人,(2000)Exp.Cell Res.255:10-17)。然而,每种具有相似特异性的整合蛋白的表达的时间和空间限制已经被报道,并且可能会改变对配体结合的细胞应答(Yokosaki等人,(1996)J.Biol.Chem.271:24144-50;Kemperman等人,(1997)Exp.CellRes.234:156-64;Thomas等人,(2006)J.Oral Pathol.Med.35:1-10)。
根据异源二聚体的配体特异性,整合蛋白家族可以被分成多个子家族。一个子家族由识别并结合RGD三肽的全部整合蛋白构成。这些受体包括αIIb/β3和全部αV异源二聚体(Thomas等人,(2006)J.Oral Pathol.Med.35:1-10)。尽管αV链能够与5种已知的β链配对,但这些β链中的一些仅能够与αV配对。β6链对于与αV异源二聚体化是选择性的,这种配对以或高或低的亲和力结合胞外基质和细胞因子蛋白质。αVβ6结合TGFβ1LAP和TGFβ3LAP潜伏复合物上的RGD基序,并激活它们(Munger等人,(1999)Cell 96:319-328;Annes等人,(2002)FEBS Letters 511:65-68)。然而,它不结合或激活TGFβ2LAP,这不会具有三肽(Ludbrook等人,(2003)Biochem.J.369:311-18)。αVβ6-介导的TGFβ激活需要潜伏TGFβ结合蛋白1(LTBP1),这包括了潜伏TGFβ复合物以及胞外基质。激活被认为是由于所诱导的构型改变,因为TGFβLAP分别被αVβ6和LTBP1保持在细胞和基质之间(Keski-Oja等人,(2004)TrendsCell Biol.14:657-659;Annes等人,(2004)J.CellBiol.165:723-34)。αVβ6对TGFβLAP复合物的皮摩尔尔结合亲和力对于所有其已知的配体是最高的。αVβ6的其他配体包括纤连蛋白、结合腕蛋白、玻璃体结合蛋白和骨桥蛋白(Busk等人,(1992)J.Biol.Chem.267:5790-6;Prieto等人,(1993)PNAS 90:10154-8;Huang等人,(1998)J.Cell.Sci.111(Pt 15):2189-95;Yokosaki等人,(2005)Matrix Biol.24:418-27)。αVβ6与这些胞外基质蛋白的结合亲和力是低亲和力,并且在纳摩尔范围内。
αVβ6整合蛋白的表达被限制在成人中活跃的组织重建区域,具体地在修复伤口的上皮细胞上,以及在侵入肿瘤的边缘(Breuss等人,(1995)J.Cell Sci.108:2241-51)。伤口边缘的角细胞在它们迁移到伤口中的过程中上调αVβ6的表达,但在伤口上皮细胞的边缘已经结合之后仍保持高表达(Breuss等人,(1995)J.Cell Sci.108:2241-51;Haapasalmi等人,(1996)J.Invest.Dermatol.106:42-48)。伤口胞外基质含有纤连蛋白、结合腕蛋白和玻璃体结合蛋白,这些都是αVβ6的抗体(Busk等人,(1992)J.Biol.Chem.267:5790-6;Koivisto等人,(1999)Cell Adhes.Commun.7:245-57;Hakkinen等人,(2000)J.Histochem.Cytochem.48:985-98)。另外,αVβ6上调基质金属蛋白酶MMP-9的表达,MMP-9能够降解IV型胶原并促进细胞运动(Niu等人,(1998)Biochem.Biophys.Res.Com.249:287-91;Agrez等人,(1999)Int.J.Can.81:90-97;Thomas等人,(2001)Int.J.Cancer 92:641-50;Gu等人,(2002)Br.J.Can.87:348-51)。根据其在伤口中的表达特征以及体外研究,αVβ6可以具有在伤口闭合的过程中促进角细胞迁移以及之后通过激活TGFβ而溶解伤口的双重作用。αVβ6激活TGFβ会有助于通过调节重上皮化而溶解伤口,抑制炎症和促进***再生和形成疤痕(Thomas等人,(2006)J.Oral Pathol.Med.35:1-10)。使用β6裸鼠的体内伤口研究表明伤口修复,但在皮肤中存在显著提高的炎症反应。类似的,因为表达其他的整合蛋白家族成员,因此伤口闭合和角细胞不受到αVβ6丢失的影响(Huang等人,(1996)J.CellBiol.133:921-8)。β6裸鼠伤口中的炎性浸润与TGFβ1裸鼠类似,这暗示这种细胞因子的活性不足以抑制在缺失αVβ6时的免疫应答(Shull等人,(1992)Nature359:693-9;Thomas等人,(2006)J.Oral Pathol.Med.35:1-10)。
β6裸鼠在肺部损伤和肾病模型中的分析还鉴定了αVβ6在纤维化中的作用。在争光霉素损伤模型中,β6裸鼠中的肺部纤维化被抑制(Munger等人,(1999)Cell 96:319-328)。这些动物还受到保护免于MMP12依赖性肺气肿类表型(Morris等人,(2003)Nature 422:169-73)。这两种疾病表型都依赖于TGFβ的激活(Munger等人,(1999)Cell 96:319-328)。αVβ6整合蛋白-介导的TGFβ激活的抑制还被猜测会促进早期应答肺部损伤的肺水肿(Pittet等人,(2001)J.Clin.Invest.107:1537-44)。在肾病模型中,β6裸鼠还被保护免于纤维化,在该模型中TGFβ激活对于发生小管间质纤维化损伤是必要的(Ma等人,(2003)Am.J.Pathol.63:1261-73)。
除了其在伤口修复中表达外,αVβ6整合蛋白还在许多人类肿瘤的外周被上调。已经报道αVβ6在口腔中(Breuss等人,(1995)J.Cell Sci.108:2241-51;Jones等人,(1997)J.Oral Pathol.Med.26:63-8;Hamidi等人,(2000)Br.J Cancer 82:1433-40;Regezi等人,(2002)Oral Oncology 38:332-6;Impola等人,(2004)J.Pathol.202:14-22)和皮肤扁平细胞癌以及肺癌(Smythe等人,(1995)Can.Met.Rev.14:229-39)、乳癌(Arhiro等人,(2000)Breast Can.7:19-26)、胰腺癌(Sipos,等人,(2004)Histopathology 45:226-36)、胃癌(Kawashima等人,(2003)Pathol.Res.Pract.199:57-64)、结肠癌(Bates等人,(2005)J.Clin.Invest.115:339-47)、卵巢癌(Ahmed等人,(2002)Carcinogenesis 23:237-44;Ahmed等人,(2002)J.Histochem.Cytochem.50:1371-79)和唾液腺(Westernoff等人,(2005)Oral Oncology 41:170-74)中表达。在这些报道的一些中,αVβ6的表达与提高的肿瘤级别(Ahmed等人,(2002)J.Histochem.Cytochem.50:1371-79;Arihiro等人,(2000)Breast Can.7:19-26),最终转移到***(Kawashima等人,(2003)Pathol.Res.Pract.199:57-64;Bates等人,(2005)J.Clin.Invest.115:339-47),或者预后差(Bates等人,(2005)J.Clin.Invest.115:339-47)相关。大部分充分研究的肿瘤类型是口腔扁平细胞癌,其中研究人员还研究了癌前损伤中的αVβ6,并其表达与发展成恶性有关(Hamidi等人,(2000)Br.J Cancer 82:1433-40)。还在结肠癌中对αVβ6与肿瘤进展之间的联系进行研究,其中整合蛋白的存在与体外模型中的结肠细胞的上皮细胞-间叶细胞转化(EMT)有关(Brunton等人,(2001)Neoplasia 3:215-26;Bates等人,(2005)J.Clin.Invest.115:339-47)。EMT是正常的发育过程,其使得上皮细胞能够离开其产地组织(home tissue),并迁移到新区域(Thiery and Sleeman,(2006)Nat.Rev.Mol.CellBiol.7:131-42)。显著的是蛋白质表达的提高,这促进了细胞的迁移和侵入,例如基质蛋白酶、细胞因子如TGFβ和多种细胞粘附分子包括整合蛋白(Zavadil and Bottinger,(2005)Oncogene 24:5764-5774)。在肿瘤中,特别是侵袭性侵入和转移癌中也已经坚定了EMT标记物的表达。αVβ6促进粘附到间质纤连蛋白上调MMP-9以及其他蛋白酶的表达,并且激活TGFβ的能力表明,其可能有助于恶性细胞的EMT和肿瘤进展(Bates and Mercurio,(2005)Cancer Bio.&Ther.4:365-70)。
人癌症的动物和体外模型已经暗示αVβ6介导促进细胞增殖和凋亡抑制中的信号转导。鉴定了在体外促进在胶原凝胶基质中的αVβ6-转染SW480结肠癌细胞增殖的β6链的C-末端中的残基。与全长β6转染的SW480细胞相比,β6缺失突变体在裸鼠中皮下生长的能力显著降低(Agrez等人,(1994)J.Cell.Biol.127:547-56)。在稳定表达αVβ6的口腔癌细胞系中,与纤连蛋白结合导致β6亚基招募和激活Fyn激酶。下游信号转导导致MMP-3的产生,体外促进细胞增殖,原位模型中的肿瘤侵入以及尾部静脉注射模型中的迁移(Li等人,(2003)J.Biol.Chem.278:41646-53)。
与细胞增殖类似,细胞凋亡的抑制是αVβ6可能促进肿瘤生长的另一种方式。正常的复层鳞状上皮表达αVβ5整合蛋白,但并且在转化成癌症后下调αVβ5整合蛋白表达并上调αVβ6表达。使用过表达αVβ5的癌细胞系,αVβ6表达显示体外防止悬浮诱导的细胞死亡(失巢凋亡(anoikis))(Janes and Watt,(2004)J.Cell Biol.166:419-31)。体外在被顺铂处理的卵巢癌细胞系中观察到了凋亡抑制,这可能代表这些肿瘤体内的药物抗性(Wu等人,(2004)Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi39:112-14)。
许多研究人员开发了治疗剂用于在纤维化和癌症中靶向αVβ6活性。具有对αVβ6、αVβ3和αVβ5整合蛋白特异性的鼠抗体显示在体外防止HT29结肠癌细胞粘附到玻璃体结合蛋白和纤连蛋白(Lehmann等人,(1994)Can.Res.54:2102-07)。对于人αVβ6蛋白特异性的另一种鼠抗体治疗剂被证明小鼠中抑制HSC-3口腔癌细胞在经口腔异种移植肿瘤模型中的侵入生长(Xue等人,(2001)Biochem.Biophys.Res.Com.288:610-18)。使用β6裸鼠模型作为宿主饲养一系列人αVβ6特异性抗体。这些抗体能够阻断TGFβLAP和纤连蛋白体外结合整合蛋白(Weinreb等人,(2004)J.Biol.Chem.279:17875-87)。它们还证明在人咽癌异种移植模型中的显著肿瘤生长抑制(Leone等人,(2003)Proc.of the Am.Assoc.Can.Res.44,Abstract#4069)。
除了阻断抗体的功能外,已经报道了人αVβ6整合蛋白的拟肽抑制剂的形成。该化合物显示抑制UCLAP-3细胞结合纤连蛋白,其IC50在200nM的范围内,并且具有额外的分别以3-20uM范围的IC50阻断αVβ5和αVβ3整合蛋白-介导的细胞结合玻璃体结合蛋白的活性(Goodman等人,(2002)J.Med.Chem.45:1045-51)。
αVβ6最近描述的作用是病毒病原体的细胞受体。其在体外介导结合***病毒和柯萨奇病毒9(Coxsackievirus9)的病毒衣壳,以实现病毒进入(Miller等人,(2001)J.Virol.75:4158-64;Williams等人,(2004)J.Virol.78:6967-73)。***病毒和柯萨奇病毒9的衣壳蛋白含有RGD序列,其被多种整合蛋白家族成员识别。针对αVβ6整合蛋白的抗体阻断两种病原体的病毒进入(Williams等人,(2004)J.Virol.78:6967-73)。
概述
本发明整体上针对靶向结合剂,其结合αVβ6。本发明的实施方式涉及全人靶向结合剂,其特异性结合αVβ6,进而抑制配体结合αVβ6。靶向结合剂还抑制肿瘤细胞粘附。另外,靶向结合剂可以用于减少肿瘤生长。能够达到这一点的机理可以包括但不限于抑制配体结合其受体αVβ6,终止与配体如TGFβ-LAP的相互作用,这样降低了αVβ6的有效浓度。
在本发明的一个实施方式中,靶向结合剂是全人抗体,其结合αVβ6并防止αVβ6结合αVβ6的配体。αVβ6的配体的例子包括TGFβLAP、纤连蛋白、结合腕蛋白、玻璃体结合蛋白和骨桥蛋白。抗体可以以低于35nM、25nM、10nM或60pM的Kd结合αVβ6。
另一个实施方式是全人抗体,其结合αVβ6,并以低达1μg/ml或更低的抗体浓度抑制超过80%、85%、90%或99%的TGFβ-LAP介导的HT29细胞的粘附。
另一个实施方式是全人抗体,其结合αVβ6,并以低于0.070μg/ml的IC50抑制TGFβ-LAP介导的HT29细胞的粘附。
靶向结合剂(即抗体)可以包含重链氨基酸序列,其具有互补性决定区(CDR),所述CDR具有表8或表29中所示序列之一。在一个实施方式中,靶向结合剂可以包含包括表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列任一种的序列。在另一个实施方式中,靶向结合剂可以包含包括表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列任两种的序列(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方式中,靶向结合剂可以包含包括表8或表29中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。注意本领域技术人员容易完成CDR测定。参见,例如Kabat等人,Sequence of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication91-3242,Bethesda MD(1991),vols.1-3。
在另一个实施方式中,靶向结合剂(即抗体)可以包含轻链氨基酸序列,其具有表9或表30中所示的互补性决定区(CDR),CDR1、CDR2或CDR3序列。在另一个实施方式中,靶向结合剂可以包含包括表9或表30中所示的CDR1、CDR2或CDR3序列任两种的序列(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方式中,靶向结合剂可以包含表9或表30中所示CDR1、CDR2和CDR3序列的序列。
本发明的靶向结合剂可以在非抗体分子内包含抗原结合位点,正如下面进一步讨论的,其通常是由非抗体蛋白骨架中的一个或者更多个CDR例如一组CDR提供的。
在另一个实施方式中,靶向结合剂包含包括全人单克隆抗体sc 264 RAD、sc 264RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc 133 TMT、sc 133WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、sc 254、sc 264或者sc 298的CDR1、CDR2或CDR3序列的任一种的序列。
在另一个实施方式中,靶向结合剂包含包括全人单克隆抗体sc 264 RAD、sc 264RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc 133 TMT、sc 133WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、sc 254、sc 264或者sc 298的CDR1、CDR2或CDR3序列的任两种的序列(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。
在另一个实施方式中,靶向结合剂包含全人单克隆抗体sc 264RAD、sc 264 RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc 133 TMT、sc 133 WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、sc 254、sc264或者sc 298的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在本发明的一个实施方式中,靶向结合剂是抗体.在本发明的一个实施方式中,靶向结合剂是是单克隆抗体。在本发明的一个实施方式中,靶向结合剂是全人单克隆抗体。
本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含轻链氨基酸序列,该轻链氨基酸序列包含表9或表30中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任一种。本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含轻链氨基酸序列,该轻链氨基酸序列包含表9或表30中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任两种(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含轻链氨基酸序列,该轻链氨基酸序列包含表9或表30中所示CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中,抗体是全人单克隆抗体。
本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含重链氨基酸序列,该重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任一种。本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含重链氨基酸序列,该重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任两种(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。本发明的另一个实施方式包含抗体,其结合αVβ6,并且包含重链氨基酸序列,该重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR1、CDR2和CDR3序列。在某些实施方式中,抗体是全人单克隆抗体。
本发明的一个实施方式包含全人单克隆抗体sc 264 RAD、sc 264RAD/ADY、sc 188SDM、sc 133、sc 133 TMT、sc 133 WDS、sc 133TMT/WDS、sc 188、sc 254、sc 264或者sc 298的一种或者多种,正如在下面更详细描述的,其特异性结合αVβ6。
另一个实施方式是抗体,其结合αVβ6,并且包含包含轻链氨基酸序列,该轻链氨基酸序列具有包含表9或表30中所示序列之一的CDR。另一个实施方式是抗体,其结合αVβ6,并且包含重链氨基酸序列,该重链氨基酸序列具有包含表8或表29中所示序列之一的CDR。在某些实施方式中,抗体是全人单克隆抗体。
进一步的实施方式是抗体,其结合αVβ6,并且包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列,其中所述重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR序列之一,所述轻链氨基酸序列具有表9或表30中所示CDR序列之一。在某些实施方式中,抗体是全人单克隆抗体。
本发明进一步的实施方式是靶向结合剂(即抗体),其与本发明的抗体竞争结合αVβ6。在一个实施方式中,所述靶向结合剂包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列,其中所述重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR序列的至少一种,所述轻链氨基酸序列具有表9或表30中所示CDR序列的至少一种。
本发明进一步的实施方式是靶向结合剂,其与本发明的抗体结合αVβ6上的相同抗原决定簇。在一个实施方式中,所述靶向结合剂包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列,其中所述重链氨基酸序列包含表8或表29中所示CDR序列的至少一种,所述轻链氨基酸序列具有表9或表30中所示CDR序列的至少一种。
在另一个实施方式中,靶向结合剂包含一种序列,该序列包含表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任一种,以及包含表9或表30中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任一种。在另一个实施方式中,靶向结合剂包含一种序列,该序列包含表8或表29中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任两种,以及包含表9或表30中所示CDR1、CDR2或CDR3序列的任两种(即:CDR1和CDR2,CDR1和CDR3,或者CDR2和CDR3)。在另一个实施方式中,靶向结合剂包含表8或表29中所示CDR1、CDR2和CDR3序列,以及包含表9或表30中所示CDR1、CDR2和CDR3序列。
在某些实施方式中,本发明的结合剂可以在非抗体分子中包含抗原结合位点,正如下面进一步讨论的,其通常是由非抗体蛋白骨架中的一个或者更多个CDR例如一组CDR所提供的。
更进一步的实施方式是抗体,其结合αVβ6,并且包含氨基酸序列,该氨基酸序列具有一个或者更多个矫正突变,在矫正突变处,抗体序列被突变回各自的生殖系序列。例如,抗体可以具有表10~13中任何所示的序列。
本发明进一步提供了检验患者或者患者样品中αVβ6水平的方法,其包括将抗-αVβ6抗体与来自患者的生物样品接触,并检测所述抗体与所述样品中αVβ6之间结合的水平。在更具体的实施方式中,生物样品是血液或血浆。
在其他实施方式中,本发明提供了组合物,其包含靶向结合剂包括抗体或其功能片段,以及药物上可以接受的载体。
