CN103509103B - 改性α‑乳白蛋白及其制备方法与应用以及功能性食品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改性α‑乳白蛋白及其制备方法与应用以及功能性食品，该改性α‑乳白蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者该改性α‑乳白蛋白具有将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍基本上不改变所述改性α‑乳白蛋白三级结构的氨基酸序列，其特征在于，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中至少第58位的赖氨酸残基具有麦芽三糖修饰，所述麦芽三糖修饰为赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式（1）所示基团所取代。本发明提供的改性α‑乳白蛋白具有较低的抗原性。

Description

改性α-乳白蛋白及其制备方法与应用以及功能性食品
技术领域
本发明涉及食品领域，具体地，涉及一种改性α-乳白蛋白及其制备方法与应用以及功能性食品，特别是牛乳改性α-乳白蛋白及其制备方法与在制备功能性食品中的应用以及含有该改性α-乳白蛋白的功能性食品。
背景技术
随着食品工业的不断发展，食物来源越来越丰富，食物的安全性日渐受到人们的重视。但近几十年来，食物过敏现象逐年增多，食物过敏已经成为人类营养尤其是儿童营养中的一个重要的公共卫生问题。流行病学研究表明，有约33%的过敏反应是由食物引发的。据统计，全球有近2%的成年人和4-6%的儿童患有食物过敏。Tariq等指出，在发达国家过敏性疾病已经成为影响人类健康的最主要因素之一。发达国家十分重视对食物过敏的研究及防治，但目前我国对食物过敏问题一直没有引起足够的重视，相关研究报道较少。胡燕在重庆医科大学儿童医院对一年内3040名2岁以下的儿童进行食物过敏流行病研究，确诊160名儿童发生过食物过敏，发病率约为5%以上。吕相征等对中国医科大学4052名学生进行调查，发现在15-24岁年龄段的健康人群中，约有6%的人曾有食物过敏现象，过敏症状主要是皮疹、消化道症状及皮肤瘙痒等。
对婴幼儿来说，母乳是最理想的营养品。但当母乳缺乏时，牛乳因其营养丰富、来源广泛，且与母乳成分较为接近而被作为母乳的最佳替代品。大量流行病学研究表明，在食物过敏中，牛乳蛋白过敏对婴幼儿来说是最普遍的，有2-6%的婴幼儿对牛乳蛋白有一定的过敏，且伴随基因遗传的提高而急速上升，约有20%的婴幼儿在1岁前，用牛奶喂养都会发生牛乳蛋白过敏。
目前，治疗食物过敏的唯一有效方法是严格避免食物过敏原的摄入，但这种方法经常导致以牛乳为主要食物的婴幼儿出现营养不良，且只能减缓症状，并不能从根本上阻断牛乳过敏的发生，因此，预防成为控制牛乳过敏的最重要环节。牛乳中的蛋白含量约为3-3.5%（重量/体积），其中主要成分为酪蛋白和乳清蛋白。乳清蛋白中的α-乳白蛋白是牛乳中重要的致敏原，且α-乳白蛋白过敏患者近几年呈增长趋势。因此，探索适合的加工方式来降低牛乳α-乳白蛋白的致敏性，提高牛乳制品的安全性具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗原性低的改性α-乳白蛋白及其制备方法与应用以及含有该改性α-乳白蛋白的功能性食品。
为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种改性α-乳白蛋白，该改性α-乳白蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者该改性α-乳白蛋白具有将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍基本上不改变所述改性α-乳白蛋白三级结构的氨基酸序列，其特征在于，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中至少第58位的赖氨酸残基具有麦芽三糖修饰，所述麦芽三糖修饰为赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式（1）所示基团所取代：
一方面，本发明提供了一种制备改性α-乳白蛋白的方法及由该方法制得的改性α-乳白蛋白，其特征在于，该方法包括在美拉德反应的条件下，将α-乳白蛋白与麦芽三糖接触。
另一方面，本发明提供了一种功能性食品，其特征在于，该功能性食品含有上述改性α-乳白蛋白和食品添加剂。
再一方面，本发明提供了上述改性α-乳白蛋白在制备功能性食品中的应用。
