CN103509744B

CN103509744B - 一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用

Info

Publication number: CN103509744B
Application number: CN201310413420.8A
Authority: CN
Inventors: 杨虹; 李正华; 柳向龙; 潘建良; 谭晶
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103509744A

Abstract

本发明公开了一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用。从太湖水体中分离获得了一株具有显著溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2，保藏号为CGMCC No.6549，并且从其代谢产物中分离纯化并鉴定出其有效溶藻成分六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮，其中六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为5.7μg/mL，对聚球藻BN60无致死效果，二氢吲哚-2,3-二酮对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的半致死量LD50分别为12.5μg/mL和34.2μg/mL。可用于新型生物杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

Description

一株溶藻希瓦氏菌及其在控制蓝藻水华中的应用

技术领域

本发明涉及环境微生物领域，特别涉及一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2及其在蓝藻水华控制中的应用。

背景技术

近些年来湖泊富营养化导致的蓝藻水华爆发对湖泊水系的污染日益严重，太湖﹑巢湖﹑滇池等淡水水域都受到了严重的影响。因此探索控制蓝藻生物量和抑制蓝藻水华发生的有效途径是非常必要的。

蓝藻水华的控制技术可归纳为物理方法、化学方法和生物方法。物理方法如机械除藻、电磁场除藻等可以作为水华爆发的辅助控制措施，但是缺点在于治标不治本，并且处理能力有限；化学方法如除草剂等化学杀藻剂可以直接杀死藻类，但这些化学物质的专一性差，而且容易富集在食物链中造成二次污染。

其中由于物理方法和化学方法存在上述缺陷，生物方法因其环保﹑经济等优点，受到越来越多的关注。针对蓝藻的溶藻细菌(algae-lysing bacteria)是一类可以直接(菌藻细胞接触)或者间接(分泌胞外物质)抑制灭杀蓝藻的细菌统称，它们是淡水生态环境***的重要组成部分，对减少蓝藻的生物量，维持生态平衡具有重要作用。

因此，本领域的技术人员致力于筛选高效溶藻细菌或分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，以开发微生物杀藻剂，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

发明内容

鉴于现有技术中物理方法和化学方法处理能力有限、容易造成二次污染的缺陷，本发所要解决的技术问题是寻找高效溶藻细菌及分离富集溶藻细菌代谢产生的高效溶藻活性物质，用以安全和高效的控制蓝藻水华问题。

为实现上述目的，本发明提供了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌及其代谢产物在蓝藻水华控制中的应用。

本发明公开了一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.6549，保藏日期为2012年9月14日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。

进一步地，本发明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2在控制蓝藻水华中的应用。

进一步地，本发明提供了上述希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。

进一步地，本发明公开了上述希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物中两种具有溶藻活性的有效成分，分别为具有结构式（I）和（II）所示结构的化合物，本发明提供了一种具有结构式（I）所示结构的化合物在控制蓝藻水华中的应用。

进一步地，本发明提供了一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2。

进一步地，本发明提供了一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2的发酵产物，所述发酵产物为发酵液、发酵液浓缩物、发酵液粗提物或发酵液提取物。

进一步地，本发明提供了一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤：

1）、发酵希瓦氏菌Lzh-2菌株；

2）、萃取发酵液；

3）、萃取液蒸干得粗提物；

4）、粗提物水溶后用于控制蓝藻水华。

优选地，步骤1）中，发酵条件为，希瓦氏菌Lzh-2接种于pH7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、200rpm环境条件下发酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液。

优选地，步骤2）中，萃取剂为乙酸乙酯，萃取体系中乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1，混合后，放入振荡器中振荡24h，分离出的上层乙酸乙酯溶液即希瓦氏菌Lzh-2发酵液的萃取液。萃取液蒸干后即为发酵液粗提物。粗提物经本领域常规技术手段，如柱层析的方法，进一步提纯即可得到发酵液提取物，发酵液提取物可以为单一成分，也可以为包括多种组分的组合物。