本发明更进一步的实施方式包括有效治疗患有αVβ6-相关疾病或者紊乱的动物的方法,其包括选择需要治疗瘤形成或非瘤形成疾病的动物,以及为动物给药特异性结合αVβ6的治疗有效剂量的全人单克隆抗体。
本发明的抗体可以用于治疗αVβ6-相关疾病或者紊乱。αVβ6-相关疾病或者紊乱可以是任何由于αVβ6的异常激活或表达所引起的病症。这类疾病的例子包括αVβ6与其配体异常相互作用的,这样改变了细胞-粘附,或者细胞信号传导性能。这种细胞粘附或细胞信号传导性能的改变能够导致瘤形成疾病。其他αVβ6-相关疾病或紊乱包括炎症紊乱、肺疾病、与纤维化相关的疾病以及与失调的TGF-β相关的任何疾病。
在一个实施例中,αVβ6-相关疾病是瘤形成疾病例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃(胃)癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆(胆管腺癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤和表皮样癌。
在另一个实施例中,αVβ6-相关疾病是炎症紊乱例如炎症性肠病;全身性红斑狼疮;类风湿性关节炎;青少年慢性关节炎;脊柱关节病;***性硬化症例如硬皮病;自发性验证肌病例如皮肤肌炎、多肌炎;干燥综合征(Sjogren′s syndrome);***性血管炎;结节病;甲状腺炎例如Grave′s疾病、淋巴瘤性甲状腺肿、青少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩的甲状腺炎;免疫介导肾病例如血管球性肾炎、小管间质肾炎;中枢神经***和外周神经***的脱髓鞘疾病神经系例如多发性硬化、自发性多神经病;肝胆管疾病例如传染性肝炎例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、及其他嗜肝病毒;自体免疫慢性活动型肝炎;原发性胆汁性肝硬化;肉芽肿性肝炎;和硬化性胆管炎;炎症和纤维化肺疾病(例如囊性纤维化);谷蛋白敏感的肠病;自体免疫或免疫介导皮肤疾病包括大疱性皮疾病、多形性红斑和接触性皮炎、牛皮癣;肺部过敏的疾病例如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、变应性结膜炎和过敏性肺炎、移植相关疾病包括移植排异和移植物抗宿主病。
在另一个实施例中,αVβ6-相关疾病是纤维化例如肾或肺纤维化。
在另一个实施例中,αVβ6-相关疾病与失调的TGF-β相关,包括癌症和***(纤维化)紊乱。
本发明的额外实施方式包括抑制动物中αVβ6诱导的细胞粘附的方法。这些方法包括选择需要治疗αVβ6诱导的细胞粘附的动物,以及为所述动物给药治疗有效剂量的全人单克隆抗体,其中所述抗体特异性结合αVβ6。
本发明进一步的实施方式包括抗体在制备药物中的应用,其中所述药物用于治疗动物中αVβ6相关疾病或者紊乱,其中所述抗体特异性结合αVβ6。
在更进一步实施方式中,本文所描述的靶向结合剂可以用于制备药物,所述药物用于有效治疗动物中αVβ6诱导的细胞粘附,其中所述抗体特异性结合αVβ6。
本文所描述的本发明实施方式涉及单克隆抗体,其结合αVβ6并影响αVβ6功能。其他实施方式涉及全人抗-αVβ6抗体和抗-αVβ6抗体制剂,其具有治疗方面的期望性质,包括对αVβ6的高结合亲和力,体外和体内中和αVβ6的能力,以及抑制αVβ6诱导的细胞粘附和肿瘤生长的能力。
在一个实施方式中,本发明包括抗体,其以非常高的亲和力(KD)结合αVβ6。例如人、兔、小鼠、嵌合或人源化抗体,其能够以低于但不限于10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,10-10或10-11M或任何其范围或数值的Kd结合αVβ6。正如本文所描述的,亲和力和/或亲和性测量可以通过和/或进行测量。
本发明的一个实施方式包括分离的抗体,或这这些抗体的片段,其结合αVβ6。正如本领域已知的,抗体可以是例如多克隆、寡克隆、嵌合、人源化和/或全人抗体。本文所描述的本发明的实施方式还提供了用于生产这些抗体的细胞。
还需要理解本发明的实施方式不限于任何特定的抗体形式或产生或生产的方法。例如,抗-αVβ6抗体可以是全长抗体(例如具有原始人Fc区)或者抗体片段(例如Fab、Fab’或者F(ab’)2、FV或者Dab(Dab是人抗体的最小功能结合单元)。另外,可以从分泌抗体的杂交瘤制造抗体,或者从已经转化或者转染编码抗体的基因或多个基因的重组制备细胞制造抗体。
本发明的其他实施方式包括编码本文所述的任何抗体的分离核酸分子,具有编码抗-αVβ6抗体的分离核酸分子的载体,或者被任何这些核酸分子转化的宿主细胞。另外,本发明的一个实施方式是生产抗-αVβ6抗体的方法,其通过在核酸分子表达的条件下培养宿主细胞以生产抗体,接着回收抗体。需要认识到本发明的实施方式还包括所有编码本发明抗体或抗体片段的核酸分子,其包括为在被转染到宿主细胞中用于生产抗体时能提高抗体或其片段的产量而优化的核酸序列。
进一步的实施方式包括生产对αVβ6高亲和力的抗体的方法,其通过使用人αVβ6或其片段以及一个或者更多个其定向进化同源序列或片段对哺乳动物进行免疫。
其他实施方式是基于产生和鉴定分离的抗体,其特异性结合αVβ6。αVβ6生物活性的抑制能够防止αVβ6诱导的细胞粘附以及其他期望的效果。
本发明的另一个实施方式包括诊断疾病或者病症的方法,其中正如本文所描述制备的抗体被用于检测患者样品中αVβ6的水平。在一个实施方式中,患者样品是血液或者血清。在进一步实施方式中,提供了用于鉴定风险因子、诊断疾病、疾病阶段的方法,其包括使用抗-αVβ6抗体鉴定αVβ6的过表达。
本发明的另一个实施方式包括用于诊断与细胞中αVβ6的表达相关的病症的方法,其通过将血清或者细胞与抗-αVβ6抗体接触,之后检测αVβ6的存在。优选的病症包括αVβ6相关疾病或者紊乱,其包括但不限於瘤形成疾病例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、胶质母细胞瘤和甲状腺瘤、胃癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、唾液腺癌、结肠直肠癌。
在另一个实施方式中,本发明包括包括检验试剂盒,用于检测哺乳动物组织、细胞或者体液中的αVβ6,以筛选αVβ6-相关疾病。该试剂盒包括结合αVβ6的抗体以及用于指示抗体与αVβ6反应(如果存在)的工具。在一个实施方式中,抗体是单克隆抗体.在另一个实施方式中,结合αVβ6的抗体被标记。在另一个实施方式中,抗体是未标记的一级抗体,并且试剂盒进一步包括用于检测一级抗体的工具。在一个实施方式中,用于检测的工具包括抗-免疫球蛋白的标记的二抗。抗体可以被标记物标记,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性核素和射线透不过的材料。
本发明的其他实施方式包括药物组合物,其具有与药物上可以接受的载体或者稀释剂混合的有效量的抗-αVβ6抗体。在另一个实施方式中,抗-αVβ6抗体或者其片段偶联到治疗剂。治疗剂可以是例如毒素或放射性同位素。
另一个实施方式包括用于治疗与患者中αVβ6表达相关的疾病或者症状的方法,其通过为患者给药有效量的抗-αVβ6抗体。抗-αVβ6抗体可以被单独给药,或者与其他抗体或化学治疗药物或放射治疗联合给药。例如,阻断细胞粘附的αVβ6抗体的单克隆、寡克隆或者多克隆混合物可以与显示直接抑制肿瘤细胞增殖的药物联合给药。可以体内进行该方法,并且优选患者是人类患者。在优选的实施方式中,该方法涉及治疗αVβ6相关疾病或者紊乱,其包括但不限于瘤形成疾病例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、胶质母细胞瘤和甲状腺瘤、胃癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、唾液腺癌、结肠直肠癌。
在另一个实施方式中,本发明提供了包括容器的制品。该容器包括含有抗-αVβ6抗体的组合物,以及表示组合物可以用于治疗特征为αVβ6过表达的αVβ6相关疾病或者紊乱的包装***物或者标记。
在某些实施方式中,将抗-αVβ6抗体给药给患者,接着给药清除剂以从血液中除去过多的循环抗体。
另一个实施方式是抗-αVβ6抗体在制备药物中的用途,其中所述药物用于治疗αVβ6-相关疾病或紊乱例如瘤形成疾病、炎症紊乱、纤维化、肺疾病或者与失调的TGF-β的疾病。在一个实施方式中,所述瘤形成疾病包括癌例如乳癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、结肠直肠癌、食道癌、甲状腺癌、胰腺癌、***癌和膀胱癌。在另一个实施方式中,αVβ6相关疾病或紊乱包括但不限于瘤形成疾病例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、肉瘤、头颈癌、间皮瘤、胆(胆管腺癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤和胶质母细胞瘤。
本发明的另一个实施方式是抗-αVβ6抗体在制备药物中的用途,其中所述药物用于治疗炎症或者超增殖疾病包括都不限于关节炎、动脉粥样硬化、过敏性结膜炎。
附图简要描述
图1是线图,其显示纯化的单克隆抗体结合αVβ6以及阻断其结合GST-LAP肽的能力。
图2A和2B是线图,其显示平均等比中项荧光(GMF)作为分子mAb浓度函数的图,其用于评估抗体之一与K562细胞的结合亲和力,所述K562细胞稳定表达人αVβ6抗原。图2A是mAb 188的亲和力数据。图2B显示mAb 264RAD的亲和力数据。
图3A-3E是柱状图,其显示纯化的单克隆抗体在稳定表达αVβ6整合蛋白的293细胞中介导补体依赖细胞毒性的能力。
图4是柱状图,其显示抗体264RAD、133和188SDM抑制肿瘤生长的能力,其使用Detroit-562鼻咽细胞系。
图5是柱状图,其显示将264RAD与264RAD/ADY进行活性的比较。
详细描述
本发明的实施方式涉及靶向结合剂,其结合αVβ6整合蛋白(αVβ6)。在某些实施方式中,结合剂结合αVβ6并且抑制配体结合αVβ6。在一个实施方式中,靶向结合剂是单克隆抗体或者其结合片段。在另一个实施方式中,抗体仅结合β6链,仍能够抑制配体结合αVβ6。
本发明的其他实施方式包括全人抗-αVβ6抗体以及在治疗上有用的抗体制剂。在一个实施方式中,抗-αVβ6抗体制剂具有期望的治疗性能,包括对αVβ6的强结合亲和力,以及体外抑制TGFβLAP介导的细胞粘附的能力。
本发明的实施方式还包括抗-αVβ6抗体的全人分离的结合片段。在一个实施方式中,结合片段来自全人抗-αVβ6抗体。示例性的片段包括Fv、Fab’或者其他下面更详细描述的公知抗体片段。本发明的实施方式还包括表达针对αVβ6的全人抗体的细胞。细胞的例子包括杂交瘤或者重组形成的细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO细胞的变体(例如DG44)以及NS0细胞,其产生针对αVβ6的抗体。关于CHO细胞变体的其他信息可见于Andersenand Reilly(2004)CurrentOpinion in Biotechnology 15,456-462,通过参照将其整体并入本文。
另外,本发明的实施方式包括使用这些抗体治疗αVβ6-相关疾病或者紊乱的方法。αVβ6-相关疾病或者紊乱可以是任何由于αVβ6的异常激活或表达而发生的病症。这类疾病的例子包括αVβ6与其配体异常相互作用的,这样改变了细胞-粘附,或者细胞信号传导性能。这种细胞粘附或细胞信号传导性能的改变能够导致瘤形成疾病。其他αVβ6-相关疾病或紊乱包括炎症紊乱、肺疾病、与纤维化相关的疾病以及与失调的TGF-β相关的任何疾病。
在一个实施例中,αVβ6-相关疾病是瘤形成疾病,例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃(胃)癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆(胆管腺癌)、小肠腺癌、小儿恶性肿瘤和表皮样癌。
αVβ6-相关疾病是炎症紊乱例如炎症性肠病;全身性红斑狼疮;类风湿性关节炎;青少年慢性关节炎;脊柱关节病;***性硬化症例如硬皮病;自发性验证肌病例如皮肤肌炎、多肌炎;干燥综合征(Sjogren′s syndrome);***性血管炎;结节病;甲状腺炎例如Grave′s疾病、淋巴瘤性甲状腺肿、青少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩的甲状腺炎;免疫介导肾病例如血管球性肾炎、小管间质肾炎;中枢神经***和外周神经***的脱髓鞘疾病神经系例如多发性硬化、自发性多神经病;肝胆管疾病例如传染性肝炎例如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、及其他嗜肝病毒;自体免疫慢性活动型肝炎;原发性胆汁性肝硬化;肉芽肿性肝炎;和硬化性胆管炎;炎症和纤维化肺疾病(例如囊性纤维化);谷蛋白敏感的肠病;自体免疫或免疫介导皮肤疾病包括大疱性皮疾病、多形性红斑和接触性皮炎、牛皮癣;肺部过敏的疾病例如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维化、变应性结膜炎和过敏性肺炎、移植相关疾病包括移植排异和移植物抗宿主病。
在另一个实施例中,αVβ6-相关疾病是纤维化例如肾或肺纤维化。
在另一个实施例中,αVβ6-相关疾病与失调的TGF-β相关,包括癌症和***(纤维化)紊乱。
本发明的其他实施方式包括诊断检验,用于特异性确定生物样品中αVβ6的量。该检验试剂盒可以包括抗-αVβ6抗体以及检验这类抗体所必要的标记。这些诊断检验能够用于筛选αV相关疾病或者β6紊乱包括但不限于瘤形成疾病,例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、胶质母细胞瘤和甲状腺瘤、胃癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、唾液腺癌、结肠直肠癌。
本发明的另一个方面是αVβ6生物活性的拮抗剂,其中所述拮抗剂结合αVβ6。在一个实施方式中,拮抗剂是靶向结合剂,例如抗体。拮抗剂可以结合:
i)仅β6;
ii)αVβ6;或
iii)αVβ6/配体复合物,
或这些的组合。在一个实施方式中,抗体能够在体外和体内拮抗αVβ6的生物活性。抗体可以选自全人单克隆抗体例如sc 264 RAD、sc 264 RAD/ADY、sc 188 SDM、sc 133、sc133 TMT、sc 133 WDS、sc 133 TMT/WDS、sc 188、sc 254、sc 264或者sc 298或者其变体。
在一个实施方式中,αVβ6生物活性的拮抗剂可以结合αVβ6,并因此防止TGFβLAP介导的细胞粘附。
一个实施方式是抗体,其与全人单克隆抗体sc 264 RAD,sc 264 RAD/ADY,sc 188SDM,sc 133,sc 133 TMT,sc 133 WDS,sc 133 TMT/WDS,sc 188,sc 254,sc 264或者sc298结合相同的抗原决定簇或多个抗原决定簇。
在一个实施方式中,靶向结合剂以低于100纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。靶向结合剂可以以低于35纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。靶向结合剂可以以低于25纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。靶向结合剂可以以低于10纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。在另一个实施方式中,靶向结合剂以低于60皮摩尔(pM)的Kd结合αVβ6。
一个实施方式是分泌抗体的浆细胞,其产生正如本文上面所描述的抗体的轻链和/或重链。在一个实施方式中,该浆细胞产生全人单克隆抗体的轻链和/或重链。在另一个实施方式中,该浆细胞产生全人单克隆抗体全人单克隆抗体sc 264 RAD,sc 264 RAD/ADY,sc 188 SDM,sc 133,sc 133 TMT,sc 133 WDS,sc 133 TMT/WDS,sc 188,sc 254,sc 264或者sc 298的轻链和/或重链。可替换的,该浆细胞可以产生抗体,其结合与全人单克隆抗体sc c 264 RAD,sc 264 RAD/ADY,sc 188 SDM,sc 133,sc 133 TMT,sc 133 WDS,sc 133TMT/WDS,sc 188,sc 254,sc 264或者sc 298相同的抗原决定簇或多个抗原决定簇。
另一个实施方式是核酸分子,其编码正如本文上面所描述的抗体的轻链或者重链。在一个实施方式中,该核酸分子编码全人单克隆抗体的轻链或者重链。另一个实施方式是核酸分子,其编码选自抗体sc 264 RAD,sc 264 RAD/ADY,sc 188 SDM,sc 133,sc 133TMT,sc 133 WDS,sc 133 TMT/WDS,sc 188,sc 254,sc 264或者sc 298的全人单克隆抗体的轻链或者重链。
本发明的另一个实施方式是含有正如本文所描述核酸分子或者多个核酸分子的载体,其中所述载体编码在上文中所限定的抗体的轻链和/或重链。
本发明的另一个实施方式是包含正如上文所描述的载体的宿主细胞。可替换的,宿主细胞可以包含超过一个载体。
另外,本发明的一个实施方式是生产抗体的方法,其通过在核酸分子被表达的条件下培养宿主细胞以生产抗体,接着回收抗体。
在一个实施方式中,本发明包括制备抗体的方法,其通过为至少一种宿主细胞转染至少一种编码正如本文上面所描述的抗体的核酸分子,在宿主细胞中表达该核酸分子,以及分离所述抗体。
根据另一个方面,本发明包括拮抗αVβ6生物活性的方法,其包括给药本文所描述的拮抗剂。该方法还包括选择需要治疗αVβ6相关疾病或者紊乱的动物,以及为该动物给药治疗有效剂量的αVβ6生物活性的拮抗剂。
本发明的另一个方面包括拮抗αVβ6生物活性的方法,其包括给药本文上文所描述的抗体。该方法可以包括选择需要治疗αVβ6相关疾病或者紊乱的动物,以及为该动物给药治疗有效剂量的拮抗Vβ6生物活性的抗体。
根据另一个方面,提供了治疗哺乳动物中αVβ6相关疾病或者紊乱的方法,其包括给药治疗有效量的αVβ6生物活性的拮抗剂。该方法可以包括选择需要治疗αVβ6相关疾病或者紊乱的动物,以及为所述动物给药治疗有效剂量的αVβ6生物活性的拮抗剂。
根据另一个方面,提供了一种治疗哺乳动物中αVβ6疾病或者紊乱的方法,其包括给药治疗有效量的抗体,所述抗体拮抗αVβ6的生物活性。该方法可以包括选择需要治疗αVβ6相关疾病或者紊乱的动物,以及为所述动物给药治疗有效剂量的拮抗Vβ6生物活性的抗体。该抗体可以单独给药,或者与其他抗体或化学治疗药物或放射治疗联合给药。
根据另一个方面,提供了治疗哺乳动物中癌症的方法,其包括给药治疗有效量的αVβ6生物活性的拮抗剂。该方法可以包括选择需要治疗癌症的动物,以及为所述动物给药治疗有效剂量的拮抗αVβ6生物活性的拮抗剂。拮抗剂可以单独给药,或者与其他抗体或化学治疗药物或放射治疗联合给药。
根据另一个方面,提供了一种治疗哺乳动物中癌症的方法,其包括给药治疗有效量的拮抗αVβ6生物活性的抗体。该方法可以包括选择需要治疗癌症的动物,以及为所述动物给药治疗有效量的拮抗αVβ6生物活性的抗体。该抗体可以单独给药,或者与其他抗体或化学治疗药物或放射治疗联合给药。
根据本发明的另一个方面,提供了αVβ6生物活性的拮抗剂用于制备药物的用途,所述药物用于治疗αVβ6相关疾病或者紊乱。
根据本发明的另一个方面,提供了拮抗αVβ6生物活性的抗体用于制备药物的用途,所述药物用于治疗αVβ6相关疾病或者紊乱。
在优选的实施方式中,本发明特别适于用于在肿瘤患者中拮抗αVβ6,所述肿瘤单独或部分依赖αVβ6整合蛋白。
本发明的另一个实施方式包括检验试剂盒,用于在哺乳动物组织、细胞或者体液中检测αVβ6,用于筛选αVβ6相关疾病或者紊乱。试剂盒包括结合αVβ6的抗体,以及用于指示抗体与αVβ6的反应(如果存在)的工具。抗体可以是单克隆抗体。在一个实施方式中,结合αVβ6抗体被标记。在另一个实施方式中,抗体是未标记的一级抗体,并且试剂盒进一步包括用于检测一级抗体的工具。在一个实施方式中,用于检测的工具包括抗-免疫球蛋白的标记的二抗。抗体可以被标记物标记,所述标记物选自荧光染料、酶、放射性核素和射线透不过的材料。
关于抗-αVβ6抗体的进一步实施方式、特征等在下面被更详细地提供。
序列表
本发明的实施方式包括在下表1中所列出的具体抗-αVβ6抗体。该表报道了每种抗-αVβ6抗体的识别号,以及相应重链和轻链基因的可变区的SEQ ID NO号。每种抗体均被提供了识别号,其包括接着数字的字母“sc”。
表1
定义
除非以其他方式说明,否则本文中所使用的科技术语都具有本领域技术人员通常理解的含义。而且,除非本文由特别要求,否则单数术语应该包括复数形式,而复数术语也应该包括单数形式。通常,结合本文所述细胞和组织培养技术、分子生物学和蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学以及杂交所使用的命名是本领域中公知并且通常使用的。
使用标准的技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质转染)。根据制造商的说明书或者根据本领域中所通常进行的,或者根据本文所描述的进行酶反应和纯化技术。前述技术和程序是通常根据本领域中公知的或者本申请中所引用和讨论的各种概括性和更具体的参考文献中所描述的常规方法而进行的。参见,例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)),通过参照将其并入本文。结合本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学所使用的命名及其试验程序和技术是本领域技术人员公知的。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送、以及治疗患者。
在根据本文使用时,除非以其他方式说明,否则下列术语需要理解成具有下列含义:
本文所使用的术语“和/或”需要被看作为具体公开两种所限定特征或组分的每一种(连同或者没有另一种)。例如“A和/或B”需要被看作具体公开了(i)A、(ii)B以及(iii)A和B的每一种,如同每一种都是在本文中单独列出一样。
