CN113454106A - 存活靶向性嵌合（surtac）分子 - Google Patents

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Abstract

本文提供了存活靶向性嵌合(SURTAC)分子，以及它们用于将泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法。在一个实施方式中，SURTAC分子包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域，其中第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将一个或多个泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接。

Description

存活靶向性嵌合(SURTAC)分子
技术领域
本公开总体上涉及双功能分子领域。在一个实施方式中，本文提供了被设计用于减少泛素化蛋白质(ubiquitinylated protein)的细胞降解的存活靶向性嵌合(survival-targeting chimeric)(SURTAC)分子。
背景技术
活细胞内任何蛋白质的浓度都取决于蛋白质合成和蛋白质降解的平衡。受调控的蛋白质降解是精确控制细胞内单一蛋白质水平的关键。
蛋白酶体是通过蛋白水解——一种破坏肽键的化学反应——降解蛋白质的蛋白质复合物。帮助此类反应的酶被称为蛋白酶。蛋白酶体是泛素-蛋白酶体***(UPS)的关键组成部分。蛋白质泛素化和随后蛋白酶体导致的蛋白水解和降解是调节细胞周期、细胞生长和分化、基因转录、信号传导和细胞凋亡的重要机制。
作为UPS的一部分，蛋白酶体在恶性转化中起着至关重要的作用。UPS蛋白水解在癌细胞对对癌症发展至关重要的刺激信号的响应中起主要作用。因此，转录因子如p53、c-Jun、c-Fos、NF-κB、c-Myc、HIF-1α、MATα2、STAT3、甾醇调节元件结合蛋白和雄激素受体的蛋白质水平受UPS降解的控制。此外，UPS调控肿瘤抑制基因产物，如结直肠癌中的大肠腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli)(APC)、视网膜母细胞瘤(Rb)、和希-林二氏肿瘤阻抑因子(VHL)的降解。
通过控制关键调节蛋白的水平，UPS促成了细胞功能的几乎所有方面。UPS还用于蛋白质量控制、快速识别和破坏错折叠的蛋白质。因此，蛋白质降解途径的功能异常在许多人类疾病中至关重要。
所有细胞所必需的蛋白质都可被称为持家蛋白，这表明它们的表达对于维持基本细胞功能至关重要。编码这些蛋白质的持家基因通常是维持基础细胞功能所需的组成性基因，而不管持家蛋白在组织或生物体中的具体作用如何。对代表人体中所有主要器官和组织的样品的转录组学分析确定了在所有经分析的组织中检测到的数千个编码蛋白质的基因。持家蛋白参与关键的细胞功能，如基因表达机制、细胞代谢、和结构细胞蛋白质。鉴于它们在维持细胞稳态中的关键作用，很明显，任何持家蛋白正常活性的任何偏差都会对细胞功能产生急性和广泛的影响，这可能导致细胞性致病和发病。
示例性持家蛋白包括HSP家族的蛋白质，其是热休克蛋白；ATF家族的蛋白质，其充当转录因子；EIF家族的蛋白质，其充当翻译因子；EIF家族的蛋白质，其充当翻译因子；RPL家族的蛋白质，其是核糖体蛋白质；ARHG家族的蛋白质，其是参与细胞周期的蛋白质；和PSMA家族的蛋白质，其是蛋白酶体的蛋白质。
热休克蛋白(HSP)是由细胞在应对暴露于胁迫条件所产生的蛋白质家族。这使得HSP蛋白成为“持家蛋白”，因为它们(a)在细胞受到损害(即热休克)后被激活，并(b)使细胞恢复到稳态。在创伤愈合和组织重塑过程中，HSP会关于热休克、冷休克、暴露于UV而被激活。研究最多的HSP是Hsp60、Hsp70和Hsp90。
对例如具体使在细胞的蛋白质组学环境中的所有蛋白质中的感兴趣的蛋白质(如持家蛋白)免受UPS相关降解的化合物和方法之类的技术的提供将是非常有益的。这种技术可用于例如在UPS相关的蛋白降解过度或其它不希望的UPS相关蛋白降解作为部分人类疾病(例如癌症或囊性纤维化(CF))病因的各种各样的治疗应用中。Hanna及其同事最近综述了蛋白质降解与人类疾病病理基础之间的联系(The American Journal of Pathology,第189卷,第1期,2019年1月)。
因此，需要开发被设计用于防止感兴趣的蛋白质的UPS相关降解的化合物，用于治疗各种人类疾病。
发明内容
在一个实施方式中，本公开提供了存活靶向性嵌合(SURTAC)分子，其包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域，其中第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割一个或多个泛素分子，并且连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接。
在一个实施方式中，第一结合结构域包括肽或小分子。在一个实施方式中，第一结合结构域被配置以直接与泛素化蛋白质结合，例如，第一结合结构域包括与泛素化蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，第一结合结构域包括与泛素化蛋白质结合的配体。在另一个实施方式中，第一结合结构域结合与泛素化蛋白质结合的中间分子。
在一个实施方式中，由第一结合结构域结合的泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP5相互作用。在另一个实施方式中，泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP7相互作用。在另一个实施方式中，泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP10相互作用。在另一个实施方式中，泛素化蛋白质是泛素蛋白酶的非天然目标，例如但不限于，不知晓泛素化蛋白质是DUB的底物。
在一个实施方式中，本文公开的嵌合分子的第二结合结构域可包括肽或小分子。在一个实施方式中，第二结合结构域被配置以直接与泛素蛋白酶结合，例如，第二结合结构域包含与泛素蛋白酶结合的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方式中，第二结合结构域包括与泛素蛋白酶结合的配体。在另一个实施方式中，第二结合结构域包括与泛素蛋白酶结合的适配体。在另一个实施方式中，第二结合结构域结合与泛素蛋白酶结合的中间分子。
在一个实施方式中，泛素蛋白酶可包括泛素特异性蛋白酶(DUSP)结构域、泛素样(UBL)结构域、甲基多巴和TRAF同源物(meprin and TRAF homology)(MATH)结构域、锌指泛素特异性蛋白酶(ZnF-UBP))结构域、锌指髓样神经和DEAF1(zinc-finger myeloid,nervyand DEAF1)(ZnF-MYND)结构域、泛素相关(UBA)结构域、CHORD-SGT1(CS)结构域、微管互作和运输(microtubule-interacting and trafficking)(MIT)结构域、硫氰酸酶样(rhodenase-like)结构域、TBC/RABGAP结构域、B-框(B-box)结构域、或其任意组合。
在一个实施方式中，泛素蛋白酶来自泛素特异性蛋白酶(USP)家族、卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族、泛素C末端水解酶(UCH)家族、Josephin结构域家族(Josephin)、与含有泛素的新型去泛素化酶(deubiquitinase)家族相互作用的基序(MINDY)、或JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)。例如，泛素蛋白酶可是USP5、USP7、或USP10。