所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液对下列藻株的4天溶藻率分别为：衣藻BS3为91.7±7.8%，绿藻B1为86±12.1%，铜绿微囊藻PCC7806为79±4.1%，铜绿微囊藻9110为77.3±3.4%，颤藻BN35为74.1±4.5%，绿色微囊藻FACHB-979为72.6±5.7%，聚球藻BN60为43±5.8%，色球藻FACHB-191为34.1±6.9%；6天溶藻率分别为：衣藻BS3为93.1±7.3%，绿藻B1为97.9±6.2%，铜绿微囊藻PCC7806为84.9±3.8%，铜绿微囊藻9110为92.3±6.8%，颤藻BN35为97.2±10.5%，绿色微囊藻FACHB-979为86.3±8.5%，聚球藻BN60为81.9±3.9%，色球藻FACHB-191为29.5±9.7%。

所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液，利用HPLC技术纯化希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物，具体制备方法如下：

将所述萃取液蒸干并加水溶解后使用0.22μm孔径滤膜过滤，滤液通过DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制备柱，水和甲醇为流动相的HPLC进行初步纯化，得到溶藻成分；

将所述溶藻成分通过DIKMA SupersilTM C18-EP分析柱，水和甲醇为流动相的HPLC进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-2A和S-2B。

所述的希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物中有效的溶藻成分的化学结构通过LC-MS﹑GC-MG和HMR分析获得。

希瓦氏菌Lzh-2用于控制蓝藻水华时，其有效的溶藻成分S-2A的分子离子峰为155.0821m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂，核磁共振氢谱结果是¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.22(s,1H),4.06(dd,J=17.3,2.7Hz,1H),3.77(d,J=17.3Hz,1H),3.44(dd,J=8.7,4.8Hz,2H),2.41–2.12(m,1H),2.09–1.71(m,3H)；有效的溶藻成分S-2B的分子离子峰为146.0250m/z，样品分子量为147.1308，分子式为C₈H₅NO₂，核磁共振氢谱结果是¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.11(s,1H),7.76(d,J=7.5Hz,1H),7.70(s,1H),7.26(t,J=7.6Hz,1H),7.05(d,J=7.9Hz,1H)。

进一步地，有效的溶藻成分S-2A是所述希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮，有效的溶藻成分S-2B是所述希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物二氢吲哚-2,3-二酮。

进一步地，六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为5.7μg/mL；所述二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为12.5μg/mL，对聚球藻BN60的半致死量LD50为34.2μg/mL。

本发明的希瓦氏菌Lzh-2的溶藻效果具有广谱性。其发酵液制备方法简单，制备周期短。希瓦氏菌Lzh-2的发酵液对太湖中的铜绿微囊藻9110、聚球藻BN60、绿藻B1、颤藻BN35等具有很好的溶藻效果，而铜绿微囊藻和聚球藻是太湖蓝藻水华中的主要蓝藻。希瓦氏菌Lzh-2发酵液和乙酸乙酯萃取液均可用于蓝藻水华或其它微藻的控制，且溶藻效果较好。其中，希瓦氏菌Lzh-2发酵液对铜绿微囊藻9110的6天溶藻率达到92.3±6.8%，对聚球藻BN60的6天溶藻率达到81.9±3.9%。希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60具有较好的致死作用，可用于新型杀藻剂的研发和生产，最终应用于湖泊蓝藻水华的控制。

以下将结合附图对本发明的希瓦氏菌Lzh-2菌株及其代谢产物六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)在蓝藻水华控制中的效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是溶藻菌Lzh-2对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果；

图2是溶藻菌Lzh-2的发酵液乙酸乙酯萃取液加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；

图3是溶藻物质六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮分别加入到铜绿微囊藻9110藻平板上的溶藻效果；

图4是溶藻物质六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮分别加入到藻液中对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果。