拮抗剂可以是多肽、核酸、糖类、脂类、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干扰(RNAi)、反义、重组蛋白、抗体或其缀合物或融合蛋白。RNAi的综述参见Milhavet O,GaryDS,Mattson MP.(Pharmacol Rev.2003 Dec;55(4):629-48.综述),反义参见OpalinskaJB,Gewirtz AM.(Sci STKE.2003 Oct 28;2003(206):pe47.)。
“αVβ6”的疾病-相关异常激活或者表达可以是任何异常、不期望的或者病理性细胞粘附,例如肿瘤-相关细胞粘附。细胞粘附-相关疾病包括但不限于非实体瘤例如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤,以及实体瘤例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、胶质母细胞瘤、甲状腺瘤、胆管癌、骨癌、胃癌、脑/CNS癌、头颈癌、肝***癌、胃癌、***癌、乳癌、肾癌、睾丸癌、卵巢癌、皮肤癌、***、肺癌、肌肉癌、神经元癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、子宫癌、***癌、子宫内膜癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胸膜/腹膜癌、唾液腺癌和表皮癌。
化合物是指分子量低于大约2000道尔顿的小分子量化合物。
术语“αVβ6”是指由αV链和β6链构成的异源二聚体整合蛋白分子。
在提到靶向结合剂例如抗体时,术语“中和”涉及所述靶向结合剂消除或者显著讲题靶抗原的能力。因此,抗-αVβ6“中和”抗体能够消除或者显著降低αVβ6的活性。αVβ6中和抗体可以例如通过阻断TGFβLAP结合整合蛋白αVβ6而发挥作用。通过阻断该结合,αVβ6介导的细胞粘附被显著或者完全消除。理想地,针对αVβ6的中和抗体抑制细胞粘附。
本文所使用的术语“分离的多核苷酸”的意思应该是已经从其天然存在环境分离的多核苷酸。这类核苷酸可以是基因组的、cDNA或合成的。分离的多核苷酸优选不与它们天然状态结合的多核苷酸的全部或者一部分结合。分离的多核苷酸可以可操作地链接到天然状态时不连接的另一种多核苷酸。另外,分离的多核苷酸优选不作为较大序列的一部分而天然存在。
本文所提到的术语“分离的蛋白质”的意思是一种蛋白质,其已经从其天然存在的环境被分离。这类蛋白质可以来自于基因组DNA、cDNA、种族DNA、重组RNA或者合成来源、或者其某些组合,其利用其来源或者衍生源,“分离的蛋白质”(1)不与天然发现的蛋白质结合,(2)不含其他相同来源的蛋白质,例如不含鼠蛋白,(3)是由来自不同物种的细胞表达的,或者(4)不在天然存在。
本文所使用的术语“多肽”是作为通用术语指的是原始蛋白质、多肽序列的片段或类似物。因此,原始蛋白质、片段和类似物是多肽种类的类别。本发明优选的多肽包括人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子,以及通过组合形成的抗体分子,该组合包括重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子,例如κ或λ轻链免疫球蛋白分子,反之亦然,以及其片段和类似物。本发明优选的多肽还仅包括人重链免疫球蛋白分子或其片段。
本文所使用的术语“天然存在”在用于对象时,是指该对象可以在自然界中发现的事实。例如,可以从天然来源中分离,并且其已经在实验室中被人故意或者其他方式修饰的在生物体(包括病毒)中存在的多肽或者多核苷酸序列是天然存在的。
本文所使用的术语“可操作连接”是指所描述的组分的位置能使其以它们期望模式发挥功能。例如,“可操作连接”到编码序列的控制序列被以一种在与控制序列兼容的条件下达到表达编码序列的方式进行连接。
本文所提到的术语“多核苷酸”的意思是聚合物形式的核苷酸,其长度为至少10个见机,可以是核糖核苷酸或者脱氧核糖核酸或者任何类型核苷酸的修饰形式,或者RNA-DNA异源双链体。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文所提到的术语“寡核苷酸”包括天然存在的和经修饰的核苷酸,其通过天然存在和非天然存在的键连接在一起。寡核苷酸是多核苷酸的子集,其通常包括200个碱基或更少的长度。优选,寡核苷酸长度为10~60个碱基,最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19、或者20~40个碱基。寡核苷酸通常是单链的,例如用作探针;尽管寡核苷酸可以是双链的,例如用于构建基因突变。寡核苷酸可以是正义或反义寡核苷酸。
本文所提到的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文所提到的术语“修饰的核苷酸”包括具有经修饰或经取代的糖基等的核苷酸。本文所提到的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate,phosphoraniladate、氨基磷酸盐等。参见,例如LaPlanche等人,Nucl.Acids Res.14:9081(1986);Stec等人,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stein等人,Nucl.Acids Res.16:3209(1988);Zon等人,Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991);Zon等人,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,Oxford University Press,Oxford England(1991));Stec等人,美国专利No.5,151,510;Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990),通过参照将其公开内容并入本文。如果期望,寡核苷酸可以包含用于检测的标记。
本文所提到的术语“选择性杂交”的意思是检测性和特异性结合。在使得与非特异性核酸的可检测结合的可感知量最小化的杂交和清洗条件下,多核苷酸、寡核苷酸及其片段选择性地与核酸链杂交。正如本领域已知的和本文所讨论的,高严格条件可以用于达到选择性杂交条件。通常多核苷酸、寡核苷酸或者抗体片段和感兴趣的核酸序列之间的核酸序列同源性为至少80%,更典型的优选至少85%、90%、95%、99%和100%的渐增同源性。
术语“CDR区”或者“CDR”是为了表示免疫球蛋白重链和轻链的高变区,如Kabat等人,1991(Kabat,E.A.等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition.US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington)以及后来版本所定义的。典型地,抗体含有3个重链CDR和3个轻链CDR。本文所使用的术语CDR或者多个CDR是为了根据情况表示这些区域中的一个或者多个,或者甚至这些区域中的全部,其含有大部分负责以抗体的亲和力结合其所识别的抗原或者抗原决定簇的氨基酸残基。
在六种短CDR序列中,重链的第三CDR(HCDR3)具有较大的尺寸可变性(较大的多样性基本上是由于产生该CDR的基因的排列机理)。其可以短至2个氨基酸,尽管已知最长尺寸是26个。CDR长度也可以根据特定的基本框架能够容纳的长度而变化。功能上,HCDR3在确定抗体的特异性方面发挥部分作用(Segal等人,PNAS,71:4298-4302,1974,Amit等人,Science,233:747-753,1986,Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901-917,1987,Chothia等人,Nature,342:877-883,1989,Caton等人,J.Immunol.,144:1965-1968,1990,Sharon等人,PNAS,87:4814-4817,1990,Sharon等人,J.Immunol.,144:4863-4869,1990,Kabat等人,J.Immunol.,147:1709-1719,1991)。
本文所提到的术语“CDR组”包含CDR1、CDR2和CDR3。因此一组HCDR指HCDR1、HCDR2和HCDR3(HCDR指可变的重链CDR),一组LCDR指LCDR1、LCDR2和LCDR3(LCDR指可变的轻链CDR)。除非以其他方式说明,“CDR组”包括HCDR和LCDR。
如果在其序列之间存在部分或完全一致,则两条氨基酸序列是“同源”的。例如,85%同源性的意思是在将两条序列进行比对获得最大配对时,85%的氨基酸是一致的。在最大匹配中允许存在缺口(在匹配的两条序列的任一个中),优选5或更小的缺口长度,更优选2或更小。可替换的并优选,在本文中使用该术语时,如果使用程序ALIGN它们具有超过5的比对评分(以标准偏差单位)并且具有突变数据矩阵和6或更大的缺口罚分,则两条蛋白质序列(或多肽序列来自于长度为至少30个氨基酸)是同源的。参见Dayhoff,M.O.,inAtlas of Protein Sequence and Structure,pp.101-110(Volume 5,NationalBiomedical Research Foundation(1972))以及该卷的Supplement 2,pp.1-10。更优选,如果在使用ALIGN程序进行最佳比对时,它们的氨基酸大于或等于50%一致,则这两条序列或其部分是同源的。需要理解,在两条定向进化同源序列中可以存在不同的同源区域。例如,小鼠和人定向进化同源的功能位点可以具有比非功能区高的同源程度。
本文所使用的术语“对应”的意思是与参照多核苷酸序列的全部或者一部分相比,多核苷酸序列是同源的(即一致、不是严格进化上相关的),或者多肽序列与参照多肽序列一致。
作为对比,本文所使用的术语“互补”的意思是互补序列与参照多核苷酸序列的全部或者一部分同源。例如,核苷酸序列“TATAC”对应参照序列“TATAC”,并与参照序列“GTATA”互补。
术语“序列同一性”的意思是经过比较,两条多核苷酸或者氨基酸序列是一致的(即在核苷酸-核苷酸或者残基-残基基础上)“序列同一性百分比”是通过在比较后通过比较两条最佳比对的序列进行计算的,其确定了一致核苷酸碱基位点的数目(例如A,T,C,G,U,或者I)或者两条序列中都存在的氨基酸残基的数目已得到匹配的位点的数目,并将匹配的位点的数目初一比对窗(comparison window)中位点的总数目(即窗口尺寸(windowsize)),并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。本文所使用的术语“基本一致”表示多核苷酸或者氨基酸序列的特征,其中多核苷酸或者氨基酸包含一种序列,该序列在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位点的比较窗上与对比序列相比具有至少85的序列同一性百分比,优选至少80~95序列同一性百分比,更有选至少99的序列同一性百分比,通常比较窗口为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位点,其中序列同一性百分比是通过在比较窗上将参照序列与可能包含缺失或添加的序列进行比较而计算的,其中所述确实或添加占参照序列的20%或更低。参照序列可以是较大序列的子集。
本文所使用的,20种常规氨基酸以及它们的缩写遵循常规用途。参见Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),通过参照将其并入本文。20种常规氨基酸的立体异构物(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-双取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适当组分。非常规氨基酸的例子包括:4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似氨基酸或亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。根据标准的用途和惯例,在本文所使用的多肽符号中,左手方向是氨基末端方向,右手方向是羧基末端方向。
类似的,除非以其他方式限定,单链多核苷酸序列的左手末端是5’末端,双链多核苷酸序列的左手方向是指5’方向。新生RNA转录子的5’至3’添加方向被称作转录方向;DNA链上与RNA具有相同序列并且处于RNA转录子5’末端的5’处的序列区域被称作“上游序列”,在DNA链上RNA具有相同序列并且处于RNA转录子3’末端的3’处的区域被称作“下游序列”。
在用于多肽是,术语“基本一致”的意思是两条链在被最佳比对(例如通过程序GAP或使用默认缺口重量的BESTFIT),共享至少80%的序列同一性,优选至少90%的序列同一性,更优选至少95%的序列同一性,最优选至少99%的序列同一性。优选,不一致的位置的区别在于保守氨基酸的替代。保守氨基酸替代是指是在具有类似侧链的可以互换的氨基酸。例如,一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸;一组具有含酰胺基的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和丝氨酸;一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替代基团是:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文所论述到的抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小变异也认为被本发明所涵盖,条件是氨基酸序列的变异保持与本文所述抗体或免疫球蛋白分子有至少75%、更优选至少80%、90%、95%、更优选99%的序列同一性。具体的说,构思了保守氨基酸氨基酸替代。保守替代是在具有相关侧链的一族氨基酸当中发生的替代。遗传编码的氨基酸通常分成以下几族:(1)酸性氨基酸=天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性氨基酸=赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性氨基酸=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和(4)不带电极性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的氨基酸族是:丝氨酸和苏氨酸是脂族羟基族氨基酸;天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺族氨基酸;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸是脂族氨基酸;而苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸。例如,有理由认为,用异亮氨酸或缬氨酸单独替代亮氨酸、用谷氨酸单独替代天冬氨酸、用丝氨酸单独替代苏氨酸或者用结构相关的氨基酸进行类似的氨基酸替代,不会对所产生的分子的结合功能或特性有重大影响,尤其是如果该替代不涉及到构架位点当中的氨基酸的话。
氨基酸变化是否会导致产生功能肽,这可容易地通过测定该多肽衍生物的比活性来确定。测定法在本文中有详细描述。本领域普通技术人员可容易地制备出抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基末端和羧基末端出现在功能结构域的边界近旁。结构和功能结构域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私有的序列数据库进行比较来鉴定。优选地,使用计算机化比较方法来鉴定在其它已知结构和/或功能的蛋白质中出现的序列基序或被预测蛋白质构象域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是公知的。Bowie等人.Science 253:164(1991)。因此,前述的实例证明,本领域技术人员能识别出可用来确定与本文所述的抗体一致的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
本发明进一步的方面是靶向结合剂或抗体分子,其包含VH结构域,该VH结构域与表1、所附序列表、本文所描述的抗体所显示任何抗体的VH结构域或者与表8或表29中所示HCDR(例如HCDR1,HCDR2,或者HCDR3)具有至少大约60、70、80、85、90、95、98或者大约99%氨基酸序列同一性。任选地,靶向结合剂或抗体分子还可以包含VL结构域,该VL结构域与表1、所附序列表、本文所描述的抗体所显示任何抗体的VL结构域或者与表9或表30中所示LCDR(例如LCDR1,LCDR2,或者LCDR3)具有至少大约60、70、80、85、90、95、98或者大约99%氨基酸序列同一性。可以用于计算两条氨基酸序列%同一性的算法包括例如BLAST(Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:405-410),FASTA(Pearson and Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448),或者Smith-Waterman算法(Smith and Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197),例如采用默认参数。在某些实施方式中,与上述具有氨基酸序列同一性,表现出与参照抗体基本上相同活性的靶向结合剂或抗体分子。例如,基本上相同的活性包含与参照抗体活性差异不超过大约50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、1%或者更少的至少一种活性。
通常抗原结合位点是由可变重链(VH)和可变轻链(VL)免疫球蛋白结构域形成的,其具有6个表面多肽环(被称作互补性决定区(CDR))形成的抗原结合界面。在每个VH中存在3种CDR(HCDR1,HCDR2,HCDR3),每个VL中存在3种CDR(LCDR1,LCDR2,LCDR,连同框架区(FR)。
典型的,VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原-结合位点,尽管也可以单独使用VH或者VL结构域来结合抗原。VH结构域(例如来自表1)可以与VL结构域(例如来自表1)配对,以便形成包含VH和VL结构域的抗体抗原-结合位点。对于本文所公开的其他VH和VL结构域,提供了类似的实施方式。在其他实施方式中,表8或表29中的VH链与异源VL结构域配对。现有技术中已经充分建立的轻链搀杂物(promiscuity)。同样,对于本文所公开的其他VH和VL结构域,提供了类似的实施方式。因此,亲代或任何表9或表30中抗体链的VH可以与亲代或任何表1或其他抗体的VL配对。
抗原结合位点可以包含亲代或任何表1中抗体的H和/或LCDR,其中在所公开的一组H和/或L CDR中存在20、16、10、9或更少例如1、2、3、4或5个氨基酸添加、替代、缺失和/或***。可替换的,抗原结合位点可以包含一组亲代或任何表1中抗体的H和/或LCDR,其中在所公开的一组H和/或L CDR中存在20、16、10、9或更少例如1、2、3、4或5个氨基算替代。可以在CDR组的任何残基有效地形成这些修饰。
优选的氨基酸替代是这样的替代:(1)能减少对蛋白酶解的易感性,(2)能减少对氧化的易感性,(3)能改变形成蛋白质复合物所需的结合亲和力,(4)能改变结合亲和力和(4)能赋予或修饰这种类似物的其它理化或功能特性。类似物可包括天然肽序列之外的序列所成的各种突变蛋白质。例如,可在天然序列中(优选在多肽的位于形成分子间接触的结构域外部的部分中)作出单个或多个氨基酸替代(优选保守氨基酸替代)。保守氨基酸替代不应实质上改变母体序列的结构特性(例如替代的氨基酸不应趋向于毁坏母体序列中出现的螺旋,或者破坏其它类型的表征母体序列的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton,Ed.,W.H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to Protein Structure(C.Branden and J.Tooze,eds.,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))和Thornton等人.Nature 354:105(1991),通过参照将这些文献并入本文中。
本发明进一步的方面是抗体分子,其包含VH结构域,该VH结构域与表1、所附序列表、本文所描述的抗体所显示任何抗体的VH结构域或者与表8或表29中所示HCDR(例如HCDR1,HCDR2,或者HCDR3)具有至少大约60、70、80、85、90、95、98或者大约99%氨基酸序列同一性。任选地,抗体分子还可以包含VL结构域,该VL结构域与表1、所附序列表、本文所描述的抗体所显示任何抗体的VL结构域或者与表9或表30中所示LCDR(例如LCDR1,LCDR2,或者LCDR3)具有至少大约60、70、80、85、90、95、98或者大约99%氨基酸序列同一性。可以用于计算两条氨基酸序列%同一性的算法包括例如BLAST(Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:405-410),FASTA(Pearson and Lipman(1988)PNAS USA 85:2444-2448),或者Smith-Waterman算法(Smith and Waterman(1981)J.Mol Biol.147:195-197),例如采用默认参数。