在一个实施方式中，本文公开的嵌合分子的连接体结构域可包括肽或小分子。在一个实施方式中，连接体结构域包括柔性连接体或刚性连接体。连接体结构域可共价地将第一结合结构域连接至第二结合结构域。在另一个实施方式中，连接体结构域非共价地将第一结合结构域连接至第二结合结构域。
附图说明
在说明书的结论部分中特别指出并清楚地要求保护本文公开的主题。然而，在结合附图阅读时，本文提供的嵌合分子，关于操作的组织和方法这两方面，连同其目的、特征和优点可通过参考以下详细描述得到最佳理解，在附图中：
整个附图中使用的缩写包括：泛素：Ub；去泛素化酶：DUB；DUB接合基序，其可与去泛素化酶(DUB)结合：DEM(第二结合结构域)；连接体：LINK；目标多肽，其可以是感兴趣的泛素化(Ub)蛋白质：TAR；和TAR接合基序，其可与感兴趣的泛素化(Ub)蛋白质结合：TEM(第一结合区)。
图1A、图1B、图1C、图1D和图1E是本文提供的嵌合分子的不同实施方式的示例，具有与感兴趣的泛素化蛋白质结合的第一结合结构域、连接体、和与去泛素化酶(DUB)结合的第二结合结构域。图1A示例了本文提供的直接与去泛素化酶和感兴趣的泛素化蛋白质两者结合的嵌合分子的实施方式。图1B示例了本文提供的直接与去泛素化酶结合并间接与感兴趣的泛素化蛋白质结合的嵌合分子的实施方式。图1C示例了本文提供的间接与去泛素化酶结合并直接与感兴趣的泛素化蛋白质结合的嵌合分子的实施方式。图1D示例了本文提供的嵌合分子的实施方式，其中嵌合分子具有刚性连接体并直接与去泛素化酶和感兴趣的泛素化蛋白质两者结合。图1E示例了本文提供的嵌合分子的实施方式，其中嵌合分子具有柔性连接体并直接与去泛素化酶和感兴趣的泛素化蛋白质两者结合。
图2是本文提供的嵌合分子的实施方式的示例，其具有与DUB酶结合的DUB接合基序(DEM)、柔性连接体(LINK)、和与感兴趣的泛素化(Ub)蛋白质结合的TAR接合基序(TEM)。
图3是在细胞的外部和内部且处于细胞内不同活动阶段的本文提供的嵌合分子的实施方式的示例。阶段#1的嵌合分子是未结合的且在细胞外部。阶段#2的嵌合分子已进入细胞并已经与细胞DUB酶结合。阶段#3的嵌合分子在细胞内部并已与细胞DUB酶和感兴趣的泛素化蛋白质两者结合。阶段#4的嵌合分子在细胞内，已与细胞DUB酶和感兴趣的泛素化蛋白质两者结合，并且细胞DUB酶已将一个或多个泛素分子(Ub)从泛素化蛋白质去除。然后嵌合分子再循环以结合其它细胞DUB酶和感兴趣的泛素化蛋白质。
图4是本文提供的嵌合分子的实施方式的示例，其通过小分子接合DUB酶并通过小分子接合目标蛋白。形成复合物后，DUB酶剪掉目标蛋白携带的Ub链的部分，从而延长目标蛋白的寿命。
图5是本文提供的嵌合分子的实施方式的示例，其通过DUB接合基序接合DUB酶并通过RITATAR接合基序接合目标泛素化(Ub)p53蛋白。形成复合物后，DUB酶剪掉p53目标蛋白携带的Ub链，从而延长p53目标蛋白在癌细胞中的寿命并促进癌细胞的细胞凋亡。
图6是将本文提供的嵌合分子与其它分子组合施用于癌症患者的实施方式的示例。可施用可充当本文提供的嵌合分子中的TAR接合基序(图5)的RITA分子来阻断癌细胞中来自其E3连接酶之一(即MDM2)的p53的泛素化，并促进癌细胞的细胞凋亡。
应当理解，为了示例的简单和清楚起见，图中所示的元件不一定按比例绘制。例如，为了清楚起见，一些元件的尺寸相对于其它元件可能是被夸大的。
具体实施方式
在以下详细描述中，阐述了许多具体细节以提供对嵌合分子的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本文所述的嵌合分子。在其它情况下，并未详细描述公知的方法、程序和组分以免使本文所述的嵌合分子不够清楚。
泛素(Ub)是一种高度保守的球状76残基真核蛋白，发现于细胞质和细胞核中。泛素以单体和以异肽连接的聚合物(被称为多聚泛素链)两者存在。
泛素可通过催化泛素转移至底物的三种酶的顺序作用共价地连接至多肽底物上的赖氨酸残基：泛素活化酶(E1)；泛素缀合酶(E2)；和泛素连接酶(E3)。人类基因组编码2种E1、37种E2、和>600种E3泛素连接酶。泛素含有7个赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)，连同其N末端甲硫氨酸(Met1)可充当次级连接点以形成具有不同结构和功能的多种多聚泛素链。泛素化通常被认为是靶向胞质溶胶蛋白质用以通过蛋白酶体降解。相比之下，膜蛋白的泛素化可导致更细微的结果，包括调控蛋白质运输/分选、稳定性、和/或功能。
与目标缀合的多聚泛素链的类型和数量受到高度调控，以产生影响不同生理过程的不同信号。这种多功能性源于这样的事实，即不仅目标可被单泛素化或多聚泛素化，而且还形成了不同类型的多聚泛素链。
所有已知Ub链的解析结构都是独特的，强烈地表明了每个键的形成和水解都是由特定的一组缀合酶和DUB催化的。最近，已鉴定出新型Ub链并且这些链包括具有异质键的不可降解的“支”链。泛素化与遗传性障碍，如囊性纤维化、心律失常、癫痫和神经性疼痛，以及传染病有关，导致多种病毒和细菌病原体的病原性生命周期。
存活靶向性嵌合(SURTAC)分子
本文提供了合成的多结构域的多功能嵌合分子，其被精心设计以允许外部操纵细胞蛋白质水平。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子经设计和靶向，以从细胞内特定的预定的蛋白质群中去除一个或多个泛素分子。
在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子能够募集细胞去泛素化酶(DUB)并特异性结合由一个或多个泛素(Ub)分子标记(labeled)或标记(tagged)的目标蛋白。本文提供的嵌合分子与DUB或泛素化蛋白质之间的结合可以是直接的或间接的。间接结合可通过一个中间分子，或通过一系列或一连串中间分子。在一个实施方式中，效应去泛素化酶和泛素化蛋白质底物两者的双重结合导致一个或多个泛素分子从蛋白质底物切割(cleaving，裂解)。
在一些实施方式中，切割(裂解，cleavage)包括Ub-Ub键的切割。在一些实施方式中，切割包括Ub-蛋白质键的切割。在一些实施方式中，切割包括与Ub-蛋白质键的切割相比增强的Ub-Ub键切割。
在一个实施方式中，泛素(一个或多个)从蛋白质底物的去除可以是部分的，即与本文提供的嵌合分子分离的蛋白质，其Ub链比它们所结合的Ub链短。在另一个实施方式中，泛素(一个或多个)的去除可以是完全的，即与本文提供的嵌合分子分离的蛋白质不含任何Ub分子。在任一种情况下，所产生的部分或完全去泛素化蛋白质经历UPS相关蛋白质降解的倾向性，如果不是无效的话，也都会大大降低。
贯穿本文附图和说明书使用的缩写包括以下：泛素：Ub；去泛素化酶：DUB；DUB接合基序，其可与去泛素化酶(DUB)结合：DEM；连接体：LINK；目标多肽，其可以是感兴趣的泛素化(Ub)蛋白质：TAR；和TAR接合基序，其可与感兴趣的泛素化(Ub)蛋白质结合：TEM。
技术人员将理解本文所述的第一结合结构域包括TAR接合基序(TEM)，其中在某些实施方式中，术语“第一结合结构域”和“TEM”可互换使用，具有相同的含义和性质。此外，技术人员将理解本文所述的第二结合结构域包括DUB接合基序(DEM)，其中在某些实施方式中，术语“第二结合结构域”和“DEM”可互换使用，具有相同的含义和性质。
图4示例了使用本文提供的SURTAC分子的实施方式，其中嵌合分子包含与其各自目标，即DUB酶和泛素化蛋白质结合的两个非抑制性小分子，从而允许DUB酶使泛素化蛋白质部分地去泛素化。在一些实施方式中，包含第一结合结构域(TAR接合基序(TEM))，其在一些实施方式中可以是非抑制性小分子；和第二结合结构域(DUB接合基序(DEM))，其在某些实施方式中可以是非抑制性小分子的嵌合分子结合其各自目标，即DUB酶和泛素化蛋白质，从而允许DUB酶使泛素化蛋白质部分地去泛素化。