具体实施方式

实施例1溶藻细菌的筛选

将太湖梅梁湾水域采集的10mL自然水样加入到90mL对数期的铜绿微囊藻9110的藻液中，两天后取黄化藻液用梯度稀释法涂牛肉膏蛋白胨培养基琼脂平板，28℃培养24h，取菌落密度适中的平板，按照菌落形态的不同挑选不同菌株。

将筛选出来的菌株分别接种入10mL牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃，200rpm培养24h，将10mL培养好的菌液分别加入90mL对数期铜绿微囊藻的藻液中。另外将10mL灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基同样加入90mL藻液中作为对照。所有实验组和对照组的藻液在光照培养箱中培养48h后计算其溶藻效率，选取了其中溶藻效率最高的一株细菌进行进一步研究，该菌株代号为Lzh-2。

藻液培养条件：铜绿微囊藻9110用BG11液体培养基培养，放置于光照培养箱中，25℃，光照强度40μmol photons m-2s-1，光暗周期比为12h：12h(光照：黑暗)。

溶藻效率计算方法：溶藻效率(%)=(对照组藻细胞密度-实验组藻细胞密度)/对照组藻细胞密度×100。其中铜绿微囊藻的藻细胞密度用血球计数板测定。

图1中A为加入溶藻菌Lzh-2时铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的变化曲线(溶藻菌Lzh-2(1×10⁸cells/mL)(■)和空白对照(◆))。B为加入溶藻菌Lzh-2时聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的变化曲线(溶藻菌Lzh-2(1×10⁸cells/mL)(●)和空白对照(▲))。

实施例2希瓦氏菌Lzh-2菌株的鉴定

用形态观察、染色、生理生化反应、16srRNA基因序列分析等方法对溶藻效果最强的Lzh-2进行鉴定，该菌株为革兰氏阴性，直短杆状，极生单鞭毛，大小为0.6μm～1.0μm×1.0μm～4.0μm，在液体培养基中摇床培养24h后，个别菌体长达7μm。在营养琼脂固体培养基平板上培养24h后，菌落形态为圆形，表面光滑扁平，边缘整齐，无色至淡肉红色，透明，菌落大小为2mm～3mm。经16srRNA基因序列分析和同源性比较，得知其与GenBank中某希瓦氏菌菌株有99%的同源性，故鉴定为希瓦氏菌Shewanella sp.，命名为希瓦氏菌Lzh-2。该菌种已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6549，保藏日期为2012年9月14日。保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：86-10-64807355。该菌种的16srRNA基因在GenBank中的登录号是HQ896842。

实施例3希瓦氏菌Lzh-2发酵液及其乙酸乙酯萃取液的制备方法

将希瓦氏菌Lzh-2按照1%接种量接种于灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下200rpm摇床培养48h后得到希瓦氏菌Lzh-2含菌发酵液。将乙酸乙酯按照1：1的比例加入发酵液中，放入振荡器中振荡24h，分离出上层溶液，即乙酸乙酯萃取液。将乙酸乙酯蒸干，加水溶解，再使用0.22μm孔径的微孔滤膜过滤后用于进一步纯化代谢产物。

实施例4希瓦氏菌Lzh-2对不同蓝藻和真核藻类的溶藻效果

将8份培养好的（培养条件：牛肉膏蛋白胨培养基，28℃，200rpm培养24h）10mL希瓦氏菌Lzh-2菌液分别加入8株蓝藻和真核藻(表1)的藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)，同样使用10mL无菌牛肉膏蛋白胨培养基分别加入8种藻液中(90mL，所有藻液均培养到对数期)作为对照(1：9)，在光照培养箱中培养4天和6天后分别测定所有实验组和对照组的藻液的叶绿素浓度，计算其溶藻效率。每个样品测三个平行样，表示成平均值±标准差的形式。