本发明VH和VL结构域以及CDR变体包括氨基酸顺序被此处列出的那些,以及可以被用于αVβ6靶向剂和抗体的那些可以通过序列改变或突变以及筛选具有期望特征的抗原靶向的方法而获得。期望的特征的例子包括但不限于:相对于认识对于抗原特异性的抗体,对抗原的结合亲和力提高;相对于对于抗原特异性的已知抗体(如果活性已知),中和抗原的活性提高;在具体的摩尔比下,与抗原的已知抗体或配体具有特定的竞争能力;形成免疫沉淀复合物的能力;结合特定抗原决定簇的能力;线性抗原决定簇例如使用本文所述的肽-结合扫描所鉴定的肽序列,例如使用以线性和/或约束性构型筛选的肽;由不连续残基形成的构型抗原决定簇;调节αVβ6或下游分子的新生物活性的能力。本文也提供了这些方法。
本文所公开的抗体分子的变体可以在本文中产生和使用。根据计算化学中将多元数据分析技术应用与结构/性能-活性关系(Wold,等人,Multivariate data analysis inchemistry.Chemometrics-Mathematics and Statistics in Chemistry(Ed.:B.Kowalski),D.Reidel Publishing Company,Dordrecht,Holland,1984)的教导,可以使用公知的数学技术得出定量活性性质关系,例如统计回归、模式识别和分类(Norman等人,Applied Regression Analysis.Wiley-Interscience;3rd edition(April 1998);Kandel,Abraham&Backer,Eric.Computer-Assisted Reasoning in ClusterAnalysis.Prentice Hall PTR,(May 11,1995);Krzanowski,Wojtek.P rinciples ofMultivariate Analysis:A User’s Perspective(Oxford Statistical Science Series,No 22(论文)).Oxford University Press;(December 2000);Witten,Ian H.&Frank,Eibe.Data Mining:Practical Machine Learning Tools and Techniques with JavaImplementations.Morgan Kaufmann;(October11,1999);Denison David G.T.(Editor),Christopher C.Holmes,Bani K.Mallick,Adrian F.M.Smith.Bayesian Methods forNonlinear Classification and Regression(Wiley Series in Probability andStatistics).John Wiley&Sons;(July 2002);Ghose,Arup K.&Viswanadhan,VellarkadN.Combinatorial Library Design and Evaluation Principles,Software,Tools,andApplications in Drug Discovery)。可以从经验和理论模型得出抗体序列、功能和三维结构的性质(例如,分析可能接触的残基或者计算的理化性质),这些性质可以单独或者联合地被考虑。
由VH结构域和VL结构域构成的抗体抗原结合位点典型地由6条多肽环形成:3个来自轻链可变结构域(VL),3个来自重链可变结构域(VH)。已知原子结构的抗体分子已经说明序列和抗体结合位点的三维结构之间的关系。这些关系意味着,除了VH结构域中的第三个区(环)之外,结合位点环具有少量主链构型之一:正则结构。在特定环中形成的正则结构已经显示是由其尺寸以及在环和框架区中的关键位点处存在某些氨基酸决定的。
这种序列-结构联系的研究可以用于预测已知序列的抗体中的那些残基,而不是未知三维结构的,其对于维持抗体CDR环的三维结构进而维持结合特异性是重要的。可以通过将预测与来自引导优化实验的结果进行比较,而支持这些预测。在结构途径中,可以使用任何自由获得或者商业购得的包形成抗体分子的模型。例如WAM。接着可以使用蛋白质可视化和分析软件包例如Insight II(Accelrys,Inc.)或者Deep View以评估CDR中每个位点的可能替代。接着,可以将该信息用于制造类似的替代以对活性具有最低或者有利的影响。
在CDR、抗体、VH或VL结构域和/或结合剂的氨基酸序列中制造替代所需的技术是本领域中通常可以利用的。可以制造变体序列,其中可以或者不可以被预测的替代对活性具有最小的影响或者有利的影响,并且所述变体序列进行测试其结合和/或中和的能力和/或其他期望的性能。
正如所讨论的,根据本发明可以采用序列被具体公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。
本文所用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但剩余的氨基酸序列与从例如全长cDNA序列推导的天然存在序列中的对应位置相同的多肽。片段的长度通常是至少大约5、6、8或10个氨基酸,优选至少大约14个氨基酸,更优选至少大约20个氨基酸,往往至少大约50个氨基酸,甚至更优选至少大约70个氨基酸。本文所用的术语“类似物”指由至少大约25个氨基酸的这样的区段所组成的多肽,该区段与推导的氨基酸序列的一部分具有实质同一性,且具有至少以下特性之一:(1)在适当的结合条件下特异性结合αVβ6,(2)阻断适当配体/αVβ6结合的能力,或者(3)抑制αVβ6活性的能力。典型地,与天然存在序列相比,多肽类似物包含保守氨基酸替代(或添加或者缺失)。典型地,类似物长至少20个氨基酸,优选至少50个氨基酸或更长,且往往可与全长天然存在的多肽一样长。
肽类似物常常在制药工业中用作其特性类似于模板肽的特性的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“拟肽”。Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986);Veber and Freidinger TINS p.392(1985)和Evans等人.J.Med.Chem.30:1229(1987),通过参照将其并入本文。这种化合物往往是借助计算机化分子建模来开发的。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用来产生等同的治疗或预防效果。通常,拟肽在结构上类似于典范多肽(即具有生化特性或药理活性的多肽)如人抗体,但有一个或多个肽键任选被以下的键用本领域公知方法取代:--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--。可采取将共有序列的一个或多个氨基酸用相同类型的D-氨基酸进行***性替代(例如D-赖氨酸替代L-赖氨酸),来产生更加稳定的肽。另外,包含共有序列或实质上相同的共有序列变异的受约束肽(constrained peptide)可用本领域公知的方法产生(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),其通过引用结合到本文中);例如,通过加入能够形成将肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基来产生。
本文所使用的术语“抗体”是指多肽或者一组多肽,其由至少一个通过多肽链的折叠形成的结合结构域,其具有三维结合空间,其中内部表面形状和电荷分布与抗原的抗原决定子的特征互补。典型地,抗体具有四聚体形式,包括两个相同的多肽链对,每个对具有一条“轻链”和一条“重链”。每条轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。
本文所使用的“靶向结合剂”是优先结合靶位点的试剂,例如抗体或者其结合片段。在一个实施方式中,靶向结合剂仅对于一个靶位点是特异性的。在其他实施方式中,靶向结合剂对于超过一个靶位点是特异性的。在一个实施方式中,靶向结合剂可以是单克隆抗体,而靶位点可以是抗原决定簇。正如下面所描述的,靶向结合剂可以包含至少一个抗体的抗原结合结构域,其中所述结构域与异源蛋白质融合,或者包含在异源蛋白质内。
抗体的“结合片段”是通过重组DNA技术产生,或者通过酶促或化学切割完整的抗体来产生的。结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和单链抗体。“双特异性”或“双功能性”抗体之外的抗体应理解为其每个结合位点都相同。当某过量的抗体减少与反受体结合的受体的量达至少约20%、40%、60%或80%、更通常超过约85%(如体外竞争性结合测定中所测量)时,则该抗体实质上抑制该受体与该对应受体的粘合。
抗体可以是寡克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、CDR接枝抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、催化性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、抗独特型抗体和能以可溶性或结合形式被标记的抗体以及它们的片段、变体或衍生物,这些抗体可以是单独的或者这些抗体以及它们的片段、变体或衍生物与公知技术所提供的其它氨基酸序列的组合。抗体可来自任何物种。术语抗体还包括本发明抗体的结合片段,示例性的片段包括Fv、Fab、Fab’、单链抗体(svFC)、二聚可变区(双抗体)和二硫化物稳定的可变区(dsFv)。
已经显示完整抗体的片段能够发挥结合抗原的功能。结合片段的例子是(Ward,E.S.等人,(1989)Nature 341,544-546)由VL、VH、CL和CH1结构域构成的Fab片段;(McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554)由VH和CH1结构域构成的Fd片段;(Holt等人,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490)由单抗体的VL和VH结构域构成的Fv片段;(iv)dAb片段(Ward,E.S.等人,Nature 341,544-546(1989),McCafferty等人,(1990)Nature,348,552-554,Holt等人,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490],其由VH或者VL结构域构成;(v)分离的CDR区;(vi)F(ab′)2片段、包含两个连接的Fab片段的二价片段;(vii)单链Fv分子(scFv),其中VH结构域和VL结构域被能够将两个结构域结合形成抗原结合位点的肽接头连接(Bird等人,(1988)Science,242,423-426,,Huston等人,(1988)PNAS USA,85,5879-5883);(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965);和(ix)通过基因融合构建的“双抗体”,多价或者多特异性片段(WO94/13804;Holliger,P.(1993)等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,)。Fv、scFv或者双抗体分子可以通过引入二硫键连接VH和VL结构域而稳定化(Reiter,Y.等人,Nature Biotech,14,1239-1245,1996)。可以制造包含连接到CH3结构域的scFv的微体(minibody)(Hu,S.等人,(1996)Cancer Res.,56,3055-3061)。结合片段的其他例子是Fab’,其与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基,其包括来自抗体铰链区的一个或者更多个半胱氨酸,以及Fab’-SH,其是Fab’片段,种种恒定结构域的半胱氨酸携带自由巯基。
术语“抗原决定簇”包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的蛋白质决定簇。抗原决定簇决定子(determinant)通常由分子的化学活性表面集合(grouping)如氨基酸或糖侧链组成,且可以但不总是具有特异性的三维结构特性以及特异性的电荷特性。某抗体当解离常数≤1μM、优选≤100nM、最优选≤10nM时可称为特异性结合抗原决定簇。
本文所用的术语“剂(agent)”表示化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或从生物材料制备的提取物。
关于αVβ6异源二聚体多肽,“活跃的”或者“活性”是指一部分αVβ6异源二聚体多肽,其具有原始αVβ6多肽的生物或免疫学活性。在本文中使用的“生物”是指由于αVβ6多肽的活性所得到的生物学功能。优选的αVβ6生物活性包括例如,αVβ6诱导的细胞粘附。
在本文中所使用的“哺乳动物”指所有被认为是哺乳动物的动物,但优选哺乳动物是人。
用木瓜蛋白酶消化抗体会产生出两个相同的抗原结合片段,也称“Fab”片段和“Fc”片段,它们不具有抗原结合活性,但具有结晶的能力。用胃蛋白酶消化抗体会产生出F(ab’)2片段,其中抗体分子的两臂保持连接和包含两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有交联抗原的能力。
本文所用的“Fv”是指抗体的保持了抗原识别位点和抗原结合位点的最小片段。
本文所用的“Fab”是指抗体的包含轻链的恒定域和重链的CH1结构域的片段。
术语“mAb”指单克隆抗体。
本文所用的“脂质体”是指可用来将药物递送给哺乳动物的小囊泡,该药物可包括本发明的αVβ6多肽或抗这种αVβ6多肽的抗体。
本文所用的“标记”或“标记的”是指将可检测部分加到多肽上,例如放射标记、荧光标记、酶促标记、化学发光标记的或生物素酰化基团。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I,荧光标记可包括罗丹明、镧系磷(lanthanidephosphors)或FITC,酶促标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶。
通过例子而不是限制,其他的标记包括:酶例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(“G6PDH”)、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸酯脱氢酶和过氧化物酶;染料;其他的荧光标记或者荧光剂包括例如荧光素和其衍生物、荧光染料、GP(GFP对应“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰、伞形酮、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺;荧光团例如镧系元素穴状化合物和螯合例如铕等(Perkin Elmerand Cis Biointernational);化学发光标记或化学发光剂例如异鲁米诺(isoluminol)、鲁米诺(luminol)和二氧杂环丁烷(dioxetanes);感光剂;辅酶;酶底物;颗粒例如乳液或碳粒子;金溶胶;微晶;脂质体;细胞等,其可以被染料、催化剂或其他可检测基团标记;分子例如生物素、地高辛(digoxygenin)或5-溴脱氧尿核苷;毒素部(moiety)例如毒素部,其选自假单胞菌外毒素(PE或细胞毒素片段或其突变体)、白喉毒素或细胞毒素片段或其突变体、肉毒毒素A、B、C、D、E或F、篦麻毒素或其细胞毒素片段例如篦麻毒素A、相思豆毒蛋白或其细胞毒素片断、皂草毒素蛋白(saporin)或其细胞毒素碎片、商陆抗病毒毒素或其细胞毒素片段和异株腹泻毒蛋白(bryodin)1或其细胞毒素碎片。
本文所用的术语“药剂或药物”是指当适当给予患者时能够引起所需的治疗效果的化学化合物、组合或组合物。本文的其它化学术语是按照本领域常规用法使用,例见TheMcGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.,Ed.,McGraw-Hill,SanFrancisco(1985))(通过引用结合到本文中)。
本文所使用的“基本上纯”的意思是目标种是所存在的主导种类(即,在摩尔基础上比组合物中的其他个体种要更丰富),并且优选基本上纯的级分是一种组合物,其中目标种占所有存在的大分子种的至少大约50%(摩尔基础上)。通常,基本上纯的组合物将含有超过大约80%的全部在组合物中存在的大分子种,更优选超过大约85%、90%、95%和99%。最优选,目标种被纯化成基本上均质的(组合物中的杂质种不能被常规检测方法检测),其中组合物基本上有单一的大分子种构成。
术语“患者”包括人和脊椎对象。
人抗体和抗体的人源化
人抗体避免了许多与具有鼠或大鼠可变区和/或恒定区相关的某些问题。存在这些鼠或大鼠来源蛋白质可能导致抗体被快速清除,或者能够导致患者针对抗体的免疫应答的产生。为了避免利用鼠或大鼠来源抗体,可以通过将功能性人抗体基因座引入到啮齿类或其他哺乳动物或动物中以便啮齿动物、其他哺乳动物或动物产生全人抗体,而获得全人抗体。
产生全人抗体的一种方式是通过使用小鼠的株,其已经被改造成含有最高达到但低于1000kb-大小的生殖系被构造的人重链基因座和κ轻链片段。参见Mendez等人,Nature Genetics 15:146-156(1997)和Green and JakobovitsJ.Exp.Med.188:483-495(1998)。株是可以从Amgen,Inc.(Fremont,CA)获得的。
小鼠株的产生被进一步讨论并描绘在下列中:美国专利申请系列号No.07/466,008(1990年1月12日提交)、07/610,515(1990年11月8日提交)、07/919,297(1992年7月24日提交)、07/922,649(1992年7月30日提交)、08/031,801(1993年3月15日提交)、08/112,848(1993年8月27日提交)、08/234,145(1994年4月28日提交)、08/376,279(1995年1月20日提交)、08/430,938(1995年4月27日提交)、08/464,584(1995年6月5日提交)、08/464,582(1995年6月5日提交)、08/463,191(1995年6月5日提交)、08/462,837(1995年6月5日提交)、08/486,853(1995年6月5日提交)、08/486,857(1995年6月5日提交)、08/486,859(1995年6月5日提交)、08/462,513(1995年6月5日提交)、08/724,752(1996年10月2日提交)、08/759,620(1996年12月3日提交),美国公开2003/0093820(2001年11月30日提交),以及美国专利No.6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598,以及日本专利No.3 068 180 B2、3 068 506 B2和3 068 507B2。还参见欧洲专利No.,EP 0 463151 B1(1996年6月12日授权出版)、国际专利申请No.,WO 94/02602(1994年2月3日出版)、国际专利申请No.,WO 96/34096(1996年10月31日出版)、WO 98/24893(1998年6月11日出版)、WO 00/76310(2000年12月21日出版)。通过参照将上述每一篇专利、申请和参考文献的公开内容整体并入本文。
在可替换的方法中,其他人包括GenPharm International,Inc.已经利用“微型基因座(minilocus)”方法。在微型基因座方法中,外源Ig基因座被通过包含来自Ig基因座的片(单独的基因)所模拟。因此一个或者更多个VH基因、一个或者更多个DH基因、一个或者更多个JH基因、mu恒定区以及通常第二恒定区(优选γ恒定区)被形成在构建体(construct)中以***动物中。该方法被描述在下列中:授予Surani等人的美国专利No.5,545,807,和均授予Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458,授予Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023,010,授予Berns等人的美国专利No.5,612,205、5,721,367和5,789,215,以及授予Choi和Dunn,and GenPharmInternational的美国专利No.5,643,763,美国专利申请系列号No.07/574,748(1990年8月29日提交)、07/575,962(1990年8月31日提交)、07/810,279(1991年12月17日提交)、07/853,408(1992年3月18日提交)、07/904,068(1992年6月23日提交)、07/990,860(1992年12月16日提交)、08/053,131(1993年4月26日提交)、08/096,762(1993年7月22日提交)、08/155,301(1993年11月18日提交)、08/161,739(1993年12月3日提交)、08/165,699(1993年12月10日提交)、08/209,741(1994年3月9日提交),通过参照将将其公开内容并入本文。还参见欧洲专利No.0 546 073 B1,国际专利申请No.WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852和WO98/24884,以及美国专利No.5,981,175,通过参照将其公开内容整体并入本文。进一步参见Taylor等人,1992,Chen等人,1993,Tuaillon等人,1993,Choi等人,1993,Lonberg等人,(1994),Taylor等人,(1994)以及Tuaillon等人,(1995),Fishwild等人,(1996),通过参照将其公开内容整体并入本文。
Kirin还证明从小鼠中产生人抗体,其中通过微细胞融合,小鼠已经被引入大片段染色体或者整个染色体。参见欧洲专利申请No.773288和843961,通过参照将其公开内容并入本文。另外,已经产生了KMTM-小鼠,其是Kirin’s Tc小鼠与Medarex’s微型基因座(Humab)小鼠的杂交繁育。这些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH转染色体(transchromosome)以及Genpharm小鼠的κ链转基因(Ishida等人,Cloning Stem Cells,(2002)4:91-102).