为了实现它们指定的活性，本文提供的嵌合分子经过精心设计。首先，使它们的尺寸保持最小，以允许容易制造和优异的细胞膜渗透性。其次，本文提供的嵌合分子必须同时靶向至少两种天然存在的细胞蛋白质，一种是泛素化蛋白质，另一种是能够使泛素化蛋白质部分或完全地去泛素化的DUB酶。为了允许同时结合两种不同的目标蛋白，本文提供的嵌合分子具有两个不同的结合结构域，各自靶向不同的目标蛋白。第三，为了使DUB酶对泛素化蛋白质发挥其作用，两个结合结构域在空间上排列成使酶和蛋白质足够接近。
在一些实施方式中，泛素化目标多肽是胞质的。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是膜结合多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是细胞表面多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽与细胞表面多肽关联。
在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子可用于体内和离体两者的治疗和研究。本文提供的嵌合分子的应用的非限制性实例是减少患病细胞中功能性或部分功能性蛋白质的不希望的(如果不是取消的话)降解，其中这种降解加重细胞的或携带这些细胞的患者的状况。
癌细胞已经发展出多种机制来中和功能性肿瘤抑制蛋白。最简单且最有效的策略之一是通过用Ub分子标记蛋白质来破坏功能性肿瘤抑制蛋白。因此，许多癌症的病因涉及功能性肿瘤抑制蛋白(如p53)的不希望的降解。诸如人***瘤病毒16和18等病毒也使用相同的机制来防止受感染的细胞发生细胞凋亡。因此，在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子可用于减少功能蛋白，例如肿瘤抑制蛋白的UPS相关的降解。
虽然在肿瘤抑制蛋白的情况下，功能蛋白被标记用于疾病促进剂的降解，但在某些情况下，防止有部分功能(partly-functional)的蛋白质的降解是有益的，例如在细胞无法获得功能完全的蛋白质的情况下。在一些实施方式中，防止有部分功能的蛋白质的降解对患有疾病或状况的对象可以是有益的，其中防止降解减缓或停止疾病或状况的进展。在一些实施方式中，减少有部分功能的蛋白质的降解对患有疾病或状况的对象可以是有益的，其中防止降解减缓或停止疾病或状况的进展。有部分功能的蛋白质的非限制性实例包括囊性纤维化受体通道(CFTR通道)多肽)，其中野生型CFTR多肽是不可用的。
蛋白质可能会错折叠，但不一定会失去其所有活性。然而，此类蛋白质会被细胞迅速破坏。与蛋白质错折叠相关的疾病是由有部分功能的蛋白质的不希望但自然的降解引起的。囊性纤维化中最常见的突变是第508位处单个残基苯丙氨酸的缺失。DF508突变体(被称为ΔF508)在ER中被识别为错折叠并被蛋白酶体降解，但与野生型功能完全的蛋白质相比保留了显著的功能。因此，在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子可用于减少有部分功能的蛋白质，例如，错折叠的蛋白质的UPS相关的降解。
本文提供的嵌合分子的应用的另一个非限制性实例是在基础细胞研究中。通过将本文提供的嵌合分子引入培养的细胞，可人为地提高感兴趣的蛋白质的细胞水平。这种操纵在例如阐明细胞对蛋白质的升高水平的响应，或在阐明蛋白质所参与的信号转导途径方面是有用的。因此，在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子可用于提高天然细胞蛋白质的细胞水平。
蛋白质的泛素化在至少四个关键方面影响蛋白质。首先，泛素化可对蛋白质标记以通过蛋白酶体降解。其次，泛素化可改变蛋白质的细胞定位。第三，泛素化会影响蛋白质的活性。第四，泛素化可调节，例如促进或抑制蛋白质相互作用。因此，本文提供的嵌合分子，通过对连接至感兴趣的蛋白质的泛素分子的数量进行操纵(例如减少)，可用于干扰、调节或控制细胞蛋白质的这些关键方面。
存活靶向性嵌合(SURTAC)分子的结构
本文提供的嵌合分子的一般结构包含至少第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域，其中这些结构域中的每一个都是本文详细描述的嵌合分子的物理区域，各自具有独特的结构和/或功能。在附图(参见例如图1A-图1E、图2、图3和图5)中，为了便于识别，所提供的嵌合分子的一般结构显示为包含至少式DEM-LINK-TEM，其中DEM、LINK和TEM中的每一个是本文详细描述的嵌合分子的物理区域，各自具有独特的结构和/或功能。
在一个实施方式中，第一结合结构域的功能是，例如当在细胞内时，结合泛素化蛋白质。在一个实施方式中，第二结合结构域的功能是，例如当在细胞内时，结合去泛素化酶(DUB)或能够切割(a)泛素、(b)泛素与其底物蛋白之间的键、和/或同一泛素链中泛素分子之间的键的任何其它蛋白质或酶。在一个实施方式中，连接体结构域的功能是以共价或其它方式将第一结合结构域连接至第二结合结构域。本领域技术人员将理解，构成“细胞内”的环境可在任何容器，例如无菌一次性实验室管中部分或完全地离体重构。本文提供的嵌合分子的某些实施方式的非限制性实例呈现在图1A、图1B、图1C、图1D、图IE和图2中。
本领域技术人员将理解，本文提供的嵌合分子可包含多个第一结合结构域、多个第二结合结构域、多个连接体结构域、或其任何组合。
技术人员将理解，通篇使用的术语“基序”在一些实施方式中可与术语“结构域”互换使用，具有所有相同的性质和度量(measures)。术语“结构域”的使用绝不意味着推断或限制嵌合分子的特定区域是肽或多肽。
在一些实施方式中，“结构域”包括小分子或其活性部分。在一些实施方式中，“结构域”包括肽。在一些实施方式中，“结构域”包括多肽或其部分。在一些实施方式中，“结构域”包括蛋白质或其活性部分。
技术人员将认识到第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域涵盖本文所述嵌合分子的离散区域，并且可通过如本文所公开的它们的物理和功能特性来区别地识别。
在一些实施方式中，DUB接合基序负责募集(例如以特异性方式识别和结合)去泛素化酶。为了在本文提供的嵌合分子和去泛素化酶之间建立连接，DUB接合基序包含与去泛素化酶特异性结合的结合位点。DEM结合位点所靶向的去泛素化酶可以是任何去泛素化酶，或任何定义的去泛素化酶的亚类。结合位点可包括特异性识别去泛素化酶(一种或多种)的分子，如抗体或其片段。
如本文所述，第一结合结构域和第二结合结构域在空间上排列成使DUB和泛素化蛋白质足够接近，以允许DUB对所结合的泛素化蛋白质发挥其作用。由于DUB和泛素化蛋白质的尺寸和体积不同，因此在设计本文提供的嵌合分子的具体实施方式时，解决了第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域彼此之间的相对取向。总体上，本文提供的嵌合分子，具体是这三个结构域的相对取向被配置以允许由第二结合结构域结合的DUB使由第一结合结构域结合的泛素化蛋白质去泛素化。本领域技术人员将理解，本文提供的功能分子是允许被第二结合结构域结合的DUB使被第一结合结构域结合的泛素化蛋白质去泛素化的功能分子。
