CN103502275A

CN103502275A - 融合蛋白的小分子疏水性标记和引起的其降解

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Publication number: CN103502275A
Application number: CN201180066936.9A
Authority: CN
Inventors: C·M·克瑞武兹; H·S·泰; A·R·斯彻尼孔斯; T·尼克利萨; T·三德博格
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2010-12-07
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2014-01-08
Also published as: CA2823837A1; US9500653B2; US20170067874A1; US9632089B2; US20170307614A1; WO2012078559A2; AU2011338615B2; AU2017204640A1; WO2012078559A3; EP2649099A4; US10145848B2; AU2011338615A1; US20140302523A1; US20180356421A9; EP2649099A2

Abstract

本发明涉及用小分子在活体***中调节任意感兴趣的蛋白质的能力。具体地，本发明涉及这样的发现：附着疏水部分到蛋白质的表面可模拟蛋白质的部分变性状态，从而使细胞质量控制机构引起其蛋白酶体降解。本发明的方面涉及双功能小分子，其结合一些蛋白质——包括，例如自标记标签，诸如细菌脱卤素酶(HaloTag蛋白质)并在其表面上呈现疏水基团。用疏水部分(例如，金刚烷基部分)疏水性标记HaloTag蛋白质得以实现，并且，标记引起细胞培养物中的胞质蛋白、异戊二烯化蛋白和跨膜融合蛋白降解。本发明还证明，通过降解在斑马鱼胚胎中表达的蛋白质和通过抑制小鼠中RasG12V-驱动的肿瘤发展，疏水性标记的体内有用性。因此，疏水性标记HaloTag融合蛋白提供对任何感兴趣的蛋白质的小分子控制，使其成为确认疾病模型中潜在的药物靶标的理想***。

Description

融合蛋白的小分子疏水性标记和引起的其降解

发明领域

本发明涉及化合物和组合物，其可用于干扰和/或扰乱跨膜蛋白质或细胞内蛋白质的功能，以确定或确认蛋白质作为感兴趣的蛋白质。除了化合物和方法外，本发明还涉及确定或确认蛋白质作为用作生物活性剂(药物)靶标的感兴趣的蛋白质以治疗疾病状态或状况的方法。

相关申请和政府支持

本发明要求2010年12月7日提交的、名称为“Regulation of Protein Function inLive Animals via Hydrophobic Tagging(通过疏水标记调节活体动物内的蛋白质功能)”的临时申请序列号61/420,584和2011年9月1日提交的、名称与本申请相同的61/530,014的优先权，其通过引用以其整体并入本文。

本发明是以国立卫生研究院(National Institutes of Health)(NIH)授予的授权号R01AI084140在政府的支持下进行的。政府在本发明中享有一定权利。

发明背景

化学生物学的主要挑战之一仍在于利用小分子干扰任意细胞内蛋白质的功能的能力。虽然已经朝向发展特定蛋白质的单独的配体取得了显着进步，但只有约300种核准药物的分子靶标被表征¹。此外，经现有方法归类为“无法制药的(undruggable)”的蛋白质组部分估计约为80%²。很可能，许多有吸引力的药物候选物尚待发现，并且，药物开发未来的发展将能够克服被认为是“无法制药的”靶标^3,4的界限。因此，对生物学家的挑战仍在于确定那些致病药物靶标。为此，深度测序、微阵列技术和全基因组RNAi筛选的进步已被成功地用于确定有前途的新药物靶标。例如，全基因组RNAi筛选已被用于确定与突变癌基因的合成致死相互作用和用于确定各种致病感染必需的基因^5-7。

尽管靶标确定是药物开发中明显重要的第一步，但对这些潜在靶标的体内确认仍是挑战。这部分是由于基于蛋白质功能体外抑制确定的任何抑制性化合物的不可预测的药代动力学/药物动力学。换言之，小分子抑制剂不能产生期望的体内结果是其体内代谢的无法预料的后果？或者仅仅其靶标蛋白质是差的药物靶标？为解决该问题，需要一般的方法来从功能上确认推定的疾病相关蛋白质的调节是否导致期望的体内结果。RNAi为推定药物靶标的生物确认提供最初的预示，然而，双链体RNA的运输和稳定性仍是在整个动物设置(setting)中敲除mRNA表达中的主要障碍⁸。在不存在靶标蛋白质的直接配体的情况下，当前存在三种基于小分子的方法，来控制感兴趣的蛋白质(POI)的功能⁹。首先，植物激素生长素可用于使植物E3泛素连接酶(TIR1)与AUX/IAA转录阻抑物(Aid1)的结构域进行二聚，该结构域在融合于POI时可通过接近TIR1被泛素化¹⁰。该方法要求融合POI与Aid1，同时引入植物E3连接酶TIR1到细胞中。用于使蛋白质功能失调的第二种一般方法涉及FKBP12和来自mTOR的FKBP12-雷帕霉素结合(FRB)结构域的二聚化。已经证明通过该方法可将POI补充到蛋白酶体或补充到线粒体外膜^11-13。再次，至少两种融合蛋白必须被引入到细胞中，以使该***发挥作用⁹。最后，已经发现了两个去稳定结构域(DDs)——一个基于FKBP12蛋白质，另一个基于大肠杆菌(E.coli)DHFR蛋白质^14,15，以使DD-POI融合蛋白不稳定。导致降解的DD可通过包含FK506¹⁶衍生物(在诱变处理的FKBP12的情况下)或大肠杆菌DHFR抑制剂三甲氧苄二氨嘧啶(在DHFR的情况下)而变稳定，最终导致融合蛋白水平增加。虽然DD方法已成功用于若干研究中^17-20，但它需要配体的持续存在，以稳定表达融合蛋白。在研究可能不接收足够的稳定配体的发育中胚胎时或在研究POI的长期作用时——在这种情况下，配体必须在研究期间内被注射到动物中，该要求可能是个问题。而且，在POI长期表达的情况下，必须考虑POI水平由于稳定化配体的间歇注入造成的可能波动。

发明概述

本发明涉及包含疏水部分的疏水化合物，该疏水部分连接于反应性连接体，优选卤代烷(haloalkane)反应性连接体(即，连接体，其包含与卤化酶/水解酶自标记标签诸如halotag具有反应性的卤代烷部分)，该反应性连接体与融合蛋白形成共价键，连接疏水化合物与融合蛋白。根据本发明的化合物可用于结合融合蛋白，其中，融合蛋白包含感兴趣的蛋白质(例如，潜在的药物或其它生理学靶标)和自标记标签(诸如halotag(halo标签)、snaptag(snap标签)、cliptag(clip标签)、ACPtag(ACP标签)、MCPtag(MCP标签)，除了别的以外)，该自标记标签可用于结合疏水化合物与融合蛋白。在本发明的优选方面，疏水化合物包含卤代烷反应性连接体，借助于该卤代烷反应性连接体，疏水部分可通过卤代烷反应性连接体上卤化酶自标记标签(例如，HaloTag)的作用而连接于融合蛋白。当反应后，疏水部分共价结合于融合蛋白。出人意料地发现，共价连接于融合蛋白的疏水部分致使融合蛋白降解(通过与感兴趣的蛋白质相互作用/降解)，导致蛋白质变性和融合蛋白的蛋白酶体降解。连接于融合蛋白的疏水部分在降解融合蛋白中的作用可用于分析中，以确定感兴趣的蛋白质对生物学过程——例如疾病状态或状况的调节，诸如癌细胞或组织的生长或抑制——的重要性。确定感兴趣的蛋白质的重要性可用于确立感兴趣的蛋白质作为生物活性剂包括小分子药剂的潜在靶标，以治疗由感兴趣的蛋白质调节的疾病状态或状况。

在根据本发明确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂(例如，药物)靶标的方法中，将疏水性标记的融合蛋白——包含感兴趣的蛋白质——暴露于细胞，并且测量细胞内或细胞表面上疏水性标记的融合蛋白的降解的影响，以确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的药物靶标(即，调节疾病或状况，针对该疾病或状况药物或其它治疗可证明是有用的)。在优选实施方式中，该方法包括共价连接融合蛋白——包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽——于疏水部分。这可通过表达两种多肽作为融合蛋白而实现。

在第一方法方面，本发明包括如下步骤：

1.提供疏水性标记的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和共价连接于所述融合蛋白的疏水部分，其中所述疏水部分能够在细胞内或细胞表面上降解所述融合蛋白；

2.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白(例如，通过融合蛋白的细胞内表达或通过将细胞暴露于融合蛋白)，其中，融合蛋白可任选地和优选地在所述细胞内或其表面上通过小分子标记有疏水部分，所述小分子以疏水部分标记融合蛋白的自标记多肽；

3.测量细胞内或细胞表面上融合蛋白的降解；和

4.确定融合蛋白的降解是否与蛋白质作为通过感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂(例如，药物)的潜在靶标相一致地通过细胞的表型响应变化(例如，被鉴定的细胞的生长和/或活性变化)调节细胞的生物学活性。

在优选方面，根据本发明的方法利用融合蛋白——包含感兴趣的蛋白质和疏水地标记融合蛋白的自标记多肽——确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂(例如，药物)靶标。该方法包括如下步骤：

1.提供融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签——在体外或体内，包括在细胞内或细胞表面上；

2.共价连接所述融合蛋白与化合物，该化合物包含疏水基团(优选地，不是Clog P至少约为1.5的荧光部分)和反应性连接体，其中，反应性连接体是自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而产生疏水性标记的融合蛋白；

3.任选地，分离所述疏水性标记的融合蛋白；

4.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白；

5.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和任选地

6.确定所述融合蛋白的所述降解是否与蛋白质作为通过感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂(例如，药物)的潜在靶标相一致地（通过细胞的表型响应变化，例如，被鉴定的细胞的生长和/或活性变化)调节所述细胞的生物学活性。

在本发明的可选方面，本发明涉及引起细胞中融合蛋白降解的方法，该方法包括如下步骤：

1.在细胞中表达融合蛋白，其中所述融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽标签；

2.在细胞内或所述细胞表面上使所述表达的融合蛋白与化合物反应，所述化合物包含疏水基团和与所述自标记多肽标签具有反应性的基团，其中所述化合物在与所述自标记多肽标签反应后与所述融合蛋白形成共价键，从而形成疏水性标记的融合蛋白；和

3.使所述融合蛋白在所述细胞内或其表面上降解。

在本发明的优选方面，在相同的细胞内或其表面上产生融合蛋白，并发生融合蛋白的疏水标记，在该细胞中，感兴趣的蛋白质被利用，以便在产生融合蛋白并且疏水性标记所产生的融合蛋白的相同细胞中确定感兴趣的蛋白质的相关性。因此，在本发明的某些优选方面，融合蛋白通过反应性连接体在体内/在细胞内或细胞表面上共价连接于疏水部分，其通过在细胞内表达融合蛋白(包括在测试动物中，诸如小鼠、大鼠或其它哺乳动物)和暴露融合蛋白于包含疏水部分和反应性连接体的化合物(例如，化合物可被体内施用给测试动物或暴露于在培养基中生长的细胞)进行，其中，连接于融合蛋白的疏水部分将与感兴趣的蛋白质——潜在的重要药物靶标——一致地引起融合蛋白在细胞内或细胞表面上降解，具有可能产生的和可测量的表型响应。注意，融合蛋白可在细胞内产生，并通过应用信号和/或细胞自身的或与融合蛋白一起表达的锚定肽序列锚定到细胞表面上。这样的方法在本领域中是众所周知的，其使得融合蛋白被表达和锚定在细胞表面上，以连接疏水部分。考虑本发明可用于在细胞表面上发挥作用的蛋白质以及在细胞内发挥作用的蛋白质。

在本发明中，融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签(例如，Halotag、Snaptag、Cliptag、ACP标签或MCP标签)，疏水部分可通过反应性连接体结合到该多肽自标记标签。在Halotag融合蛋白的情况下，反应性连接体包含卤代烷基团，其与Halotag的卤化酶反应，以与融合蛋白产生共价键。在Snaptag融合蛋白的情况下，反应性连接体包含苄基鸟嘌呤底物，其与DNA修复蛋白质O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶反应，以于融合蛋白上提供共价连接的疏水部分。在Cliptag融合蛋白的情况下，反应性连接体包含O2-苄基胞嘧啶部分，以于融合蛋白上提供共价连接的疏水部分。在ACP标签的情况下，反应性连接体包含辅酶A衍生物(CoA衍生物)，其通过由酰基载体蛋白质(ACP)磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS(ACP合成酶)催化的翻译后修饰进行共价结合。在MCP标签(突变体)的情况下，反应性连接体包含辅酶A衍生物，其通过由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(SFP合成酶)，而不是AcpS，催化的翻译后修饰进行共价结合。注意，ACP和MCP标签可用于提供疏水性标记的融合蛋白，该融合蛋白不能穿透细胞——它们限于应用于作为表面蛋白质的感兴趣的蛋白质。

在上述测量步骤中，可利用确定和量化蛋白质的标准方法，通过测量所述细胞内或其表面上非降解的或降解的融合蛋白，量化降解的蛋白质。这些方法包括——除了其它方法之外——利用连接于报道分子诸如荧光剂或其它报道分子的蛋白质特异性抗体，这样的方法包括免疫分析(例如，ELISA，除了别的以外)和免疫印迹、吸光度分析、质谱法和蛋白质组学方法——除了许多别的以外。定量样品中具体蛋白质的方法在本领域中是众所周知的，并且，容易用于根据本发明的方法。对降解的蛋白质和这样的降解对细胞功能例如细胞生长和/或增殖(例如，细胞死亡)或细胞的其它特性(例如，生物学、生理学特性)的影响的分析证明感兴趣的蛋白质对细胞生长和功能的重要性，并确立感兴趣的蛋白质是否是疾病状态或状况的调节因子，从而确立感兴趣的蛋白质是否是治疗所述疾病状态或状况的潜在靶标(生物活性剂，包括药物)。将感兴趣的蛋白质确定为药学靶标将允许分析发展，以确定显示如感兴趣的蛋白质的潜在抑制剂和/或激动剂的活性的化合物和其它生物活性剂。

在一个方面，根据本发明的化合物可由如下通式表示：

其中，

是疏水基团，不是报道基团(例如，荧光基团)，其ClogP至少约为1.5或具体如本文另外描述；和

是连接基团，其具有反应部分，该反应部分与融合蛋白的自标记多肽标签反应——该融合蛋白包含所述自标记标签和感兴趣的蛋白质，以在所述基团和所述融合蛋白之间形成共价键，其中所述疏水基团促进共价连接于所述

基团的所述融合蛋白中的所述感兴趣的蛋白质的降解。

在根据本发明的可选实施方式中，根据本发明的化合物包含根据如下化学结构的化合物：

其中，是疏水基团，不是荧光部分，其ClogP至少约为1.5或如本文另外具体描述；

是融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和在所述融合蛋白中连接于所述感兴趣的蛋白质的自标记多肽标签，所述酶标签共价连接所述

基团与所述融合蛋白；和

L是化学连接体，其共价结合所述

基团与所述融合蛋白，其中所述疏水基团促进包含共价连接于所述基团的感兴趣的蛋白质的所述感兴趣的蛋白质的降解。

在本发明的优选方面，

化合物——其可用于共价结合疏水部分与融合蛋白，该融合蛋白优选包含自标记标签蛋白质，该化合物具有以下化学结构：

其中，

是疏水基团，如本文另外描述；

Z是连接

与X的基团；

X是连接Z与基团Y_R的基团；和

Y_R是与融合蛋白，优选与所述融合蛋白上的自标记标签，具有反应性的基团，其形成连接疏水基团和融合蛋白的共价键。

在优选方面，Z是不存在(键)的、-(CH₂)_i-O、-(CH₂)_i-S、-(CH₂)_i-N-R、

基团，其中，X₁Y₁形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团，或者

或

基团

每一个R均是H或C₁-C₃烷基或链烷醇基团；

每一个Y均独立地是键、O、S或N-R；

和每一个i均独立地是0至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；

在优选方面，X是

基团

其中，每一个D均独立地是键(不存在)、

-(CH₂)_m'-；或

j是1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；

k是1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；优选k是1、2、3、4或5；

m’是1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；

n是1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；

X¹是O、S或N-R、优选O；

Y同上；和

是键(不存在)或

基团，

其中，X²是O、S、NR⁴、S(O)、S(O)₂、-S(O)₂O、-OS(O)₂或OS(O)₂O；

X³是O、S、NR⁴；和

R⁴是H或C₁-C₃烷基或

其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体。

优选地，

是基团或酰胺基团。

在优选方面，Y_R是与融合蛋白的自标记标签具有反应性的基团，其中，自标记标签优选是Halo标签、Snap标签、Clip标签、ACP标签或MCP标签。优选地，自标记标签是Halo标签，和Halo标签的反应性底物是卤代烷基团——该卤代烷基团其任选地被一个或两个醚基团取代，优选C₂-C₁₂氯烷基——该氯烷基任选地被一个(单醚)或两个(二醚)醚基团取代，甚至更优选地，卤烷基二醚基团。在优选方面，卤烷基二醚基团根据如下化学结构：

并与疏水基团和根据如下化学结构的连接体的剩余部分形成化学结构：

其中，Z和X如上面另外描述。

在可选实施方式中，当融合蛋白包含自标记标签如Snap标签时，Y_R是苄基鸟嘌呤基团

，其提供根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z和X如上面另外描述。

在可选实施方式中，当融合蛋白包含自标记标签如Clip标签时，Y_R是苄基胞嘧啶基团

，其形成根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z和X如上面另外描述。

在进一步可选实施方式中，当融合蛋白包含自标记标签如ACPtag或MCPtag时，Y_R是辅酶A衍生物

，其形成根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z和X如上面另外描述。

通过融合蛋白的自标记标签对上述化合物的反应部分的作用，上述各化合物将产生共价连接于融合蛋白的化合物。

通过自标记标签的作用产生的代表性化合物由如下结构表示：

其中，

Z、X和

如上面另外描述，和

Y_Rp是化学部分，其通过融合蛋白——优选融合蛋白的自标记标签蛋白质——对基团Y_R的作用而形成。

在包含halotag自标记标签蛋白质的融合蛋白的情况下，反应产物是根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z、X和如上面另外描述。注意，Y_Rp基团(表示为烷基二醚基团)与融合蛋白形成共价键(通过表示为X_Fp基团的氮、氧或硫基团)。