人抗体还可以通过体外方法产生。适当的例子包括但不限于噬菌体展示(CAT,Morphosys,Dyax,Biosite/Medarex,Xoma,Symphogen,Alexion(formerly Proliferon),Affimed)、核糖体展示(CAT)、酵母展示等。
抗体的制备
本文所描述的抗体是通过利用下面所描述的技术而制备的。接着,这类小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体,并且缺乏产生鼠免疫球蛋白分子和抗体。用于达到这一点的技术被公开与本文背景部分中过公开的专利、申请和参考文献中。然而,特别的,小鼠与其抗体的转基因生产的优选实施方式被公开在下列中:美国专利申请系列号No.08/759,620(1996年12月3日提交),和国际专利申请No.WO 98/24893(1998年6月11日出版)以及WO 00/76310(2000年12月21日出版),通过参照将其公开内容并入本文。还参见Mendez等人,Nature Genetics 15:146-156(1997),通过参照将其公开内容并入本文。
通过利用这类技术,已经产生了针对多种抗原的全人单克隆抗体。基本上,使用感兴趣的抗原(例如αVβ6)对小鼠的系进行免疫,从超免疫的小鼠回收淋巴细胞(例如B细胞),并将回收的淋巴细胞与骨髓类细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系。对这些杂交瘤细胞系进行筛选,并选择以鉴定产生对所感兴趣抗原特异性的抗体。本文所提供的是生产产生对αVβ6特异性的抗体的多种杂交瘤细胞系的方法。进一步,本文提供了鉴定这些细胞系所产生的抗体,其包括对这些抗体的重链和轻链进行核苷酸和氨基酸序列分析。
可替换的,不是与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤,而是直接检验B细胞。例如,可以从超免疫XenoMouse小鼠分离CD19+B细胞,并进行增殖和分化成分泌抗体的浆细胞。接着通过获得αVβ6免疫原的反应性的ELISA从细胞上清液筛选抗体。也可以对上清液筛选针对αVβ6片段的免疫活性,以进一步描绘不同的抗体结合αVβ6上感兴趣功能的结构域。也可以对抗体进行筛选针对相关的人整合蛋白,以及针对大鼠、小鼠和非人灵长类动物例如猕猴、αVβ6的定向进化同源,最后用于确定物种间的交叉反应。可以通过各种方法使得来自含有感兴趣抗体的孔的B细胞永生化,包括融合以制备来自单独孔或者汇总孔的杂交瘤,或者通过感染EBV或者转染已知的永生基因,接着接种在适当的培养基中。可替代的,接着使用αVβ6-特异性溶血斑检验分离分泌具有期望特异性的抗体的单个浆细胞(参见例如Babcook等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843-48(1996))。优选靶向进行裂解的细胞是包被αVβ6抗原的绵羊血红细胞(SRBC)。
在存在含有分泌感兴趣免疫球蛋白和补体的浆细胞的B细胞时,溶血斑的形成表示在感兴趣的浆细胞周围,特异性αVβ6-介导的绵羊血红细胞的裂解。溶血斑中部的单抗原特异性浆细胞可以被分离,并从单个浆细胞分离编码抗原特异性的遗传信息。使用反转录,接着PCR(RT-PCR),可以克隆编码抗体重量和轻链可变区的DNA。接着可以将这类克隆的DNA***适当的表达载体中,优选载体框例如pcDNA,更优选含有免疫球蛋白重链和轻链恒定区的pcDNA载体。接着,所产生的载体可以被转染到宿主细胞内,例如HEK293细胞、CHO细胞,并在被适当修饰以进行诱导转录的传统营养培养基中进行培养,选择转录子,或者扩增编码期望序列的基因。
通常,融合杂交瘤所产生的抗体是人IgG2重链,其具有全人κ或者λ轻链。本文所描述的抗体具有人IgG4重链以及IgG2重链。抗体还可以是其他人同工型的,包括IgG1。该抗体具有高亲和力,在通过固相和溶液相技术进行测量时,典型地具有大约10-6~大约10-12M或者更低的的Kd。具有至少10-11M的Kd的抗体对于抑制αVβ6的活性是优选的。
正如能够理解的,可以在杂交瘤细胞系以外的细胞系表达抗体。编码特定抗体的序列可以用于转化适当的哺乳动物宿主细胞。可以通过任何已知的将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行转化,其包括将多核苷酸包装在病毒中(或者包装在病毒载体中),并通过本领域中已知的转染程序使用病毒(或载体)转导宿主细胞,其例子是美国专利No.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(通过参照将专利并入本文)。所使用的转化程序依赖于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域中公知的,并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚乙二醇接到的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸封装在脂质体中、以及直接将DNA微注射到细胞核中。
可以利用作为宿主进行表达的哺乳动物细胞是本领域中已知的,并且包括许多可以从American Type Culture Collection(ATCC)获得的永生化细胞系包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、人上皮肾293细胞以及一些其他细胞系。通过确定何种细胞系具有高表达水平并产生具有组成型αVβ6结合性质,而选择特别优选的细胞系。
根据mAb显著中和αVβ6活性的能力(如在下面实施例中所证实的),这些抗体抗体将在治疗由于αVβ6表达所引起的症状和病症中有治疗效果。在具体的实施方式中,本文的抗体和方法涉及治疗由于αVβ6诱导的细胞粘附或αVβ6与其配体相互作用所诱导信号传导而引起的症状。
根据本发明的另一个方面,提供了药物组合物,其包含αVβ6生物活性的拮抗剂以及药物上可以接受的载体。在一个实施方式中,拮抗剂包含抗体。根据本发明的另一个方面,提供了药物组合物,其包括αVβ6生物活性的拮抗剂,以及药物上可以接受的载体。在一个实施方式中,拮抗剂包含抗体。
抗-αVβ6抗体可以用于检测患者样品中的αVβ6,并因此可以用作本文所述疾病状态的诊断剂。另外,根据它们显著抑制αVβ6活性的能力(如在下面实施例中所证实的),抗-αVβ6抗体在治疗由于αVβ6表达所引起的症状和病症中有治疗效果。在具体的实施方式中,本文的抗体和方法涉及治疗由于αVβ6诱导的细胞粘附而引起的症状。进一步实施方式包括使用本文所描述的抗体和方法治疗αVβ6相关疾病或者紊乱,其包括瘤形成疾病例如黑素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞(肝)癌、甲状腺瘤、胃(胃)癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌和胰腺癌。
治疗给药和制剂
本发明的实施方式包括抗-αVβ6抗体的无菌药物制剂,其可以用于治疗疾病。这些制剂将抑制配体结合αVβ6整合蛋白,以便有效治疗生理病症,例如组织αVβ6被异常提高的病症。优选,抗-αVβ6抗体具有充分亲和力以有力地抑制αVβ6活性,并优选具有充分的作用时间以达到在人中不频繁的给药。延长的作用时间将允许通过可替换的肠胃外路线例如皮下或肌内注射的较低频率以及更便利的给药时间表。
可以形成无菌制剂,例如通过在冻干以及重建抗体之前过滤经过无菌过滤膜。通常以冻干形式或在溶液中储存抗体。治疗性抗体组合物通常被置于具有无菌存取端口的容器中,例如静脉溶液包或者小瓶,其具有转接器允许取用制剂例如可以被皮下注射针刺穿的塞子。
抗体给药的路线是根据已知方法,例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌内、眼内、动脉内、脑脊髓膜内、注射或者灌输、吸入或损伤内路线、直接注射到肿瘤位点或者通过下面所述的持续释放***。优选通过灌输或快速浓注(bolus injection)给药抗体。
治疗上所采用的抗体的有效量依赖于治疗目标、给药路线、患者的病症。因此,优选治疗学家根据需要确定剂量并修改给药路线以获得最佳的治疗效果。典型地,临床医生会管理抗体直到达到获得期望效果的剂量。容易通过传统检验或通过本文所描述的检验对该治疗的进程进行监控。
正如本文所描述的,抗体可以被制备成与药物上可以接受的载体的混合物。可以静脉内或者经鼻或肺给药该治疗组合物,优选作为液体或者粉末气雾剂(冻干)。如果期望,还可以肠胃外或皮下给药该组合物。在***性给药时,该治疗组合物应该是无菌的、无热原的,并且在肠胃外可以接受的适当考虑pH、等渗性和稳定性的溶液中。这些条件对于本领域技术人员是已知的。简言之,本文所描述的化合物的配药制剂是通过将具有期望纯度的化合物与药物上可以接受的载体、赋形剂或者稳定剂进行混合而制备进行储存或者给药的。这些材料以其所采用的剂量和浓度对于接受者是无毒的,并且包括缓冲剂例如TRIS HCl、磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其他有机酸盐;抗氧化剂例如山梨酸;低分子量(低于大约10个残基)肽例如聚精氨酸,蛋白质例如血清白蛋白、明胶或者免疫球蛋白;亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或者精氨酸;单糖、双糖、和其他糖类包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或者糊精;螯合剂例如EDTA;糖醇例如甘露醇或者山梨醇;抗衡离子例如钠和/或非离子表面活性剂例如TWEEN、PLURONICS或者聚乙二醇。
根据传统药物时间可以配制用于注射的无菌组合物,例如在Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(第20版,Lippincott Williams&WilkensPublishers(2003))中所描述的。例如,将活性化合物溶解或悬浮在药物上可以接受的载体中例如水或天然存在的植物油例如芝麻油、花生油或棉籽油或合成的脂肪载体例如油酸乙酯等可以是期望的。根据可以接受的药物实践,可以掺入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等。
持续释放制剂的适当例子包括含有多肽的固体疏水聚合物半渗透基质,其中基质是以成型物体或者微胶囊的形式。持续释放的基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如Langer等人,J.Biomed Mater.Res.,(1981)15:167-277 and Langer,Chem.Tech.,(1982)12:98-105所描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯),或者聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919,EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,Biopolymers,(1983)22:547-556)、不可降解乙烯-醋酸乙烯共聚物(Langer等人,见前)、可降解乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DepotTM(可注射微球体,由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)构成)以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
尽管聚合物例如乙烯-醋酸乙烯和乳酸-乙醇酸能够释放分子持续100天以上,但某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间。在封装的蛋白质长时间保持在身体中时,它们可能会由于暴露到37℃的潮湿下而变性或者聚集,导致生物活性的丧失以及可能的免疫原性变化。根据所参与机理可以设计合理的策略而进行蛋白质稳定化。例如,如果发现聚集机理是通过二硫键交换而形成分子键S-S键,则可以通过修饰巯基残基,从酸性溶液冻干,控制湿量,使用适当的添加剂以及开发特异性的聚合物基质组合物而达到稳定化。
本发明的抗体还包括抗体,其在哺乳动物优选人中具有超过未修饰抗体的半衰期(例如血清半衰期)。在一个实施方式中,所述抗体半衰期大于15天,大于20天,大于25天,大于30天,大于35天,大于40天,大于45天,大于2个月,大于3个月,大于4个月,或者大于5个月。本发明抗体或其片段在哺乳动物优选人中提高的半衰期导致所述抗体或抗体片段在哺乳动物中较高的血清滴度,因此降低了所述抗体或抗体片段的给药频率,和/或降低了待给药所述抗体或抗体片段的浓度。可以通过本领域技术人员已知的技术产生体内半衰期提高的抗体或其片段。例如,可以通过将鉴定为Fc结构域和FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基进行修饰(例如取代、缺失或添加)而产生体内半衰期提高的抗体或其片段(参见,例如国际公开No.WO 97/34631和WO 02/060919,通过参照将其整体并入本文)。可以通过将聚合物分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)附加到抗体或抗体片段而产生体内半衰期提高的抗体或其片段。PEG可以被附加到所述抗体或抗体片段上,利用或者不利用多功能接头,通过位点特异性PEG偶联到所述抗体或抗体片段的N-或C-末端,或者通过赖氨酸残基上的ε-氨基。将使用直链或直链聚合物衍生,其导致生物活性的最小损失。通过SDS-PAGE和质谱对偶联度进行紧密监控,以确保PEG分子正确偶联到抗体。可以通过例如尺寸排阻或者例子交换层析从抗体-PEG缀合物分离未反应的PEG。
持续释放组合物还包括制备抗体晶体,其悬浮在适当的制剂中能够维持晶体在悬浮中.在皮下或腹膜内注射时,这些制剂能够产生持续释放效果。其他组合物还包括脂质体封装的抗体。通过本身已知的方法制备含有这些抗体的脂质体:美国专利No.DE 3,218,121;Epstein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985)82:3688-3692;Hwang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1980)77:4030-4034;EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP143,949;142,641;日本专利申请83-118008;美国专利No.4,485,045和4,544,545;和EP102,324。
对于给定患者,抗体制剂的剂量将由主治医生来确定,其考虑各种已知的因素以修饰药物的作用,包括疾病的严重性和类型、体重、性别、饮食、给药时间和路线、其他药物和其他相关临床因素。治疗上有效的剂量可以由体外或体内方法决定。
治疗上所采用的本文所描述的抗体的有效量将依赖于例如治疗目标,给药路线以及患者的状态。因此,对于治疗学家优选的是,根据需要确定剂量和修该给药路线以后的最佳的治疗效果。典型的日剂量可以在大约0.001mg/kg最高达到100mg/kg或者更高的范围内,其一来上述的因素。典型地,临床医生会管理治疗抗体,达到获得期望效果的剂量。通过传统检验或者本文所述的检验容易对这种治疗的进程进行监控。
需要理解,根据本文的组合物和方法给药治疗剂将与适当的载体、赋形剂和掺入制剂中提供改进的转移、递送、忍受力等的其他试剂进行给药。这些制剂包括例如粉末、糊、药膏、凝胶剂、蜡、油、脂质体、含有囊泡(例如LipofectinTM)的脂质(阳离子或阴离子)、DNA缀合物、无水吸收糊(anhydrous absorption paste)、水包油和油包水乳剂、乳液Carbowax(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有Carbowax的半固体混合物。所有前述混合物可以适于根据本发明进行处理和治疗,只要制剂中的活性成分不会被制剂所灭活,并且该制剂与给药路线生理上兼容并且可以忍受。还参见Baldrick P.“Pharmaceuticalexcipient development:the need for preclinical guidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W.“Lyophilization anddevelopment of solid protein pharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-someemerging concepts.”J Pharm Sci.89(8):967-78(2000),Powell等人,“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311(1998)以及其引用文献获取关于药物化学家公知的制剂、赋形剂和载体的其他信息。
其他治疗剂的设计和产生
根据本发明以及基于本文所产生和鉴定的抗体针对αVβ6的活性,促进了设计抗体成分意外的其他治疗剂形式。这些形式包括但不限于高级抗体治疗剂例如双特异性抗体、免疫毒素和放射性标记治疗剂、单结构域抗体、肽治疗剂的产生、新型骨架中的αVβ6结构域、基因治疗,特别是胞内抗体、反义治疗剂和小分子。
关于产生补体结合是期望属性的高级抗体治疗剂,其可以通过利用例如双特异性抗体、免疫毒素或放射性标记,避免依赖补体进行细胞杀死。
可以产生双特异性抗体,其包括(i)两种抗体,一种具有对αVβ6的特异性,偶联在一起的另一种针对第二分子;(ii)单种抗体,其一条链对αVβ6有特异性,另一条链对第二分子有特异性;或者(iii)单链抗体,其对αVβ6和其他分子有特异性。可以使用公知的技术产生这类双特异性抗体,例如关于(i)和(ii),参见例如Fanger等人,Immunol Methods 4:72-81(1994)以及Wright and Harris,见前,关于(iii)参见例如Traunecker等人,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992)。在每种情况中,可以形成针对重链激活受体的第二特异性,包括但不限于CD16或者CD64(参见例如Deo等人,Immunol.Today 18:127(1997))或者CD89(参见例如Valerius等人,Blood 90:4485-4492(1997))。
关于免疫毒素,利用本领域中公知的技术,抗体可以被修饰成作为免疫毒素发挥作用。参见例如Vitetta Immunol Today 14:252(1993)。还参见美国专利No.5,194,594。关于制备放射性标记抗体,利用本领域中公知的技术可以容易制备这些经修饰的抗体。参见,例如Junghans等人,in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686(第2版,Chafnerand Longo,eds.,Lippincott Raven(1996))。还参见美国专利No.4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE 35,500)、5,648,471和5,697,902。
通过在非抗体蛋白骨架例如纤连蛋白或者细胞色素B等上进行CDR排列而提供抗原结合位点(Haan&Maggos(2004)BioCentury,12(5):A1-A6;Koide等人,(1998)Journal ofMolecular Biology,284:1141-1151;Nygren等人,(1997)Current Opinion inStructural Biology,7:463-469)或者通过随机化或者突变蛋白质骨架内环的氨基酸残基以提供针对期望目标的结合特异性。用于建造蛋白质中新型结合位点的骨架已经被详细综述在Nygren等人,(Nygren等人,(1997)Current Opinion in Structural Biology,7:463-469)中。抗体模拟物的蛋白质骨架被公开在WO/0034784中,通过参照将其整体并入本文,其中发明人描述了蛋白质(抗体模拟物),其包括具有至少一个随机化环的纤连蛋白III型结构域。可以通过免疫球蛋白基因家族的任何结构域提供适于枝接一个或者更多个CDR例如一组HCDR的骨架。该骨架可以是人或者非人蛋白质。非抗体蛋白骨架的优点是,其可以在比至少某些抗体分子小和/或更容易制造的骨架分子中提供抗原结合位点。结合剂的小尺寸可以提供有用的生理性质,例如进入细胞、渗透深入组织或达到其他结构中的目标、或者在结合蛋白质腔内靶抗原的能力。非抗体蛋白骨架中抗原结合位点的应用被综述在Wess,2004(Wess,L.In:BioCentury,The Bernstein Report on BioBusiness,12(42),A1-A7,2004)中。典型的是具有稳定骨架和一个或者更多个可变环的蛋白质,其中环或多个环的氨基酸序列被特异性或随机突变以形成结合靶抗原的抗原结合位点。这些蛋白质包括金黄色葡萄球菌的蛋白质A的IgG-结合结构域、转铁蛋白、白蛋白、四结合素(tetranectin)、纤连蛋白(例如第10个纤连蛋白III型结构域)、Lipocalin以及γ-晶体和其他AffilinTM骨架(Scil Proteins)。其他方法的例子包括基于具有分子键二硫键的环肽-小蛋白的合成“微体(microbody)”、微型蛋白(Microproteins)(VersabodiesTM,Amunix)以及锚蛋白重复蛋白(DARPins,Molecular Partners)。
除了抗体序列和/或抗原结合位点外,根据本发明的结合剂可以包含其他氨基酸例如形成肽或者多肽,例如折叠的结构域或者为分子提供处结合抗原以外的其他功能特征。本发明的结合剂可以携带可检测标记,或者可以偶联到毒素或者靶向部(targetingmoiety)或者酶(例如通过肽键或接头)。例如,结合剂可以包含催化位点(例如在酶结构域中)以及抗原结合位点,其中抗原结合位点结合抗原,并因此将催化位点靶向到抗原。催化位点可以已知抗原的生物学功能,例如通过切割。
联合
本文所限定的抗肿瘤治疗可以作为唯一治疗进行施加,或者除了本发明的化合物外还可以包括传统的外科手术或者放疗或者化疗。这类化疗可以包括下列抗肿瘤剂类别中的一种或者更多种:
(i)在医学肿瘤学中使用的其他抗增殖/抗瘤形成药物及其组合,例如烷化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、泰莫佐罗和亚硝基脲);抗代谢物(例如吉西他滨和抗叶酸物例如氟代嘧啶如5-氟尿嘧啶和喃氟啶、雷替曲塞、氨甲蝶呤、阿糖胞苷和羟基脲);抗肿瘤抗生素(例如蒽环类如阿霉素、博来霉素、羟基红比霉素、柔毛霉素、表阿霉素、盐酸去甲柔毛霉素、丝裂霉素-C、放线菌素D和光辉霉素);抗有丝***药物(例如长春花-生物碱如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春烯碱,以及紫杉醇类(taxoid)如紫杉醇和泰素替尔和polokinase抑制剂);和拓扑异构酶抑制剂(例如鬼臼乙叉甙如依托泊苷和替尼泊苷、胺苯吖啶、拓扑替康和喜树碱);
(ii)细胞生长抑制剂例如抗***(antioestrogen)(例如它莫西芬、氟维司群(fulvestrant)、涛瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和iodoxyfene)、抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟利坦、尼鲁米特和环丙孕酮醋酸盐)、LHRH拮抗剂或者LHRH激动剂(例如性瑞林、亮丙瑞林和布噻来灵)、孕激素(例如甲地孕酮醋酸盐)、芳香酶抑制药(例如阿那曲唑、来曲唑、vorazole和依西美坦(Exemestane))以及5α-还原酶的抑制剂例如非那雄胺;
(iii)抗-侵入剂(例如c-Src激酶家族抑制剂例如4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基羟喹唑啉(AZD0530;国际专利申请WO 01/94341)和N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(达沙替尼(Dasatinib),BMS-354825;J.Med.Chem.,2004,47,6658-6661)以及金属蛋白酶抑制剂如马马司他(Marimastat)、尿激酶血纤维蛋白溶酶原激活受体功能的抑制剂或者肝素酶的抗体);
(iv)生长因子功能的抑制剂:例如这些抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体(例如抗-erbB2抗体曲妥珠单抗(Trastuzumab)[HerceptinTM],抗-EGFR抗体西妥昔单抗(panitumumab)、抗-EGFR抑制剂Bevacizumab(AvastinTM)、抗-erbB1抗体cetuximab[Erbitux,C225]以及所有Stern等人,Critical reviews in oncology/haematology,2005,Vol.54,pp11-29所公开的生长因子或生长因子受体抗体);这些抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族络氨酸激酶抑制剂例如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼,ZD1839),N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib,OSI-774)和6-丙烯酰胺-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033),erbB2酪氨酸激酶抑制剂例如拉帕替尼(lapatinib),肝细胞生长因子家族抑的制剂,血小板衍生家族的抑制剂例如马替尼(Imatinib),丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂例如法尼基(Farnesyl)转移酶抑制剂例如索拉非尼(sorafenib)(BAY 43-9006)),通过MEK和/或AKT激酶的信号传导的抑制剂,肝细胞生长因子家族的抑制剂,c-kit抑制剂,abl激酶抑制剂,IGF受体(胰岛素类生长因子)激酶抑制剂;aurora激酶抑制剂(例如AZD1152,PH739358,VX-680,MLN8054,R763,MP235,MP529,VX-528AND AX39459)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂例如CDK2和/或CDK4抑制剂;
(v)抗血管生成剂例如抑制血管内皮生长因子作用的[例如抗-血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(Bevacizumab)(AvastinTM)和VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474;WO 01/32651中的实施例2),4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171;WO 00/47212中的实施例240),vatalanib(PTK787;WO 98/35985)和SU11248(舒尼替尼(Sunitinib);WO 01/60814),例如在国际专利申请WO97/22596,WO 97/30035,WO97/32856和WO 98/13354中过公开的化合物,以及通过其他基质工作的化合物(例如罗喹美克,整合蛋白αvβ3功能的抑制剂以及血管生长抑制素);
(vi)血管破坏剂例如康布瑞塔卡汀(Combretastatin)A4以及在国际专利申请WO99/02166、WO 00/40529、WO 00/41669、WO 01/92224、WO 02/04434和WO 02/08213中所公开的化合物;
(vii)反义治疗,例如针对上述所列靶的,例如例如ISIS 2503,抗-ras反义;
(viii)基因治疗途径,包括例如替代异常基因例如异常p53或者异常BRCA1或者BRCA2,的途径,GDEPT(基因指导酶前药治疗)途径例如使用胞苷脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的,提高患者对化疗或放疗忍受的途径,例如多药物抗性基因治疗;以及
(ix)免疫治疗途径,包括例如先体外后体内(ex-vivo)和体内途径以提高患者肿瘤细胞的免疫原性,例如转染细胞因子例如白介素2,白介素4或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,降低T细胞缺失的途径,使用被转染的免疫细胞的途径例如转染细胞因子的树突状细胞,使用转染细胞因子的肿瘤细胞系的途径以及使用抗-独特型抗体的途径。
这些联合治疗可以通过同时、一次或者分别给药治疗的各种组分而达到。在之前所描述的剂量范围内,这种联合产物采用本发明的化合物,或者其药物上可以接受的盐,以及批准剂量范围内的其他药物活性剂。
实施例
下面的实施例包括所进行的实验以及所得到的结果仅仅为了说明的目的提供的,而不应构成对本文教导的限制。
实施例1
免疫和滴度
免疫
分别使用可溶性αVβ6和细胞-结合αVβ6(在细胞表面表达αVβ6的CHO转染子)进行免疫。为了产生CHO转染子,将人全长αVβ6cDNA***到pcDNA 3表达载体中。通过电穿孔对CHO细胞进行瞬时转染。通过荧光剂或细胞分选仪(FACS)分析确认适于免疫原目的水平的细胞表面上人αVβ6的表达。对于方案1采用10μg/小鼠的可溶性蛋白,对于方案2采用3×106个细胞/小鼠转染的CHO细胞,用于XenoMouseTM中的起始免疫,其根据在下列中所公开的方法:美国专利申请系列号No.08/759,620(1996年12月3日)和国际专利申请No.WO 98/24893(1998年6月11日出版)以及WO 00/76310(2000年12月21日),通过参照将其公开内容并入本文。在起始免疫之后,对组1和2(可溶性抗原)给药13次后续推进免疫,对于组3和4(细胞-结合抗原)给药1.5×106个细胞/小鼠进行8次后续推进免疫。免疫程序概述在表2中。
表2:免疫程序概述
通过滴度选择收获用动物
通过ELISA检验被免疫可溶性抗原的小鼠测试抗体针对人αVβ6的滴度。通过FACS测试被免疫原始(细胞-结合)抗原的抗体的滴度ELISA和FACS分析显示存在某些小鼠似乎对于αVβ6是特异性的。因此,在免疫程序的最后,选择20只小鼠进行收获,根据实施例2中所描述的,从经免疫的小鼠的脾脏和***分离淋巴细胞。
实施例2
回收淋巴细胞和分离B-细胞
通过颈脱臼处死经免疫的小鼠,并从每组中收获和汇集引流***。通过在DMEM中研磨使淋巴细胞解离,以从组织释放细胞,并将细胞悬浮在DMEM中。通过在IgM中复选择以及在IgG中正选择,而富集B细胞。将细胞进行培养,以使得B细胞扩张并分化成分泌抗体的浆细胞。
根据常规,将分泌抗体的血浆培养在选择培养基中。将从可能产生抗-人αVβ6抗体的细胞收集的全部上清液进行在下面实施例中详细描述的后续筛选检验。
实施例3
结合细胞-结合αVβ6
检测所分泌抗体与αVβ6的检验。使用FMAT大共聚焦扫描仪(macroconfocalscanner)检验与细胞-结合αVβ6的结合,并根据下面所描述的,通过ELISA分析与可溶性αVβ6的结合。
对从所收获细胞收集的上清液进行测试以检验所分泌抗体与稳定过表达αVβ6的HEK 293细胞的结合。使用亲代293F细胞作为阴性对照。以50μL/孔的体积,以对于稳定转染子2500个细胞/孔的密度,对于亲代细胞密度为22,500个细胞/孔,将Freestyle培养基(Invitrogen)中的细胞接种到384-孔FMAT平板中,并将细胞在37℃下孵育过夜。接着加入10μL/孔的上清液,并将平板在4℃下孵育大约1小时,之后以2.8μg/ml的浓度加入10μL/孔抗-人IgG-Cy5二抗(终浓度400ng/ml)。接着将平板在4℃下孵育1小时,并使用FMAT大共聚焦扫描仪(Applied Biosystems)读取荧光。表3中概述了11种抗体的FMAT结果。
另外通过ELISA分析与可溶性αVβ6结合的抗体。通过与TBS/1mM MgCl2缓冲液中浓度5μg/ml总体积50μL/孔的αVβ6在4℃下孵育过夜,而对Costar培养基结合96-孔板(Costarcatalog#3368)进行涂覆。接着使用TBS/1mM MgCl2缓冲液对板进行清洗,并使用250μLof1X PBS/1%牛奶在室温下封闭30分钟。接着将10μL上清液加入到40μL TBS/1mM MgCl2/1%牛奶中,并在室温下孵育1小时。清洗绊子,并接着与在TBS/1mM MgCl2/1%牛奶中0.400ng/ml的山羊-抗-人IgG Fc-过氧化物酶进行孵育,并在室温下孵育1小时。清洗扳,并接着使用1-Step TMB底物进行显影。表3中显示了抗体之一的ELISA结果。
表3:上清液与细胞-结合和可溶性αVβ6的结合
实施例4
抑制细胞粘附
为了测定含有不同抗体的上清液的相对能力,对抗体进行检验它们抑制TGFβLAP-介导的αVβ6-阳性HT29细胞粘附的能力。将板包被10μg/ml TGFβLAP过夜,并在检验之前,使用3%BSA/PBS预封闭1小时。接着将细胞沉淀并在HBBS中清洗2次,之后,接着将细胞以适当的浓度重悬浮在HBSS中。在存在适当抗体时,在4℃下将细胞在V-底板中孵育30分钟。除去抗原包被溶液,并使用100μL 3%BSA在室温下将板封闭1小时。使用PBS或者HBSS清洗板2次,并将细胞-抗体混合物转移到经包被的板上,并将板在37℃下孵育30分钟。接着,将经包被的板上的细胞在温HBSS中清洗4次,之后将细胞在-80℃冷冻1小时。使细胞在室温下融化1小时,接着根据制造商的说明向每孔中加入100μL CyQuant染料/裂解缓冲液(MolecularProbes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。表4中概述了12种抗体的结果。这些抗体显示相对于板上未包被的对照孔,效力在62%抑制~100%抑制以上的范围内,其中对照孔用于代表在该检验中可以获得的最大和最低粘附。
表4:粘附检验
抗体ID | 检验1%抑制 | 检验2%抑制 | 平均%抑制 |
sc 049 | 80% | 98% | 89% |
sc 058 | 77% | 46% | 62% |
sc 097 | 96% | 106% | 101% |
sc 133 | 99% | 106% | 103% |
sc 161 | 98% | 106% | 102% |
sc 188 | 99% | 103% | 101% |
sc 254 | 98% | 106% | 102% |
sc 264 | 98% | 100% | 99% |
sc 277 | 98% | 101% | 100% |
sc 298 | 98% | 102% | 100% |
sc 320 | 97% | 97% | 97% |
sc 374 | 118% | 89% | 104% |
实施例5
与短尾猿αVβ6和人αV的交差反应
使用对瞬时转染猕猴αV和猕猴β6的HEK-293细胞的FACS分析,对上清测试含有抗体的上清液与短尾猿αVβ6的交叉反应。
还测试了与人αV的交叉反应。对于该检验,使用对亲代A375M细胞的FACS分析对上清液测试交叉反应,其中所述亲代A375M细胞表达αVβ3和αVβ5,而不表达αVβ6。涉及该筛选用于显示抗体特异性地识别β6链或者联合αV的β6链。短尾猿αVβ6交叉反应筛选的同时运行人αV检验。
如下进行检验。将大约75%汇合的A375M细胞标记CFSE胞内染料,其通过在法尔康管(falcon tube)中解离接着沉淀细胞(当量为每孔250,000~300,000个细胞),接着重悬浮在FACS缓冲液中的0.125μM CFSE中,达到每250,000个细胞的终体积为100μL,接着在37℃下孵育5分钟。接着沉淀细胞,弃上清液,重悬浮在FACS缓冲液中,在37℃下孵育30分钟。接着使用FACS缓冲液清洗细胞2次,并悬浮在终体积每孔100μL FACS缓冲液中。
将HEK-293细胞瞬时转染猕猴αV和猕猴β6。48小时之后,收集细胞并重悬浮在FACS缓冲液中以达到100μL中大约50,000个细胞的终浓度。
如下在每个反应中使用总共大约100,000个细胞,其包括50∶50CFSE-标记的A375M细胞和转染的293细胞的混合物。将100μL CFSE-标记的A375M细胞和100μL 293细胞分配到V底板中。以1500rpm 3分钟将板中的细胞沉淀,接着重悬浮在100μL FACS缓冲液中。重复沉淀步骤,并除去FACS缓冲液上清液。以50μL的体积加入所收集的含抗体上清液或对照第一抗体,并重悬浮细胞。对照第一抗体是鼠αVβ6(Cat#MAB2077z,Chemicon)以及重组抗-αV。将板在冰上孵育45分钟,之后加入100μL FACS缓冲液以稀释第一抗体。接着通过在1500rpm下离心3分钟而使细胞沉淀,并将沉淀重悬浮在100μL FACS缓冲液中。重复沉淀步骤,除去FACS缓冲液上清液。接着,将细胞重悬浮在具有7AAD染料(10μg/ml)的适当二抗(5μg/ml)中,并在冰上染色7分钟。接着加入150μL FACS缓冲液,并以1500rpm 3分钟沉淀细胞,之后在100μL FACS缓冲液中清洗细胞,沉淀,接着重悬浮在250μL缓冲液中,并加入到FACS管中。在高通量FACS机器上分析样品,并使用Cell Quest Pro软件进行分析。
表5中概述了12种抗体的结果,并且证明所显示的抗体能够特异性结合短尾猿αVβ6,但不能非特异性结合亲代A375M细胞上的人αV。
表5.与短尾猿αVβ6和人αV的交差反应
实施例6
αVβ6-特异性溶血斑检验
从每种收获选择分泌抗体的浆细胞用于生产重组抗体。此处,使用荧光办检验鉴定表达针对αVβ6的抗体的浆细胞。接着,根据实施例7中所描述的,将单种细胞进行反转录以及聚合酶链式反应以获取并扩增编码起始抗体特异性的可变重链和可变轻链。下面描述了需要制备许多专门试剂和材料以进行αVβ6-特异性的溶血斑检验。
绵羊血红细胞的生物素化(SRBC)。将SRBC保存在RPMI培养基中,作为25%储液。通过将1.0mL储液分到15mL法尔康管中,将细胞离心下来,并除去上清液,获得250μl SRBC压缩的细胞沉淀。在单独的50mL管中,将2.5mg Sulfo-NHS生物素加入到pH 8.6的45mLPBS中。一旦生物素完全溶解,则加入5mL SRBC,并在室温下旋转管1小时。在3000g下离心SRBC5分钟。除去上清液,并加入25mL pH 7.4的PBS进行清洗。重复3次清洗循环,接着将4.75mL免疫细胞培养基(RPMI 1640,具有10%FCS)加入到250μl生物素化-SRBC(B-SRBC)沉淀中以轻微重悬浮B-SRBC(5%B-SRBC储液)。在4℃下保藏储液直到需要时。
B-SRBC包被链亲合素(SA)。将1mL 5%B-SRBC储液转移到新eppendorf管中。使用在微型离心机中以8000rpm(6800rcf)脉冲旋转,使得B-SRBC沉淀。接着除去上清液,并将沉淀重悬浮在1.0mL PBS pH7.4中,重复离心。重复清洗循环2次,接着将B-SRBC沉淀重悬浮在1.0mL PBS pH 7.4中,以得到5%(v/v)的终浓度。加入10μl 10mg/mL的链亲合素(CalBiochem,San Diego,CA)储液。在室温下将管混合并旋转20分钟。重复清洗步骤,并将SA-SRBC重悬浮在1mL PBS pH 7.4(5%(v/v))中。
SA-SRBC包被人αVβ6。将可溶性抗原(缺少跨膜结构域)用于包被SRBC。使用两种链,因为αVβ6仅作为二聚体被呈递在细胞表面上。将SA-SRBC包被50μg/mL生物素化-αVβ6,混合并在室温下旋转20分钟。如上,使用1.0mL PBS pH 7.4清洗SRBC两次。将包被Ag的SRBC重悬浮在RPMI(+10%FCS)中达到终浓度5%(v/v)。
通过免疫荧光(IF)确定αVβ6-SRBC的量。将10μl 5%SA-SRBC和10μl 5%包被Ag的SRBC均加入到独立的含有40μl PBS的新1.5mL eppendorf管中。将人抗-αVβ6抗体以50μg/mL加入到SRBC的每个样品中。在室温下将管旋转25分钟,并接着使用100μl PBS清洗这些细胞3次。将细胞重悬浮在50μl PBS中,并与2μg/mL偶联到光稳定荧光染料Alexa488(Molecular Probes,Eugene,OR)的Gt-抗人IgG Fc抗体孵育。在室温下旋转管25分钟,接着使用100μl PBS清洗,并重悬浮在10μl PBS中。将10μl染色的细胞点到洁净的显微镜载玻片上,盖上盖玻片,在荧光光线下观察,并在0~4的任意刻度上进行评分以评估所分离细胞的质量。
制备浆细胞。收获之前根据中和αVβ6活性所充分鉴定的单种B细胞的含量(因此,B细胞克隆分泌感兴趣的免疫球蛋白)。通过在37℃下加入RPMI+10%FCS回收孔中存在的B细胞培养物。通过移液管将细胞重悬浮,接着转到新的1.5mL eppendorf管中(终体积为大约500-700μl)。将细胞在微型离心机中室温下以1500rpm(240rcf)离心2分钟,接着将管旋转180度,并再次以1500rpm离心2分钟。将除去冻结的培养基,并将免疫细胞重悬浮在100μlRPMI(10%FCS)中,接着离心。重复这种使用RPMI(10%FCS)的清洗,并将细胞重悬浮在60μlRPMI(FCS)中,并储存在冰上直到进行使用。
溶血斑检验的结果。向60μl免疫细胞样品中加入60μl各种αVβ6-包被的SRBC(5%v/v储液),4x在RPMI(FCS)中制备的豚鼠补体储液(Sigma,Oakville,ON),以及4x增强血清储液(在RPMI(FCS)中1∶900)。将混合物(3-5μl)从100mm Falcon组织培养板点到玻璃盖上,并将点覆盖未稀释的石蜡油。将玻片在37℃下孵育最低45分钟。
斑检验结果的分析。成功将绵羊血红细胞包被人αVβ6的催化结构域。接着如下表6中所显示的,将这些包被Ag的血红细胞用于从孔鉴定抗原特异性浆细胞。接着,通过显微操作分离这些细胞。如在实施例7中进一步描述的,在显微操作回收抗原-特异性浆细胞后,通过对单个浆细胞进行RT-PCR而提取编码可变区基因的基因。
表6.斑检验结果
实施例7
分离重组蛋白
在从实施例4分离期望的单个浆细胞后,提取mRNA并进行反转录PCR,以产生编码每个细胞所分泌的抗体可变重链和轻链的cDNA。将人可变重链cDNA使用限制性酶(在PCR反应过程中已经加入)进行消化,并将该反应的产物克隆到具有适当悬臂进行克隆的IgG2表达载体中。通过将人IgG2的恒定结构域克隆到pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen,Burlington,Ontario,Canada)的多克隆位点而产生该载体。使用在PCR反应过程中已经加入的限制性酶对人可变轻链cDNA进行消化,并将该反应的产物克隆到具有适当悬臂进行克隆的Igκ或者Igλ表达载体中。该在提示通过将人Igκ或者Igλ的恒定结构域克隆到pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen)的多克隆位点而产生的。
接着将重链和轻链表达载体共转染到人胚胎肾(HEK)293细胞70%汇合的60mm盘中。所转染的细胞分泌重组抗体持续24~72小时,其与原始浆细胞具有一致的特异性。从HEK 293细胞收获上清液(3mL),并使用夹心式ELISA证明原始抗体的分泌,其中所述ELISA特异性检测人IgG。使用ELISA通过重组抗体结合αVβ6而确认特异性。表7中概述了分泌能够结合靶抗原的抗体的所回收克隆。
表7.重组抗体的分泌和结合数据
实施例8
纯化重组抗体
为了更大规模生产抗-αVβ6抗体,将重链和轻链表达载体(每条链均为2.5μg/盘)脂质体转染到10个100mm的盘中,在所述盘中HEK293细胞为70%汇合。将转染的细胞在37℃下孵育4天,收获上清液(6mL),并置换6mL新培养基。在第7天,除去上清液,并与起始收获汇集(10个板中总计120mL)。使用蛋白质-A琼脂糖(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)亲和力层析(1mL)从上清液纯化抗体。使用500μL 0.1M甘氨酸pH 2.5,从蛋白质-A柱洗脱抗体。在PBS pH7.4中对洗脱液进行透析并过滤灭菌。通过非还原SDS-PAGE对抗体进行分析以评估纯度和产量。通过测定280nm处的光学密度而测定蛋白质浓度。
实施例9
αVβ6抗体的结构分析