在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子被设计成特异性结合各种细胞蛋白质，例如泛素蛋白酶和泛素化蛋白质。在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子与细胞内蛋白质结合。在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子与胞外蛋白质结合。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子与泛素化蛋白质结合。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子与泛素蛋白酶结合。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子与泛素化蛋白质和泛素蛋白酶两者结合。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子与泛素化蛋白质、泛素蛋白酶、或泛素化蛋白质和泛素蛋白酶两者结合。本文提供的嵌合分子的一个实施方式的非限制性实例呈现在图3中，其中嵌合分子进入细胞，结合泛素化蛋白质和泛素蛋白酶，并释放去泛素化蛋白质。
在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化过程中和/或之后不抑制泛素化蛋白质的活性和/或泛素蛋白酶的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化过程中和之后不抑制泛素化蛋白质的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化过程中和之后不抑制泛素蛋白酶的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化过程中和之后不抑制泛素化蛋白质的活性和泛素蛋白酶的活性。
在其它实施方式中，本文提供的嵌合分子抑制泛素化蛋白质的活性和/或泛素蛋白酶的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化过程中和/或之后抑制泛素化蛋白质的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子抑制泛素蛋白酶的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子在去泛素化之前和/或之后部分地抑制泛素化蛋白质的活性。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子部分地抑制泛素蛋白酶的活性。
在某些情况下，其中嵌合分子部分或完全抑制泛素蛋白酶活性和/或部分或完全抑制泛素化蛋白质的活性，但嵌合分子的使用仍可以是有益的。例如，在某些实施方式中，嵌合分子可将DUB和Ub-蛋白质带入功能范围内，而与其对DUB活性或Ub-蛋白质活性的影响无关。在某些实施方式中，嵌合分子将被移位，并且DUB将处于适当的位置以使Ub分子从Ub-蛋白质切割。因此，嵌合分子的使用将有效地维持或提高Ub-蛋白质的预期半衰期。
在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子具有穿透膜，尤其是细胞膜的固有能力。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子不靶向任何特定细胞群。然而，混杂的细胞在体内，尤其是在全身施用期间可能存在问题。因此，在另一个实施方式中，本文提供的嵌合分子可进一步包含特异性靶向由所限定的细胞群呈递的目标抗原(一种或多种)的第三结合结构域。第三结合结构域可包括特异性识别细胞呈递的抗原的分子，如抗体或其片段。在可选方案中，第三结合结构域可包括被细胞呈递的抗原特异性识别的分子，如细胞呈递的抗原的配体。在可选方案中，第三结合结构域可包括被细胞呈递的抗原特异性识别的分子，如适配体。本领域技术人员将理解，由于第三结合结构域在细胞外结合细胞呈递的抗原，因此在无另外步骤的情况下其在结合后不与细胞呈递的抗原共价连接。不受任何理论或机制的束缚，假设第三结合结构域与细胞呈递的抗原瞬时结合，至少持续最短的时间以允许与细胞呈递的抗原结合的本文提供的嵌合分子进入细胞。本领域技术人员将理解，许多细胞类型特异性抗原是已知的，如肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原，每年鉴定出的更多。
在另一实施方式中，本文提供的嵌合分子穿透膜，例如细胞膜的固有能力，可通过进一步包含细胞膜穿透标签来加强。虽然在体外使用本文提供的嵌合分子时细胞渗透可能不是问题，但当通常在研究分离的细胞或几层细胞时，在体内，尤其在靶向多层组织或器官，如肝脏或胰腺时，或在实体瘤的情况下，细胞进入可能存在问题。因此，本文提供的嵌合分子可进一步包含细胞穿透标签，其提高本文提供的嵌合分子的细胞穿透或膜穿透倾向性。不受任何理论或机制的束缚，假设细胞穿透标签与细胞的膜瞬时相互作用，至少持续最短时间以允许本文提供的嵌合分子进入细胞。本领域技术人员将理解，许多细胞穿透标签是已知的，如细胞穿透肽(CPP)，每年鉴定出的更多。细胞穿透标签，如细胞穿透肽(CPP)，可以是促进细胞摄入/摄取各种分子的短肽。本文提供的嵌合分子可通过共价键的化学连接或通过非共价相互作用与CPP关联。
技术人员将理解，靶向细胞表面上的蛋白质的DUB减少或消除了本文所述嵌合分子进入细胞的需要。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是胞质的。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是膜结合多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是细胞表面多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽与细胞表面多肽关联。
由于本文提供的嵌合分子是合成的，即在自然界中未发现，因此本领域技术人员将理解本文提供的嵌合分子可通过例如蛋白质合成和有机化学领域中任何已知的方法产生。因此，本文提供的嵌合分子可在体外产生，并且在可选方案中，可在体内产生。虽然本文提供的嵌合分子可完全或部分由氨基酸制成，例如可以是肽或蛋白质，但本文提供的嵌合分子可由编码本文提供的嵌合分子的核酸序列产生，如mRNA、单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)。
结合结构域
在一个实施方式中，第一结合结构域负责募集(例如以特异性方式识别和结合)泛素化蛋白质。第一结合结构域所靶向的泛素化蛋白质可以是任何泛素化蛋白质，或任何定义的泛素化蛋白质的亚类。在一个实施方式中，第一结合结构域包含与泛素化蛋白质特异性结合的结合位点。例如，此类结合位点可包含特异性识别泛素化蛋白质(一种或多种)的分子，如抗体或其片段。在可选方案中，结合位点可包含被泛素化蛋白质(一种或多种)特异性识别的分子，如泛素化蛋白质(一种或多种)的配体。在一些实施方式中，结合位点可包含被泛素化蛋白质(一种或多种)特异性识别的分子，如适配体。本领域技术人员将理解，由于第一结合结构域在细胞内结合泛素化蛋白质(一种或多种)，因此在无另外步骤的情况下其在结合后不与泛素化蛋白质(一种或多种)共价连接。不受任何理论或机制的束缚，假设第一结合结构域与泛素化蛋白质(一种或多种)瞬时结合，至少持续最短时间以允许被第二结合结构域结合的去泛素化酶(一种或多种)执行它们的对如本文所述所结合的泛素化蛋白质(一种或多种)的活性。
在另一个实施方式中，第一结合结构域可直接和特异性结合中间分子，该中间分子直接和特异性结合目标泛素化蛋白质。因此，在一些实施方式中，由于第一结合结构域特异性结合中间分子，并且中间分子特异性结合泛素化蛋白质，所以第一结合结构域间接但特异性结合泛素化蛋白质。在可选方案中，可在第一结合结构域和泛素化蛋白质之间采用多于一个的中间分子，因此第一结合结构域再次间接但特异性地结合泛素化蛋白质。在某些实施方式中，与泛素化蛋白质结合的中间分子包括与泛素化蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，与泛素化蛋白质结合的中间分子包括泛素化蛋白质的配体。在某些实施方式中，与泛素化蛋白质结合的中间分子包括与泛素化蛋白质结合的适配体。
