CN103519170A - 一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法 - Google Patents

一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法。该方法是用75-85%食用乙醇为溶剂，料液比1:30-50，65-75℃水浴浸提4h，抽滤液浓缩至原体积的1/8-1/10，放入高压反应釜内，蒸气压0.6-0.8MPa，水解20-60min，离心收集沉淀，60℃烘干，即可获得高活性荞麦叶黄酮产品。该产品总黄酮纯度由高压水解前的73.5%提高到90.6%。DPPH自由基的清除率比水解前提高9.7%。此方法可使生理活性更高的异槲皮素和槲皮素含量增加，前者由水解前的检测不到提高到3.27-20.6%，后者由水解前的2.2%提高到8.2-22.78%。本发明还具有废物利用、成本低、无污染、操作简单等优点。

Description

一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法
技术领域
本发明涉及荞麦叶黄酮，具体属于一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法及其产品。
背景技术
荞麦为蓼科荞麦属、双子叶植物，荞麦籽粒、根、茎、叶及花均含有丰富的黄酮类化合物。荞麦叶中黄酮类物质的主要成分是芦丁，槲皮素微量。化学结构分析揭示芦丁是槲皮素的芸香糖苷，异槲皮素是槲皮素的葡萄糖苷，芦丁可被水解为异槲皮素或槲皮素，异槲皮素可被水解为槲皮素。槲皮素、异槲皮素和芦丁的结构式如下：
Figure BDA0000395244570000011
它们三者具有不同的生物利用率和生理活性，细胞生物学研究表明黄酮化合物的吸收利用主要是通过小肠进入血液，且生物利用率由其分子量和亲水性决定，异槲皮素除部分通过自由扩散外，由于其末端含有葡萄糖配体主要通过细胞膜上的钠离子依赖型葡萄糖转运蛋白（SGLT1）即主动运输进入血浆，生物利用率较高；而槲皮素和芦丁只能通过自由扩散进入血浆，生物利用率较低，同时槲皮素因其分子量较小且亲脂性，生物利用率要比芦丁高（参见：Wolffram et al.Quercetin-3-glucoside is transported by the glucose carrier SGLT1across thebrush border membrane of rat small intestine[J].J Nutr.2002,132(4):630-5；Gee JM et al.Intestinal transport of quercetin glycosides in rats involves both deglycosylation and interactionwith the hexose transport pathway[J].J Nutr.2000,130(11):2765-71.）。此外，槲皮素除具有与芦丁相似的生理功能外，还具有防治动脉粥样硬化和降低胆固醇等功效（
Figure BDA0000395244570000012
et al.Effectof quercetin on experimental hyperlipidemia and atherosclerosis in rabbits[J].Pharmacol Rep.2005,57(5):604-9;Auger et al.Dietary wine phenolics catechin,quercetin,and resveratrolefficiently protect hypercholesterolemic hamsters against aortic fatty streak accumulation[J].JAgric Food Chem.2005,53(6):2015-21.）；异槲皮素具有更好的市场前景，其市场价格是芦丁的1000倍以上；体外活性测定表明槲皮素和异槲皮素比芦丁表现出更高的抗氧化活性。因此，对荞麦叶黄酮提取物进行水解转变为异槲皮素和/或槲皮素，可使其生物学活性最大化和多样化，从而促进荞麦黄酮营养保健品以及药物的开发。