对抗体的可变重链和可变轻链进行测序以测定它们的DNA序列。在序列表中提供了抗-αVβ6抗体的完整序列信息,其包括每种γ和κ/λ链组合的核苷酸和氨基酸序列。对可变重链序列进行分析以测定VH家族、D-区序列以及J-区序列。接着,将序列进行翻译以测定一级氨基酸序列,并与生殖系VH、D和J-区序列进行比较以评估体细胞高变。
表8是比较抗体重链区与它们同源的生殖系重链区的表。表9是比较抗体κ或者λ轻链区与它们同源生殖系轻链区的表。免疫球蛋白链的可变区区(V)是由多种生殖系DNA片段编码的,其在B-细胞个体发生的过程中被连接成功能性可变区(VHDJH或者VKJK)。详细研究抗体对αVβ6的分子和遗传学多样性。这些检验揭示了许多对抗-αVβ6抗体特异性的位点。
根据测序数据,sc 298和sc 374重链的一级结果类似,但不一致。sc 254结构上与其他两个不同。还需要理解,如果特定的抗体与其各自的生殖系序列在氨基酸水平上不同,则抗体序列可以被突变回生殖系序列。使用标准的分子生物学技术,可以在1个、2个、3个或者更多个位点或者任何突变位点的组合处发生这类校正突变。作为非限制性例子,表9显示了sc 298(SEQ ID NO.:40)的轻链序列,其与相应的生殖系序列(SEQ ID NO.:68)不同,在FR1区中存在Val到Ala的突变(突变1),在CDR1区中存在Leu到Ala的突变(突变2)以及在FR3区中存在Asn到Ser的突变。因此,编码sc 298的轻链的氨基酸或者核苷酸序列可以被修饰以改变突变1以在突变1的位点产生生殖系序列。进一步,编码mAb sc 298的轻链的氨基酸或者核苷酸序列可以被修饰以改变突变2,以在突变2的位点产生生殖系序列。更进一步,编码mAb sc 298的轻链的氨基酸或者核苷酸序列可以被修饰以改变突变3,以在突变3的位点产生生殖系序列。更加进一步,编码mAb sc 298的轻链的氨基酸或者核苷酸序列可以被修饰以改变突变1、2和3,以在突变1、2和3的位点产生生殖系序列。更加进一步,编码mAb sc298的轻链的氨基酸或者核苷酸序列可以被修饰以改变突变1、2和3的任意组合。在另一个实施例中,sc 264的重链(SEQ ID NO:30)其与生殖系(SEQ ID NO:55)在61位不同。因此,编码sc重链的氨基酸或者核苷酸序列可以被从N修饰为Y,以产生生殖系序列。下表10-13描述了对于sc 133、sc 188和sc 264与生殖系的这些变化。每行代表在由黑体字表示的位点处独特的生殖系和非生殖系残基的组合。可以被突变回生殖系序列的抗体序列的特定例子包括:sc 133,其中重链70位氨基酸L被突变回生殖系的氨基酸M(本文称作133TMT);sc 133,其中轻链93位氨基酸N被突变回生殖系的氨基酸D(本文称作sc 133 WDS);以及sc 264,其中轻链氨基酸84位的A被突变回生殖系的氨基酸D(本文称作sc 264ADY)。
在一个实施方式中,本发明的特征在于修饰了CDR区即CDR1,CDR2和/或CDR3中的一个或者更多个氨基酸。在一个实施例中,本文所描述的抗体重链的CDR3被修饰。典型地,氨基酸被替代为具有类似侧链的氨基酸(保守氨基酸取代)或者可以被替代为任何适当的氨基酸例如丙氨酸或者亮氨酸。在一个实施方式中,sc 264 CDR3、VATGRGDYHFYAMDV(SEQID NO:30的氨基酸残基100-114)可以在一个或者更多个氨基酸处被修饰。申请人已经证明CDR3区可以被修饰,而不会对活性有不利影响,即参见sc 264RAD,其中CDR3区中的第二个G已经被替代成A。还涉及了CDR3区中的其他修饰。在另一个实施方式中,sc 133 CDR3区,RLDV可以在一个或者更多个氨基酸处被修饰,包括将L替代为A和/或V替代为A。替代氨基酸的手段是本领域中公知的,包括定点诱变。
在另一个实施方式中,本发明包括替换序列中可能影响本发明抗体结合的异质性或特异性的结构责任(structural liability)。在一个实施例中,抗体sc 264在CDR3区中具有RGD序列,其可能造成交叉结合。因此,RGD中的甘氨酸残基可能被丙氨酸取代(sc 264RAD)。
表10:sc 133重链(SEQ ID NO:14)在指定的残基编号处突变成生殖系(SEO ID
NO:49)的示范性突变
54 | 57 | 70 | 76 |
N | G | M | T |
N | G | L | I |
N | G | L | T |
N | D | M | I |
N | D | L | I |
N | D | M | T |
N | D | L | T |
K | G | M | I |
K | G | M | T |
K | G | L | I |
K | G | L | T |
K | D | M | I |
K | D | L | I |
K | D | M | T |
表11:sc 188轻链(SEO ID NO:24)在指定的残基编号处突变成生殖系(SEO ID
NO:61)的示范性突变
26 | 28 | 29 | 32 | 47 |
G | S | V | S | L |
G | S | V | S | P |
G | S | V | R | P |
G | S | V | R | L |
G | S | V | R | L |
G | S | V | S | P |
G | S | I | R | P |
G | S | I | R | L |
G | T | V | R | L |
G | T | V | S | P |
G | T | V | S | L |
G | T | I | R | P |
G | T | I | R | L |
G | T | I | S | L |
S | S | V | S | P |
S | S | V | R | P |
S | S | V | R | L |
S | S | V | R | L |
S | S | V | S | P |
S | S | I | R | P |
S | S | I | R | L |
S | T | V | R | L |
S | T | V | S | P |
S | T | V | S | L |
S | T | I | R | P |
S | T | I | R | L |
S | T | I | S | L |
表12:sc 188重链(SEQ ID NO:22)在指定的残基编号处突变成生殖系(SEQ ID
NO:56)的示范性突变
33 | 37 | 45 | 60 | 78 | 83 | 85 |
G | S | K | Y | N | K | S |
G | S | K | Y | N | K | T |
G | S | K | Y | N | N | S |
G | S | K | Y | N | N | T |
G | S | K | Y | K | N | S |
G | S | K | Y | K | N | T |
G | S | K | Y | K | K | S |
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G | S | K | S | K | N | S |
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33 | 37 | 45 | 60 | 78 | 83 | 85 |
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V | I | K | S | K | N | S |
V | I | K | S | K | N | T |
V | I | K | S | K | K | S |
V | I | K | S | K | K | T |
V | I | N | Y | N | K | S |
33 | 37 | 45 | 60 | 78 | 83 | 85 |
V | I | N | Y | N | K | T |
V | I | N | Y | N | N | S |
V | I | N | Y | N | N | T |
V | I | N | Y | K | N | S |
V | I | N | Y | K | N | T |
V | I | N | Y | K | K | S |
V | I | N | Y | K | K | T |
V | I | N | S | N | K | S |
V | I | N | S | N | K | T |
V | I | N | S | N | N | S |
V | I | N | S | N | N | T |
V | I | N | S | K | N | S |
V | I | N | S | K | N | T |
V | I | N | S | K | K | S |
V | I | N | S | K | K | T |
表13:sc 264轻链(SEQ ID NO:32)在指定的残基编号处突变成生殖系(SEQ ID
NO:69)的示范性突变
31 | 36 | 84 |
Y | H | A |
Y | H | D |
Y | Q | A |
S | H | D |
S | Q | D |
S | Q | A |
实施例10
αVβ6抗体的能力测定
为了根据它们防止HT29细胞粘附到TGFβLAP的能力,而区分抗体,进行下面的粘附检验。
使用50μL 10μg/ml TGF β1 LAP(TGFβLAP)对Nunc MaxiSorp(Nunc)板进行包被过夜,并在检验之前使用3%BSA/PBS预封闭1小时。将HT29细胞培养到最佳密度,接着沉淀并在HBBS(具有1%BSA而没有Mn2+)中清洗两次,之后接着30,000个细胞/孔将细胞重悬浮在HBSS中。从板除去包被液,接着使用100μL 3%BSA在室温下封闭1小时,之后使用PBS清洗两次。
以1∶3系列稀释,以30μL终体积以及两倍终浓度制备抗体滴定液。注意确保对照孔中的PBS浓度与最稀释的抗体孔中PBS浓度匹配。将30μL细胞加入到每个孔中,并在存在抗体时,将细胞在4℃下在V底板中孵育40分钟。将细胞-抗体混合物转到经包被的板,并在37℃下孵育40分钟。接着将经包被的板上的细胞在温HBSS中清洗4次,之后将细胞在-80℃下冷冻15分钟。在室温下使细胞熔化,接着根据制造商的说明书向每个孔中加入100μLCyQuant染料/裂解缓冲液(Molecular Probes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。正如通过阳性和阴性对照孔所测定的,根据在检验中可能的细胞粘附的最大量和最小量计算每种mAb的估计IC50值,表41中概述了12种抗体的结果。
表14.粘附检验结果(估计IC50值)
实施例11
竞争检验
为了确定抗体特异性地能够阻断αVβ6整合蛋白结合可溶性TGFβLAP,使用纯化的抗体运行竞争检验,以测量它们结合αVβ6并阻断其结合GST-LAP肽的能力。
将结合培养基96孔板(Costar,catalog#3368)包被50μL/孔10μg/ml PBS以及0.05%叠氮化钠中的GST-LAP,并在4℃下孵育过夜。接着使用300μL/孔检验稀释液(在TBS(50mM Tris,50mM NaCl,1mM MgCl2和1mM CaCl2,pH 6.9)中的牛奶)将板清洗3次,之后使用300μL/孔TBS中的5%牛奶将板进行封闭,并在室温下孵育30分钟。将mAb(以10μg/ml~0.01μg/ml范围内的1∶3系列稀释)与αVβ6(在含有0.05%叠氮化钠的检验稀释液中为250ng/ml)孵育过夜。第二天,将50μL/孔预孵育的第一抗体转移到包被GST-LAP肽的板,并在室温下孵育1小时。接着使用300μL/孔的检验稀释液将孔清洗3次。接着,为了检测结合到板的αVβ6的量,以在检验稀释液中1μg/ml的浓度加入mAb 2075(Chemicon)(50μL/孔),并在室温下孵育1小时。接着使用300μL/孔的检验稀释液将孔清洗3次,并与检验稀释液中的400ng/ml山羊抗-小鼠IgG Fc-过氧化物酶(50μL/孔)在室温下孵育1小时。接着使用300μL/孔的检验稀释液将孔清洗3次,并使用1-step TMB(Neogen)以总体积为50μL/孔进行显影。15分钟后,使用50μL/孔的1N盐酸淬灭显影反应。在450nm处读取板,图1中概述了5种抗体的结果,其显示抗体能够抑制αVβ6结合GST-LAP。
实施例12
与αVβ3或者αVβ5整合蛋白的交叉反应
为了确定抗体仅针对αVβ6整合蛋白有功能,而对αVβ3或者αVβ5整合蛋白没有功能,进行下面的检验以测试抗体抑制A375M细胞粘附到骨桥蛋白肽的能力。
将检验板包被骨桥蛋白肽。使用两种骨桥蛋白肽:OPN 17-168和OPN 17-314。在检验前使用3%BSA/PBS将检验板进行预封闭1小时。从培养瓶中取出A375M细胞,沉淀,并使用含有1%BSA和1mMCa2+与1mM Mg2+的HBSS清洗两次。接着将细胞悬浮在HBSS中,浓度为每孔30,000个细胞。除去含有骨桥蛋白片段的涂覆液,在室温下使用100μL 3%BSA对板进行封闭1小时。使用含有1%BSA的HBSS将经涂覆的板进行清洗两次。以1∶4系列稀释制备两次30L终体积以及终浓度的抗体滴定液。将重悬浮的细胞加入到V底板中含有滴定法测量的抗体的孔中,并将细胞和抗体在4℃下共孵育40分钟。接着,将细胞-抗体混合物转移到经包被的板上,之后在37℃下孵育40分钟。下一步在温HBSS中将经包被板上的细胞清洗4次,接着将板中的细胞在-80℃下冷冻15分钟。在室温下融化细胞,接着根据制造商的指导向每个孔中加入100μL CyQuant染料/裂解缓冲液(Molecular Probes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。
表15中概述了5种抗体的结果。在该检验中使用商业购得的αV整合蛋白特异性抗体用作阳性对照,并表现出抑制大约90%的粘附。在该粘附检验中商业购得的αVβ6抗体作为αVβ3或者αVβ5整合蛋白的阴性对照。所有抗体均以5μg/ml的浓度进行测试,并且没有测试抗体能够阻断粘附αVβ3或者αVβ5整合蛋白。
表15.αVβ3或者αVβ5整合蛋白的交叉反应
抗体ID | 抑制百分比 |
sc 133 | 3 |
sc 188 | -2 |
sc 254 | -5 |
sc 264 | 3 |
sc 298 | 9 |
αV对照 | 89 |
αVβ6对照 | 11 |
人IgG对照 | 3 |
小鼠IgG对照 | 5 |
实施例13
与α4Vβ1整合蛋白的交叉反应
为了确定抗体仅对αVβ6整合蛋白有功能,而对α4β1整合蛋白没有功能,进行检验以测试抗体抑制J6.77细胞粘附纤连蛋白CS-1肽的能力。除了使用J6.77细胞进行结合,以及将纤连蛋白CS-1肽用于包被检验板以外,根据实施例12中所描述的,进行该检验。
表16中概述了11种抗体的结果。商业购得的β1整合蛋白特异性抗体在该检验中用作阳性对照,其表现出抑制97%的粘附。商业购得的αVβ6特异性抗体在该检验中作为粘附α4β1的阴性对照。所有抗体均以5μg/ml的浓度进行测试,并且没有测试抗体能够阻断粘附α4β1。
表16.与α4β1整合蛋白的交叉反应
抗体5ug/ml | 抑制百分比 |
sc 58 | -14 |
sc 97 | -7 |
sc 133 | -15 |
sc 161 | 12 |
sc 188 | -10 |
sc 254 | 0 |
sc 264 | -8 |
sc 277 | -17 |
sc 298 | -7 |
sc 320 | -8 |
sc 374 | -8 |
人IgG1 | -6 |
人IgG2 | -9 |
抗-beta1整合蛋白抗体 | 97 |
抗-αVβ整合蛋白抗体 | -15 |
板上没有CS-1或者抗体 | 12 |
CS-1片段包被的没有抗体的板 | 10 |
实施例14
与α5β1整合蛋白的交叉反应
为了确定抗体仅对αVβ6整合蛋白有功能,而对α5β1整合蛋白没有功能,进行粘附检验以测试抗体抑制K562粘附纤连蛋白的能力。
以12.5μg/mL的浓度,将检验板包被纤连蛋白的FN9-10肽。在检验前使用3%BSA/PBS将检验板进行预封闭1小时,。从培养瓶中取出K562细胞,从培养瓶中取出A375M细胞,沉淀,并使用含有1%BSA和1mM Ca2+与1mM Mn2+的HBSS清洗两次。接着将细胞悬浮在HBSS中,浓度为每孔30,000个细胞。除去含有骨桥蛋白片段的涂覆液,在室温下使用100μL 3%BSA对板进行封闭1小时。使用含有1%BSA的HBSS将经涂覆的板进行清洗两次。以1∶4系列稀释制备两次30L终体积以及终浓度的抗体滴定液。将重悬浮的细胞加入到V底板中含有滴定法测量的抗体的孔中,并将细胞和抗体在4℃下共孵育60分钟。接着,将细胞-抗体混合物转移到经包被的板上,之后在37℃下孵育40分钟。在温HBSS中将经包被板上的细胞清洗4次,接着将板中的细胞在-80℃下冷冻15分钟。在室温下融化细胞,接着根据制造商的指导向每个孔中加入100μL CyQuant染料/裂解缓冲液(Molecular Probes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。
表17中概述了5种抗体的结果。将测试抗体与商业购得的作为阳性对照的α5β1抗体以及作为阴性对照的αVβ6特异性抗体进行比较。在该检验中,测试抗体以在该检验中所使用的5μg/ml浓度都不能够阻断粘附。
表17.与α5β1整合蛋白的交叉反应
抗体ID | 抑制百分比 |
sc 133 | -12 |
sc 188 | 5 |
sc 254 | -9 |
sc 264 | -4 |
sc 298 | 2 |
αVβ6对照 | 7 |
α5β1对照 | 78 |
人IgG对照 | 11 |
实施例15
与鼠和猕猴αVβ6整合蛋白的交叉反应
为了确定是否抗体表现出与小鼠αVβ6或者猕猴αVβ6的交叉反应,进行下列检验。
使用对瞬时转染猕猴或者小鼠αV,β6,或者αVβ6的HEK-293细胞进行的FACS分析,对纯化的mAb进行mAb与短尾猿和小鼠αVβ6的交叉反应。转染后大约48小时,收集细胞并重悬浮在FACS缓冲液中以达到100μL中大约50,000个细胞的终浓度。
如下在每个反应中使用总共大约100,000个细胞。将200μL 293细胞分配到V底板中。以1500rpm 3分钟将板中的细胞沉淀,接着重悬浮在100μL FACS缓冲液中。重复沉淀步骤,并除去FACS缓冲液上清液。以50μL的体积加入纯化的mAb、或者对照第一抗体,并重悬浮细胞。对照第一抗体是鼠αVβ6(Cat#MAB2077z,Chemicon)以及重组抗-αV和抗-β6抗体。将板在冰上孵育45分钟,之后加入100μLFACS缓冲液以稀释第一抗体。接着通过在1500rpm下离心3分钟而使细胞沉淀,并将沉淀重悬浮在100μL FACS缓冲液中。重复沉淀步骤,除去FACS缓冲液上清液。接着,将细胞重悬浮在具有7AAD染料(10μg/ml)的适当二抗(5μg/ml)中,并在冰上染色7分钟。接着加入150μL FACS缓冲液,并以1500rpm 3分钟沉淀细胞,之后在100μLFACS缓冲液中清洗细胞,沉淀,接着重悬浮在250μL缓冲液中,并加入到FACS管中。在高通量FACS机器上分析样品,并使用Cell Quest Pro软件进行分析。
结果概述在表18中,证明mAb sc 133和mAb sc 188明显与小鼠和猕猴αVβ6或β6交叉反应。mAb sc 254似乎与β6、αV和Vβ6交叉反应。mAb sc 264和298与亲代细胞有高水平的结合,这使得这些种类的交叉反应难以辨别。
表18.与小鼠和猕猴αVβ6的交叉反应
数据表示转移的细胞的百分比。
实施例16
内化检验
使用稳定表达人αVβ6的K562细胞系测试抗体的内化。将纯化的抗体的内化与商业购得的在该检验中不会被内化的αVβ6抗体进行比较。
结果概述在表19中。
表19.内化检验的概述
抗体 | 浓度(ug/mL) | 内化百分比 |
sc 133 | 10 | 28% |
sc 133 | 1 | 30% |
sc 188 | 10 | 38% |
sc 188 | 1 | 34% |
sc 254 | 10 | 49% |
sc 254 | 1 | 39% |
sc 264 | 10 | 76% |
sc 264 | 1 | 77% |
sc 298 | 10 | 28% |
sc 298 | 1 | 26% |
实施例17
高精度BIACORE分析
对于5种αVβ6抗体进行使用可溶性αVβ6结合固定在CM5芯片上的抗体的高精度Biacore分析,以测定它们与可溶性抗原的亲和力。
如下进行Biacore分析。使用常规的胺连接制备在两片CM5Biacore芯片上的高密度山羊α人IgG抗体。将每种mAb稀释在除气的HBS-P电泳缓冲液中达到大约1μg/mL的浓度,其中在HBS-P电泳缓冲液中含有100μg/ml BSA、1mM MgCl2和1mM CaCl2。更精确地,将mAb sc133稀释到0.98μg/mL,mAb sc 188稀释到0.96μg/mL,mAb sc 264稀释到0.94μg/mL,mAb sc254.2稀释到0.87μg/mL,以及mAb sc 298稀释到1.6μg/mL。接着对每种mAb开发捕获水平规程,其通过在每种细胞流上捕获每种mAb,其中所述细胞流的流速为10μL/分钟,浓度如上所列。将mAb sc 133、sc 298和sc 254.2捕获30秒,而将mAb sc 188和sc 264捕获1分钟。以50μL/分钟进行4分钟的清洗步骤,以稳定mAb。
对于mAb sc 133,sc 188,sc 264,and sc 298以116~3.6nM范围的浓度,对于mAbsc 254.2以233~3.6nM范围的浓度,注射可溶性αVβ64分钟,其中对于每个浓度范围采用2x系列稀释。每次抗原注射后,进行10分钟解离。在上面所述的HBS-P电泳缓冲液中制备抗原样品。将所有样品三份随机注射,其中散布某些mAb捕获/缓冲液注射循环进行双参照。在每次流速100μL/分钟的循环后,使用一次18秒脉冲146mM磷酸(pH 1.5)。对于所有的抗原注射循环使用50μL/分钟的流速。
接着使用CLAMP将数据拟合到1∶1相互作用模型,其中包括物质转运的期间。所得到的结合常数列于表20中。按照最高到最低亲和力列出mAb。
表20.从高精度BiacoreTM测定的克隆和纯化的mAb的亲和力结果
抗体 | Rmax | ka(M-1s-1) | kd(s-1) | KD(nM) |
sc 264 | 96 | 5.85×104 | 3.63×10-4 | 6.2 |
sc 298 | 77 | 5.65×104 | 1.18×10-3 | 21.0 |