通过上述技术方案，获得的改性α-乳白蛋白的抗原性大大降低，从而为低敏性乳制品的开发提供了技术支持。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1A-E是本发明方法制得的改性α-乳白蛋白经胰蛋白酶酶解的酶解产物的的电喷雾质谱（ESI质谱）图；
图2是本发明方法制得的改性α-乳白蛋白的荧光光谱扫描图；
图3是本发明方法制得的改性α-乳白蛋白的圆二色谱远紫外图谱（虚线所示）。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种改性α-乳白蛋白，该改性α-乳白蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者该改性α-乳白蛋白具有将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍基本上不改变所述改性α-乳白蛋白三级结构的氨基酸序列，其特征在于，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中至少第58位的赖氨酸残基具有麦芽三糖修饰，所述麦芽三糖修饰为赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式（1）所示基团所取代：
本发明的发明人发现，只要SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中至少第58位的赖氨酸残基具有所述麦芽三糖修饰即可获得抗原性降低的改性α-乳白蛋白，优选情况下，SEQID NO：1所示的氨基酸序列中第93、94、98、108和114位中至少一位上的赖氨酸残基也具有所述麦芽三糖修饰，此时，可以获得抗原性进一步降低的改性α-乳白蛋白。
本发明提供一种制备改性α-乳白蛋白的方法，其特征在于，该方法包括在美拉德反应的条件下，将α-乳白蛋白与麦芽三糖接触。
蛋白质与糖的糖基化反应是美拉德反应（Maillard reaction），属于蛋白质的化学改性范畴。本发明中，在美拉德反应的条件下，所述α-乳白蛋白中赖氨酸残基的ε-氨基与麦芽三糖的还原性羰基反应生成C-N键，即获得本发明的经麦芽三糖改性的改性α-乳白蛋白。本领域技术人员公知的是，α-乳白蛋白的氨基酸序列中，只有赖氨酸残基上具有能与还原性羰基反应的游离氨基。因此，当在本发明限定的条件下制备改性α-乳白蛋白时，只有赖氨酸残基才能够被麦芽三糖修饰（参见R Shepherda et al.,Dairy glycoconjugateemulsifiers:casein-maltodextrins.,Food Hydrocolloids,Volume 14,Issue 4,July2000,281-286）。
根据本发明，所述α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比可以在较宽范围内选择，一般来说，麦芽三糖越多越好，优选情况下，所述α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比为1:5-20，更优选为1:11-15。
根据本发明，只要将α-乳白蛋白与麦芽三糖在美拉德反应的条件接触即可实现本发明的目的，所述美拉德反应的条件可以在较宽范围内选择，优选情况下，所述美拉德反应的条件包括温度为50-60℃，更优选为54-56℃；时间为10-120h，更优选为35-50h。
根据本发明，所述α-乳白蛋白与麦芽三糖优选以粉末状态进行接触，可以直接将α-乳白蛋白粉末与麦芽三糖粉末混合；也可以将α-乳白蛋白、麦芽三糖与溶剂混合并溶解，然后除去溶剂得到α-乳白蛋白与麦芽三糖的混合粉末。根据本发明的优选实施方式，所述方法包括以下步骤：将α-乳白蛋白和麦芽三糖共同溶解于溶剂中，得到溶液，调节所得溶液的pH值为7.5-8.5，然后在4℃以下的温度下除去溶剂，得到混合粉末，再将所得混合粉末置于温度为50-60℃，更优选为54-56℃；相对湿度为60-70%，更优选为63-68%的条件下10-120h，更优选为35-50h。
其中，所述溶剂可以为本领域常规使用的溶剂，只要能够溶解α-乳白蛋白和麦芽三糖且不会使α-乳白蛋白变性即可，优选情况下，所述溶剂为水或Tris-HCl缓冲液，更优选为去离子水。所述Tris-HCl缓冲液可以自行配制，也可以通过商购获得。
所述溶液中α-乳白蛋白的含量优选为4-6重量%。
本领域技术人员可以理解的是，在上述本发明的优选实施方式中，对α-乳白蛋白和麦芽三糖溶解于溶剂中的方式没有特殊限定，可以将所述α-乳白蛋白和麦芽三糖同时溶解于溶剂中，也可以将α-乳白蛋白和麦芽三糖分别溶解于溶剂中后再混合，还可以将α-乳白蛋白和麦芽三糖按顺序溶解于溶剂中。
根据本发明，还可以通过常规方法纯化α-乳白蛋白与麦芽三糖接触的产物，以获得更纯的改性α-乳白蛋白，例如，所述纯化的方法包括透析法和色谱法等。