在包含snaptap或cliptag自标记标签蛋白质的融合蛋白的情况下，反应产物是根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z、X和

如上面另外描述。注意，Y_Rp基团(表示为苄基)与融合蛋白形成共价键(通过所示硫基团)。

在包含ACP或MCP自标记标签蛋白质的融合蛋白的情况下，反应产物是根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z、X和

如上面另外描述。注意，Y_Rp基团与融合蛋白形成共价键(通过所示氧基团和磷酸酯)。

附图简介

图1显示利用HaloTag融合蛋白***的疏水性标记策略

(a)代表性HaloTag配体：HyT5、HyT12、HyT13、HyT16、HyT21和HyT22的化学结构。(b)表达HA-HaloTag-荧光素酶的HEK293T细胞经所示化合物以1μM处理24小时，此时，进行荧光素酶分析。

图2显示HyT13导致HaloTag融合蛋白的降解

(a)表达HA-EGFP-HaloTag的Flp-In293细胞经所示浓度的HyT13处理24小时。溶胞产物用抗-HA和抗-β-肌动蛋白抗体探测。(b)与(a)中相同的细胞系经1μMHyT13处理所示时间。最右边的样品经HyT13处理24小时，此后，提供不含HyT13的培养基达24小时。(c)与(a)中相同的细胞系经蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)和YU101(10μM)预处理1小时，然后加入1μM HyT13。在HyT13加入后6小时，从细胞制备溶胞产物。(d)稳定表达EGFP-HaloTag的HeLa细胞经介质或1μMHyT13处理达24小时，然后，细胞内GFP荧光通过流式细胞术被量化。MFI=平均荧光强度。(e)稳定表达所示跨膜HA-HaloTag融合蛋白的HEK293T细胞经1μM HyT13处理24小时。显示的是来自至少三个试验的代表性图像；条带被量化和平均降解±SEM被显示。(f)单细胞阶段斑马鱼胚胎被注射以100ng的HA-HaloTag-Smad5cRNA，生长至256细胞阶段，然后经10μM HyT13处理24小时。显示的是来自至少三个试验的代表性图像；条带被量化和平均降解±SEM被显示。

图3显示通过HyT13的Halo标签降解的功能确认

(a)NIH-3T3细胞通过逆转录病毒地被感染以表达HA-HaloTag-HRas(G12V)或HA-HaloTag(D106A)-HRas(G12V)的构建体。然后，细胞经介质或1μM HyT13处理24小时。制备溶胞产物用于免疫印迹法，并且，印迹用抗-HA和抗-β-肌动蛋白抗体探测。(b)将含有10%FBS的培养基中的感染以HA-HaloTag-HRas(G12V)或HA-HaloTag(D106A)-HRas(G12V)的十万个NIH-3T3细胞在10-cm平板上铺平板。次日，将培养基替换为含1%FBS与介质或1μM HyT13的培养基。培养基每2天被更新一次，并且，在第6天将平板绘图。条，5mm。(c)如(b)中所述的集落(foci)的量化。计算来自三个独立的平板的集落数/cm²，其中，误差条表示SEM。(d)十万个表达HA-HaloTag-HRasG12V的NIH-3T3细胞在第0天被注入到裸鼠的胁中。从第0天开始，每日经IP给予小鼠介质或HyT13的注射。每日测量肿瘤大小，并且计算肿瘤体积。每一个处理组使用7只小鼠。误差条表示SEM。

图4显示HyT13介导的HaloTag融合蛋白降解的示意图

融合蛋白——由感兴趣的蛋白质和HaloTag蛋白质组成——在HyT13处理后通过蛋白酶体被降解。

图5显示合成的代表性化合物及其测试数目。

图6显示HyT13的浓度曲线。表达HA-EGFP-HaloTag的Flp-In293细胞经所示浓度的HyT13处理24小时。溶胞产物用抗-HA和抗-β-肌动蛋白抗体探测，其中，β-肌动蛋白充当负荷对照。显示的是三个独立试验的定量，其中误差条表示SEM。

图7显示HyT13活性的时间进程。表达HA-EGFP-HaloTag细胞的Flp-In293细胞经1μM HyT13被处理所示时间，并且，溶胞产物用抗-HA和抗-β-肌动蛋白抗体探测。最右边的样品经HyT13处理24小时，此后，提供不含HyT13的培养基达24小时。显示的是三个独立试验的定量，其中误差条表示SEM。

图8显示化合物HyT13在上至20μM HyT13的剂量下不表现出毒性。HEK293或HeLa细胞经所示浓度的HyT13处理24小时。氧化还原指示剂刃天青(阿尔玛蓝(alamarBlue)，Invitrogen)被用于确定细胞生存力。蛋白酶体抑制剂YU101在指示的浓度下对细胞是有毒性的，并且充当分析的阳性对照。

图9显示在经HyT13处理的小鼠中没有观察到毒性。裸鼠每日经IP注射以指示浓度的HyT13并在14天的试验过程中被监测体重增长。显示的是每一个处理组在14天期间增加的百分比体重±SEM。每一个处理组由7只小鼠组成。

图10显示血清HyT13测定。Webster Swiss小鼠经IP接受25mg/kg HyT13的注射。注射体积为10μL，由在DMSO中的5μL克列莫佛EL赋形剂和5μL HyT13组成。在注射后1和24小时，自颈动脉收集血液。使血液凝结10分钟，以10,000g下离心5分钟，并且，血清用移液管移到新管中。十微升血清用于生物-报道分子分析，包括使HEK293T荧光素酶-HaloTag细胞的荧光素酶活性退化的能力。HyT13的血清浓度基于随同生物-报道分子分析显示的HyT13的浓度曲线。来自未接收HyT13的小鼠的血清中没有观察到降解活性。每一个处理组均由三只小鼠组成。显示的是平均血清HyT13水平±SEM。

图11显示多种合成的HyT化合物对绿色荧光蛋白质halotag融合蛋白的降解的效果，每种化合物为1μM的浓度。

图12a-f显示如本申请实验部分所述的几种融合蛋白降解的代表性免疫印迹凝胶图像。

图13显示HA-HaloTag-HRas(G12V)融合蛋白的免疫印迹凝胶图像。

图14显示如本文另外描述共价连接于融合蛋白的多种代表性疏水部分。

图15显示根据本发明产生疏水标签(ClogP>1.5)的某些典型方法，该疏水标签具有卤代烷反应性连接体，以能够与细菌卤化酶(halotag)多肽共价连接。疏水标签(HyTs)可通过标准合成化学技术经由连接商业Promega反应性配体和RCO₂H、RNH₂、ROH、RCH₂X而被制备。

图16显示本发明中应用的halotag、snaptag、cliptag、ACPtag和MCPtag自标记多肽标签的十个代表性多肽(氨基酸)序列。

发明详述

根据本发明，可以应用本领域技术中的常规化学合成方法以及分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术是众所周知的，并且在文献中被另外充分说明。参见，例如，Sambrook等，2001,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"；Ausubel编著,1994,"Current Protocols in Molecular Biology"Volumes I-III；Celis编著,1994,"Cell Biology:A Laboratory Handbook"Volumes I-III；Coligan编著,1994,"Current Protocols in Immunology"Volumes I-III；Gait编著,1984,"OligonucleotideSynthesis"；Hames&Higgins编著,1985,"Nucleic Acid Hybridization"；Hames &Higgins编著,1984,"Transcription And Translation"；Freshney编著,1986,"AnimalCell Culture"；IRL Press,1986,"Immobilized Cells And Enzymes"；Perbal,1984,"APractical Guide To Molecular Cloning"。

在提供数值范围的情况下，应该理解，该范围上下限之间的每一个中间值——除非上下文另外明确说明，相对于下限单位的十分之一(诸如，在含有数个碳原子的基团的情况下)——和任意其它陈述的范围或该陈述范围内的中间值均包含在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地包括在这些较小的范围内，其也包含在本发明内，从属于所陈述范围内任意具体排除的界限。在陈述的范围包括界限中的一个或两个时，排除这些包含的界限的任意一个或两者的范围也包含在本发明内。

除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些相似或等同的任意方法和材料也可以用于实施或测试本发明，但现在描述优选方法和材料。

注意，如本文和所附权利要求书所使用的，单数形式"一(a)"、"和(and)"和"该(the)"包括复数指代，除非上下文另外明确说明。

此外，以下术语将具有下面提出的定义。应该理解，在特定术语没有在下面限定的情况下，该术语将具有其通常被本领域普通技术人员使用的背景下的含义。

如本文所使用的，除非另有说明，术语“化合物”是指本文公开的任意具体化学化合物。在其在上下文的应用中，该术语一般只单个化合物，其包含疏水部分和连接体，该连接体能够与融合蛋白反应并形成共价键，如本文另外描述。在某些情况下，该术语也可以指公开的化合物的立体异构体和/或旋光异构体(包括外消旋混合物)或富含对映异构体的混合物。在本发明中，在某些情况下，尤其在本发明的优选方面，化合物包含疏水部分和连接体部分，并且，通过共价键化学连接于融合蛋白，以便疏水部分可促进和/或导致作为融合蛋白一部分的感兴趣的蛋白质降解。公开的化合物是那些稳定的并且可以对取代基和要求元素进行选择的化合物，取代基或要求元素被选择，以便稳定的化合物由公开的元素和取代基形成。

术语“患者”或“对象”在整个说明书中被用于描述进行治疗或程序包括预防性治疗或程序的动物，通常是哺乳动物并优选是人的背景下。对于针对具体动物，诸如人患者，的那些感染、状况或疾病状态治疗，术语患者是指该具体动物。在大部分情况下，本发明的患者或对象是任一性别或两种性别的人患者。

除非另外说明，术语“有效的”在本文中用于描述在上下文中用于产生或实现预期结果的化合物或组合物的量，无论该结果是否涉及结合疏水部分-连接体化合物于融合蛋白上的结合或化学改性的融合蛋白(与疏水基团共价结合)的应用。术语有效的包含所有其它有效量或有效浓度术语，这些术语被另外描述或使用于本申请中。

术语“感兴趣的蛋白质”被用于描述——除了其它之外——细胞内和细胞外蛋白质，该蛋白质在细胞内或其表面上显示功能并可以被认为是疾病状态或状况的药物靶标。感兴趣的蛋白质包括结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、与细胞的整体功能有关的蛋白质，包括涉及催化活性、芳化酶活性、传动蛋白活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成的蛋白质、具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导蛋白活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质、脂质碳水化合物)、受体活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物学过程调节、发育、细胞分化、刺激物响应的蛋白质、行为蛋白质、细胞黏着蛋白质、涉及细胞死亡的蛋白质、涉及转运(包括蛋白质转运体活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、透性酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机理、蛋白伴侣调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外组构和生源说活性、翻译调节因子活性)的蛋白质。感兴趣的蛋白质可以包括来自如下的蛋白质：真核生物和原核生物，包括人，作为药物治疗的靶标；其它动物，包括驯养动物、微生物，用于确定抗生素和其它抗微生物剂和植物，甚至病毒等的靶标。感兴趣的蛋白质是包括本发明的融合蛋白的两种蛋白质中的一种，其可被发现于融合蛋白的氨基末端或羧酸末端；另一种蛋白质是报道蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质、红色荧光蛋白质，除了别的以外)、更优选自标记标签(例如，Halotag、Snaptag、Cliptag、ACPtag或MCPtag)，如本文另外描述。

如本文中所使用的，术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白质”描述通过连接两个或更多个基因——最初针对单独不同的蛋白质被编码——而产生的蛋白质。融合基因的翻译产生单个多肽(具有两个多肽区段)，其功能性质来源于每一个最初的蛋白质。根据本发明的融合蛋白主要是重组融合蛋白并通过重组DNA技术被人工产生。在本发明中，融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和第二蛋白质，该第二蛋白质可以是报道蛋白质，诸如绿色或红色荧光蛋白质，或荧光素酶蛋白质，或优选地，融合蛋白的第二蛋白质是自标记多肽标签蛋白质，诸如Halotag、Snaptag、Cliptag、ACPtag或MCPtag，如本文另外描述。注意，感兴趣的蛋白质可位于融合蛋白的氨基末端或羧基末端，并且，连接疏水部分的第二蛋白质(例如，报道分子或标签多肽)可以被相应地定位。

根据本发明的融合蛋白是重组融合蛋白，其通过融合基因工程而产生。这通常涉及从编码第一蛋白质的cDNA序列去除终止密码子，然后，通过连接或重叠延伸PCR——除了其它技术以外——将第二蛋白质的cDNA序列添加到框架中。引入的DNA序列然后将与其它DNA序列一起被细胞表达为单个蛋白质。该蛋白质可被改造，以包括两个最初蛋白质的全部序列或仅其中之一的部分。如果两个实体(entity)是蛋白质，则可加入间隔肽，这使得蛋白质更加可能如预期独立地折叠和表现。在连接体能够实现蛋白质纯化的情况下，蛋白质或肽融合体中的间隔肽有时通过蛋白酶或化学剂的切割位点被改造，这能够实现两个单独的蛋白质的释放。根据本发明的融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和可以连接疏水标签的第二蛋白质。如所述，根据本发明的融合蛋白包含感兴趣的蛋白质和第二多肽，该第二多肽用于共价结合疏水部分，如本文另外描述。第二蛋白质可以是，例如报道多肽，诸如荧光蛋白质或荧光素酶蛋白质，但在本发明的优选方面，第二蛋白质是自标记多肽标签。

根据本发明的融合蛋白可通过利用商业可得的可被用于制备融合基因的表达载体而产生，，该融合基因通过***适当的DNA序列到表达载体中被产生，而该表达载体被引入到表达细胞中，诸如酵母或细菌细胞，以表达融合蛋白。除了感兴趣的蛋白质之外，本发明还优选利用表达自标记多肽标签的融合蛋白，如本文另外描述，以将疏水部分连接至融合蛋白。

术语“自标记多肽标签”或“自标记标签”被用于描述用于根据本发明的优选融合蛋白的多肽标签，作为通过与自标记标签具有反应性的连接体共价连接疏水部分与感兴趣的蛋白质的手段。自标记标签包含酶(通常是突变的)，该酶可***到融合蛋白中，并且与特定部分具有反应性，以共价结合连接体(其在一端包含该特定部分和在另一端包含疏水部分)与自标记标签，从而共价结合疏水部分与融合蛋白。优选的自标记标签包括，例如halotag、snaptag、cliptag、ACPtag和MCPtag自标记标签。所有这些标签均容易从来自威斯康辛州麦迪逊市的Promega Corporation(halotag)和马萨诸塞州伊普斯维奇市的New England BioLabs,Inc的商业可得的表达载体.获得，这些载体可适应感兴趣的蛋白质的基因的剪接于表达载体中，以产生包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽标签的融合蛋白。

halotag自标记多肽标签是基于halotag蛋白质——34kDa突变细菌水解酶(卤代烷脱卤素酶)，其已由Promega公司整合到表达载体中，是商业可得的。例如，halotag2自标记标签(卤代烷脱卤素酶)序列SEQ ID NO:1(见图16)可在

Acc.#.AAV70825找到和表达载体可在AY773970找到。halotag7多肽是SEQ ID NO:2(图16)。Halotag与卤代烷具有反应性，并且，在以融合蛋白形式表达时，在融合蛋白和反应性连接基团之间产生共价键，该反应性连接基团上已经进一步连接了报道部分，或者，在本申请中已经进一步连接了疏水部分(不是荧光团)。尽管多种卤代烷基团可用作在halotag***中的反应性连接体，以产生共价键，但优选的反应性连接体是

基团。Halogtag容易在来自威斯康辛州麦迪逊市的Promega Corporation的商业可得的表达载体(halotag)中获得。这些载体可适应感兴趣的蛋白质的基因的剪接于表达载体，以产生在大肠杆菌以及其他表达载体中表达的包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽标签的融合蛋白。

snaptag自标记多肽标签是基于DNA修复蛋白质O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的20kDa突变体，该DNA修复蛋白质O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶特异性地和快速地与苄基鸟嘌呤(BG)衍生物反应，如本文另外描述，导致snaptag通过存在于snaptag上的硫基团和苄基鸟嘌呤合成探针的苄基被含有探针的合成疏水部分不可逆地共价标记。snaptag与BG衍生物的反应速率在很大程度上独立于附着于BG的合成探针的性质，并允许snap融合蛋白被多种合成探针标记。用于将snaptag整合到多种融合蛋白中的表达载体(例如，psnap-tag(m)、psnap-tag(m)2、psnap-tag(T7)和psnap-tag(T7)-2载体)可从New England Biolabs,Inc.,USA获得。每一种snaptag多肽(snaptagm、snaptagm2、snaptagT7和snaptagT7-2)的多肽序列可以在图16中找到，如：psnap-tag(m)(SEQ ID NO:3)、psnap-tag(m)2(SEQ IDNO:4)、psnap-tag(T7)(SEQ ID NO:5)和psnap-tag(T7)-2(SEQ ID NO:6)。

cliptag自标记多肽标签基于snaptag DNA烷基转移酶酶的突变，导致不同的底物特异性。在cliptag蛋白质的情况下，该蛋白质特异性地与O2-苄基胞嘧啶(BC)衍生物反应，通过cliptag上的硫基团和苄基胞嘧啶衍生物上的苄基，在附着于O2-苄基胞嘧啶的合成探针和cliptag之间形成共价键。SNAP-和CLIP-标签融合蛋白可在活细胞中被同时并特异性地标记以不同的合成探针。用于将sliptag整合到多种融合蛋白中的表达载体(例如，clip-tag(m)载体，可得自New England Biolabs,Inc.,USA)。Cliptag多肽(cliptagm)的多肽序列可以在图16中找到，如：pclip-tag(m)(SEQID NO:7)。