sc 188 | 76 | 4.52×104 | 9.56×10-4 | 21.2 |
sc 133 | 96 | 5.73×104 | 1.89×10-3 | 33.0 |
sc 254.2 | 53,45 | 5.73×104 | 5.64×10-4 | 34.9 |
实施例18
使用FACS的结合亲和力分析
作为Biacore的替代,还使用FACS分析评估抗体之一与K562细胞的结合亲和力,其中K562细胞稳定表达人αVβ6抗原。对抗原的量进行滴定,以产生结合曲线,并评估与抗原的亲和力。
将表达αVβ的K562细胞重悬浮在经过滤的HBSS缓冲液中,浓度为大约600万个细胞/mL,其中HBSS缓冲液含有1mM MgCl2以及1mM CaCl2。将细胞保持在冰上。通过96孔板中的11个孔,以1∶2的因子在HBSS中系列稀释纯化。在每排的第12个孔中仅含有缓冲液。滴定进行三次。向每个孔中加入额外的HBS和细胞以便终体积为300μL/孔,并且每个孔含有大约120,000个细胞。mAb sc 188的分子终浓度为4.9~0.019nM。在4℃下,将板置于板摇晃器中5小时,之后,将板进行离心,并时候HBSS清洗3次,随后,向每个孔中加入200μL 131nM Cy5山羊α-人多克隆抗体(Jackson Laboratories,#109-175-008)。接着在4℃下将板摇晃40分钟,之后,离心并再使用HBSS清洗3次。使用FACSCalibur仪器记录每种mAb浓度的20,000个“事件”的几何平均荧光(GMF),对相应的三次滴定点进行平均化以提供一个每种mAb浓度的GMF点。将使用Scientist软件的平均GMF作为分子mAb浓度函数的图进行非线性拟合,其使用下列公式:
在上面的公式中,F=几何平均荧光,LT=总分子mAb浓度,P’=任意荧光单元与结合的mAb的比例常数,M=以摩尔计的细胞浓度,n=每个细胞的受体数目,B=背景信号,以及KD=平衡解离常熟。对于mAb sc 188,当P’,n,B和KD能够自由地在非线性分析中浮动时,获得对KD的评估。
图2中显示了具有其非线性拟合(红线)的所得到图。表21列出了mAb sc 188所得到的KD,以及拟合的95%置信区间。mAb sc 188的这些结果表示与一种受体类型结合。
根据FACS所测定的sc 188的结合亲和力显著地比通过Biacore测定的高(实施例17)。对于sc 188,KD值中的区别有至少两种可能的解释。第一中原因是两种检验使用不同形式的抗原进行测量-Biacore使用可溶性抗原,FACS则使用细胞-结合形式的抗原。第二中原因是抗体在针对细胞结合形式抗原时会被测处提高,而它们不会以结合细胞-结合抗原一样高的亲和力结合可溶性抗原。
表21.使用FACS的结合亲和力分析
抗体 | KD(pM) | 95%CI(pM) |
sc 188 | 51.9 | ±22.7 |
实施例19
CDC检验
上面实施例中所描述的纯化的抗体是IgG1同种型,并且可能具有效应子功能。为了测定这些抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力,使用稳定表达αVβ6的293细胞(293-10A11)以及亲代293细胞(293F)进行下列检验。
为进行钙黄绿素细胞染色,将等份的HT29,293-10A11和293F每一种的大约25×106个细胞分别重悬浮在3ml无血清RPMI培养基中。接着,将45μL 1mM钙黄绿素加入每一个3ml的细胞样品中,并在37℃下孵育细胞45分钟。在1200xRPM下离心细胞3分钟,弃上清液,并将细胞重悬浮在每种各自细胞系的培养基中。重复离心步骤,并将细胞重悬浮以得到在50μL培养基中大约100,000个细胞的终浓度。
在v-底96孔板中制备每种抗体的系列1∶2稀释液,其浓度在20μg/ml~0.625μg/ml的范围内,体积为50μL。接着将如上制备的100,000个细胞以50μL的体积加入到含抗体的板中,并将所得到的混合物孵育在冰上2小时。在孵育之后,沉淀细胞,并弃上清液。将细胞重悬浮在100μL它们各自的含有10%人血清(ABI供体#27)的培养基中,并在37℃下孵育30分钟。接着对细胞进行离心,并将80μL上清液转至FMAT板。使用485nm的激发波长和530nm的发射波长在Tecan上对板进行读取。
图3A~3E中概述了结果,并证明所测试的每种纯化的抗体都能够在稳定表达αVβ6整合蛋白的293细胞中介导CDC。
实施例20
定点诱变
从免疫(实施例1)制备的抗体(sc 264)之一显示在TGFβLAP结合抑制检验(参见实施例4)中体外强功能阻断活性,但显示与表达非-αVβ6的细胞系的交叉反应结合(参见实施例15)。Th是抗体sc 264,其在CDR3区中具有RGD序列,其被认为负责交叉反应结合。因此,定点诱变被用于RGD中将甘氨酸残基替代为丙氨酸(sc 264 RAD)。
另一个抗体(sc 188)在FR3区中具有糖基化位点。通过定点诱变利用将NLT替代为KLT而除去该位点(sc 188 SDM)。接着,根据在实施例7和8中所描述的,表达和纯化这两种抗体的突变版本,并根据在下面的实施例中所描述的,对纯化的抗体进行分析。
实施例21
测试突变抗体的交叉反应结合的结合检验
进行结合检验,以测试在实施例15中所观察到的交叉反应结合会由于sc 264的定点诱变而降低。对293T和293F细胞系进行分析抗体的结合,以测试是否从sc 264除去RGD位点会导致与原始抗体相比结合减少。
在收集后,将293T和293F离心下来,并重悬浮在具有1%BSA和1mM CaCl2和1mMMgCl2(清洗缓冲液)的HBSS中,以便在每次反应中使用至少150,000个细胞。在V底96孔板中在反应之间将细胞进行分开,以1500rpm 3分钟,将板中细胞沉淀,之后除去HBSS上清液。以表10中所表示的浓度加入体积50μL的第一抗体,并将细胞重悬浮,之后在冰上孵育60分钟。孵育后,通过1500rpm离心3分钟沉淀细胞,并将细胞重悬浮在100μL清洗缓冲液,接着再次沉淀。接着将细胞重悬浮在2μg/ml适当的具有7AAD的第二抗体中,并在冰上染色7分钟,之后加入150μL清洗缓冲液,并以1500rpm 3分钟沉淀细胞,接着重悬浮在100μL具有1%BSA的HBSS中。在具有HTS附件的FACS机器上对样品进行读取,并使用Cell Quest Pro软件对数据进行分析。表22中概述了这些结果,数据是以任意单位表示的几何平均转移。这些数据证明以所有所测试的浓度,与mAb sc 264相比,sc 264 RAD与亲代293T细胞的结合显著得少。
表22.突变抗体与亲代细胞的交叉反应
抗体 | 浓度(ug/ml) | 293T细胞 | 293T-αVβ6细胞 |
无 | n/a | 3 | 2 |
小鼠IgG2a | 20 | 27 | 8 |
人IgG1 | 20 | 4 | 4 |
抗-αVβ6 | 20 | 4 | 5 |
sc 264 | 20 | 433 | 6673 |
sc 264 RAD | 20 | 44 | 7241 |
sc 188 | 20 | 27 | 6167 |
sc 188 SDM | 20 | 25 | 6758 |
sc 264 | 5 | 88 | 6418 |
sc 264 RAD | 5 | 13 | 6840 |
sc 188 | 5 | 9 | 5822 |
sc 188 SDM | 5 | 9 | 6822 |
sc 264 | 1.25 | 24 | 6230 |
sc 264 RAD | 1.25 | 7 | 4890 |
sc 188 | 1.25 | 6 | 6395 |
sc 188 SDM | 1.25 | 5 | 4532 |
实施例22
突变抗体的能力分析
为了测定抑制TGFβLAP-介导的HT-29细胞的粘附所需要的突变αVβ6抗体的浓度(IC50),进行下列检验。
使用50μL 10μg/ml TGF β1 LAP(TGFβLAP)对Nunc MaxiSorp(Nunc)板进行包被过夜,并在检验之前使用3%BSA/PBS预封闭1小时。将HT29细胞培养到最佳密度,接着沉淀并在HBBS(具有1%BSA,1mM Ca2+和1mM Mg2+)中清洗两次,之后接着30,000个细胞/孔将细胞重悬浮在HBSS中。从板除去包被液,接着使用100μL 3%BSA在室温下封闭1小时,之后使用PBS清洗两次。
以1∶4系列稀释制备两次30μL终体积以及终浓度的抗体滴定液。注意确保对照孔中的PBS浓度与最稀释的抗体孔中PBS浓度匹配。将30μL细胞加入到每个孔中,并在存在抗体时,将细胞在4℃下在V底板中孵育40分钟。将细胞-抗体混合物转到经包被的板,并在37℃下孵育40分钟。接着将经包被的板上的细胞在温HBSS中清洗4次,之后将细胞在-80℃下冷冻15分钟。在室温下使细胞熔化,接着根据制造商的说明书向每个孔中加入100μLCyQuant染料/裂解缓冲液(Molecular Probes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。表23中概述了12种抗体的结果,并且表明突变抗体的IC50一贯低于每种原始抗体的。
表23.抑制TGFβLAP-介导的HT-29细胞的粘附所需要的突变αVβ6抗体的浓度(IC50)
实施例23
突变抗体与α4Vβ1整合蛋白的交叉反应
仅对αVβ6整合蛋白有功能,而对α4β1整合蛋白没有功能,进行检验以测试抗体抑制J6.77细胞粘附纤连蛋白CS-1肽的能力。如下所描述的,进行该检验。
将纤连蛋白CS-1肽包被检验板。在检验使用3%BSA/PBS将检验板进行预封闭前1小时。J6.77细胞培养到汇合,接着从培养瓶中取出,沉淀,并使用HBSS清洗3次。接着将细胞悬浮在HBSS中,浓度为每孔30,000个细胞。除去含有纤连蛋白片段的涂覆液,在室温下使用100μL 3%BSA对板进行封闭1小时。使用含有1%BSA的HBSS将经涂覆的板进行清洗两次。以1∶4系列稀释制备两次30L终体积以及终浓度的抗体滴定液。将重悬浮的细胞加入到V底板中含有滴定法测量的抗体的孔中,并将细胞和抗体在4℃下共孵育40分钟。接着,将细胞-抗体混合物转移到经包被的板上,之后在37℃下孵育40分钟。下一步在温HBSS中将经包被板上的细胞清洗4次,接着将板中的细胞在-80℃下冷冻15分钟。在室温下融化细胞,接着根据制造商的指导向每个孔中加入100μL CyQuant染料/裂解缓冲液(Molecular Probes)。在485nm的激发波长和530nm的发射波长处读取荧光。
表24中概述了两种突变抗体和它们非突变对应物的结果。在该检验中使用商业购得的β1整合蛋白特异性抗体用作阳性对照,并表现出抑制大约90%的粘附。在该粘附检验中商业购得的αVβ6抗体作为α4β1整合蛋白的阴性对照。所有抗体均以5μg/ml的浓度进行测试,并且没有测试抗体能够阻断粘附α4β1。
表24.与α4β1整合蛋白的交叉反应
抗体5ug/ml | 抑制百分比 |
sc.188 | 2 |
sc.188 SDM | -6 |
sc.264 | -30 |
sc.264 RAD | -2 |
人IgG1 | 26 |
人IgG2 | 13 |
人IgG4 | 15 |
抗-β1整合蛋白 | 95 |
实施例24
突变抗体与α5β1整合蛋白的交叉反应
仅对αVβ6整合蛋白有功能,而对α5β1整合蛋白没有功能,进行粘附检验以测试抗体抑制K562粘附纤连蛋白的能力。根据实施例14中所描述的,进行该检验。表25中概述了这些结果,并且证明没有所测试侧抗体能够阻断粘附α5β1。
表25.与α5β1整合蛋白的交叉反应.
抗体ID | %抑制 |
sc 188 | -5 |
sc 188 SDM | -8 |
sc 264 | 3 |
sc 264 RAD | 6 |
αVβ6对照 | -16 |
α5β1对照 | 78 |
人IgG对照 | -12 |
实施例25
突变抗体与小鼠和猕猴αVβ6整合蛋白的交叉反应
为了确定是否突变αVβ6-特异性抗体表现出与小鼠αVβ6或者猕猴αVβ6的交叉反应,进行下列检验。
在收集后,将K562亲代细胞或者表达猕猴或者小鼠αVβ6的K562细胞离心下来,并重悬浮在具有1%BSA和1mM CaCl2和1mMMgCl2(清洗缓冲液)的HBSS中,以便在每次反应中使用至少150,000个细胞。在V底96孔板中在反应之间将细胞进行分开,以1500rpm 3分钟,将板中细胞沉淀,之后除去HBSS上清液。以50μL的体积加入第一抗体,并将细胞重悬浮,之后在冰上孵育60分钟。孵育后,通过1500rpm离心3分钟沉淀细胞,并将细胞重悬浮在100μL清洗缓冲液,接着再次沉淀。接着将细胞重悬浮在2μg/ml适当的具有7AAD的第二抗体中,并在冰上染色7分钟,之后加入150μL清洗缓冲液,并以1500rpm 3分钟沉淀细胞,接着重悬浮在100μL具有1%BSA的HBSS中。在具有HTS附件的FACS机器上对样品进行读取,并使用CellQuest Pro软件对数据进行分析。表26中概述了这些结果,数据是以任意单位表示的几何平均转移。这些数据证明以所有所测试的浓度,sc 264 RAD和sc 188 SDM表现出与小鼠和猕猴αVβ6的交叉反应。
表26.与小鼠和猕猴αVβ6的交叉反应
抗体 | 亲代 | 小鼠αVβ6 | 猕猴αVβ6 |
仅细胞 | 3 | 3 | 3 |
Gt抗小鼠 | 5 | 6 | 7 |
抗αVβ6 | 15 | 122 | 84 |
抗αV | 109 | 144 | 163 |
抗β6 | 26 | 43 | 37 |
小鼠IgG2a | 23 | 36 | 25 |
小鼠IgG1 | 12 | 20 | 13 |
Gt抗人 | 7 | 12 | 7 |
人IgG1 | 46 | 108 | 54 |
sc 133 | 57 | 246 | 154 |
sc 188 | 55 | 227 | 139 |
sc 188 SDM | 47 | 219 | 142 |
sc 254 | 98 | 260 | 190 |
sc 264 | 33 | 160 | 121 |
sc 264 RAD | 48 | 196 | 139 |
sc 298 | 33 | 150 | 97 |
实施例26
内化检验
使用稳定表达人αVβ6的K562细胞系测试突变抗体的内化。根据在实施例15中所描述的,进行该检验。将纯化的抗体的内化与商业购得的αVβ6抗体进行比较,在该检验中商业购得的αVβ6抗体不被内化。
表27概述了这些结果,并证明sc 264RAD突变抗体被内化,其显著地低于未突变sc264。
表27.内化检验的概述
抗体 | 浓度(ug/ml) | 内化百分比 |
sc 264 | 10 | 75% |
sc 264 | 1 | 47% |
sc 264 RAD | 10 | 42% |
sc 264 RAD | 1 | 31% |
sc 188 | 10 | 18% |
sc 188 | 1 | 27% |
sc 188 SDM | 10 | 22% |
sc 188 SDM | 1 | 17% |
实施例27
使用FACS分析SC 264 RAD的结合亲和力
根据如实施例18中所述测量sc 264 RAD抗体与αVβ6的结合亲和力。表28中概述了该检验的结果,并证明sc 264 RAD抗体具有<50pM的亲和力。
表28.使用FACS分析亲和力亲和力
mAb样品 | KD(pM) | 95%CI(pM) |
sc 264RAD | 46.3 | ±15.9 |
实施例28
SC 264 RAD与SC 264 RAD/ADY活性的比较
在Detroit-562粘附检验中比较sc 264 RAD抗体和生殖系d(GL)版本的264RAD(在轻链中含有突变A84D)、264RAD/ADY的活性。
在4℃下将板包被0.5μg/ml GST-TGF-b LAP融合蛋白过夜,第二天早上进行清洗,并接着使用3%BSA/PBS封闭1小时。接着将Detroit-562细胞(每孔25000个细胞)在37℃下在含有2mM MgCl2的HBSS中粘附到板上持续45分钟。45分钟后,将板在PBS中清洗3次,接着在乙醇中固定。通过使用Hoescht对细胞进行可视化,并在Cellomics Arrayscan II上,通过计算每孔结合的细胞的数目而进行定量。
图5中的数据显示sc 264 RAD和sc 264 RAD/ADY都具有类似的活性,并且在修饰的抗体中保持了阻断αVβ6的能力。
实施例29
生长研究
为了确定抗体264RAD,133和188SDM在体内阻断αVβ6功能,均对其测试抑制αVβ6阳性肿瘤异种移植物的生长的能力。一种这类模型是Detroit-562鼻咽癌细胞系(nasophayngeal cell line),其表达αVβ6,还生长为皮下肿瘤异种移植物。
将Detroit 562细胞培养在EMEM中,其具有Earle′s BSS以及2mML-Glu+1.0mM丙酮酸钠、0.1mM NEAA+1.5g/L碳酸氢钠+10%FBS。收集细胞,并重悬浮在50%PBS+50%基质胶(matrigel)中。接着以0.1ml的体积将悬浮液在小鼠的右侧植入每只小鼠5x10-6个细胞。动物是6-8周的NCR雌性裸鼠。在肿瘤达到0.1cm3时,开始给药,并在整个研究过程中以每周一次20mg/kg的剂量给药。
所有三种抗体均抑制肿瘤生长(参见图4)。264RAD最有效,接着是133和188。该数据明显表示抗体264RAD、133和188在体内有活性,并且能够降低依赖αVβ6信号传导进行生长的肿瘤的生长。
通过参照并入
本文引述的所有参考文献,包括专利、专利申请、论文、教科书等及其中引述的参考文献,通过引用整体结合到本文中。
等同
前面的书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。前面的说明内容和实施例详述了本发明的某些优选实施方案,描述了本发明人所构思的最佳方式。但是需要认识到,前述内容无论在文本上可能显得如何详尽,本发明都还可用多种方式进行实施,本发明应按照所附权利要求或其任何等同权利要求进行解释。
Claims (18)
1.分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段特异性结合αVβ6整合蛋白,所述抗体或其片段包含:
(i)包含重链可变区的重链多肽,所述重链可变区具有CDR1、CDR2和CDR3序列,其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列为由SEQ ID NO.14序列组成的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列;和
(ii)包含轻链可变区的轻链多肽,所述轻链可变区具有CDR1、CDR2和CDR3序列,其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列为由SEQ ID NO.16序列组成的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其片段包含:
包含重链可变区的重链多肽,所述重链可变区由SEQ ID NO.:14的序列组成;以及
包含轻链可变区的轻链多肽,所述轻链可变区由SEQ ID NO.:16的序列组成。
3.权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合片段,其具有以下特征的一个或多个:
抑制配体结合αVβ6;
抑制大于99%的TGFβ-LAP介导的HT29细胞的粘附;
以低于0.070μg/ml的IC50抑制TGFβ-LAP介导的HT29细胞粘附;和/或
以低于35纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。
4.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合片段,其以低于25纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。
5.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合片段,其以低于10纳摩尔(nM)的Kd结合αVβ6。
6.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合片段,其以低于60皮摩尔(pM)的Kd结合αVβ6。
7.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述分离的抗体是全人单克隆抗体。
8.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段,其中所述抗原结合片段选自:Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、FV、dAb和单链抗体scFv或scFv2。
9.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段,其与药物上可以接受的载体结合。
10.核酸分子,其编码权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
11.载体,其包含权利要求10的核酸分子。
12.宿主细胞,其包含权利要求11的载体。
13.生产如权利要求1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段的方法,其包括培养权利要求12的宿主细胞。
14.权利要求1-9中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段在制备治疗动物中恶性肿瘤的药物中的用途,其中所述恶性肿瘤与异常αVβ6信号传导相关。
15.权利要求14的用途,其中所述恶性肿瘤选自:黑素瘤、神经胶质瘤、肝细胞癌、甲状腺瘤、胃癌、***癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食道癌、头颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆管腺癌、小肠腺癌、表皮样癌和鼻咽癌。
16.权利要求15的用途,其中所述肺癌为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。
17.权利要求15的用途,其中所述恶性肿瘤为小儿恶性肿瘤。
18.权利要求1-9中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段在制备治疗炎症的药物中的用途,其中所述炎症与异常αVβ6信号传导相关。
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