根据本发明，所述α-乳白蛋白优选为牛乳α-乳白蛋白，本发明的方法可以在较大程度上降低α-乳白蛋白的抗原性，从而为低敏性乳制品的开发提供了技术支持。其中，所述α-乳白蛋白可以通过商购获得，也可以通过将牛乳经脱脂、选择性沉淀和离子交换等步骤获得，α-乳白蛋白的制备方法已为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
本发明中，可能是基于α-乳白蛋白的特定三维结构，α-乳白蛋白与麦芽三糖发生美拉德反应而被修饰的赖氨酸残基位点具有特异性，本发明中被修饰的α-乳白蛋白的位点多见于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第58、93、94、98、108和114位赖氨酸残基。并且，本发明的发明人发现，可能由于麦芽三糖能够特异性地修饰α-乳白蛋白第58位的赖氨酸残基，相对于利用其他糖（如葡萄糖、麦芽糖、麦芽四糖或麦芽五糖）对α-乳白蛋白进行修饰的情况，本发明能够获得抗原性大大降低的改性α-乳白蛋白。
本发明还提供上述方法制得的改性α-乳白蛋白。本发明方法制得的改性α-乳白蛋白抗原性明显降低。
本发明还提供一种功能性食品，其特征在于，该功能性食品含有上述改性α-乳白蛋白或由本发明的方法制得的改性α-乳白蛋白以及食品添加剂。其中，对所述食品添加剂没有特殊限定，可以为本领域常规使用的食品添加剂，例如增味剂、营养强化剂、防腐剂和甜味剂中的一种或多种。所述改性α-乳白蛋白和食品添加剂的重量比可以为常规的选择，例如10-10000：1。
另外，本发明还提供了上述改性α-乳白蛋白或由本发明的方法制得的改性α-乳白蛋白在制备功能性食品中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例和对比例中，未改性的α-乳白蛋白购自Sigma公司，货号D0079；麦芽三糖、麦芽糖和麦芽四糖均购自Supelco公司；冷冻干燥的温度为-60℃，所用设备为LGJ25冷冻干燥机（购自北京四环科学仪器厂）；透析所用的半透膜为透析袋MD48-3500（购自上海绿鸟科技发展有限公司）。
实施例1
将α-乳白蛋白和麦芽三糖按摩尔比1:13溶解于去离子水中，制成最终蛋白质含量为5重量%的混合液，用1M的NaOH调节混合液的pH值为8.0，冷冻干燥。将冻干的混合物粉末放入培养皿内，再把培养皿置于含有饱和KBr溶液的干燥器（干燥器中的相对湿度为65%）中，然后将干燥器放入55℃的培养箱内，48h后取出混合物，透析除去未参与反应的麦芽三糖及NaOH，再次冷冻干燥，得到的改性α-乳白蛋白样品G1。利用α-乳白蛋白ELISA试剂盒（上海高创化学科技有限公司，货号：NO502320）测定未改性的α-乳白蛋白和改性α-乳白蛋白样品G1的抗原性，经ELISA检测的OD值越低，说明抗原性越低，具体操作步骤参见ELISA试剂盒的说明书。其中，以凯氏定氮法测定未改性的α-乳白蛋白和改性α-乳白蛋白样品G1中的蛋白含量。在待检测的蛋白量相等的情况下（每孔0.05μg），未改性的α-乳白蛋白经ELISA检测的OD值为1.42，改性α-乳白蛋白样品G1经ELISA检测的OD值为0.71。
对比例1
按照实施例1的方法制备改性α-乳白蛋白样品D1，不同的是，用麦芽糖代替麦芽三糖，经ELISA检测的OD值为0.98，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
对比例2
按照实施例1的方法制备改性α-乳白蛋白样品D2，不同的是，用麦芽四糖代替麦芽三糖，经ELISA检测的OD值为0.95，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
实施例2
将α-乳白蛋白和麦芽三糖按摩尔比1:11溶解于去离子水中，制成最终蛋白质含量为4重量%的混合液，用1M的NaOH调节混合液的pH值为8.5，冷冻干燥。将冻干的混合物粉末放入培养皿内，再把培养皿置于含有饱和KBr溶液的干燥器（干燥器中的相对湿度为68%）中，然后将干燥器放入56℃的培养箱内，50h后取出混合物，透析除去未参与反应的麦芽三糖及NaOH，再次冷冻干燥，测定得到的改性α-乳白蛋白样品G2经ELISA检测的OD值为0.78，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
实施例3
将α-乳白蛋白和麦芽三糖按摩尔比1:15溶解于去离子水中，制成最终蛋白质含量为6重量%的混合液，用1M的NaOH调节混合液的pH值为7.5，冷冻干燥。将冻干的混合物粉末放入培养皿内，再把培养皿置于含有饱和KBr溶液的干燥器（干燥器中的相对湿度为63%）中，然后将干燥器放入54℃的培养箱内，35h后取出混合物，透析除去未参与反应的麦芽三糖及NaOH，再次冷冻干燥，测定得到的改性α-乳白蛋白样品G3经ELISA检测的OD值为0.73，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