ACP和MCP标签的应用稍微不同于snap和clip融合蛋白的标记，因为ACP和MCP标签是基于酶催化的翻译后修饰。在该方法中，感兴趣的蛋白质被融合至酰基载体蛋白质(ACP)，并且，相应的融合蛋白被特异性地标记以CoA衍生物——通过由磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS(SCP合成酶)催化的翻译后修饰。ACPtag具有9kDa的小尺寸。MCPtag——其是具有相似大小的ACP标签突变体——被磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(Sfp合成酶)而不是被ACP合成酶标记，从而允许在一个样品中用不同探针标记ACP和MCP选择性地融合蛋白。与halotag、snaptag和cliptag的底物相反，ACPtag(ACPtagm和ACPtagm-2)和MCPtag(MCPtagm)的底物不是细胞透性的，尽管该方法可被容易地用于感兴趣的蛋白质是细胞表面蛋白质的情况。这些标签(pACP-tag(m),pACP-tag(m)-2和pMCP-tag(m))的表达载体可得自New England Biologics,Inc.,Massachussets,USA。这些表达载体可用于容易地适应多种感兴趣的蛋白质，以提供各种融合蛋白，从而在根据本发明的方法中确定感兴趣的蛋白质的功能性和重要性。这些载体可适应感兴趣的蛋白质的基因的剪接于表达载体中，以产生表达于大肠杆菌以及其他表达载体中的包含感兴趣的蛋白质和自标记多肽标签的融合蛋白。ACPtag和MCPtag多肽各自的多肽序列可以在图16中找到，如：pACP-tag(m)(SEQ ID NO:8)、pACP-tag(m)-2(SEQ ID NO:9)和pMCP-tag(m)(SEQ ID NO:10)。

用于本发明的优选的自标记标签——halotag、snaptag、cliptag、ACPtag和MCPtag，可在细胞分析和体外应用中用于以包含本文所述疏水部分的合成探针选择性地标记相应的融合蛋白。

术语“疏水基团”或“疏水部分”被用于描述共价连接于根据本发明的融合蛋白的疏水基团，其使融合蛋白中感兴趣的蛋白质失稳和降解，使得融合蛋白在细胞中降解(蛋白酶体降解)。在本发明中，疏水基团具有以下理化特征，具体地，如由如下所表示的：其ClogP值至少约为1.5、至少约1.75、至少约2.0、至少约2.25、至少约2.5、至少约2.75、至少约3.0、至少约3.25、至少约3.5、至少约3.75、至少约4.0、至少约4.25、至少约4.5、至少约4.75、至少约5.0、至少约5.25、至少约5.5。

ClogP是利用ClogP软件可被容易计算的值，该ClogP软件可得自Biobyte,Inc.,Claremont,California,USA，并适用于应用Windows、linux或Apple操作***的任何计算机。ClogP软件容易适于多种化学程序，包括ChemDraw程序和相关化学结构制图程序。ClogP制定给化学剂或部分的疏水性的值是基于log P正辛醇/水(logPOW)的测定，其是辛醇和水中分子或部分的分配系数的对数(log)。ClogP精确地估计logPOW数，并提供可容易应用于本发明的值的读取。较新版本的ChemDraw软件——可得自CambridgeSoft,Inc.,Cambridge Massachusetts,USA——结合与ClogP软件连接和提供ClogP计算的能力，这可通过仅仅绘制分子和对待利用的疏水分子或部分应用该软件的ClogP计算而容易地实现。因此，根据本发明，事实上，任何疏水部分均可被提出，和被化学合成，以及被结合到反应性连接体中，同时预期该部分在结合到如本文别处所公开的融合蛋白中时，将按照本发明方法导致融合蛋白(包含感兴趣的蛋白质)的降解。

在本发明中，事实上，计算ClogP值至少约为1.5的任何疏水基团(如上文别处所公开的)均可用于促进融合蛋白中感兴趣的蛋白质的降解。代表性疏水基团包括含有至少三个碳原子的任选地取代的烃基，诸如任选地取代的C₃-C₃₀烷基、烯基或炔基，包括线性、支链或环状(包括二环、金刚烷基和稠合环基团)烃基、芳基，包括含有单环或2个或更多个稠合环(例如，二、三或四个稠合环)的芳基，诸如任选地取代的苯基，包括任选地取代的萘基(包括1-或2-萘基)、任选地取代的蒽基、菲基和苯甲酰甲基(phenacenyl)

基团、任选地取代的三苯基甲基(三苯甲基、甲氧基三苯甲基)基团、任选地取代的疏水杂环，包括杂芳基，诸如任选地取代的喹啉基，除了别的以外。代表性疏水基团可在附图5和14分别示出的化学化合物中找到。本领域的普通技术人员可容易地运用ClogP软件，结合结构化学程序(例如，ChemDraw)，以容易地提供在本发明中有用的疏水部分。另外，本领域的普通技术人员可用疏水部分修饰多个部分，以增加该部分的疏水性，从而使ClogP值显著大于1.5。注意，在某些情况下，有用的疏水部分的ClogP值可以小于1.5，但这些部分含有大量的空间体积(steric bulk)，这弥补了低水平的疏水性。在芳基诸如苯基、萘基、菲基、蒽基(对萘基)等上包含硼烷巢式癸硼烷基团(B₁₀H₁₄)取代基。

术语“烃”或“烃基”是指含有碳和氢的任何单价自由基，其在性质上可以是直链的、支链的或环状的。烃包括线性、分支和环状烃，包括烷基、亚烷基、饱和和不饱和烃基(例如，烯、炔)，包括取代和未取代的芳族基团。

“烷基”是指含有碳和氢的、充分饱和的单价自由基，其可以是环状的、支链或直链，含有1至30个碳原子、1至20个碳原子，优选1至10个碳原子。烷基的实例是甲基、乙基、正丁基、正己基、正庚基、正辛基、异丙基、2-甲基丙基、环丙基、环丙基甲基、环丁基、环戊基、环戊基乙基、环己基乙基和环己基。优选的烷基是C₁-C₆或C₃-C₁₀烷基。“亚烷基”是指充分饱和的二价烃(可以是直链、支链或环状的)，并且，其任选地被取代。用于表示根据本发明化合物的取代基团的其他术语如本领域常规使用。

在上下文中，“芳基”或“芳族的”是指取代的或未取代的单价芳族自由基，其具有单环(例如，苯)或多个稠环(例如，萘基、蒽基、菲基、苯甲酰甲基)，并可在环(一个或多个)上的任何位置结合于根据本发明的化合物。在上下文中，芳基的其它实例可包括杂环芳族环***“杂芳基”基团——其环(单环的)中具有一个或多个氮、氧或硫原子，该环诸如咪唑、呋喃基、吡咯、吡啶基、呋喃基、噻吩、噻唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、***、

唑、吲哚或优选稠合环***(二环的、三环的)——除了别的以外，该环可被取代或未被取代，如本文另外描述。优选的杂芳基在性质上是疏水的，或者，可通过于杂芳基上包括一个或多个疏水性取代基或生成至少一个环是苯(苯基)环的稠合***而被赋予疏水性。

术语“环状的”是指任选地取代的碳环或杂环基团，优选5-或6-元环或稠合环(二、三或四环)，优选含有8至14个原子。杂环或杂环基团应该含有至少一个单环——含有3个和7个之间的原子，其中，上至四个原子不是碳并且选自氮、硫和氧。根据本发明的碳环和杂环可以是不饱和的或饱和的。优选的环状基团是烃基，优选不饱和烃基，其任选地被取代。其它优选的环状基团是双环烷基或金刚烷基，其每一种均可任选地被取代。优选的杂环基团是杂芳基或杂芳族基团。

术语"杂环基团"在整个本发明说明书中被用于指芳族(“杂芳基”)或非芳族环状基团，其形成环(一个或多个)并包括至少一个杂原子，诸如氮、硫或氧，除了形成环的其他原子以外。杂环可以是饱和的(杂环)或不饱和的(杂芳基)。示例性杂环基团包括，例如吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、吡咯、吡啶、吡啶酮、嘧啶、咪唑、吲哚、喹啉、异喹啉、喹嗪、2,4-二氮杂萘、1,5-二氮杂萘、喹唑啉、噌啉、吖啶、phenacene、噻吩、苯并噻吩、呋喃、吡喃、苯并呋喃、噻唑、苯并噻唑、吩噻嗪和喹诺酮(carbostyryl)，更优选吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、吡咯、吡啶、噻吩、苯并噻吩、噻唑、苯并噻唑、喹啉、喹唑啉、噌啉和喹诺酮,，甚至更优选噻唑、喹啉、喹唑啉、噌啉、喹诺酮、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、四氢吡喃基、1,4-二

烷和邻苯二甲酰亚胺，除了别的以外。

可用于本发明的示例性杂芳基部分包括例如，吡咯、吡啶、吡啶酮、哒嗪、嘧啶、吡嗪、吡唑、咪唑、***、四唑、吲哚、异吲哚、吲嗪、嘌呤、吲唑、喹啉、异喹啉、喹嗪、2,4-二氮杂萘、1,5-二氮杂萘、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶(pteridine)、咪唑并吡啶、咪唑并三嗪、吡嗪哒嗪、吖啶、菲啶、咔唑、咔唑啉(carbazoline)、伯啶(perimidine)、菲咯啉、phenacene、

二唑、苯并咪唑、吡咯并吡啶、吡咯并嘧啶和吡啶并嘧啶；含硫芳族杂环，诸如噻吩和苯并噻吩；含氧芳族杂环，诸如呋喃、吡喃、环戊吡喃、苯并呋喃和异苯并呋喃；和尤其是包含选自氮、硫和氧的2个或更多个杂原子的芳族杂环，诸如噻唑、噻二唑、异噻唑、苯并唑、苯并噻唑、苯并噻二唑、吩噻嗪、异唑、呋咱）、吩

嗪、吡唑唑、咪唑并噻唑、噻吩并呋喃、呋喃并(furo)吡咯、吡啶并嗪、呋喃并吡啶、呋喃并嘧啶、噻吩并嘧啶和唑。进一步的杂芳基可包括吡啶、三嗪、吡啶酮、嘧啶、咪唑、吲哚、喹啉、异喹啉、喹嗪、2,4-二氮杂萘、1,5-二氮杂萘、喹唑啉、噌啉、吖啶、phenacene、噻吩、苯并噻吩、呋喃、吡喃、苯并呋喃、噻唑、苯并噻唑、吩噻嗪、吡咯并嘧啶、呋喃并吡啶、呋喃并嘧啶和噻吩并嘧啶，优选苯并噻吩、苯并噻唑、喹啉、喹唑啉、噌啉、吡咯并嘧啶、呋喃并吡啶和噻吩并嘧啶。

术语“取代的”意为在上下文中在碳(或氮)位置取代的羟基、羧基、氰基(C≡N)、硝基(NO₂)、卤素(优选地，1、2或3个卤素，尤其是在烷基上，尤其是甲基，诸如三氟甲基)、硫羟基、烷基(优选地，C₁-C₁₀，更优选地，C₁-C₆)、烷氧基(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基，包括苯基和取代的苯基)、酯(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)，包括亚烷基酯(以便附着是在亚烷基上，而不是位于酯官能上，优选被C₁-C₁₀烷基或芳基取代)、硫醚(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)、硫酯(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)、(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)、卤素(F、Cl、Br、I)、硝基或胺(包括五-或六元环亚烷基胺，进一步包括C₁-C₁₀烷基胺或C₁-C₁₀二烷基胺)、酰胺基——其优选被一个或两个C₁-C₁₀烷基取代(包括被一个或两个C₁-C₁₀烷基取代的羧基酰胺)、链烷醇(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)或链烷酸(优选地，C₁-C₁₀烷基或芳基)。优选地，术语“取代的”在其应用的上下文中意为烷基、烷氧基、卤素、酯、酮基、硝基、氰基和胺(尤其包括单-或二-C₁-C₁₀烷基取代的胺)。根据本发明的化合物中任何可取代的位置均可在本发明中被取代，但优选不多于5个，更优选不多于3个取代基存在于单环或环***上。优选地，术语“未取代的”意为被一个或多个H原子取代。优选的取代基是具有疏水特征的那些，如本文另外描述。注意，将疏水性取代基结合到另外的疏水性较小或非疏水性部分可赋予进入(enter)部分疏水性，如针对本发明所述。用于本发明的芳基(例如，苯基、萘基)上的优选的取代基是硼烷巢式癸硼烷基团(B₁₀H₁₄)，其尽管本身不是疏水基团，但提供显著位阻效应的有利特征，以增强本发明中融合蛋白的降解。

术语“连接体”被用于描述化学基团，在本发明的优选方面，其共价连接疏水部分与融合蛋白。具体地，连接体一端结合疏水部分，而另一端结合融合蛋白。在其最广义的方面，通过使融合蛋白上的亲核基团(胺、硫氢基或羟基)与连接疏水基团的连接体上的亲电子基团(羧酸等)反应(缩合)，连接体可利用常规化学连接疏水部分与融合蛋白，从而提供经连接体连接疏水部分与融合蛋白的化合物。在某些优选实施方式中，取决于自标记标签的类型，连接体通过自标记标签对连接体(“反应性连接体”)的反应部分的作用结合至融合蛋白的自标记标签。与各种根据本发明的连接体有关的化学(chemistry)将与疏水部分连接的融合蛋白的函数，尤其在融合蛋白包含自标记蛋白质标签(halotag等，如本文另外描述)的情况下，这种情况下连接体的化学性质将反映自标记蛋白质标签的底物特异性。由于连接体的反应部分对用于本发明的融合蛋白的自标记标签是特异性的，所以位于共价结合于融合蛋白的末端(反应性末端)的连接体的化学性质将是该自标记标签蛋白质的底物特异性的函数。因此，连接体的反应部分作为融合蛋白的自标记标签的底物是特异性的，其中，自标记标签优选HALOtag、SNAPtag、CLIPtag、ACPtag或MCPtag，其在本领域中均是众所周知的。

优选地，自标记标签是HALOtag，尤其是卤代烷基团(优选C₂-C₁₂氯烷基，甚至更优选卤烷基二醚基团，在优选方面，根据下面化学结构的基团：

在融合蛋白包含自标记标签如SNAPtag的情况下，Y_R是苄基鸟嘌呤基团，其形成根据如下化学结构的化合物：

其中，Z和X如上面另外描述。

在融合蛋白包含自标记标签如CLIPtag的情况下，Y_R是苄基胞嘧啶基团，其形成根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z和X如上面另外描述。

在融合蛋白包含自标记标签如ACPtag或MCPtag的情况下，Y_R是辅酶A衍生物，其形成根据如下化学结构的化合物：

其中，

Z和X如上面另外描述。

术语“接合体(connector)”——在根据本发明的化合物中以符号[CON]表示——被用于描述化学部分，其任选地包括在根据本发明的化合物的连接基团中，如本文另外描述。接合体基团是产生的部分，其通过两个单独的化学区段的简单缩合而形成，该化学区段包含反应性基团，该反应性基团可提供如接合体基团，该接合体基团如另外描述产生连接基团，该连接基团在根据本发明的化合物中共价连接疏水部分与融合蛋白。注意，接合体与连接体的区别在于接合体是用于提供根据本发明的化合物的特定化学的结果，其中，这些基团的反应产物产生可鉴别的接合体基团，该接合体基团形成更长的连接基团，如本文另外描述。

用于本发明的一般接合体基团包括如下化学基团：

X³是O、S、NR⁴；和

R⁴是H或C₁-C₃烷基。

利用本领域中众所周知的方法容易合成根据本发明的化合物。在本发明中，提供与疏水部分共价连接的反应性连接体的优选方法遵循充分确立的合成化学方法。疏水部分可被衍生，并且，方便的方法是提供包含羧酸或其它亲电子官能团的疏水部分，以与连接体分子上的亲核基团(例如，胺、羟基或硫氢基)反应，从而提供包含疏水部分的连接体。疏水性连接体可包含反应部分，以共价结合连接体与融合蛋白，或者，疏水性连接体可被衍生，以提供能够与融合蛋白反应的官能团(例如，亲核或亲电子部分)。在利用自标记多肽标签共价连接疏水部分与融合蛋白的情况下，含有疏水性的连接体被衍生，以包含(优选地，在远离疏水部分的远末端)化学部分，该化学部分通过自标记标签(例如，halo、snap、clip、ACP或MCP)发挥作用，如本文另外描述。与自标记标签具有反应性的官能团的形成是众所周知的，并且，容易利用本领域中悉知的化学合成技术被提供。在halotag的情况下，卤代烷的形成，在本发明特别优选的方面，氯烷基二醚部分——如本文另外描述——的形成，容易通过商业可得的中间体完成。具体的合成方法提供在下面的实施例部分。在snaptag和cliptag自标记标签的苄基鸟苷和苄基胞嘧啶连接体类似物底物的情况下，这些容易通过分别经苄基鸟苷和苄基胞嘧啶封端的反应性连接体提供。

当提供包含疏水部分的反应性连接体后，与融合蛋白的反应开始，以共价连接疏水部分与融合蛋白。反应性连接体可通过标准化学反应共价连接于细胞外面的融合蛋白，但优选通过自标记标签在细胞内连接。反应性连接体和融合蛋白可在细胞内反应，分离，然后用于分析，以确定融合蛋白中感兴趣的蛋白质作为潜在靶标功能和重要性，或可选地，融合蛋白和反应性连接体可被细胞内引入到同一细胞中，在该细胞中进行功能和重要性分析。根据本发明的化合物可在体外或体内被利用，并可用于基于细胞的分析和用于动物模型中，条件是多种化合物相对低的毒性与.体内应用一致。

根据本发明的化合物可用于基于细胞的分析，通过分析共价连接疏水部分的融合蛋白的降解而导致的细胞功能，确定感兴趣的蛋白质的功能和重要性。这些分析可基于原核生物和/或真核生物细胞并可涉及动物和植物蛋白质以及微生物蛋白质，诸如真菌和细菌蛋白质以及病毒蛋白质。包含感兴趣的蛋白质的融合蛋白的降解可指示感兴趣的蛋白质对调节疾病状态或状况的重要功能的重要性，所述疾病状态或状况，例如，癌细胞生长、炎性反应或其它生物学反应或细菌和/或病毒的增殖。在分析条件下融合蛋白的降解可利用本领域中可利用的许多标准技术之一容易地监测，所述标准技术包括免疫印迹、免疫分析(例如，ELISA，除了别的以外)、吸光度分析、质谱法和蛋白质组学方法，除了别的以外。事实上，任何测量蛋白质的技术均可适合用于本发明的方法——条件是其另外与利用根据本发明的化合物进行的分析的整体一致。