常见的水解方法有化学水解、酶法水解以及物理高压水解。化学水解法在反应体系中引入化学试剂，毒性增加且安全性降低；酶法水解虽绿色高效，但目前仍无合适的酶源，酶制剂较昂贵，相比之下，高压水解不失为一种优选方案。在我国荞麦种植面积广泛，但对荞麦叶的开发利用却很低，基本上被当作柴火烧掉了。为提高荞麦叶利用率、变废为宝，我们从荞麦叶中提取黄酮化合物，并通过高压水解将其转变为生理活性更高的黄酮产品，以期进一步开发研制成营养保健品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，该方法制得的荞麦叶黄酮产品中异槲皮素和槲皮素的含量大幅增加，生理活性提高。
本发明提供的一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，包括如下步骤：
1）把荞麦叶洗净烘干、磨碎，得到荞麦叶粉，按料液比1:30-50向荞麦叶粉中加入75-85%的食用乙醇，混合均匀，加热至65-75℃，搅拌浸提4h；
2）浸提结束后，趁热抽滤得滤液，沉淀用2-3倍75-85%食用乙醇清洗、抽滤得滤液，合并滤液；
3）浓缩滤液到原体积的1/8-1/10，放入高压反应釜内，控制釜内蒸气压0.6-0.8MPa，水解20-60min，待反应釜冷却后，将水解物离心，收集沉淀，再用蒸馏水洗涤沉淀3-5次，所得的沉淀物在60℃烘干，即获得生理活性更高的荞麦叶黄酮，产品总黄酮含量为88.8-90.6%，其中含芦丁14.0-51.1%、异槲皮素3.27-20.6%、槲皮素8.2-22.78%和微量的其它类黄酮成分。
所述的步骤1）中料液比优选为1:40-50；步骤3）中高压水解蒸汽压力优选为0.7MPa；步骤中所述的食用乙醇的浓度优选为85%。
与现有技术相比，本发明的优点和效果：
首先，本发明获得的荞麦叶黄酮产品中异槲皮素和槲皮素的含量大幅增加，显著高于同类产品，异槲皮素和槲皮素不仅生理活性高于芦丁，而且分子量小、脂溶性好，吸收和生物利用率也得到大幅改善。
其次，产品的纯度大幅提高，有利于进一步制备高质量和不同剂型的药物。
最后，本发明所用乙醇为食用乙醇且可回收使用、安全性高；本发明使用的高压水解属于物理法水解，体系中未引入化学试剂和重金属离子，绿色、安全，同时减少了污染物的排放、降低了对环境的破坏。本发明选择荞麦中富含黄酮类化合物且被当作柴火的荞麦叶作为提取材料，不仅提高了荞麦的利用率，变废为宝；而且采用荞麦叶提取黄酮，成本低、收率高。
附图说明
图1芦丁、异槲皮素和槲皮素的标品色谱图
图2本发明荞麦叶黄酮粗提物溶液色谱图
图3本发明高活性荞麦叶黄酮溶液（0.7MPa，20min）色谱图
图4本发明高活性荞麦叶黄酮溶液（0.7MPa，60min）色谱图
图5本发明高活性荞麦叶黄酮与粗提物对DPPH自由基清除活性的比较
具体实施方式
实施例1
荞麦叶黄酮粗提物的制备：将田间收割的荞麦叶洗净烘干、磨碎、过60目筛，得到荞麦叶粉；称取荞麦叶粉40g，加入85%食用乙醇1600mL(料液比1:40)，混匀，放入70℃水浴锅中搅拌浸提4h，取出后，趁热抽滤得滤液，用2倍的85%食用乙醇清洗沉淀一次，合并滤液；用旋转蒸发仪浓缩滤液到300mL，大量沉淀析出；离心浓缩液，沉淀物在60℃烘干、粉碎，获得荞麦叶黄酮粗提物5.33g，产品总黄酮含量≥73.5%。
高效液相色谱法测定黄酮组分与含量：仪器：美国Agilent公司1100系列高效液相色谱仪，包括在线真空脱气机，四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD二极管阵列检测器和化学工作站。
色谱分析条件：Hypersil BDS C18色谱柱（4.6×250mm,5μm），柱温30℃，流动相A（纯水），C（乙腈），D（2%的乙酸，v/v）；检测中A和C的浓度变化为0～7min，A：56%，C：24%；8～12min，A：20%，C：60%；13～17min，C：100%。流速1.0mL/min，检测波长360nm，参比波长450nm。
标品：芦丁:异槲皮素:槲皮素=0.1:0.05:0.1(mg/mL)，根据标品测定结果（见图1），芦丁、异槲皮素和槲皮素的出峰时间分别为3.401、4.120和10.741min。