实施例4
将α-乳白蛋白和麦芽三糖粉末按摩尔比1:13均匀混合后放入培养皿内，再把培养皿置于含有饱和KBr溶液的干燥器（干燥器中的相对湿度为65%）中，然后将干燥器放入55℃的培养箱内，48h后取出混合物，测定得到的改性α-乳白蛋白样品G4经ELISA检测的OD值为0.87，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
实施例5
将α-乳白蛋白和麦芽三糖按摩尔比1:13溶解于去离子水中，制成最终蛋白质含量为5重量%的混合液，用1M的NaOH调节混合液的pH值为8.0，再将混合液置于含有饱和KBr溶液的干燥器（干燥器中的相对湿度为65%）中，然后将干燥器放入55℃的培养箱内，48h后取出混合物，透析除去未参与反应的麦芽三糖及NaOH，再次冷冻干燥，测定得到的改性α-乳白蛋白样品G5经ELISA检测的OD值为0.89，其中ELISA检测按照与实施例1相同的方法和待测量进行。
测试实施例1
用胰蛋白酶（色谱级，购自Sigma公司）分别将改性α-乳白蛋白样品G1、D1和D2进行酶解（酶解的条件包括酶与底物的摩尔比1:100，37℃恒温水浴，pH值为8.5）。然后对各自的酶解产物进行高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析，分析条件如下（参照文献Maillardglycation of β-lactoglobulin with several sugars:comparative study of theproperties of the obtained polymers and the substituted sites，2001）：
高效液相色谱条件：Zobalx SB-C18色谱柱（2.1mm×150mm）。洗脱速度为0.2mL/min，流动相分别为5%~45%的缓冲液A（三氟乙酸：水=0.1:99.9），洗脱50min；45%~60%缓冲液A，洗脱5min；60%~90%的洗脱液A，洗脱65min。高效液相色谱仪型号为1100，由美国Agilent公司生产。
质谱条件：喷雾电压为3.5kV，干燥气温度为300℃，质量扫描范围m/z300~2000。采用一级全扫描质谱（full scan MS）和多级全扫描质谱（full scan MSn）同时检测。质谱仪型号为LCQ DaceXP，由Thermo公司生产
HPLC-MS分析结果如表1和图1A-E所示，其中，未检出表明在相应的分子量处没有检测到质谱峰。
表1
图1A-E为样品G1酶解产物的ESI质谱图，经分子量对比分析（1分子的麦芽三糖加入到肽段上，则肽段分子量增加486，即麦芽三糖与赖氨酸残基上的ε氨基通过脱去一分子水而形成赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式（1）所示基团所取代的麦芽三糖修饰）得出的被修饰的肽段有5条，分别为肽段（17-62）、（80-98）、（95-108）、（99-114）和（109-122）。这表明，样品G1中，第58、93、94、98、108和114位上的赖氨酸残基被麦芽三糖修饰。
比较样品G1、D1和D2被修饰的位点及其抗原性，样品D1和D2的第58位赖氨酸上均没有被修饰且抗原性比样品G1的抗原性高，这说明麦芽三糖能够对α-乳白蛋白的第58位赖氨酸进行特异地修饰，并获得了抗原性更低的改性α-乳白蛋白。
测试实施例2
对改性α-乳白蛋白样品G1进行内源荧光光谱分析（分析方法参照文献Freeradical scavenging capacity of Maillard reaction products as related tocolour and fluorescence（Morales FJ，Jimenez-Perez S,Food Chemistry，2001））：使用荧光分光光度计（日本岛津公司，RF-5301）在280nm处进行发射波长扫描（300nm-400nm），结果如图2所示。
样品G1的最大荧光波长为338nm，与未改性的α-乳白蛋白比较，出现了最大荧光波长红移的情况。然而，样品G1的荧光强度较未改性的α-乳白蛋白明显降低，说明本发明方法制得的改性α-乳白蛋白的三级结构发生了改变。
测试实施例3