针对药物靶标确认阐明蛋白质功能的体内功能是药物开发中的绊脚石，这可利用本发明疏水性标记方法容易地解决。例如，许多G蛋白-连接的受体(GPCRs)GPCR缺少已知的配体或功能。可以将HaloTag基因引入小鼠基因组，以便敲入的转基因编码与感兴趣的蛋白质，例如孤儿GCPR，融合的halotag融合蛋白。对表达融合蛋白的动物施用疏水标记的反应性连接体会引起融合蛋白的降解(通过促进含有反应性连接体的疏水部分与融合蛋白的共价连接)，并且，产生的表型响应会模拟药物作用(例如，作为感兴趣的蛋白质的抑制剂)，从而确认GPCR(或任何其它蛋白质)作为药物靶标。

本发明提供的时间控制优势的另外的实例是在寄生虫药物靶标确认领域。由于其复杂的生活周期，抑制某些寄生虫蛋白质的功能结果难以确定，即，蛋白质可能在两个阶段被需要——早期阶段在动物载体中和后期阶段在人类中。期望在早期阶段保留蛋白质功能，然后能够在后期阶段将其去除，以便模拟人药物对该寄生虫的作用。通过将特定寄生虫蛋白质的基因替换为与候选基因(产生感兴趣的蛋白质)融合的自标记标签(例如，halotag)，然后利用疏水性标记方法引起表达的融合蛋白降解，将能够确认该候选寄生虫蛋白质作为药物靶标。

本发明现将通过以下实施例的方式被进一步描述，对实施例的描述应被看作仅仅是示例，而不是限制本发明。

实施例

综述

为建立利用小分子降解任意细胞内蛋白质的通用方法，我们设法获得细胞蛋白质质量控制机构。内部疏水残基在蛋白质核心内中包埋是蛋白质折叠背后的主要驱动力，因而，认为暴露这样的疏水区域是展开蛋白质的特点^21-23。例如，内质网Hsp70-类蛋白伴侣BiP特异性地结合疏水性氨基酸并且有助于使缓慢折叠的蛋白质折叠^22,24。要是细胞不能正确折叠靶标蛋白质，则展开的蛋白质通过泛素-蛋白酶体***或自噬而被去除²⁵。我们设法通过添加疏水标签于其表面上模拟蛋白质的部分变性状态，以引起其降解。为测试该假设，我们选择由Promega开发的HaloTag脱卤素酶***作为融合蛋白组分²⁶。选择该***是因为HaloTag融合蛋白可以以多种形式商业获得，并且，卤代烷反应性连接体共价结合到HaloTag结构域，表明配体对HaloTag的高度特异性。在此，我们证明在培养的细胞中以及在斑马鱼和小鼠模型中疏水性标记提供对多种大量蛋白质，包括跨膜受体，的快速和有力的控制。

化学合成

材料、纯化和分析。

用于化学合成的试剂购自Sigma-Aldrich Co.，并且，其在没有进一步纯化的情况下被使用。所有反应均在烘箱干燥或火焰干燥的装配有橡胶隔片的玻璃器皿、在氮的正压力条件下进行。从钠/二苯酮蒸馏THF。从氢化钙蒸馏二氯甲烷。利用预涂覆硅胶(0.25mm)的玻璃平板进行分析薄层层析(TLC)。TLC平板通过暴露于UV光(UV)而被可视化，然后其通过浸入到高铈钼酸铵(CAM)或乙醇茚三酮水溶液(茚三酮)中而被染色，接下来，在热平板上短暂加热。采用指示的溶剂利用硅胶60(230-400目，Merck)进行快速柱层析。

¹H和¹³C光谱记录在Bruker Avance DPX-500或Bruker Avance DPX-400NMR光谱仪上。¹H NMR光谱表示如下：化学位移、峰裂数(s=单峰、d=双峰、t=三峰、q=四峰、m=多峰、br=宽峰(broad))、整合(integration)和偶合常数(J)——以赫兹(Hz)表示。¹H NMR化学位移相对于CDCl₃(7.26ppm)和d₄-MeOD(3.30ppm)报告。¹³CNMR相对于CDCl₃(77.00ppm)和d₄-MeOD(49.00ppm)的中央线被记录。高分辨率质谱在Yale University(耶鲁大学)的Keck生物技术资源实验室(KeckBiotechnology Resource Laboratory)测量。低分辨率质谱在Waters Micromass ZQ质谱仪或Perkin-Elmer API150EX LCMS光谱仪上获得。

合成实验程序和表征数据

化合物(2、3、4、5、6)和对照化合物(1)。

方案1.疏水标签(Halotag)的一般合成方案

方案2.HyT13(3)的合成

叔丁基(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(9)：在0℃下，向2-(2-氨基乙氧基)-乙醇(2.1g，20mmol)在C₂H₅OH(50mL)中的溶液加入Boc₂O(4.36g，20mmol)。反应混合物在rt下搅动5h、蒸发，并以CH₂Cl₂(20mL)和H₂O(20mL)进行稀释。混合物用CH₂Cl₂萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以供应叔丁基(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯9(4.09g，定量)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ5.01(brs，1H)，3.76-3.72(m，2H)，3.58-3.54(m，4H)，3.35-3.32(m，2H)，2.39(t，J＝5.9Hz，1H)，1.44(s，9H)。_¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ156.1，79.3，72.1，70.3，61.7，40.3，28.7。LRMS(ES+)[M+Na]⁺228.4。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.08(茚三酮)。

叔丁基(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(11)：在0℃下，向叔丁基(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸酯9(2.15g，10.48mmol)在THF(20mL)和DMF(10mL)中的溶液分批加入NaH(在矿物油中的60％分散体，560mg，14.04mmol)。在0℃下搅动0.5h后，在0℃下，将6-氯-1-碘己烷10(Sigma-Aldrich，2.4mL，15.72mmol)加入混合物。在0℃下搅动反应混合物20min，在rt下搅动14h，并在0℃下用饱和NH₄Cl水溶液淬火。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供叔丁基(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯11(2.4g，71％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ4.98(brs，1H)，3.61-3.51(m，8H)，3.46(t，J＝6.7Hz，2H)，3.31(t，J＝4.7Hz，2H)，1.81-1.74(m，2H)，1.61-1.57(m，2H)，1.49-1.33(m，4H)，1.43(s，9H)。¹³CNMR(125MHz，CDCl₃)δ155.9，79.2，71.2，70.3，70.2，70.0，45.0，32.5，29.4，28.4，26.7，25.4.LRMS(ES+)[M+Na]⁺346.3。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.36(茚三酮)。

2-(2-((6-氯己基)氧）乙氧基)乙胺(8)：在0℃下，向叔丁基(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯11(1.348g，4.171mmol)在CH₂Cl₂(30mL)中的溶液加入TFA(5mL)。在0℃下搅动2.5h后，在真空下去除TFA和溶剂，并且，残余物用MeOH(30mL)进行稀释。将溶液冷却至5℃，并将K₂CO₃(1.65g，11.929mmol)加入混合物。混合物在相同的温度下被搅动10min，过滤并蒸发。残余物用H₂O(20mL)稀释，并且，混合物用乙酸乙酯萃取四次。组合的萃取物在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。粗制胺通过快速柱层析在硅胶上纯化，以产生2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙胺8(867mg，93％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.47(brs，1H)，3.69(t，J＝4.9Hz，2H)，3.63-3.60(m，2H)，3.56-3.53(m，2H)，3.52(t，J＝6.6Hz，2H)，3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，3.12(t，J＝4.9Hz，2H)，1.79-1.71(m，2H)，1.60-1.53(m，2H)，1.46-1.39(m，2H)，1.36-1.28(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ71.1，70.1，69.7，45.0，39.4，32.4，29.1，26.5，25.1。LRMS(ES+)[M+H]⁺223.8，[M+Na]⁺246.1。TLC(10％CH₃OH，在EtOAc中)，R_f0.08(CAM)。

2-((3r，5r，7r)-金刚烷-1-基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)乙酰胺(HyT13， 3)：在rt下，向1-金刚烷乙酸12(Sigma-Aldrich，19.5mg，0.10mmol，1.0当量)和2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙胺8(23mg，0.10mmol，1.0当量)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液加入HOBt(16mg，0.12mmol，1.2当量)和DIEA(52μL，3.0当量)。反应混合物在0℃下被冷却，并且，将EDCI(23mg，0.12mmol，1.2当量)加入混合物。所得混合物在rt下被搅动20h，并在0℃下用H₂O(5mL)进行淬火。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供3(HyT13，38mg，96％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ5.89(brs，1H)，3.61-3.59(m，2H)，3.57-3.50(m6H)，3.47-3.42(m，4H)，1.95(s，2H)，1.92(s，2H)，1.80-1.73(m，2H)，1.70-1.56(m，13H)，1.48-1.41(m，2H)，1.40-1.33(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ170.9，71.2，70.2，69.9，51.7，45.0，42.5，38.9，36.7，32.7，32.4，29.4，28.6，26.6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₂₂H₃₈N₈ClNO₃[M+H]⁺400.2613被计算，发现为400.2609。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.29(CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2，2-二苯基乙酰胺(HyT12，2)：

HyT12通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.35-7.24(m，10H)，6.15(s，1H)，4.91(s，1H)，3.56-3.47(m，10H)，3.42(t，J＝6.7Hz，2H)，1.80-1.73(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.48-1.41(m，2H)，1.39-1.31(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.8，139.4，128.8，128.6，127.1，71.2，70.2，69.9，69.6，59.1，45.0，39.4，32.4，29.4，26.6，25.3。LRMS(ES+)[M+H]⁺418.4。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.33(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-(9H-芴-9-基)乙酰胺(HyT16，4)：

HyT16通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.50(d，J＝7.4Hz，2H)，7.38(d，J＝7.4Hz，1H)，7.36(d，J＝7.4Hz，1H)，7.29(dd，J＝7.4，1.0Hz，1H)，7.28(dd，J＝7.4，1.0Hz，1H)，6.0(brs，1H)，4.52(t，J＝7.4Hz，1H)，3.59-3.53(m，6H)，3.51-3.49(m，2H)，3.47(t，J＝6.7Hz，2H)，3.36(t，J＝6.7Hz，2H)，2.59(d，J＝7.4Hz，2H)，1.72-1.65(m，2H)，1.52-1.45(m，2H)，1.39-1.32(m，2H)，1.30-1.24(m，2H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ171.2，146.4，140.6，127.3，127.0，124.5，119.8，71.1，70.2，69.8，69.6，45.0，43.9，40.9，39.3，32.4，29.3，26.5，25.3。LRMS(ES+)[M+H]⁺430.5。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.36(CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2，2-二环己基乙酰胺(HyT21，5)：

HyT21通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ5.85(s，1H)，3.60-3.51(m，8H)，3.47-3.51(m，4H)，1.80-1.72(m，2H)，1.71-1.57(m，13H)，1.49-1.32(m，4H)，1.28-1.03(m，8H)，0.97-0.88(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ174.2，71.2，70.2，70.1，70.0，59.4，45.0，38.7，36.4，32.5，31.5，29.6，29.5，26.7，26.6，26.5，25.4。LRMS(ES+)[M+H]⁺430.6。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.34(CAM)。

(S)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-(4-异丁基苯基)丙酰胺(HyT22，6)：

HyT22通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.18(d，J＝8.0Hz，2H)，7.09(d，J＝8.0Hz，2H)，5.88(s，1H)，3.53-3.45(m，8H)，3.44-3.36(m，5H)，2.44(d，J＝7.2Hz，2H)，1.87-1.79(m，1H)，1.61-1.55(m，2H)，1.49(d，J＝7.2Hz，3H)，1.47-1.41(m，2H)，1.38-1.32(m，2H)，0.89(d，J＝6.6Hz，6H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ174.4，140.5，138.5，129.4，127.2，71.2，70.2，69.9，69.7，46.7，44.9，39.2，32.4，30.1，29.4，26.6，25.3，22.3，18.5。LRMS(ES+)[M+H]⁺412.6。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.54(UV，CAM)。

方案3.HyT5(1)的合成

叔丁基(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)氨基甲酸酯(14)：在rt下，向Boc-11-氨基-3，6，9-三氧杂十一酸13(Peptides International Inc.，Boc-mini-PEG-3，200mg，0.650mmol)和2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙胺8(145mg，0.650mmol)在CH₂Cl₂(4.5mL)中的溶液加入HOBt(105mg，0.780mmol)和DIEA(280μL，1.625mmol)。将混合物冷却至0℃，并将EDCI(150mg，0.780mmol)加入混合物。使所得混合物达到rt，在rt下搅动20h，并在0℃下用H₂O(10mL)淬火。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供叔丁基(24-氯-11-氧-3,6,9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)氨基甲酸酯14(296mg，89％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.18(brs，1H)，5.13(brs，1H)，4.00(s，2H)，3.69-3.47(m，20H)，3.43(t，J＝6.7Hz，2H)，3.31-3.28(m，2H)，1.79-1.72(m，2H)，1.61-1.54(m，2H)，1.47-1.40(m，2H)，1.42(s，9H)，1.38-1.32(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ169.9，155.9，79.1，71.2，70.8，70.5，70.4，70.2，70.1，69.9，69.7，45.0，40.2，38.5，32.4，29.4，28.3，26.6，25.3。LRMS(ES+)[M+H]⁺535.5。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.48(CAM)。

N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)戊-4-炔酰胺(15)：在0℃下，向叔丁基(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)氨基甲酸酯14(170mg，0.332mmol)在CH₂Cl₂(2.5mL)中的溶液加入TFA(0.5mL)。反应混合物在0℃下搅动2.5h并被浓缩。粗制胺被用于下一反应而无需进一步纯化。

在rt下，向粗制胺(0.330mmol)和4-戊炔酸(32mg，0.330mmol)在CH₂Cl₂(2.5mL)中的溶液加入HOBt(54mg，0.396mmol)和DIEA(150μL，0.825mmol)。混合物冷却至0℃，并将EDCI(76mg，0.396mmol)加入混合物。使所得混合物达到rt，在rt下搅动17h，并在0℃下用H₂O(5mL)淬火。混合物用乙酸乙酯萃取三次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)戊-4-炔酰胺15(140mg，86％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.18(brs，1H)，6.71(brs，1H)，4.02(s，2H)，3.70-3.64(m，4H)，3.63-3.59(m，6H)，3.57-3.54(m，6H)，3.53-3.48(m，4H)，3.47-3.42(m，4H)，2.54-2.49(m，2H)，2.43-2.39(m，2H)，1.99(t，J＝2.6Hz，1H)，1.80-1.72(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.48-1.40(m，2H)，1.39-1.31(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.2，170.3，83.1，71.2，70.6，70.5，70.3，70.2，70.1，70.0，69.9，69.7，69.1，45.0，39.3，38.6，35.0，32.4，29.4，26.6，25.3，14.8。LRMS(ES+)[M+H]⁺515.62。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.42(UV，CAM)。

叔丁基(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(16)：在0℃下，向11-叠氮基-3，6，9-三氧杂十一烷-1-胺(Fluka，370mg，1.695mmol)在C2H5OH(3.5mL)中的溶液加入Boc₂O(370mg，1.695mmol)。反应混合物在rt下搅动12h，并被蒸发。残余物用CH₂Cl₂(5mL)&H₂O(5mL)稀释和混合物用CH₂Cl₂萃取两次。组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。粗制残余物通过快速色谱法在硅胶上被纯化，以提供叔丁基(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯16(518mg，96％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.01(s，1H)，3.69-3.59(m，10H)，3.53(t，J＝5.1Hz，2H)，3.38(t，J＝5.1Hz，2H)，3.32-3.29(m，2H)，1.43(s，9H)。TLC(10％CH3OH，在CH2Cl2中)，Rf0.49(CAM)。

叔丁基(2-(2-(2-(2-(4-(28-氯-3，15-二氧-7，10，13，19，22-五氧杂-4，16-二氮杂二十八基)-1H-1，2，3-***-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(17)：在rt下，向叔丁基(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯16(37mg，0.116mmol)和N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)戊-4-炔酰胺15(57mg，0.116mmol)在t-BuOH-H₂O(1∶1，0.5mL)和THF(0.5mL)中的溶液加入CuSO₄·5H₂O(3mg，0.012mmol)和抗坏血酸钠(1.0M，在H₂O中，3滴)。反应混合物在rt下搅动22h并被蒸发。残余物用H₂O(5mL)稀释和混合物用乙酸乙酯萃取三次。组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥、过滤并浓缩。粗制残余物通过快速色谱法在硅胶上被纯化，以产生叔丁基(2-(2-(2-(2-(4-(28-氯-3，15-二氧-7，10，13，19，22-五氧杂-4，16-二氮杂二十八基)-1H-1，2，3-***-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯17(86mg，92％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.54(s，1H)，7.17(brs，1H)，6.60(brs，1H)，5.11(brs，1H)，4.49(t，J＝5.1Hz，2H)，4.02(s，2H)，3.84(t，J＝5.1Hz，2H)，3.70-3.38(m，34H)，3.31-3.28(m，2H)，3.03(t，J＝7.4Hz，2H)，2.61(t，J＝5.1Hz，2H)，1.79-1.72(m，2H)，1.61-1.54(m，2H)，1.47-1.40(m，2H)，1.42(s，9H)，1.39-1.31(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ172.0，170.1，155.9，146.3，122.6，79.1，77.2，71.2，70.65，70.62，70.54，70.51，70.47，70.42，70.3，70.2，70.16，70.14，69.9，69.8，69.7，69.4，50.1，45.0，40.2，39.2，38.5，35.5，32.4，29.4，28.4，26.6，25.3，21.4。LRMS(ES+)[M+Na]⁺833.48。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.25(CAM)。