实验中用到的藻种有3株购自武汉水生所藻种库，另外5株筛选自太湖水体。实验结果表明，希瓦氏菌Lzh-2的发酵液对于绝大部分原核藻种具有很好的溶藻效果，对色球藻FACHB-191没表现出很好的溶藻效果(表1)。此结果表明希瓦氏菌Lzh-2的溶藻能力具有广谱性，是一种非常有潜力的溶藻细菌。

表1.希瓦氏菌Lzh-2对8株藻株的溶藻效果

注：表中用星号(*)标记的藻株是从太湖无锡梅梁湾水体中筛选得到的，其余藻株都是购买自中国淡水藻种库。

希瓦氏菌Lzh-2对太湖蓝藻水华中的主要蓝藻铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的溶藻效果如图1所示。图1A表明，加入希瓦氏菌Lzh-2后，铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而下降，第六天时的溶藻率为92.3%。而空白对照中铜绿微囊藻9110细胞浓度随时间的延长而上升。其中希瓦氏菌Lzh-2为1×10⁸cells/mL。图1B表明，加入希瓦氏菌Lzh-2后，聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的延长而下降，第六天时的溶藻率为81.9%。而空白对照中聚球藻BN60叶绿素a浓度随时间的延长而上升。其中希瓦氏菌Lzh-2为1×10⁸cells/mL。

实施例5Lzh-2菌株溶藻方式的研究

将希瓦氏菌Lzh-2发酵液按照步骤3所述的方法制成乙酸乙酯萃取液，用离心干燥器蒸干后，用无菌水溶解后备用。最后把灭菌牛肉膏蛋白胨培养基同样离心干燥浓缩作为对照。将按照上述方法制得的萃取液以及浓缩牛肉膏蛋白胨对照分别加到圆纸片(直径1cm)上，放置于铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上。藻平板放入光照培养箱中培养2天后观察圆纸片周围的抑藻圈的形成以判断其溶藻效果。

铜绿微囊藻琼脂平板的制作方法：向每块平板上倒入适量(约20mL)BG11琼脂培养基(琼脂比例1.5%)，待其凝固后备用。将300mL培养好的铜绿微囊藻藻液4000g离心20min后弃掉上清，收集藻细胞沉淀加入到100mL灭菌后的BG11软琼脂固体培养基中(1%琼脂，放置于53℃水浴中防止凝固)，摇匀后倒入制好的BG11固体平板上层(每块平板约倒入20mL)，待其凝固后放入光照培养箱中培养并备用。

实验结果如图2所示，显示希瓦氏菌Lzh-2的发酵液萃取液有很好的溶藻效果，这表明该菌株具有分泌胞外溶藻物质进行溶藻的性能。

实施例6希瓦氏菌Lzh-2发酵产物中溶藻有效成分的提取纯化

利用HPLC技术将溶藻菌Lzh-2的溶藻代谢产物纯化，得到两种具有溶藻功能的纯化物质S-2A和S-2B，具体步骤如下：

将希瓦氏菌Lzh-2发酵液的萃取液通过DIKMA公司的SupersilTM C18-EP半制备柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行初步纯化，得到溶藻有效成分。然后通过DIKMA SupersilTM C18-EP分析柱，水和甲醇为流动相的HPLC技术手段进行进一步纯化，得到两种有效溶藻成分S-2A和S-2B，用于结构鉴定。

实施例7希瓦氏菌Lzh-2代谢产物中溶藻有效成分的化学结构鉴定

利用LC-MS﹑GC-MG和HMR分析(核磁共振氢谱分析)具有溶藻功能的代谢产物的化学结构。

将纯化后的样品S-2A进行LC-MS分析，得到样品S-2A的分子离子峰为155.0821m/z，样品分子量为154.0742，分子式为C₇H₁₀N₂O₂。

将纯化后的样品S-2A进行GC-MS分析，与GC-MS数据库中六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮的结构相似,相似性指数＞850。

将样品S-2A进行核磁共振氢谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ4.22(s,1H),4.06(dd,J=17.3,2.7Hz,1H),3.77(d,J=17.3Hz,1H),3.44(dd,J=8.7,4.8Hz,2H),2.41–2.12(m,1H),2.09–1.71(m,3H)。