对改性α-乳白蛋白样品G1进行圆二色谱（CD）分析，具体步骤为：将待测样品溶解于50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中，蛋白质浓度为0.1mg/mL，室温下，用圆二色谱仪（J-810，Jasco，日本）进行远紫外光谱分析，扫描范围为190~250nm，扫描速度为200nm/min，每个样品连续扫描三次，参照文献Estimation of globular protein secondary structurefrom circular dichroism （Provencher SW，Gloeckner J,Biochemistry，1981），计算样品各个二级结构比例如表2所示，得到的圆二色谱远紫外图谱如图3所示（实线表示未改性的α-乳白蛋白，虚线表示改性α-乳白蛋白样品G1）。
表2
从表2可以看出，样品G1的二级结构中，α-螺旋比例减少，β-折叠比例增加；从图3可以看出，样品G1的负槽向低波长偏移（203nm），说明本发明方法制得的改性α-乳白蛋白的二级结构发生了变化。
从以上实施例和对比例可以看出，本发明方法制得的改性α-乳白蛋白经ELISA检测的OD值比未改性的α-乳白蛋白和非本发明方法制得的改性α-乳白蛋白的OD值要小得多，因此，本发明的改性α-乳白蛋白的抗原性大大降低。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (12)

1.一种功能性食品，其特征在于，该功能性食品含有改性α-乳白蛋白和食品添加剂，所述改性α-乳白蛋白为如下(a)，或者为如下(a)和(b)，
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的改性α-乳白蛋白，其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第58、93、94、98、108和114位的赖氨酸残基具有麦芽三糖修饰，所述麦芽三糖修饰为赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式(1)所示基团所取代：
(b)由包括以下步骤的方法制得的改性α-乳白蛋白：
在美拉德反应的条件下，将α-乳白蛋白与麦芽三糖接触。
2.根据权利要求1所述的功能性食品，其中，(b)中，α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比为1:5-20。
3.根据权利要求1所述的功能性食品，其中，(b)中，α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比为1:11-15。
4.根据权利要求1所述的功能性食品，其中，(b)中，所述美拉德反应的条件包括温度为50-60℃，时间为10-120h。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的功能性食品，其中，(b)中，所述方法包括将α-乳白蛋白和麦芽三糖共同溶解于溶剂中，得到溶液，调节所得溶液的pH值为7.5-8.5，然后在4℃以下的温度下除去溶剂，得到混合粉末，再将所得混合粉末置于温度为50-60℃与相对湿度为60-70％的条件下10-120h。
6.根据权利要求5所述的功能性食品，其中，所述溶剂为水；所述溶液中α-乳白蛋白的含量为4-6重量％。
7.改性α-乳白蛋白在制备功能性食品中的应用，其特征在于，所述改性α-乳白蛋白为如下(a)，或者为如下(a)和(b)，
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的改性α-乳白蛋白，其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第58、93、94、98、108和114位的赖氨酸残基具有麦芽三糖修饰，所述麦芽三糖修饰为赖氨酸残基的ε氨基上的一个氢被式(1)所示基团所取代：
(b)由包括以下步骤的方法制得的改性α-乳白蛋白：
在美拉德反应的条件下，将α-乳白蛋白与麦芽三糖接触。
8.根据权利要求7所述的应用，其中，(b)中，α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比为1:5-20。
9.根据权利要求7所述的应用，其中，(b)中，α-乳白蛋白与麦芽三糖的摩尔比为1:11-15。
10.根据权利要求7所述的应用，其中，(b)中，所述美拉德反应的条件包括温度为50-60℃，时间为10-120h。
11.根据权利要求7-10中任意一项所述的应用，其中，(b)中，所述方法包括将α-乳白蛋白和麦芽三糖共同溶解于溶剂中，得到溶液，调节所得溶液的pH值为7.5-8.5，然后在4℃以下的温度下除去溶剂，得到混合粉末，再将所得混合粉末置于温度为50-60℃与相对湿度为60-70％的条件下10-120h。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述溶剂为水；所述溶液中α-乳白蛋白的含量为4-6重量％。
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