在一些实施方式中，泛素化目标多肽是胞质多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是膜结合多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽是细胞表面多肽。在一些实施方式中，泛素化目标多肽与细胞表面多肽关联。
本文提供的嵌合分子的一个实施方式的非限制性实例呈现在图1B中，其中第一结合结构域直接与中间分子结合并且中间分子直接与感兴趣的泛素化蛋白质结合。如本领域技术人员将理解的，当组分“A”特异性结合组分“B”，并且当组分“B”特异性结合组分“C”时，则组分“A”特异性与组分“C”结合。“中间分子”是与至少两个其它分子特异性结合的分子。
如本领域技术人员将理解的，本文提供的分子可结合它们的目标，对它们的目标发挥作用，然后释放它们的目标。在某些实施方式中，第一结合结构域瞬时与泛素化蛋白质结合并在一个或多个泛素分子从泛素化蛋白质去除后与蛋白质解离。在某些实施方式中，第一结合结构域仅识别处于其泛素化状态的泛素化蛋白质，而不识别处于其去泛素化状态的同一蛋白质(例如，当从泛素化蛋白质去除泛素分子的全部或一些时)。
在一个实施方式中，第二结合结构域负责募集(例如以特异性方式识别和结合)去泛素化酶(DUB)。第二结合结构域所靶向的DUB可以是任何去泛素化酶，或任何定义的DUB的亚类。在一个实施方式中，第二结合结构域包含与DUB特异性结合的结合位点。例如，此类结合位点可包含特异性识别DUB的分子，如抗体或其片段。在可选方案中，结合位点可包含被DUB特异性识别的分子，如DUB的配体。在一些实施方式中，结合位点可包含被DUB特异性识别的分子，如适配体。本领域技术人员将理解，由于第二结合结构域在细胞内结合DUB，因此在无另外步骤的情况下其在结合后不与DUB共价连接。不受任何理论或机制的束缚，假设第二结合结构域与DUB瞬时结合，至少持续最短时间以允许被第二结合结构域结合的去泛素化酶(一种或多种)执行它们的对如本文所述所结合的泛素化蛋白质(一种或多种)的活性。
在另一个实施方式中，第二结合结构域可直接且特异性与中间分子结合，该中间分子直接且特异性与DUB结合。因此，在一些实施方式中，由于第二结合结构域与中间分子特异性结合，并且中间分子与DUB特异性结合，所以第二结合结构域间接但特异性地与DUB结合。在可选方案中，可在第二结合结构域和DUB之间使用多于一个的中间分子，因此第二结合结构域再次间接但特异性地与DUB结合。在某些实施方式中，与泛素蛋白酶结合的中间分子包括与泛素蛋白酶结合的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，与泛素蛋白酶结合的中间分子包括泛素蛋白酶的配体。在某些实施方式中，与泛素蛋白酶结合的中间分子包括适配体。本文提供的嵌合分子的一个实施方式的非限制性实例在图1C中呈现，其中第二结合结构域与中间分子直接结合并且中间分子与泛素蛋白酶直接结合。
在某些实施方式中，第二结合结构域与泛素蛋白酶瞬时结合并在泛素化蛋白质被去泛素化时，例如在一个或多个泛素分子从泛素化蛋白质去除时与泛素蛋白酶解离。在某些实施方式中，第二结合结构域不可逆地与泛素蛋白酶结合并在泛素化蛋白质被去泛素化时不与泛素蛋白酶解离。在某些实施方式中，第二结合结构域与将泛素从泛素化蛋白质切割的任何泛素蛋白酶结合。在某些实施方式中，第二结合结构域与将泛素从被第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割的泛素蛋白酶结合。在某些实施方式中，在泛素蛋白酶和泛素化蛋白质两者都未被本文提供的嵌合分子结合时，第二结合结构域与将泛素从被第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割的泛素蛋白酶结合。在某些实施方式中，仅在泛素蛋白酶和泛素化蛋白质两者都被本文所述的嵌合分子结合时，第二结合结构域与将泛素从被第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割的泛素蛋白酶结合。
在某些实施方式中，第一或第二结合结构域可以是小分子。在一个实施方式中，小分子是有机化合物。在一个实施方式中，小分子横跨其最长轴具有0.1nm至10nm之间的尺寸。在另一个实施方式中，小分子横跨其最长轴具有0.5nm至5nm之间的尺寸。在一个实施方式中，小分子具有1道尔顿上至1000道尔顿的重量。在另一个实施方式中，小分子具有1道尔顿上至500道尔顿的重量。在另一个实施方式中，小分子具有1道尔顿上至100道尔顿的重量。
去泛素化酶
去泛素化酶(DUB)是特化的异肽酶，通过修正和去除泛素链为泛素信号传导提供显著性(特征，salience)。有超过100种人DUB，包括6个不同的家族：1)泛素特异性蛋白酶(USP)家族，2)卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族，3)泛素C末端水解酶(UCH)家族，4)Josephin结构域家族(Josephin)，5)与含有泛素的新型DUB家族相互作用的基序(MINDY)，以及6)JABl/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)。要注意的是，USP家族相对混杂，水解所有泛素键，与OTU家族形成鲜明对比，OTU家族包括键偏好不同的一组不同的酶。键特异性DUB已被纯化并用于无细胞体外测定。
为了使去泛素化酶(DUB)对泛素化蛋白质(一种或多种)执行其活性，它们包含至少一个催化结构域。催化结构域是与连接至目标蛋白的泛素接触并将其从目标蛋白去除的结构域。在一个实施方式中，DUB的催化单元对所有泛素键类型都具有选择性。在另一个实施方式中，催化单元对特异性泛素键类型具有选择性。
在一个实施方式中，DUB包含催化结构域或其它结构域，如泛素特异性蛋白酶(DUSP)结构域；泛素样(UBL)结构域；甲基多巴和TRAF同源物(MATH)结构域；锌指泛素特异性蛋白酶(ZnF-UBP)结构域；锌指髓样神经和DEAF1(ZnF-MYND)结构域；泛素相关(UBA)结构域；CHORD-SGT1(CS)结构域；微管互作和运输(MIT)结构域；硫氰酸酶样结构域；TBC/RABGAP结构域；或B-框结构域。
在一个实施方式中，由本文提供的嵌合分子的第二结构域结合的DUB可以是来自泛素特异性蛋白酶(USP)家族、卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族、泛素C末端水解酶(UCH)家族、Josephin结构域家族(Josephin)、与含有泛素的新型DUB家族互作的基序(MINDY)、或JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)的DUB。
在一些实施方式中，DUB包含作为较大复合物的部分的去泛素化酶。在一些实施方式中，DUB包含其中存在去泛素化酶的较大复合物。在一些实施方式中，DUB包含其中存在去泛素化酶的较大复合物的组分中的一些。在一些实施方式中，DUB包含其中存在去泛素化酶的较大复合物的组分中的至少一种。在一些实施方式中，DUB包含去泛素化酶的催化亚基。在一些实施方式中，DUB包含去泛素化酶的催化亚基的催化活性片段。
在一些实施方式中，DUB包含提供混杂的蛋白酶活性的去泛素化酶。在一些实施方式中，DUB包含提供特异性键切割的去泛素化酶。
泛素化蛋白质