3-(1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1，2，3-***-4-基)-N-(24- 氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)丙酰胺(HyT5，1)：在0℃下，向叔丁基(2-(2-(2-(2-(4-(28-氯-3，15-二氧-7，10，13，19，22-五氧杂-4，16-二氮杂二十八基)-1H-1，2，3-***-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯17(30mg，0.037mmol)在CH₂Cl₂(2.0mL)中的溶液加入TFA(0.5mL)。在0C下搅动2.5h后，在真空下去除TFA和溶剂，并且，残余物用MeOH(0.5mL)进行稀释。将溶液冷却至5℃，并将K₂CO₃(26mg，0.185mmol)加入混合物。在相同温度下搅动混合物30min并用乙酸乙酯萃取三次。组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。粗制残余物通过快速色谱法在硅胶上被纯化，以产生提出结构，3-(1-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1，2，3-***-4-基)-N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)丙酰胺1(HyT5，24.5mg，93％)。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.77(s，1H)，4.53(t，J＝5.1Hz，2H)，3.99(s，2H)，3.86(t，J＝5.1Hz，2H)，3.70-3.50(m，28H)，3.46(t，J＝6.5Hz，2H)，3.41(t，J＝5.6Hz，2H)，3.35(t，J＝5.4Hz，2H)，3.12(t，J＝5.0Hz，2H)，2.98(t，J＝7.5Hz，2H)，2.56(t，J＝7.6Hz，2H)，1.79-1.72(m，2H)，1.61-1.54(m，2H)，1.49-1.43(m，2H)，1.42-1.35(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)δ174.6，172.7，147.6，124.1，72.1，71.8，71.5，71.4，71.37，71.33，71.29，71.22，71.1，70.6，70.47，70.40，67.9，51.2，45.7，40.6，40.3，39.8，36.2，33.7，30.5，27.7，26.5，22.5。LRMS(ES+)[M+H]⁺711.36，[M+Na]⁺733.36。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.09(茚三酮，CAM)。

方案4.HyT6(20)的合成

(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸乙基酯(18)：在rt下，向4-(1-金刚烷基)苯酚(250mg，1.095mmol)在DMF(2mL)中的溶液加入溴乙酸乙酯(150μL，1.314mmol)和K₂CO₃(454mg，3.285mmol)。反应混合物在rt下被搅动20h并用H₂O(10mL)和乙酸乙酯(10mL)稀释。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，萃取物用饱和NaHCO₃和盐水洗涤。组合的有机层在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。粗制残余物通过快速色谱法在硅胶上被纯化，以产生(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸乙基酯18(335mg，量)，为白色固体。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.27(d，J＝8.7Hz，2H)，6.86(d，J＝8.7Hz，2H)，4.59(s，2H)，4.27(q，J＝7.1Hz，2H)，2.08(s，3H)，1.87(d，J＝2.4Hz，6H)，1.79-1.71(m，6H)，1.30(t，J＝7.0Hz，3H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ169.1，155.6，144.7，125.9，114.1，65.5，61.2，43.3，36.7，35.6，28.9，14.1。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.48(UV，CAM)。

(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸(19)：在rt下，向酯18(290mg，0.923mmol)在THF-H₂O(3mL/3mL)中的溶液加入LiOH·H₂O(78mg，1.846mmol)。反应混合物在rt下搅动15h，并在真空下去除THF。含水混合物用H₂O(5mL)稀释、冷却至0℃下，并用1N-HCl调至pH4。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，萃取物用盐水洗涤。组合的有机层在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。粗制残余物用己烷凝固，并且，固体用己烷过滤并在真空下干燥，以供应(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸19(246mg，93％)，为白色固体。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.26(d，J＝8.8Hz，2H)，6.84(d，J＝8.8Hz，2H)，4.60(s，2H)，2.05(s，3H)，1.89(s，6H)，1.83-1.75(m，6H)。

3-(1-(1-(4-((3r，5r，7r)-金刚烷-1-基)苯氧基)-2-氧-6，9，12-三氧杂-3-氯杂十四烷 -14-基)-1H-1，2，3-***-4-基)-N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氯杂二十四基) 丙酰胺(HyT6，20)：在rt下，向(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸19(6.3mg，0.022mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液加入HATU(10mg，0.027mmol)和DIEA(10μL，0.055mmol)。混合物在rt下搅动0.5h，并将HyT51(16.5mg，0.023mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液加入混合物。所得混合物在rt下搅动22h并在0℃下用H₂O(5mL)淬火。混合物用乙酸乙酯萃取三次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供HyT620(19mg，88％)。¹HNMR(500MHz，CD₃OD)δ7.74(s，1H)，7.26(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.46(s，1H)，4.46(t，J＝4.9Hz，2H)，4.45(s，2H)，3.98(s，2H)，3.80(t，J＝5.1Hz，2H)，3.65(s，4H)，3.63-3.61(m，2H)，3.59-3.51(m，20H)，3.49(t，J＝5.5Hz，2H)，3.45-3.42(m，4H)，3.39(t，J＝5.5Hz，2H)，3.32(t，J＝5.2Hz，2H)，2.95(t，J＝7.6Hz，2H)，2.52(t，J＝7.6Hz，2H)，2.04(s，3H)，1.86(d，J＝2.3Hz，6H)，1.80-1.70(m，8H)，1.57-1.52(m，2H)，1.46-1.40(m，2H)，1.38-1.32(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ174.7，127.0，124.2，115.4，72.2，71.8，71.6，71.5，71.4，71.32，71.30，71.2，71.1，70.8，70.5，70.4，51.3，45.7，44.5，40.3，39.9，39.8，37.8，36.7，36.3，33.7，30.5，30.4，27.7，26.5，22.5。HRMS(ES+)，针对C₄₉H₈₀N₆O₁₂Cl[M+H]⁺979.5523计算，发现为979.5529。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.51(UV，CAM)。

方案5.HyT7(21)的合成

在rt下，向3，3，3-三苯基丙酸(11.3mg，0.0373mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液加入HATU(17mg，0.0447mmol)和DIEA(16μL，0.0932mmol)。混合物在rt下搅动0.5h，并将HyT51(28mg，0.0392mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液加入混合物。所得混合物在rt下被搅动20h并在0℃下用H₂O(6mL)淬火。混合物用乙酸乙酯萃取三次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供N-(2-(2-(2-(2-(4-(28-氯-3，15-二氧-7，10，13，19，22-五氧杂-4，16-二氮杂二十八基)-1H-1，2，3-***-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3，3，3-三苯基丙酰胺21(HyT7，33.5mg，91％)。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ7.75(s，1H)，7.37(brs，1H)，7.27-7.20(m，12H)，7.16-7.13(m，3H)，4.47(t，J＝5.0Hz，2H)，4.00(s，2H)，3.82(t，J＝5.0Hz，2H)，3.68-3.47(m，26H)，3.46-3.40(m，6H)，3.34(t，J＝5.1Hz，2H)，3.15(t，J＝5.2Hz，2H)，3.03-3.01(m，2H)，2.96(t，J＝7.5Hz，2H)，2.54(t，J＝7.3Hz，2H)，1.77-1.71(m，2H)，1.58-1.53(m，2H)，1.46-1.41(m，2H)，1.38-1.34(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ174.7，172.9，172.7，148.3，147.5，130.5，128.7，127.1，124.2，72.1，71.7，714，71.36，71.33，71.2，71.18，71.13，70.9，70.4，70.3，70.2，57.5，51.2，48.1，45.7，40.3，40.0，39.8，36.3，33.7，30.5，27.7，26.4，22.4。HRMS(ES+)，针对C₅₂H₇₆N₆O₁₁Cl[M+H]⁺995.5261计算，发现为995.5265。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.62(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-3，3，3-三苯基丙酰胺(HyT8，22)：

HyT8通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.31-7.26(m，12H)，7.23-7.19(m，3H)，5.36(brs，1H)，3.58(s，2H)，3.53(t，J＝6.7Hz，2H)，3.48-3.46(m，2H)，3.45-3.41(m，4H)，3.22-3.20(m，2H)，3.16-3.13(m，2H)，1.81-1.74(m，2H)，1.63-1.56(m，2H)，1.49-1.42(m，2H)，1.40-1.32(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ170.3，146.3，129.1，127.9，126.2，71.2，70.0，69.8，69.3，56.1，48.4，45.0，38.9，32.4，29.3，26.6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₃₁H₃₉NO₃Cl[M+H]⁺508.2618计算，发现为508.2617。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.69(UV，CAM)。

补充方案6.HyT9(24)的合成

叔丁基(6-((2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸酯23：在rt下，向6-(Boc-氨基)-己酸(28mg，0.121mmol)和胺8(27mg，0.121mmol)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液加入HOBt(20mg，0.145mmol，1.2当量)和DIEA(63μL，0.363mmol)。反应混合物被冷却至0℃，并将EDCI(28mg，0.145mmol，1.2当量)加入混合物。所得混合物在rt下被搅动20h，并在0℃下用H₂O(5mL)进行淬火。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供叔丁基(6-((2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸酯23(45mg，85％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.09(s，1H)，4.59(s，1H)，3.60-3.49(m，8H)，3.46-3.40(m，4H)，2.15(t，J＝7.4Hz，2H)，1.78-1.71(m，2H)，1.66-1.55(m，4H)，1.50-1.39(m，4H)，1.41(s，9H)，1.37-1.27(m，2H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ172.8，155.9，79.0，71.2，70.1，69.9，69.7，44.9，39.0，36.4，32.4，29.7，29.3，28.3，26.6，26.3，25.3，25.2。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.46(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-6-(3，3，3-三苯基丙酰胺基)己酰胺(HyT9， 24)：

在0℃下，向叔丁基(6-((2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基)-6-氧代己基)氨基甲酸酯23(30mg，0.0687mmol)在CH₂Cl₂(1.5mL)的搅动的溶液中加入TFA(0.5mL)。反应混合物在0℃下搅动2.0h并被浓缩。粗制胺被用于下一反应而无需进一步纯化。

在rt下，向粗制胺和3，3，3-三苯基丙酸(20mg，0.068mmol)在CH₂Cl₂(1.0mL)中的溶液加入HOBt(11mg，0.0816mmol)和DIEA(36μL，0.204mmol)。混合物冷却至0℃，并将EDCI(16mg，0.0816mmol)加入混合物。使所得混合物达到rt，在rt下搅动17h，并在0℃下用H₂O(3mL)淬火。混合物用乙酸乙酯萃取三次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供24(HyT9，35mg，83％)。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ7.89(s，1H)，7.23-7.16(m，13H)，7.12-7.09(m，3H)，3.55-3.45(m，10H)，3.42(t，J＝6.5Hz，2H)，3.30-3.28(m，2H)，2.80-2.78(m，2H)，2.07(t，J＝7.2Hz，2H)，1.73-1.67(m，2H)，1.56-1.50(m，2H)，1.45-1.37(m，4H)，1.36-1.31(m，2H)，1.11-1.09(m，2H)，1.05-1.02(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ176.1，172.9，172.8，148.3，130.6，128.6，127.1，72.2，71.2，71.1，70.6，57.6，48.2，40.3，40.0，36.8，33.7，30.5，29.7，27.7，27.4，26.5，26.4。HRMS(ES+)，针对C₃₇H₅₀N₂O₄Cl[M+H]⁺621.3459计算，发现为621.3460。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.48(UV，CAM)。

N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)-3，3，3-三苯基丙酰胺 (HyT10，25)：HyT10通过与HyT9类似的方法被合成。

补充方案7.HyT10(25)的合成

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.29-7.17(m，15H)，7.12(s，1H)，5.68(s，1H)，4.00(s，2H)，3.66-3.64(m，2H)，3.62-3.60(m，2H)，3.59-3.57(m，4H)，3.55-3.51(m，8H)，3.20-3.17(m，2H)，3.15-3.13(m，2H)，1.80-1.73(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.49-1.41(m，2H)，1.39-1.32(m，2H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ170.5，170.1，146.5，129.2，127.9，126.2，71.2，70.6，70.5，70.4，70.3，70.2，69.9，69.7，69.5，56.1，48.1，45.0，39.0，38.5，32.4，29.4，26.6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₃₉H₅₄N₂O₇Cl[M+H]⁺697.3620计算，发现为697.3622。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.43(UV，CAM)。

(S)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-(3，4，5-三甲氧基苯基)丁酰胺 (HyT11，26)：HyT11通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.51(s，2H)，6.01(brs，1H)，3.84(s，6H)，3.81(s，3H)，3.54-3.45(m，9H)，3.43-3.32(m，3H)，3.10(t，J＝7.5Hz，1H)，2.17-2.06(m，1H)，1.85-1.70(m，3H)，1.61-1.54(m，2H)，1.47-1.39(m，2H)，1.37-1.30(m，2H)，0.87(t，J＝7.3Hz，3H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.3，153.2，136.8，135.8，104.7，71.1，70.2，69.9，69.8，60.7，56.0，55.3，44.9，39.2，32.4，29.3，26.6，26.5，25.3，12.3。HRMS(ES+)，针对C₂₃H₃₉NO₆Cl[M+H]⁺460.2466计算，发现为460.2465。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.62(UV，CAM)。

2-(4-((3r，5r，7r)-金刚烷-1-基)苯氧基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)乙酰胺(HyT14，27)：HyT14通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

方案8.HyT14(27)的合成

在rt下，向(4-金刚烷-1-基-苯氧基)乙酸19(27mg，0.094mmol)和胺8(21mg，0.094mmol)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液加入HOBt(15mg，0.113mmol)和DIEA(50μL，0.282mmol)。反应混合物在0℃下被冷却，并将EDCI(22mg，0.113mmol)加入混合物。所得混合物在rt下搅动22h，并在0℃下用H₂O(4mL)进行淬火。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供27(HyT14，42mg，92％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，7.04(brs，1H)，6.86(d，J＝8.8Hz，2H)，4.47(s，2H)，3.58-3.52(m，8H)，3.51(t，J＝6.7Hz，2H)，3.44(d，J＝6.7Hz，2H)，2.08(s，3H)，1.87(s，6H)，1.79-1.71(m，8H)，1.62-1.55(m，2H)，1.46-1.38(m，2H)，1.37-1.30(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ168.4，155.0，145.1，126.0，114.2，71.2，70.3，69.9，67.4，45.0，43.3，38.7，36.7，35.6，32.4，29.4，28.8，26.6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₂₈H₄₃NO₄Cl[M+H]⁺492.2881计算，发现为492.2883。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.65(UV，CAM)。

(1S)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-7，7-二甲基-2-氧代双环[2.2.1]庚烷-1- 羰酰胺(HyT15，28)：Hy15通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.79(s，1H)，3.62-3.53(m，6H)，3.54-3.48(m，4H)，3.46(t，J＝6.4Hz，2H)，2.53(dd，J＝13.9，4.0Hz，1H)，2.48(dd，J＝5.6，5.0Hz，1H)，2.17-2.09(m，1H)，2.07(t，J＝4.5Hz，1H)，1.95(d，J＝18.6Hz，2H)，1.80-1.73(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.47-1.32(m，4H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ216.9，169.1，71.2，70.4，70.0，69.8，64.6，50.1，45.0，43.7，43.2，38.6，32.5，29.4，28.1，27.6，26.7，25.4，20.9，20.4。HRMS(ES+)，针对C₂₀H₃₅NO₄Cl[M+H]⁺388.2255计算，发现为388.2253。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.57(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-6-氟-2-萘酰胺(HyT17，29)：

HyT17通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.31(s，1H)，7.91(dd，J＝9.0，5.6Hz，1H)，7.85(dd，J＝8.7，8.7Hz，1H)，7.83(dd，J＝8.5，8.5Hz，1H)，7.47(dd，J＝9.6，2.4Hz，1H)，7.31(ddd，J＝8.7，8.7，2.5Hz，1H)，3.72-3.70(m，4H)，3.69-3.66(m，2H)，3.62-3.59(m，2H)，3.46(d，J＝6.5Hz，2H)，3.44(d，J＝6.5Hz，2H)，1.71-1.64(m，2H)，1.57-1.50(m，2H)，1.39-1.21(m，4H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ167.2，162.8，160.3，135.6，135.5，131.4，131.3，131.23，131.21，129.5，127.7，127.6，127.5，124.6，117.3，117.1，111.0，110.8，71.2，70.2，69.9，69.7，44.9，39.7，32.4，29.4，26.5，25.3。HRMS(ES+)，针对C₂₁H₂₈NO₃ClF[M+H]⁺396.1742计算，发现为396.1744。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.65(UV，CAM)。

2-(4-((3r，5r，7r)-金刚烷-1-基)苯氧基)-A-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)乙酰胺(HyT18，30)：HyT18通过与HyT9相同的方法被合成。

方案9.HyT18(30)的合成

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.29(d，J＝8.8Hz，2H)，6.90(d，J＝8.8Hz，2H)，4.47(s，2H)，3.95(s，2H)，3.64(s，4H)，3.60-3.51(m，14H)，3.47-3.39(m，6H)，2.06(s，3H)，1.89(d，J＝2.2Hz，6H)，1.80-1.70(m，8H)，1.59-1.52(m，2H)，1.48-1.42(m，2H)，1.41-1.34(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)δ172.8，171.4，156.9，146.1，127.0，115.4，72.2，71.9，71.5，71.4，71.3，71.2，71.1，70.5，70.4，68.4，45.7，44.5，39.9，39.8，37.8，36.7，33.7，30.5，30.4，27.7，26.5。HRMS(ES+)，针对C₃₆H₅₈N₂O₈Cl[M+H]⁺681.3871计算，发现为681.3861。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.62(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-(((2S，5R)-2-异丙基-5-甲基环己基)氧)乙酰胺(HyT23，31)：HyT23通过与3相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.97(brs，1H)，4.05(d，J＝15.1Hz，1H)，3.84(d，J＝15.1Hz，1H)，3.61-3.59(m，2H)，3.57-3.54(m，4H)，3.52(t，J＝6.7Hz，2H)，3.49(t，J＝5.0Hz，2H)，3.45(t，J＝6.6Hz，2H)，3.13(td，J＝10.6，4.1Hz，1H)，2.12(dtd，J＝14.0，7.0，2.8Hz，1H)，2.06-2.00(m，1H)，1.80-1.73(m，2H)，1.67-1.63(m，2H)，1.62-1.55(m，2H)，1.48-1.23(m，7H)，0.96(qd，J＝13.8，3.2Hz，1H)，0.91(d，J＝1.2Hz，3H)，0.90(d，J＝1.8Hz，3H)，0.89-0.81(m，2H)，0.77(d，J＝6.9Hz，3H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ170.4，80.5，71.2，70.3，70.0，69.8，67.9，47.9，45.0，40.1，38.4，34.3，32.5，31.3，29.4，26.6，25.9，25.4，23.2，22.2，20.9，16.2。HRMS(ES+)，针对C₂₂H₄₃NO₄Cl[M+H]⁺420.2881计算，发现为420.2881。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.14(CAM)。