将样品S-2A的LC-MS﹑GC-MS和HMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的代谢产物S-2A是六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮，其化学结构如下图所示。

将纯化后的样品S-2B进行LC-MS分析，得到样品S-2B的分子离子峰为146.0250m/z，样品分子量为147.1308，分子式为C₈H₅NO₂。

将纯化后的样品S-2B进行GC-MS分析，其中S-2B与GC-MS数据库中二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)的结构相似,相似性指数＞850。

将样品S-2B进行核磁共振氢谱分析，得到以下结果：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.11(s,1H),7.76(d,J=7.5Hz,1H),7.70(s,1H),7.26(t,J=7.6Hz,1H),7.05(d,J=7.9Hz,1H)。

将样品S-2B的LC-MS﹑GC-MS和HMR结果进行分析，可以确定具有溶藻效果的代谢产物S-2B是二氢吲哚-2,3-二酮，也称为靛红，其化学结构如下图所示。

实施例8希瓦氏菌Lzh-2溶藻代谢产物六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)的溶藻效能研究

使用上述Lzh-2菌株溶藻方式的研究中的方法，经实验发现六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)在铜绿微囊藻制成的BG11固体平板上能形成明显的抑藻圈，而空白对照则不会形成抑藻圈(图3)。

将六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)分别加入太湖中主要的两种蓝藻即铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60中，使六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)的浓度分别形成一个系列：100μg/mL﹑50μg/mL﹑40μg/mL﹑30μg/mL﹑20μg/mL﹑10μg/mL和5μg/mL。将加入六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)的铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60放入光照培养箱中培养24小时后测定溶藻率。实验结果表明，六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮对铜绿微囊藻9110的半致死量LD50为5.7μg/mL，对聚球藻BN60无致死效果；二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)对铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60的半致死量LD50分别为12.5μg/mL和34.2μg/mL(图4)。此结果表明希瓦氏菌Lzh-2的代谢产物六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮(靛红)是十分有效的控制蓝藻的物质。

图4中A加入不同浓度溶藻物质六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮时铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60存活率变化曲线(铜绿微囊藻9110(▲)和聚球藻BN60(●))。B加入不同浓度溶藻物质二氢吲哚-2,3-二酮时铜绿微囊藻9110和聚球藻BN60存活率变化曲线(铜绿微囊藻9110(◆)和聚球藻BN60(■))。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一株具有溶藻活性的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.6549，保藏日期为2012年9月14日，所述希瓦氏菌Lzh-2能发酵生成六氢吡咯并[1,2-A]吡嗪-1,4-二酮和二氢吲哚-2,3-二酮。

2.如权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2在控制蓝藻水华中的应用。

3.如权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2的发酵产物在控制蓝藻水华中的应用。

4.一种溶藻菌剂，其特征在于，所述溶藻菌剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2。

5.一种溶藻药剂，其特征在于，所述溶藻药剂中包含权利要求1所述的希瓦氏菌(Shewanella sp.)Lzh-2的发酵产物，所述发酵产物为发酵液或发酵液提取物。

6.一种控制蓝藻水华的方法，包括如下步骤：

1)、发酵权利要求1所述的希瓦氏菌Lzh-2；

2)、萃取发酵液；

3)、萃取液蒸干得粗提物；

4)、粗提物水溶后用于控制蓝藻水华。

7.如权利要求6所述的方法，其中步骤1)中，发酵条件为，希瓦氏菌Lzh-2接种于pH 7.0的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃、200rpm环境条件下发酵48h，得到所述希瓦氏菌Lzh-2发酵液。

8.如权利要求6所述的方法，其中步骤2)中，萃取剂为乙酸乙酯。

9.如权利要求8所述的方法，其中步骤2)中，乙酸乙酯与发酵液的体积比为1:1。