在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子被设计为使任何泛素化蛋白质紧邻(inclose proximity to)去泛素化酶(DUB)，使得去泛素化酶可将一个或多个泛素分子从泛素化蛋白质去除。在某些实施方式中，泛素化蛋白质携带单泛素分子。在某些实施方式中，泛素化蛋白质在与上述嵌合分子结合后携带单泛素分子。在某些实施方式中，泛素化蛋白质携带多聚泛素链。在某些实施方式中，泛素化蛋白质在与上述嵌合分子结合后携带多聚泛素链。在某些实施方式中，多聚泛素链包含至少2个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含至少4个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含至少6个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含至少8个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含至少10个泛素分子。
在某些实施方式中，多聚泛素链包含2-50个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含4-45个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含6-40个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含8-35个泛素分子。在某些实施方式中，多聚泛素链包含10-30个泛素分子。
在一个实施方式中，当DUB的催化单元对所有泛素键类型都具有选择性时，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质将包括具有所有种类泛素键类型的所有种类的泛素化蛋白质。在另一个实施方式中，当DUB的催化单元对特定泛素键类型具有选择性时，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质将仅包括具有某些种类的泛素键类型的某些种类的泛素化蛋白质。
在另一个实施方式中，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质可以是DUB的非天然目标，例如未知晓是DUB的底物的蛋白质。因此，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质可以是目前已知的DUB底物列表之外的蛋白质。这可能是由于这样的事实：某些DUB，例如USP5已被认为更多地作用于泛素-泛素键而不是泛素-目标蛋白键，使得具有一个或多个泛素-泛素键的任何蛋白质都可以是本文提供的嵌合分子的目标蛋白。
在一个实施方式中，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质可与泛素蛋白酶USP5相互作用。此类泛素化蛋白质的实例包括但不限于CACNA1H(电压依赖性T型钙通道亚基α-1H)、FOXM1(叉头框蛋白M1(Forkhead box protein M1))、MAF(转录因子Maf)、SMURF1(E3泛素-蛋白连接酶SMURF1)、或TRIML1(三重基序家族样蛋白1)。
在一个实施方式中，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质可与泛素蛋白酶USP7相互作用。此类泛素化蛋白质的实例包括但不限于UVSSA(UV刺激的支架蛋白A(UV-stimulated scarffold protein A))、XPC(C组着色性干皮病互补蛋白(Xerodermapigmentosum group C-complementing protein))、ABL1(Abelson酪氨酸-蛋白激酶1)、AR(雄激素受体)、ATXN1(共济失调蛋白-1)、CHEK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1)、CHFR(E3泛素-蛋白连接酶CHFR)、CLSPN(Claspin)、CSNK2A1(酪蛋白激酶II亚基α)、DAXX(死亡结构域相关蛋白6)、DNMT1(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1)、FOXO1(叉头框蛋白O1)、FOXO4(叉头框蛋白O4)、GMPS(GMP合成酶)、IFNAR1(I型干扰素受体1)、IKBKG(I-κ-B激酶亚基γ)、KAT5(组蛋白乙酰转移酶KAT5)、KDM1A(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A)、MARCHF7(膜相关环-CH-型指7(Membrane Associated Ring-CH-Type Finger 7))、MDM2(E3泛素-蛋白连接酶Mdm2)、MDM4(Mdm2样p53结合蛋白)、MEX3C(RNA结合E3泛素-蛋白连接酶MEX3C)、MYC(MyC原癌基因蛋白)、MYD88(髓样分化初级反应蛋白MyD88)、PML(早幼粒细胞白血病蛋白)、POLH(DNA聚合酶θ)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、PTEN(磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶)、RAD18(E3泛素-蛋白连接酶RAD18)、RARA(视黄酸受体α)、RB1(视网膜母细胞瘤相关蛋白)、RELA(转录因子p65)、RNF168(E3泛素-蛋白连接酶RNF168)、RNF220(E泛素-蛋白连接酶RNF220)、SKP1(S期激酶相关蛋白1)、TP53(细胞肿瘤抗原p53)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、TRIP12(E3泛素-蛋白连接酶TRIP12)、或TRRAP(转化/转录结构域相关蛋白)。
在一个实施方式中，被本文提供的嵌合分子结合的泛素化蛋白质可与泛素蛋白酶USP10相互作用。此类泛素化蛋白质的实例包括但不限于AR(雄激素受体)、ATM(丝氨酸-蛋白激酶ATM)、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)、EIF4G1(真核翻译起始因子4γ1)、MSH2(DNA错配修复蛋白Msh2)、PRKAA1(5'-AMP活化蛋白激酶催化亚基α-1)、PTEN(磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog))、或TBX21(T-框转录因子TBX21)。
在一些实施方式中，与本文所述的嵌合分子结合的泛素化蛋白质是与同一嵌合分子结合的泛素蛋白酶的已知目标，例如，已知泛素化蛋白质是DUB的底物。在一些实施方式中，与本文描述的嵌合分子结合的泛素化蛋白质是与同一嵌合分子结合的泛素蛋白酶的非天然目标，例如但不限于未知晓泛素化蛋白质是DUB的底物。
在另一个实施方式中，泛素化蛋白质是包括USP5、或USP7、或USP10的泛素蛋白酶的已知目标。在另一个实施方式中，泛素化蛋白质是泛素蛋白酶的非天然目标，例如但不限于其中未知晓泛素化蛋白质是USP5、或USP7、或USP10的底物。
连接体结构域
第一和/或第二结合结构域可直接、间接、共价、非共价、刚性和/或柔性地连接至连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过刚性共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过柔性共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过刚性非共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过非共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，结合结构域可直接通过柔性非共价键连接到连接体结构域。在一些实施方式中，一个结合结构域可通过共价键连接到连接体结构域，而第二个结合结构域可通过非共价键连接。