(R)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-(2-氟-[1，1′-二苯基]-4-基)丙酰胺 (HyT24，32)：HyT24通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.53-7.51(m，2H)，7.45-7.33(m，4H)，7.17-7.11(m，2H)，6.04(brs，1H)，3.59-3.48(m，9H)，3.46-3.39(m，4H)，1.78-1.71(m，2H)，1.60-1.53(m，2H)，1.54(d，J＝7.1Hz，3H)，1.46-1.39(m，2H)，1.37-1.29(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.4，160.9，158.4，142.9，142.8，135.4，130.9，130.8，128.9，128.8，128.4，127.7，127.6，71.2，70.2，69.9，69.6，46.5，44.9，39.3，32.4，29.4，26.6，25.3，18.5。HRMS(ES+)，针对C₂₅H₃₄NO₃ClF[M+H]⁺450.2211计算，发现为450.2209。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.66(UV，CAM)。

2-(2，2，4，7-四甲基-3，4-二氢喹啉-1(2H)-基)乙基(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基) 氨基甲酸酯(HyT25，33)：HyT25通过与3类似的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ6.97(d，J＝7.7Hz，1H)，6.51(s，1H)，6.42(d，J＝7.7Hz，1H)，4.13(dd，J＝8.7，5.8Hz，1H)，4.06(dd，J＝8.7，5.7Hz，1H)，3.64-3.56(m，4H)，3.55-3.50(m，4H)，3.47(t，J＝6.5Hz，2H)，3.30-3.26(m，4H)，2.87-2.78(m，1H)，2.23(s，3H)，1.77-1.70(m，3H)，1.62-1.55(m，2H)，1.48-1.35(m，5H)，1.29(s，3H)，1.26(d，J＝6.7Hz，3H)，1.13(s，3H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ159.0，145.8，1373，126.9，126.5，118.1，113.4，72.2，71.3，71.2，70.9，63.8，55.2，45.6，44.9，41.7，33.7，30.5，30.0，28.3，27.7，26.5，24.4，21.8，20.8。HRMS(ES+)，针对C₂₆H₄₄N₂O₄Cl[M+H]⁺483.2990计算，发现为483.2986。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.43(UV，CAM)。

2-(10H-吩

嗪-10-基)乙基(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯 (HyT26，34)：

HyT26通过与HyT13(3)类似的方法被合成。

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ6.79(dd，J＝8.2，1.5Hz，1H)，6.78(dd，J＝8.2，1.5Hz，1H)，6.72(d，J＝7.5Hz，2H)，6.64(dd，J＝7.5，1.3Hz，1H)，6.62(dd，J＝7.4，1.3Hz，1H)，6.57(dd，J＝7.8，1.3Hz，2H)，4.25(t，J＝6.4Hz，2H)，3.81(t，J＝6.4Hz，2H)，3.56-3.53(m，3H)，3.51(t，J＝6.6Hz，3H)，3.48(t，J＝5.5Hz，2H)，3.44(t，J＝6.5Hz，2H)，3.26(t，J＝5.5Hz，2H)，1.76-1.70(m，2H)，1.59-1.53(m，2H)，1.46-1.40(m，2H)，1.39-1.32(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ159.1，146.5，134.8，125.3，122.6，116.7，113.5，72.6，71.7，71.6，71.3，61.6，46，1，44.7，42.2，34.1，30.9，28.2，26.9。HRMS(ES+)，针对C₂₅H₃₄N₂O₅Cl[M+H]⁺477.2156计算，发现为477.2152。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.43(UV，CAM)。

(R)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-3，3，3-三氟-2-甲氧基-2-苯基丙酰胺 (HyT27，35)：HyT27通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.55-7.53(m，2H)，7.40-7.38(m，3H)，7.17(brs，1H)，3.59-3.56(m，5H)，3.54-3.48(m，5H)，3.43(t，J＝6.7Hz，2H)，3.41(s，3H)，1.79-1.72(m，2H)，1.61-1.54(m，2H)，1.48-1.40(m，2H)，1.39-1.31(m，2H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ166.3，132.6，129.4，128.4，127.6，71.2，70.2，69.9，69.4，54.9，45.0，39.1，32.4，29.4，26，6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₂₀H₃₀NO₄ClF₃[M+H]⁺440.1815计算，发现为440.1814。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.51(UV，CAM)。

(R)-1-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-3-(3-甲基-1，1-二苯基丁-2-基)脲 (HyT29，36)：HyT29通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.38(dd，J＝6.7，6.7Hz，4H)，7.32-7.25(m，4H)，7.22-7.14(m，2H)，4.72(t，J＝9.7Hz，1H)，4.60(t，J＝5.7Hz，1H)，4.23(d，J＝9.8Hz，1H)，3.95(d，J＝11.0Hz，1H)，3.57(t，J＝6.6Hz，2H)，3.55-3.42(m，7H)，3.37-3.32(m，1H)，3.30-3.15(m，2H)，1.85-1.78(m，2H)，1.76-1.68(m，1H)，1.67-1.60(m，2H)，1.54-1.46(m，2H)，1.44-1.36(m，2H)，0.98(d，J＝6.8Hz，3H)，0.88(d，J＝6.8Hz，3H)，0.04(s，6H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ158.3，143.1，142.8，128.7，128.4，128.3，127.9，126.4，126.3，71.2，70.9，70.3，70.0，55.7，45.0，40.5，32.5，29.4，29.2，26.6，25.4，20.8，15.1，0.0。HRMS(ES+)，针对C₂₈H₄₂N₂O₃Cl[M+H]⁺489.2884计算，发现为489.2881。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.62(UV，CAM)。

2-(双((R)-1-苯基乙基)氨基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)乙酰胺(HyT30， 37)：HyT30通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ7.34(s，4H)，7.33(s，4H)，7.27-7.23(m，2H)，4.87(s，2H)，3.95(q，J＝6.8Hz，2H)，3.67-3.60(m，4H)，3.52-3.42(m，6H)，3.38(d，J＝17.6Hz，1H)，3.27-3.16(m，2H)，2.85(d，J＝17.6Hz，1H)，1.73-1.68(m，2H)，1.60-1.54(m，2H)，1.45-1.34(m，4H)，1.35(d，J＝6.8Hz，6H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)170.0，142.7，128.4，127.7，127.2，71.3，70.4，70.0，69.8，59.5，50.3，45.0，38.4，32.4，29.4，26.5，25.4，20.0，-0.03。HRMS(ES+)，针对C₂₈H₄₂N₂O₃Cl[M+H]⁺489.2884计算，发现为489.2883。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.56(UV，CAM)。

方案10.HyT31(42)的合成

酮38和醇39由已报道的程序(Bioorg.Med.Chem.，1998，6，1309-1335)制备。

酮38：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.55(d，J＝7.9Hz，1H)，7.44(dd，J＝2.6，1.4Hz，1H)，7.35(t，J＝7.9Hz，1H)，7.10(ddd，J＝8.2，2.7，0.8Hz，1H)，6.79-6.74(m，3H)，4.54(s，2H)，3.85(s，3H)，3.83(s，3H)，3.23(t，J＝8.0Hz，2H)，2.98(t，J＝6.9Hz，2H)，1.47(s，9H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ198.8，167.6，158.1，148.9，147.4，138.2，133.8，129.7，121.4，120.1，120.0，113.1，111.8，111.3，82.6，77.6，65.6，55.9，55.8，40.7，29.8，28.0。

醇39：¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.26(dd，J＝8.2，8.2Hz，1H)，6.96(d，J＝7.7Hz，1H)，6.93(s，1H)，6.81-6.78(m，2H)，6.74-6.71(m，2H)，4.68-4.65(m，1H)，4.52(s，2H)，3.86(s，3H)，3.85(s，3H)，2.72-2.66(m，1H)，2.64-2.58(m，1H)，2.12-2.04(m，1H)，2.02-1.95(m，1H)，1.83(d，J＝3.3Hz，1H)，1.55(s，1H)，1.48(s，9H)。¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ168.0，158.1，148.8，147.2，146.4，134.3，129.6，120.2，119.1，113.6，112.2，111.7，111.2，82.4，77.2，73.7，65.6，55.9，55.8，40.6，31.6，28.0。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.19(UV，CAM)。

叔丁基 2-(3-((S)-1-(4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)苯氧基)-3-(3，4- 二甲氧基苯基)丙基)苯氧基)乙酸酯40：

在rt下，向醇39(48mg，0.1193mmol)、4-(1-金刚烷基)苯酚(27mg，0.1193mmol)和三苯膦(35mg，0.1312mmol)在THF(1.2mL)中的溶液加入DIAD(26μL，0.1312mmol)。所得混合物在rt下被搅动20h，并在rt下用H₂O/EtOAc(1∶1，5mL)稀释。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥、过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供叔丁基2-(3-((S)-1-(4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)苯氧基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙基)苯氧基)乙酸酯40(55mg，76％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.23(dd，J＝7.9，7.9Hz，1H)，7.15(d，J＝8.8Hz，2H)，6.95(d，J＝7.7Hz，1H)，6.88(s，1H)，6.80-6.75(m，4H)，6.72(ddd，J＝8.2，8.2，1.8Hz，1H)，6.62(d，J＝1.6Hz，1H)，4.94(dd，J＝8.9，4.0Hz，1H)，4.48(s，2H)，3.85(s，3H)，3.65(s，3H)，2.80-2.72(m，2H)，2.29-2.20(m，1H)，2.05-1.96(m，4H)，1.82-1.69(m，11H)，1.45(s，9H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ167.9，158.1，156.0，148.5，147.0，144.3，143.6，133.9，129.6，125.6，120.1，119.0，115.1，113.2，112.0，111.9，111.1，82.3，78.5，77.2，65.5，55.8，55.4，43.2，40.6，36.7，35.4，31.5，28.9，27.9。LRMS(ES+)[M+Na]⁺635.8，TLC(25％EtOAc，在己烷中)，R_f0.57(UV，CAM)。

2-(3-((S)-1-(4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)苯氧基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙基)苯氧基)乙酸41：在0℃下，向叔丁基2-(3-((S)-1-(4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)苯氧基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙基)苯氧基)乙酸酯40(40mg，0.0653mmol)在CH₂Cl₂(2.0mL)中的搅动溶液加入TFA(0.15mL)。反应混合物在0℃下搅动2.0h并被浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供酸41(31mg，85％)。¹H NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.22(dd，J＝7.9，7.9Hz，1H)，7.13(d，J＝8.8Hz，2H)，6.93-6.88(m，2H)，6.84(d，J＝8.1Hz，1H)，6.78(dd，J＝8.2，2.2Hz，1H)，6.74(d，J＝8.8Hz，2H)，6.71(dd，J＝8.2，1.7Hz，1H)，6.67(d，J＝1.7Hz，1H)，4.97(dd，J＝8.8，4.2Hz，1H)，4.59(s，2H)，3.78(s，3H)，3.56(s，3H)，2.74(t，J＝7.6Hz，2H)，2.22-2.15(m，1H)，2.03-1.96(m，4H)，1.84-1.79(m，6H)，1.78-1.71(m，6H)。¹³C NMR(100MHz，CD₃OD)δ159.7，157.4，150.2，148.6，145.7，144.9，135.6，130.7，126.6，121.7，120.2，116.4，114.3，113.7，113.5，113.2，79.4，56.5，56.1，44.5，41.8，37.8，36.6，32.5，30.5。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.24(UV，CAM)。

2-(3-((S)-1-(4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)苯氧基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)丙基)苯氧基)-N-24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基)乙酰胺(HyT31，42)：42通过与3类似的方法被合成。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ7.25(dd，J＝7.1，7.1Hz，1H)，7.15(d，J＝8.7Hz，2H)，6.96(d，J＝6.8Hz，2H)，6.84(d，J＝8.2Hz，2H)，6.75(d，J＝8.8Hz，2H)，6.71(d，J＝8.2Hz，1H)，6.67(d，J＝1.4Hz，1H)，5.00(dd，J＝8.9，4.0Hz，1H)，4.47(d，J＝3.2Hz，2H)，3，92(s，2H)，3.77(s，3H)，3.59(s，3H)，3.56-3.50(m，18H)，3.43-3.36(m，6H)，2.76(t，J＝7.0Hz，2H)，2.25-2.17(m，1H)，2.02-1.97(m，4H)，1.84-1.69(m，14H)，1.56-1.51(m，2H)，1.45-1.39(m，2H)，1.37-1.32(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)δ172.7，171.1，159.5，157.4，150.4，148.8，145.9，145.0，135.8，130.9，126.7，121.8，120.7，116.5，114.8，113.7，113.5，79.5，72.2，72.0，71.4，71.33，71.31，71.2，71.1，70.5，70.4，68.4，56.7，56.3，45.7，44.6，41.8，40.0，39.8，37.9，36.6，33.7，32.5，30.6，30.5，27.7，26.5。HRMS(ES+)，针对C₅₃H₇₆N₂O₁₁Cl[M+H]⁺951.5138计算，发现为951.5142。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.68(UV，CAM)。

N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-4-戊基双环[2.2.2]辛烷-1-羰酰胺(HyT33， 43)：HyT33通过与HyT13(3)相同的方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ6.01(t，J＝4.8Hz，1H)，3.60-3.58(m，2H)，3.56-3.54(m，2H)，3.52(t，J＝6.5Hz，4H)，345(t，J＝6.7Hz，2H)，3.19(t，J＝5.3Hz，2H)，1.80-1.73(m，2H)，1.72-1.68(m，6H)，1.63-1.56(m，2H)，1.49-1.41(m，2H)，1.40-1.34(m，8H)，1.30-1.23(m，2H)，1.20-1.12(m，4H)，1.09-1.03(m，2H)，0.86(t，J＝7.0Hz，3H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ178.2，77.2，71.2，70.2，69.9，69.8，45.0，41.2，39.0，38.9，32.7，32.5，30.6，30.3，29.4，28.8，26.6，25.4，23.3，22.6，14.0。HRMS(ES+)，针对C₂₄H₄₅NO₃Cl[M+H]⁺430.3088计算，发现为430.3088。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.51(CAM)。

方案11.HyT34(44)的合成

在rt下，向胺8(23mg，0.1mmol)在CH₂Cl₂(1.5mL)中的溶液加入三乙基胺(140μL，1.0mmol)和1-金刚烷基异氰酸酯(18mg，0.1mmol)。反应混合物在rt下搅动16h并被蒸发。残余物在硅胶上进行层析，以产生1-((3s，5s，7s)-金刚烷-1-基)-3-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)脲44(HyT34，40mg，76％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ4.81(t，J＝5.6Hz，1H)，4.46(s，1H)，3.60-3.58(m，2H)，3.56-3.54(m，2H)，3.53(t，J＝6.7Hz，2H)，3.52(t，J＝6.7Hz，2H)，3.44(t，J＝6.7Hz，2H)，3.31(t，J＝5.4Hz，1H)，3.30(t，J＝5.4Hz，1H)，2.04(brs，3H)，1.93(t，J＝2.8Hz，6H)，1.79-1.72(m，2H)，1.64(t，J＝2.8Hz，6H)，1.62-1.56(m，2H)，1.48-1.40(m，2H)，1.39-1.31(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ157.4，77.2，71.2，70.9，70.2，70.0，50.7，45.0，42.4，39.9，36.4，32.4，29.5，29.4，26.6，25.3。HRMS(ES+)，针对C₂₁H₃₈N₂O₃Cl[M+H]⁺401.2571计算，发现为401.2573。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.59(CAM)。

1-((3s，5s，7s)-金刚烷-1-基)-3-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)硫代脲(HyT35， 45)：

HyT35通过与HyT34(44)相同的方法被合成。

¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ6.20(s，1H)，3.76(s，2H)，3.63-3.60(m，3H)，3.55-3.49(m，5H)，3.45-3.38(m，2H)，2.14-1.93(m，9H)，1.77-1.72(m，2H)，1.69-1.63(m，6H)，1.59-1.54(m，2H)，1.48-1.39(m，2H)，1.38-1.30(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ180.8，77.2，71.3，70.4，70.1，53.8，45.0，42.4，42.1，42.0，36.2，32.5，29.7，29.6，29.5，26.8，25.4。HRMS(ES+)，针对C₂₁H₃₈N₂O₂SCl[M+H]⁺417.2343计算，发现为417.2341。TLC(10％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.58(CAM)。

方案12.HyT36(49)的合成

(3r，5r，7r)-1-(2-碘乙基)金刚硼(adamantine)46：在rt下，向PPh₃(1.57g，6.0mmol)在CH₂Cl₂(14mL)的搅动的溶液中加入咪唑(442mg，6.5mmol)和碘(1.52g，6.0mmol)。反应混合物被冷却至0℃，并在0℃下搅动5min。1-金刚烷乙醇(901mg，5.0mmol)在CH₂Cl₂(6mL)中的溶液通过套管被逐滴加入至混合物。所得混合物在0℃下搅动2.0h，并将H₂O(20mL)加入冰浴中的混合物。将有机层分离，并且，将水相用CH₂Cl₂萃取两次。组合的有机层被浓缩。浓缩物通过柱层析被纯化，以提供(3r，5r，7r)-1-(2-碘乙基)金刚硼46(1.375g，95％)，作为白色固体。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.17(d，J＝17.9Hz，1H)，3.17(dt，J＝3.2，1.8Hz，1H)，1.95(brs，3H)，1.78(d，J＝17.9Hz，1H)，1.78(dt，J＝3.3，1.8Hz，1H)，1.71(brs，1H)，1.68(brs，2H)，1.63-1.61(m，1H)，1.61-1.58(m，1H)，1.49(d，J＝2.4Hz，1H)。TLC(10％EtOAc，在己烷中)，R_f0.81(UV，CAM)。