称取干燥恒重的荞麦叶黄酮粗提物0.2g，精确至0.0001g，置于具塞三角瓶中加入70%乙醇在70℃水浴中提取4h，趁热抽滤，滤液置于25mL容量瓶中定容，再取1mL定容至50mL作为待测液。准确吸取5μL待测液，进行高效液相色谱获得色谱图（见图2），经计算荞麦叶黄酮粗提物中含芦丁60.4%、槲皮素2.0%和微量的其它类黄酮成分。
生理活性测定：以DPPH自由基清除能力来评价荞麦叶黄酮的抗氧化活性。用70%乙醇配制DPPH溶液，浓度为0.04mg/mL。在预先加入2.0mL DPPH溶液的比色管中分别加入2mL浓度为4、6、8、12、16、20μg/mL待测液，摇匀、静置30min，在517nm处测定其吸光值，
Figure BDA0000395244570000031
其中：Ax为样品和DPPH反应溶液的吸光值；Axo为70%乙醇代替DPPH溶液的吸光度；A0为70%乙醇代替样品溶液的吸光值。
荞麦叶黄酮粗提物对DPPH自由基清除能力结果见图5。
实施例2
高活性荞麦叶黄酮的制备：将田间收割的荞麦叶洗净烘干、磨碎、过60目筛，得到荞麦叶粉；称取荞麦叶粉40g，加入85%食用乙醇2000mL(料液比1:50)，混匀，放入70℃水浴锅中搅拌浸提4h，取出后，趁热抽滤得滤液，用2倍的85%乙醇清洗沉淀一次，合并滤液；用旋转蒸发仪浓缩滤液到200mL，放入高压反应釜内，在0.7MPa水解20min，待反应釜冷却后，将水解物倒入离心杯，6000g离心收集沉淀，再用蒸馏水洗涤沉淀4次，所得沉淀60℃烘干，获得生理活性更高的荞麦叶黄酮产品，该产品总黄酮含量≥88.8%。
黄酮组分与含量的测定方法：同实施例1，高活性荞麦叶黄酮中含芦丁51.1%、异槲皮素20.6%、槲皮素8.2%和微量的其它类黄酮成分（见图3）。
生理活性测定方法：同实施例1，高活性荞麦叶黄酮对DPPH自由基清除能力结果见图5。
实施例3
高活性荞麦叶黄酮的制备：将田间收割的荞麦叶洗净烘干、磨碎、过60目筛，得到荞麦叶粉；称取荞麦叶粉40g，加入85%食用乙醇1600mL（料液比1:40），混匀，放入70℃水浴锅中搅拌浸提4h，取出后，趁热抽滤得滤液，用2倍的85%食用乙醇清洗沉淀一次，合并滤液；用旋转蒸发仪浓缩滤液到160mL，放入高压反应釜内，在0.7MPa水解60min，待反应釜冷却后，将水解物倒入离心杯，6000g离心收集沉淀，再用蒸馏水洗涤沉淀4次，所得沉淀60℃烘干，获得生理活性更高的荞麦叶黄酮产品，该产品总黄酮含量≥90.6%。
黄酮组分与含量的测定方法：同实施例1，高活性荞麦叶黄酮中含芦丁14.0%、异槲皮素3.27%、槲皮素22.78%和微量的其它类黄酮成分（见图4）。
生理活性测定方法：同实施例1，高活性荞麦叶黄酮对DPPH自由基清除能力结果见图5。

Claims (4)

1.一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）把荞麦叶洗净烘干、磨碎，得到荞麦叶粉，按料液比1:30-50向荞麦叶粉中加入75-85%的食用乙醇，混合均匀，加热至65-75℃，搅拌浸提4h；
2）浸提结束后，趁热抽滤得滤液，沉淀用2-3倍75-85%食用乙醇清洗、抽滤得滤液，合并滤液；
3）浓缩滤液到原体积的1/8-1/10，放入高压反应釜内，控制釜内蒸气压0.6-0.8MPa，水解20-60min，待反应釜冷却后，将水解物离心，收集沉淀，再用蒸馏水洗涤沉淀3-5次，所得的沉淀物在60℃烘干，即获得高活性荞麦叶黄酮。
2.如权利要求1所述的一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）中高压水解蒸汽压力为0.7MPa。
3.如权利要求1所述的一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，其特征在于，所述的步骤1）中料液比为1:40-50。
4.如权利要求1所述的一种高活性荞麦叶黄酮的制备方法，其特征在于，所述的食用乙醇的浓度为85%。
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