技术人员将理解，连接体结构域必须足够柔性以成功地使DUB和所靶向的泛素化蛋白质有效地在一起。在一些实施方式中，连接体结构域包括刚性足以防止过多运动和熵问题的连接体。在一些实施方式中，连接体结构域的长度包括使DUB和所靶向的泛素化蛋白质有效地在一起的长度。在一些实施方式中，连接体结构域的柔性与长度的组合使DUB和所靶向的泛素化蛋白质有效地在一起。技术人员将理解连接体结构域因此在尺寸和柔性方面都应该是有效的。
在一个实施方式中，连接体结构域负责连接第一结合结构域与第二结合结构域。本领域技术人员将理解，第一结合结构域和第二结合结构域之间的连接可以多种方式实现。例如，连接可以是共价的或非共价的。本领域技术人员将理解，连接体结构域可以是第一结合结构域和第二结合结构域之间的直接共价键。在一个实施方式中，共价键包括第一结合结构域和第二结合结构域中的原子之间，直接或间接通过一系列原子和共价键的简单的单、双或三共价键。在一个实施方式中，非共价键包括所有形式的非共价分子间相互作用，包括但不限于静电相互作用、氢键相互作用、范德华力、疏水相互作用和亲水相互作用。
在某些实施方式中，连接体结构域是单个氨基酸。在某些实施方式中，连接体结构域包括肽。在某些实施方式中，肽包含2-50个氨基酸。在某些实施方式中，肽包含4-10个氨基酸。在一些实施方式中，肽包含4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方式中，肽包含11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。
在某些实施方式中，连接体结构域包括小分子。在某些实施方式中，小分子是有机化合物。在某些实施方式中，小分子是合成的非天然存在的化合物。在一个实施方式中，连接体结构域可以是尺寸为10nm或更小、上至1,000道尔顿的低分子量有机小分子。在另一个实施方式中，连接体结构域可以是短肽，含有例如大约100个或更少的氨基酸。
在某些实施方式中，连接体结构域被配置以将泛素蛋白酶定位在泛素化蛋白质附近。如本领域技术人员将理解的，对于泛素蛋白酶使泛素化蛋白质去泛素化所必需的泛素蛋白酶与泛素化蛋白质之间的接近或距离将根据蛋白酶/蛋白质组合而变化。
在某些实施方式中，泛素蛋白酶到泛素化蛋白质的距离为
Figure BDA0003221578920000143
至
Figure BDA0003221578920000144
在某些实施方式中，泛素蛋白酶到泛素化蛋白质的距离为
Figure BDA0003221578920000151
或更小。在某些实施方式中，泛素蛋白酶到泛素化蛋白质的距离为
Figure BDA0003221578920000152
或更小。在某些实施方式中，泛素蛋白酶到泛素化蛋白质的距离为
Figure BDA0003221578920000153
或更小。在某些实施方式中，泛素蛋白酶到泛素化蛋白质的距离为
Figure BDA0003221578920000154
或更小。在某些实施方式中，泛素蛋白酶与泛素化蛋白质之间的距离使得泛素蛋白酶，尽管在两者都未被本文提供的嵌合分子结合时不使泛素化蛋白质去泛素化，但在两者都被本文提供的嵌合分子结合时使泛素化蛋白质去泛素化。
在一些实施方式中，连接体的长度在5与20个碳原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在2与18个碳原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在2与20个碳原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在5与10个原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在10与15个原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在15与20个原子之间。在一些实施方式中，连接体的长度在10与20个原子之间。在一些实施方式中，连接体为2个原子长、3个原子长、4个原子长、5个原子长、6个原子长、7个原子长、8个原子长、9个原子长、10个原子长、11个原子长、12个原子、13个原子长、14个原子长、15个原子长、16个原子长、17原子长、18个原子长、19个原子长、或20个原子长。
本领域普通技术人员将容易地认识到，本领域一般已知的各种连接体都可并入本文提供的嵌合分子中，例如，参见WO 2014/108452、WO 2011/008260等，其以它们的整体并入本文。此外，本领域普通技术人员还将认识到，双功能蛋白水解靶向嵌合(PROTAC)化合物中采用的各种连接体可并入本文提供的嵌合分子中，例如，参见WO 2016/197114、美国专利9,632,089、美国专利9,938,264等，其以它们的整体并入本文。
在一些实施方式中，连接体包括聚乙二醇。在一些实施方式中，连接体包括烷基。在一些实施方式中，连接体包括烯基。在一些实施方式中，连接体包括磷酸烷基酯。在一些实施方式中，连接体包括烷基硅氧烷。在一些实施方式中，连接体包括环氧基(epoxy)。在一些实施方式中，连接体包括酰卤。在一些实施方式中，连接体包括缩水甘油基。在一些实施方式中，连接体包括羧酸酯。在一些实施方式中，连接体包括酸酐。
在一些实施方式中，连接体包括被至少一个羧基部分取代的C1至C18亚烷基。在某些实施方式中，连接体可衍生自被至少一个羧基部分取代的C1至C18亚烷基。在某些实施方式中，连接体可衍生自链长介于2与18个碳原子之间的天然或合成来源的氨基酸(多肽)，或所述氨基酸的酰卤。此类氨基酸的非限制性实例是18-氨基十八烷酸和18-氨基硬脂酸。
在一些实施方式中，连接体包括链长介于2与18个碳原子之间的天然或合成来源的氨基酸(多肽)，或所述氨基酸的酰卤。在一些实施方式中，连接体包括链长为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个碳原子的天然或合成来源的氨基酸(多肽)，或所述氨基酸的酰卤。
在一些实施方式中，连接体包含C1至C18亚烷基。在一些实施方式中，此连接体可衍生自二卤代亚烷基。在一些实施方式中，连接体包含C1亚烷基、C2亚烷基、C3亚烷基、C4亚烷基、C5亚烷基、C6亚烷基、C7亚烷基、C8亚烷基、C9亚烷基、C10亚烷基、C11亚烷基、12亚烷基、C13亚烷基、C14亚烷基、15亚烷基、C16亚烷基、C17亚烷基、或C18亚烷基。
在一些实施方式中，连接体是衍生自4,4-联苯酚、二苯甲酸、二苯甲酸卤代基(dibenzoic halides)、二苯甲磺酸基(dibenzoic sulphonates)、对苯二甲酸、对苯二甲酸卤代基(tetrphthalic halides)、和对苯二甲酸磺酸基(terephthalic sulphonates)的非限制性实例的芳族基团。
如WO 2014/108452中所述并以其整体并入本文中，在一些实施方式中，连接体包含连接基团，该连接基团包含6-16个原子的长度，最短长度下具有式-(CH2)n-(R1CH2CH2)m(OCH2)qCONH-，n为0-6，m为2-10，q为0或1，每个R1独立地是-O-、-NH-、-N(Cl-3烷基)-，或含有2个N原子的4-6元杂环基，其通过环N原子与链中的碳相连(任选被氧基取代)。
在一些实施方式中，连接体包括(CH2)4(OCH2CH2)3OCH2ONH；(CH2)4(OCH2CH2)2OCH2CONH；(CH2)4(OCH2CH2)4OCH2CONH；(CH2)5N(CH3)CH2CH2(OCH2CH2)3CONH；(CH2)5N(CH3)CH2CH2(OCH2CH2)2CONH；(CH2)5
Figure BDA0003221578920000161