(R)-4-((3R，5R，7R)-金刚烷-1-基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N，2-二甲基丁酰胺47：在-78℃下，将正丁基锂溶液(2.5M，在己烷中，0.8mL，2.0mmol，4.0当量)加入至氯化锂(275mg，6.5mmol，13.0当量)和二异丙基胺(0.3mL，2.15mmol，4.3当量)在THF(2mL)中的悬浮液中。所得悬浮液略微加温至0℃，然后冷却至-78℃。(1S，S)-(+)-假麻黄碱丙酰胺(221mg，1.0mmol，2.0当量)在THF(2mL)中的冰***液在30min中通过套管被逐滴加入，并且，反应混合物在78℃下被搅动1.0h，在0℃下被搅动15min，并且在室温下被搅动5min，并且，冷却至0℃。在0℃下，通过套管向该溶液加入碘化物46(145mg，0.5mmol，1.0当量)在THF(1mL)中的溶液，并且，反应混合物在0℃下搅动6h并在室温下搅动20h。浅黄色混合物被冷却至0℃，然后用半饱和的NH₄Cl水溶液(10mL)处理，并用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。组合的有机层在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速色谱法在硅胶上被纯化，以提供(R)-4-((3R，5R，7R)-金刚烷-1-基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N，2-二甲基丁酰胺47(178mg，93％)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.38-7.30(m，5H)，4.62(dd，J＝7.3，7.3Hz，1H)，4.35(brs，1H)，2.81(s，3H)，2.50-2.41(m，1H)，1.93(s，3H)，1.71-1.60(m，7H)，1.57-1.41(m，8H)，1.17(d，J＝7.0Hz，3H)，1.08(d，J＝6.7Hz，3H)，0.98-0.87(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ179.3，142.7，128.7，128.3，127.5，126.9，126.3，77.2，76.5，42.3，42.2，37.4，37.2，32.1，28.7，26.9，17.2，15.4。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.24(UV，CAM)。

(R)-4-((3R，5R，7R)-金刚烷-1-基)-2-甲基丁酸48：在rt下，向(R)-4-((3R,5R,7R)-金刚烷-1-基)-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N,2-二甲基丁酰胺47(120mg，0.313mmol)在1，4-二

烷(3mL)和H₂O(2mL)中的溶液加入n-Bu₄NOH(40％wt％，在H₂O中，1.22mL，1.878mmol)。反应混合物在110℃下被搅动20h、冷却至rt，并被蒸发。残余物用H₂O(2mL)稀释，冷却至0℃，用3N-HCl调至pH4。混合物用乙酸乙酯萃取两次，并且，组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥、过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供酸48(73mg，量)。¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ10.8(brs，1H)，2.41-2.32(m，1H)，1.93(brs，3H)，1.71-1.60(m，7H)，1.46(d，J＝2.0Hz，6H)，1.42-1.34(m，1H)，1.18(d，J＝7.0Hz，3H)，1.11-1.03(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ183.5，42.3，41.7，40.0，37.2，32.1，28.7，26.5，16.8。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.62(CAM)。

(R)-4-((3R，5R，7R)-金刚烷-1-基)-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)-2-甲基丁酰胺(HyT36，49)：HyT36如HyT13通过EDC-介导的连接方法被合成。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ5.93(s，1H)，3.62-3.59(m，2H)，3.57-3.55(m，2H)，3.54(t，J＝5.0Hz，2H)，3.52(t，J＝6.5Hz，2H)，3.47-3.43(m，4H)，2.09-2.01(m，1H)，1.92(s，3H)，1.79(t，J＝6.7Hz，1H)，1.75(t，J＝6.7Hz，1H)，1.69-1.57(m，9H)，1.47-1.27(m，11H)，1.12(d，J＝6.8Hz，3H)，1.03-0.98(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ176.6，71.2，70.2，70.0，44.9，42.4，42.2，42.1，38.9，37.2，32.5，32.1，29.4，28.7，27.2，26.6，25.4，17.8。HRMS(ES+)，针对C₂₅H₄₅NO₃Cl[M+H]⁺442.3088计算，发现为442.3086。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.40(CAM)。

HyT39通过与HyT36相同的方法被合成。

方案13.HyT39(53)的合成

N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基-3-苯基丙酰胺50：在rt下，向(1S，2S)-(+)-假麻黄碱(496mg，3.0mmol)在THF(9mL)中的溶液加入三乙基胺(0.59mL，4.2mmol)。混合物冷却至0℃，并且将氢化肉桂酰氯(0.54mL，3.6mmol)加入混合物。所得混合物在0℃下搅动0.5h，用H₂O(10mL)淬火，并用乙酸乙酯萃取两次。组合的萃取物用盐水洗涤，在Na₂SO₄上干燥，过滤并浓缩。残余物在硅胶上进行层析，以提供N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基-3-苯基丙酰胺50(865mg，97％)。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)δ7.38-7.31(m，4H)，7.29-7.13(m，6H)，4.77(brs，1/2H)，4.58(dd，J＝11.2，8.2Hz，1H)，4.03-3.97(m，1/2H)，2.88(d，J＝10.7Hz，3H)，2.87(t，J＝8.1Hz，2H)，2.76-2.58(m，2H)，0.88(t，J＝7.0Hz，3H)。¹³C NMR(额外的峰是由于结合酰胺的旋转异构体，125MHz，CD₃OD)δ175.7，175.6，143.8，142.6，142.5，130.0，129.6，129.5，129.4，129.3，128.8，128.1，128.0，127.13，127.11，76.3，76.1，59.7，36.8，36.2，32.7，32.4，27.9，15.6，14.4。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.08(UV，CAM)。

(S)-4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)-2-苄基-N-((1S，2S)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)-N-甲基丁酰胺51：51通过与47相同的方法被合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)7.30-7.28(m，4H)，7.27-7.24(m，4H)，7.20-7.17(m，2H)，4.48(dd，J＝6.5，6.5Hz，1H)，2.80-2.71(m，2H)，2.49(s，3H)，1.94(s，3H)，1.72-1.59(m，7H)，1.55(s，3H)，1.43(d，J＝2.2Hz，6H)，0.99(d，J＝7.0Hz，3H)，0.97-0.92(m，1H)，0.90-0.83(m，2H)。TLC(33％EtOAc，在己烷中)，R_f0.43(UV，CAM)。

(S)-4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)-2-苄基丁酸52：52通过与48相同的方法被合成。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ10.15(brs，1H)，7.28-7.23(m，2H)，7.20-7.14(m，3H)，2.94(dd，J＝13.8，8.2Hz，1H)，2.76(dd，J＝13.8，6.5Hz，1H)，2.61-2.53(m，1H)，1.92(s，3H)，1.69-1.56(m，7H)，1.54-1.46(m，1H)，1.43(d，J＝2.0Hz，6H)，1.13-1.03(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ181.8，139.2，128.6，128.4，126.3，47.9，42.3，41.6，37.9，37.2，32.1，28.7，24.8。TLC(25％EtOAc，在己烷中)，R_f0.54(UV)。

(S)-4-((3S，5S，7S)-金刚烷-1-基)-2-苄基-N-(2-(2-((6-氯己基)氧)乙氧基)乙基)丁酰胺(HyT39，53)：HyT39如HyT13通过EDC介导的连接方法被合成。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)δ7.25-7.22(m，2H)，7.17-7.14(m，3H)，5.72(t，J＝5.4Hz，1H)，3.52(t，J＝6.6Hz，2H)，3.50-3.45(m，3H)，3.44-3.40(m，1H)，3.42(t，J＝6.6Hz，2H)，3.69-3.33(m，2H)，3.31-3.25(m，1H)，3.23-3.19(m，1H)，2.88(dd，J＝13.3，9.6Hz，1H)，2.72(dd，J＝13.4，5.3Hz，1H)，2.16-2.11(m，1H)，1.92(s，3H)，1.79-1.73(m，2H)，1.69-1.56(m，9H)，1.47-1.41(m，3H)，1.44(d，J＝2.2Hz，6H)，1.38-1.33(m，2H)，1.09-0.97(m，2H)。¹³C NMR(125MHz，CDCl₃)δ174.8，140.1，128.9，128.2，126.0，71.2，70.1，70.0，69.9，51.0，44.9，42.3，42.1，39.2，38.8，37.2，32.5，32.1，29.4，28.6，26.6，25.7，25.4。HRMS(ES+)，针对C₃₁H₄₉NO₃Cl[M+H]⁺518.3401计算，发现为518.3405。TLC(5％CH₃OH，在CH₂Cl₂中)，R_f0.55(UV，CAM)。

2-((3r，5r，7r)-金刚烷-1-基)-N-(24-氯-11-氧-3，6，9，15，18-五氧杂-12-氮杂二十四基) 乙酰胺(HyT40，54)：HyT40通过与3类似的方法被合成。

方案14.HyT40(54)的合成

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.18(s，1H)，6.19(s，1H)，4.04(s，2H)，3.70-3.41(m，24H)，1.95(s，3H)，1.80-1.73(m，4H)，1.70-1.55(m，8H)，1.61(d，J＝2.2Hz，6H)，1.48-1.41(m，2H)，1.39-1.33(m，2H)。¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.1，171.0，71.2，70.7，70.6，70.5，70.4，70.2，70.1，70.0，69.9，69.8，51.5，45.0，42.5，39.0，38.6，36.7，32.6，32.5，29.4，28.6，26.6，25.4。HRMS(ES+)，针对C₃₀H₅₄N₂O₇Cl[M+H]⁺589.3620计算，发现为589.3622。TLC(10％CH₃OH，在中CH₂Cl₂)，R_f0.66(UV，CAM)。

生物学实验

方法

细胞培养和材料

指示的细胞在37℃下，在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中生长。HaloTag蛋白质获自pHT2载体(Promega)。荧光素酶序列获自pGL3-Basic载体(Promega)，小鼠Ror2由Sigmar Stricker(Max Planck-Institute for MolecularGenetics(马克斯-普朗克分子遗传学研究所))热心提供，斑马鱼(Danio rerio)Smad5克隆自斑马鱼cDNA文库，并且，H-RasG12V获自Addgene质粒9051——由RobertWeinberg(MIT)贡献。其余跨膜蛋白质克隆自人脾脏cDNA文库(Invitrogen)。通过QuikChange Site Directed mutagenesis kit(QuikChange定点诱变试剂盒)(Stratagene)，D106A点突变被引入HaloTag基因。Flp-In293细胞购自Invitrogen。HA-HaloTag-Smad5和EGFP-HaloTag被克隆到pCS2+载体中，而构建体的其余部分被克隆到逆转录病毒pEYK3.1载体(由George Daley，MIT热心提供)中——通过切除GFP⁴¹。逆转录病毒在具有pVSV-G和相应的pEYK质粒的GP2-293细胞(Clontech)中产生，并且，指示的细胞如所描述地被感染⁴¹。抗-HA抗体购自Covance(克隆16B12)，并且，抗-β-肌动蛋白抗体购自Sigma(克隆AC-74)。HyT化合物在DMSO中以1000×原液被存储和整分。

荧光素酶分析

将用HA-荧光素酶-HaloTag感染的一万个稳定的HEK293T细胞在96孔板的每一个孔中铺平。次日，一式三份加入指示的HyT化合物，并将细胞再培养24小时。将细胞用冷PBS洗涤一次，并在被动裂解液(Passive Lysis Buffer)(Promega)中裂解。通过Steady-Glo Luciferase Assay System(Steady-Glo荧光素酶分析***)(Promega)在Wallac Victor2Plate Reader(平板读取器)(Perkin Elmer)上显示荧光素酶活性，并且，荧光素酶活性通过如Bradford分析所确定的蛋白质浓度标准化。

免疫印迹法

指示的细胞用冷PBS洗涤两次，并且，细胞在裂解液(1×PBS、1％NP-40、1mMEDTA、40mM HEPES)中用蛋白酶抑制剂裂解。通过在10,000g下离心5min清除溶胞产物。总蛋白质浓度通过Bradford分析而确定，并将50μg蛋白质加载到8％Bis-Tris凝胶中。为了在蛋白酶体抑制⁴²后溶解多泛素化和聚集的蛋白质，用具有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液(1×PBS、1％NP-40、1％SDS、1％脱氧胆酸钠、1mMEDTA、40mM HEPES)裂解图12e产生的样品。通过标准程序用指示的抗体处理印迹，并且，用ImageJ量化带强度。

流式细胞术分析

通过共转染pCS2/EGFP-HaloTag和含有嘌呤霉素抗性基因的p-Puro培养稳定的HeLa细胞。分离表达EGFP-HaloTag的克隆细胞群。这些细胞用介质或1μMHyT13处理24小时，用PBS洗涤，并被胰蛋白酶消化。将细胞重悬于不含FBS的DMEM中，并且，通过FACSCalibur(BD Biosciences)测量细胞内GFP水平。

斑马鱼(Danio rerio)实验

野生型鱼种系TLF被用于该研究。将pCS2+质粒中的HA-HaloTag-Smad5用SP6转录试剂盒(Ambion)在体外转录。在一个细胞期以100ng/μL注入mRNA，并将胚胎培养至256细胞期，此时，将它们移至凹玻片(10个/孔)并置入具有或不具有HyT13(10μM)的1ml E2培养基中。在28.6℃下培养胚胎24小时，然后，将其去卵膜(dechorionated)和去卵黄，如述⁴³。每种条件收集大约60个胚胎，用于免疫印迹分析，如上所述。

集落形成分析

将具有DMEM的10%FBS中的用HA-HaloTag-H-RasG12V和HA-HaloTag(D106A)-H-RasG12V感染的十万个NIH-3T3细胞在10-cm细胞培养板上铺平。次日，用1%FBS培养基替换培养基，并且，对细胞施加介质或1μMHyT13。每两天替换培养基和药物。在第6天，给集落照相，并以每1-cm²面积的不同集落数计数。

肿瘤形成分析

将表达HA-HaloTag-H-RasG12V的十万个NIH-3T3细胞注入到麻醉的6周龄雌性nu/nu裸鼠(Charles River Laboratories)的胁中。两小时后，小鼠经IP注射以介质(10μL体积，具有5μL DMSO和5μL克列莫佛EL)、25mg/kg HyT13或100mg/kg HyT13。药物注射每日持续进行，直到实验结束。在第7天肿瘤出现后，每日用测径器测量肿瘤，并且，利用下列公式计算其体积：a(b)²/2，其中，a和b分别代表肿瘤的最长和最短直径。

结果

疏水性标记使HaloTag融合蛋白失稳

本发明人设计了21个不同结构的支架，作为疏水标签(HyTs)的基础，并在这些支架上合成和测试了30种化合物，这些化合物由如下组成：连接至HaloTag卤代烷反应性连接体的疏水部分(表1，图5)。在设计这些双功能分子的疏水部分时，发明人应用了可在Yale University Small Molecule Discovery Center(耶鲁大学小分子发现中心)获得的化合物库，作为非正式的源，来鉴别如下化合物：(1)最大化疏水性、(2)最小化分子重量、和(3)结合化学上不同的并且商业可得的支架。为确定其生物学活性，生成了稳定的HEK293T细胞系——表达荧光素酶-HaloTag融合蛋白，并用HyT化合物以1μM处理这些细胞24小时。引人注目地，若干非毒性化合物呈现降低荧光素酶活性，并且，进一步表征五种最有效的化合物(图1)。所有五种HyT均呈现高疏水性得分(logP范围为+3至+5)并以浓度依赖性方式起作用，然而，具有两个PEG基团的HyT5对照化合物没有降低荧光素酶活性(图1)。基于这些初始数据，继续以下研究：通过含有疏水性的HyT13的疏水性标记引起的降解——由于具有金刚烷基的化合物的报告的高稳定性和细胞渗透性^27,28。

因为荧光素酶分析依赖于荧光素酶-HaloTag融合蛋白的活性损失，希望确定荧光素酶活性降低是由于整个融合蛋白的降解还是可能是仅仅由于荧光素酶活性的抑制。生成了稳定的Flp-In293细胞系——具有含有HA-EGFP-HaloTag融合蛋白的单个整合位点，并利用该细胞系和HyT13一起进行动力学研究。免疫印迹法显示，HyT13有效降解融合蛋白，其中最大效力达到100nM(图12a)。HyT13的IC₅₀经分析为21nM(图6)。时程实验揭示，在8小时内达到全部效力，其中，到1.5小时观察到50%降解(图12b和图7)。当细胞用1μM HyT13处理24小时，然后将HyT13除去24小时时，蛋白质水平恢复至起始水平的一半。在20μM的HyT13——IC₅₀值1000倍的剂量——下，没有观察到细胞毒性(图8)。与假设一致的是，疏水性标记模拟部分变性的蛋白质状态，并且，蛋白质最终被输送至蛋白酶体以进行降解，将蛋白酶体抑制剂MG132和YU101²⁹的内含阻止HyT13介导的降解(图12c)。为验证观察到的HA-EGFP-HaloTag水平降低并不是由于在免疫印迹法过程中HA表位的遮蔽而造成的，生成了HeLa细胞系——其稳定地表达EGFP-HaloTag，并通过流式细胞术分析细胞内荧光。与之前的观察一致，以1μMHyT13对这些细胞进行24小时的处理使细胞的平均荧光强度降低几乎7倍(图12d)。总之，这些发现提供第一实验证据——疏水性标记代表可行的蛋白质水平控制策略。

跨膜蛋白质和斑马鱼蛋白质的降解

蛋白质水平小分子控制的现有技术的一个限制是难以降解跨膜蛋白质⁹。为确定疏水性标记是否也具有该限制，构建体了若干跨膜-HA-HaloTag融合蛋白，以便HaloTag部分将处于细胞内。Ror2是单程跨膜受体酪氨酸激酶样孤儿受体，其在Wnt配体信号转导中发挥作用³⁰。类似地，CD3E是单程跨膜细胞表面糖蛋白，其涉及抗原识别³¹。CD9是4程跨膜蛋白质，来自跨膜四蛋白(tetraspanin)家族，并在整联蛋白信号转导中发挥作用³²。最后，G-蛋白连接受体GPR40和Frizzled-4分别是不具有长链的脂肪酸和Wnt蛋白质的7程跨膜受体^33,34。用HyT13处理HEK293T细胞系——稳定表达这些跨膜HaloTag融合蛋白，有效引起其降解(图12e)，表明疏水性标记***降解跨膜蛋白质的潜力。这些实验表明，与HaloTag蛋白质的氨基或羧基末端融合容易受该小分子引起的降解策略的影响，并且，跨膜蛋白质可被HyT13降解。

还研究在斑马鱼中应用疏水性标记***的可能性。将HA-HaloTag-Smad5cRNA注入到斑马鱼胚胎中，然后，用介质或HyT13处理胚胎。注入的胚胎溶胞产物的免疫印迹法揭示，融合蛋白被非常有效地降解，表明HyT13能够穿透绒毛膜，并可引导HaloTag融合蛋白进行斑马鱼中降解(图12f)。这些实验表明，HyT13能够降解不同细胞系以及斑马鱼胚胎中的融合蛋白。

HyT13阻抑小鼠中的HaloTag-RasG12V肿瘤负荷

接下来研究在细胞培养物和小鼠中，通过HyT13进行的癌基因的基于HaloTag的降解的功能作用。小GTPase H-Ras是癌症中最常突变的基因之一，其中，高达90%的癌症在该基因中具有激活突变³⁵。激活突变，诸如H-RasG12V等位基因，导致对细胞外有丝***信号的依赖性降低。H-RasG12V在小鼠成纤维细胞细胞系NIH-3T3中的异常表达会导致转化的表型，如通过在细胞培养物和小鼠中的分析所显示的。当表达H-RasG12V的细胞在低血清条件下在培养中生长时，它们失去细胞-细胞接触抑制，并形成不同的集落，而不是作为细胞单层生长。此外，在注入到免疫受损裸鼠中时，这些转化的细胞能够形成肿瘤^36,37。研究了(1)HaloTag-H-RasG12V驱使的集落形成是否可在NIH-3T3细胞中受到阻抑，和(2)小鼠中HaloTag-H-RasG12V驱使的肿瘤负荷是否可通过给予HyT13而降低。首先，NIH-3T3细胞用HA-HaloTag-H-RasG12V逆转录病毒构建体进行稳定地感染。编码的融合蛋白容易被HyT13降解(图13a)。为测试HyT13的HaloTag受体特异性，在HaloTag蛋白质(HaloTagD106A)中生成了点突变，其不能与HyT13中的反应性氯化烷烃(chloroalkane)形成共价键²⁶。不同于HA-HaloTag-H-RasG12V，HA-HaloTag(D106A)-H-RasG12V融合蛋白不受HyT13影响(图13a)。接下来。将两个细胞系稀疏地(10⁵细胞/10-cm平板)在含有10%FBS的培养基中铺平。次日，用含有1%FBS的培养基替换培养基，并且，用介质或HyT13处理培养物。到第6天，用介质处理的细胞系和用HyT13处理的表达HA-HaloTag(D106A)-H-RasG12V的细胞均已经形成了多个集落，然而，HyT13处理的表达HA-HaloTag-H-RasG12V的细胞已经长成了正常的细胞单层，非常类似于亲本NIH-3T3细胞(图13b-c)。在HyT13不存在的情况下，与HA-HaloTag(D106A)-H-RasG12V细胞相比，表达HA-HaloTag-H-RasG12V的细胞显示稍高数目的集落。然而，将这观察结果归因于对逆转录病毒感染效率的轻微差异，因为已经观察到这样的实例：其中，HaloTag(D106A)-H-RasG12V细胞也比HA-HaloTag-H-RasG12V细胞显示更多集落(数据未显示)。这些结果表明，疏水性标记可用于在体外细胞培养的背景下降低蛋白质活性。

为检验基于HaloTag:HyT13的***是否能够用于小鼠模型以减轻H-RasG12V-驱使的肿瘤负荷，首先评价了HyT13的药代动力学。在14天的治疗方案中在裸鼠中利用HyT13以上至100mg/kg的剂量进行最大耐受剂量试验。甚至在最高剂量下也没有观察到明显的表型(图9)。接下来，设法确定注射后HyT13的血清生物利用率。以25mg/kg经腹膜内(IP)注射向Swiss Webster小鼠施用HyT13，并在注射后1和24小时收集血清。在HyT13施用后1小时，血清浓度大约为2μM，到24小时，HyT13浓度已降至大约500nM(图10)。基于之前在细胞培养设置中的实验，推测这些血清HyT13浓度足以阻抑H-RasG12V肿瘤在小鼠中形成。为对此进行测试，将表达HA-HaloTag-H-RasG12V的NIH-3T3细胞注入到裸鼠的胁中，并在同一天，启动介质、25mg/kg HyT13或100mg/kg HyT13的每日治疗方案。在第9天，在介质处理的小鼠中观察到明显的实体肿瘤块，并且，肿瘤体积呈指数生长直到第13天，此时，动物被处死。HyT13小鼠中的肿瘤比介质处理的小鼠中的肿瘤平均小6倍，表明HyT13能够减少H-RasG12V肿瘤形成(图13d)。这些数据清楚地表明，HaloTag:HyT13***在干扰活体动物的蛋白质功能中的有用性。

讨论

本发明涉及新的疏水性标记技术，以在加入小分子后***地降低特定蛋白质的水平(图9)。该策略相对于现有技术具有若干益处：首先，在化合物施用后而不是在配体撤回后实现蛋白质降解。当蛋白质在研究前需要被长期表达时，这方面尤其相关，因为无需连续配体处理以维持POI的表达，。相反，控制蛋白质丰度的基于DD的方法(见背景部分)要求恒定的药物施用，这是费时和昂贵的。同样，利用基于DD的***的配体施用之间的融合蛋白浓度还可能存在波动，而HaloTag融合蛋白的表达在降解信号不存在的情况下是稳定的。因此，取决于应用，可期望有这样的***：其中小分子引起POI降解而不是POI稳定化。第二，HaloTag:HyT13方法依赖于单次引入融合结构域至POI中。该特征与生长素***形成对比，在生长素***中，除了融合蛋白以外，还必须表达外源植物E3连接酶。第三，几乎所有的人和小鼠基因均是商业可得的，作为瞬时和慢病毒表达载体中的N-和C末端HaloTag融合体。具有34kDa HaloTag受体的这些蛋白质融合体在许多蛋白质功能的研究中被证明是有用的，因为它们可容易地在体内被标记和利用荧光或生物素标记的HaloTag试剂被纯化。用疏水标签HyT13降解这些融合蛋白的能力只是增加了可能的HaloTag应用的选项(repertoire)。尽管HyT13尚不是商业可得的，但可利用标准合成方法在四步骤中从商业可得的原材料获得该小分子，总产率为63%(方案2，上文)。

围绕若干基于FKBP12的降解***的一种批评是其依赖于雷帕霉素、FK506或其衍生物，以引起蛋白质干扰。由于这些是生物活性的小分子，所以，它们可引起与干扰POI无关的生物学作用。相反，HaloTag脱卤素酶是细菌基因，并且，HyT13与HaloTag的共价结合为该***提供高度的特异性。这种生物正交性(bioorthogonality)可解释显而易见的HyT13细胞毒性的缺乏——甚至在比其在细胞培养物中21nM的IC₅₀值高1,000倍施用后。此外，每日注射以HyT13，100mg/kg，达14天的小鼠体重正常增加，表明HyT13即使在该高剂量下也在体内不具有毒性。

如同若干其它***性降解方法，HaloTag:HyT13方法也不能降解内源蛋白质，除非HaloTag基因与感兴趣的基因融合。然而，存在两种可行的策略以克服该限制并在培养物中或在或动物中使内源蛋白质受到Halotag:HyT13介导的调节。首先，可以通过靶向的基因组工程产生HaloTag融合构建体。锌指核酸酶^20,38,39和同源重组⁴⁰技术中的最近进展展现了以类似于酵母的方式在啮齿动物中全身性标记内源蛋白质的可能性。第二种方法可以是通过敲低或敲除技术使内源基因失活，并将相应的HaloTag融合基因引入到动物中。两种方法均将绕过对关键基因的早期需求，从而允许在器官发生或疾病发展期间稍后对其功能进行研究。

总之，本文描述了在细胞培养物或整个动物中全身性降解任何POI的化学生物方法。该***要求构建单一融合蛋白，该融合蛋白通过加入非毒性的低分子量疏水标签而被特异性降解。认为该***尤其适于动物研究，因为如已经通过在斑马鱼和小鼠中进行的实验证明。另外，这些发现表明，疏水性标记代表了促进不依赖于HaloTag:HyT13***的内源蛋白质的靶向降解的新方法。

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Claims

1.根据下式的化合物：

其中，

是ClogP至少约为1.5的疏水基团，或本文图14描述的疏水基团；和

是连接基团，其具有反应部分，该反应部分与融合蛋白上的自标记多肽标签反应，以在所述

基团和所述融合蛋白之间形成共价键，所述融合蛋白包含所述自标记标签和感兴趣的蛋白质，其中所述疏水基团促进共价连接于所述

基团的所述融合蛋白中所述感兴趣的蛋白质的细胞内降解。

2.权利要求1所述的化合物，其中所述疏水基团不是报道基团。

3.权利要求1所述的化合物，其中所述疏水基团不是荧光报道基团。

4.权利要求1-3任一项所述的化合物，其中所述自标记多肽标签是卤代烷脱卤素酶(halotag2或halotag7)自标记多肽标签(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)。

5.权利要求1-3任一项所述的化合物，其中所述自标记多肽标签选自：snaptag(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)、cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)和MCPtag(SEQ ID NO:10)。

6.权利要求4所述的化合物，其中反应性基团是卤烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。

7.权利要求6所述的化合物，其中所述卤烷是C₂-C₁₂氯烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。

8.权利要求6所述的化合物，其中所述反应性基团是

9.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基鸟嘌呤(BG)衍生物(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6)反应。

10.权利要求9所述的化合物，其中所述反应性基团是

11.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基胞嘧啶(BC)衍生物(cliptag)反应。

12.权利要求9所述的化合物，其中所述反应性基团是

13.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS(SCP合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(ACPtag、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9)反应。

14.权利要求5所述的化合物，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(Sfp合成酶)(SEQ ID NO:10)，其特异性地与辅酶A衍生物反应。

15.权利要求13或14所述的化合物，其中所述反应性基团是

16.根据如下化学结构的化合物：

其中，

是疏水基团；

Z是连接

与X的基团；

X是连接Z与基团Y_R的基团；和

Y_R是与融合蛋白反应的基团，这形成连接所述疏水基团和所述融合蛋白的共价键。

17.权利要求16所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少约为1.5。

18.权利要求16所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。

19.权利要求16所述的化合物，其中，Z是键、-(CH₂)_i-O、-(CH₂)_i-S、-(CH₂)_i-N-R、

基团，其中，X₁Y₁形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团，或

或

基团；

每一个R均是H或C₁-C₃烷基或链烷醇基团；

每一个Y均独立地是键、O、S或N-R；

和每一个i均独立地是0至100；

X是

基团，

其中，每一个D均独立地是键(不存在)，

-(CH₂)_m'-；或

j是1至100；

k是1至100；

m’是1至100；

n是1至100；

X¹是O、S或N-R；

Y同上；和

是键(不存在)或

基团，

X³是O、S、NR⁴；和

R⁴是H或C₁-C₃烷基，或者

其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体。

20.权利要求19所述的化合物，其中，

是

基团或酰胺基团。

21.权利要求19所述的化合物，其中，Y_R是与所述融合蛋白的自标记标签反应的基团。

22.权利要求21所述的化合物，其中所述自标记标签是halotag2或7(SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2)、snaptag(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6)、cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或MCPtag(SEQ ID NO:10)。

23.权利要求21所述的化合物，其中，Y_R是

或

24.权利要求19所述的化合物，其中，Y_R是

25.权利要求19所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少为约1.5。

26.权利要求19所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。

27.根据本文图4的化合物HyT。

28.根据如下结构的化合物：

其中，

是疏水基团；

Z是连接

与X的基团；

X是连接Z与基团Y_Rp的基团；

是融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和在所述融合蛋白中与所述感兴趣的蛋白质连接的自标记多肽标签，所述自标记多肽标签与反应性基团Y_R反应，以共价连接所述

基团与所述融合蛋白；和

Y_Rp是化学部分，其通过所述融合蛋白对所述反应性基团Y_R的作用而形成，所述反应性基团Y_R通过所述X基团和所述Z基团连接所述融合蛋白与所述疏水基团。

29.根据权利要求28的如下化学结构的化合物：

或

其中，

Z、X和

如权利要求28所述，和X_Fp是来自所述融合蛋白的N、O或S基团，反应性YR通过所述X_Fp共价结合于所述融合蛋白。

30.根据权利要求28或29所述的化合物，其中所述疏水基团的ClogP至少约为1.5。

31.权利要求28-30任一项所述的化合物，其中所述疏水基团是来自本文图14的基团。

32.权利要求28-31任一项所述的化合物，其中，Z是键、-(CH₂)_i-O、-(CH₂)_i-S、-(CH₂)_i-N-R、

基团，其中，X₁Y₁形成酰胺基团或氨基甲酸乙酯基团、酯或硫酯基团或

或

基团；

每一个R均是H或C₁-C₃烷基或链烷醇基团；

每一个Y均独立地是键、O、S或N-R；

和每一个i均独立地是0至100；和

X是

基团，

其中，每一个D均独立地是键(不存在)、

-(CH₂)_m'-；或

j是1至100；

k是1至100；

m’是1至100；

n是1至100；

X¹是O、S或N-R；

Y同上；和

是键(不存在)或

基团，

X³是O、S、NR⁴；和

R⁴是H或C₁-C₃烷基，或者

其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体。

33.权利要求31或32所述的化合物，其中，

是

基团或酰胺基团。

34.权利要求28-33任一项所述的化合物，其中所述自标记标签是halotag2或7(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)、snaptag(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6)、cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或MCPtag(SEQ ID NO:10)。

35.权利要求28-34任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、涉及催化活性、芳化酶活性、传动蛋白活性、解旋酶活性、代谢过程、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成、激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导蛋白活性、结构分子活性、结合活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物学过程调节、发育、细胞分化、刺激物响应的蛋白质、行为蛋白质、细胞黏着蛋白质、涉及细胞死亡、蛋白质转运体活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、透性酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机理、蛋白伴侣调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外组构和生源说活性或翻译调节因子活性的蛋白质。

36.权利要求28-35任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是真核蛋白质。

37.权利要求28-35任一项所述的化合物，其中所述感兴趣的蛋白质是原核蛋白质。

38.确定感兴趣的蛋白质是否是生物活性剂的潜在靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤：

a.提供疏水性标记的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含所述感兴趣的蛋白质和共价连接于所述融合蛋白的疏水部分，其中所述疏水部分能够在细胞内或细胞表面上降解所述融合蛋白；

b.暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞于所述疏水性标记的融合蛋白，其中在所述细胞内或所述细胞表面上所述融合蛋白任选地标记有所述疏水部分；

c.测量所述细胞内或所述细胞表面上所述融合蛋白的降解；和

d.确定所述融合蛋白的所述降解是否与蛋白质作为通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在靶标相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性。

39.权利要求38所述的方法，其中所述融合蛋白被表达于利用所述感兴趣的蛋白质的所述细胞内或其表面上。

40.确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤：

1.通过在细胞群内表达融合蛋白，提供所述融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签；

2.任选地，分离所述融合蛋白；

3.任选地，暴露利用所述感兴趣的蛋白质的细胞群于所述分离的融合蛋白；

4.在细胞内或细胞表面上共价连接所述融合蛋白与化合物，所述化合物包含疏水基团和反应性连接体，其中，所述反应性连接体具有反应性基团，所述反应性基团是所述自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而在细胞内或所述细胞表面上产生疏水性标记的融合蛋白；

5.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和

6.任选地确定所述融合蛋白的所述降解是否与所述感兴趣的蛋白质相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性，所述感兴趣的蛋白质是通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在靶标。

41.确定感兴趣的蛋白质是否是潜在的生物活性剂靶标或药物靶标的方法，包括如下步骤：

1.通过在利用所述感兴趣的蛋白质的细胞群内表达融合蛋白，提供所述融合蛋白，其包含感兴趣的蛋白质和多肽自标记标签；

2.在所述细胞内共价连接所述融合蛋白与化合物，所述化合物包含疏水基团和反应性连接体，其中，所述反应性连接体具有反应性基团，所述反应性基团是所述自标记标签的底物，其中所述疏水基团共价连接于所述融合蛋白，从而在所述细胞内或其表面上产生疏水性标记的融合蛋白；

3.测量所述细胞内或其表面上所述融合蛋白的降解；和

4.任选地确定所述融合蛋白的所述降解是否与所述感兴趣的蛋白质相一致地通过所述细胞的表型响应变化调节所述细胞的生物学活性，所述感兴趣的蛋白质是通过所述感兴趣的蛋白质调节的疾病和/或状况的生物活性剂或药物的潜在靶标。

42.权利要求40或41所述的方法，其中所述自标记多肽标签是halotag2或7(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)、snaptag(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)、cliptag(SEQ ID NO:7)、ACPtag(SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9)或MCPtag(SEQ ID NO:10)。

43.权利要求38-42任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是报道基团。

44.权利要求38-42任一项所述的方法，其中所述疏水基团不是荧光报道基团。

45.权利要求40-44任一项所述的方法，其中所述自标记多肽标签是卤代烷脱卤素酶(halotag1或halotag2)自标记多肽标签(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)。

46.权利要求45所述的方法，其中所述反应性基团是卤烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。

47.权利要求46所述的方法，其中所述卤代烷是C₂-C₁₂氯烷基，其任选地被单醚或二醚基团取代。

48.权利要求46所述的方法，其中所述反应性基团是

49.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基鸟嘌呤(BG)衍生物(SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)反应。

50.权利要求49所述的方法，其中所述反应性基团是

51.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是O⁶-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶，其特异性地与苄基胞嘧啶(BC)衍生物(SEQ ID NO:7)反应。

52.权利要求51所述的方法，其中所述反应性基团是

53.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶AcpS(SCP合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(SEQ ID NO:8、SEQID NO:9)反应。

54.权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自标记标签是磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp(Sfp合成酶)，其特异性地与辅酶A衍生物(SEQ ID NO:10)反应。

55.权利要求53或54所述的方法，其中所述反应性基团是

56.权利要求38-55任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是结构蛋白质、受体、酶、细胞表面蛋白质、涉及催化活性、芳化酶活性、传动蛋白活性、解旋酶活性、代谢过程、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成、激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节因子活性、信号转导蛋白活性、结构分子活性、结合活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物学过程调节、发育、细胞分化、刺激物响应的蛋白质、行为蛋白质、细胞黏着蛋白质、涉及细胞死亡、蛋白质转运体活性、核转运、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、透性酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机理、蛋白伴侣调节因子活性、核酸结合活性、转录调节因子活性、细胞外组构和生源说活性或翻译调节因子活性的蛋白质。