CH2CH2(OCH2CH2)2OCHCONH；(CH2)6(OCH2CH2)2OCH2CONH；或(CH2)4
Figure BDA0003221578920000162
CH2CH2OCH2CH2OCH2CONH。涉及这些连接结构域的WO 2014/108452的公开内容以整体并入本文。
如WO 2016/197114中所述并以其整体并入本文中，在一些实施方式中，连接体结构域包含基团，该基团包括一个或多个共价连接的A结构单元(例如-A1…Aq-)，其中q是大于或等于0的整数。在一些实施方式中，q是1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20、或1至10的整数。在某些实施方式中，A1至Aq各自独立地是键、CRL1RL2、O、S、SO、SO2、NRL3、SO2NRL3、SONRL3、CONRL3、NRL3CONRL4、NRL3SO2NRL4、CO、CRL1＝CRL2、C^C、SiRL1RL2、P(O)RL1、P(O)ORL1、NRL3C(＝NCN)NRL4、NRL3C(＝NCN)、NRL3C(＝CNO2)NRL4、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的C3-11环烷基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的C3-11杂环基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的芳基、任选地被0-6个RL1和/或RL2基团取代的杂芳基，其中RL1或RL2各自独立地可连接至其它A基团以形成可进一步被0-4个RL5基团取代的环烷基和/或杂环基部分；并且其中RL1、RL2、RL3、RL4和RL5各自独立地是H、卤基(halo)、C1-8烷基、OC1-8烷基、SC1-8烷基、NHC1-8烷基、N(C1-8烷基)2、C3-11环烷基、芳基、杂芳基、C3-11杂环基、OC1-8环烷基、SC1-8环烷基、NHC1-8环烷基、N(C1-8环烷基)2、N(C1-8环烷基)(C1-8烷基)、OH、NH2、SH、SO2C1-8烷基、P(O)(OC1-8烷基)(C1-8烷基)、P(O)(OC1-8烷基)2、CC-C1-8烷基、CCH、CH＝CH(C1-8烷基)、C(C1-8烷基)CH(C8烷基)、C(C8烷基)C(C8烷基)、Si(OH)3、Si(C1-8烷基)3、Si(OH)(C1-8烷基)2、COC1-8烷基、CO2H、卤素、CN、CF3、CHF2、CH2F、NO2、SF5、SO2NHC1-8烷基、SO2N(C1-8烷基)2、SONHC1-8烷基、SON(C1-8烷基)2、CONHC1-8烷基、CON(C1-8烷基)2、N(C1-8烷基)CONH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)CON(C1-8烷基)2、NHCONH(C1-8烷基)、NHCON(C1-8烷基)2、NHCONH2、N(C1-8烷基)SO2NH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)SO2N(C1-8烷基)2、NHSO2NH(C1-8烷基)、NHSO2N(C1-8烷基)2、或NHSO2NH2。
在另一个实施方式中，连接体结构域可包括任选地取代的(聚)乙二醇，其具有介于1与约100之间个乙二醇单元、介于约1与约50之间个乙二醇单元、介于1与约25之间个乙二醇单元、介于约1与10之间个乙二醇单元、介于1与约8之间个乙二醇单元和1与6个乙二醇单元、介于2与4之间个乙二醇单元，或被任选地取代的O、N、S、P或Si原子相互分散的(inter-dispersed)任选地取代的烷基。在某些实施方式中，连接体被芳基、苯基、苄基、烷基、亚烷基、或杂环基团取代。
在一些实施方式中，连接体结构域包括诸如聚乙二醇、芳族基团、烷基、烯基、磷酸烷基酯、烷基硅氧烷、环氧基、酰卤、缩水甘油基、羧酸酯、和酸酐的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有聚乙二醇的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有芳族基团的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有烷基的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有烯基的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有磷酸烷基酯的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有烷基硅氧烷的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有环氧基的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有酰卤的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有缩水甘油基的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有羧酸酯的结构。在一些实施方式中，连接体结构域包括含有酸酐的结构。
在一些实施方式中，连接体结构域可包括以下连接结构域中的一个：
Figure BDA0003221578920000171
Figure BDA0003221578920000181
在某些实施方式中，连接体单元中的每一个独立地是2-50个碳原子的取代或未取代的直链或支链烷基链、2-50个碳原子的磷酸烷基酯链、2-50个碳原子的烷基醚链(例如PEG、各种长度的PPG)或其任意组合。在一些实施方式中，连接体包括具有8个乙二醇单元的任选地取代的(聚)乙二醇。在另外的实施方式中，连接体包括具有11个乙二醇单元的任选地取代的(聚)乙二醇。在另外的实施方式中，连接体包括具有14个乙二醇单元的任选地取代的(聚)乙二醇。在另外的实施方式中，连接体包括具有17个乙二醇单元的任选地取代的(聚)乙二醇。
在某些实施方式中，连接体可以是不对称的。在某些实施方式中，连接体可以是对称的。
连接体与结合结构域的连接化学包括但不限于酯、酰胺、胺、酰肼、硫醇、砜、亚砜、醚、羟基酰胺、杂环、乙炔、烷基和烯烃。
嵌合分子的用途
本文提供的嵌合分子的设计和结构使其能够在所有应用中，在例如治疗或在研究中用作唯一的活性剂。当作为一线疗法单独使用时，本文提供的嵌合分子能够在DUB和泛素化蛋白质之间形成蛋白质复合物，这导致泛素化蛋白质携带的泛素分子数量减少。如本文总体上公开的，由于泛素化对细胞蛋白质的精细作用，本文提供的嵌合分子可用于影响多种细胞蛋白质和过程。本领域技术人员将理解，通过提供影响诸如泛素化的关键细胞调节器(regulator)的工具，基于当前科学知识设想到了许多应用，并且随着泛素化研究的进展，更多应用将变得显而易见。
在一些实施方式中，泛素化水平影响感兴趣的蛋白质在细胞中的半衰期。在一些实施方式中，泛素化水平影响感兴趣的蛋白质在细胞中的降解。在一些实施方式中，感兴趣的蛋白质在细胞中起调节作用。在一些实施方式中，感兴趣的蛋白质在细胞稳态中起调节作用。在一些实施方式中，感兴趣的蛋白质被认为是持家蛋白。
本文提供的嵌合分子的一种应用的非限制性实例是泛素化的蛋白质的去泛素化(例如将泛素分子中的全部或一些从蛋白质去除)。在一些实施方式中，去除泛素分子中的全部或一些维持或增加蛋白质的半衰期。在一些实施方式中，去除泛素分子中的全部或一些减少蛋白质的降解。在一些实施方式中，维持或增加蛋白质的半衰期为患有疾病或状况的对象提供益处。在一些实施方式中，减少蛋白质的降解增加蛋白质的半衰期。在一些实施方式中，防止蛋白质的降解增加蛋白质的半衰期。在一些实施方式中，减少蛋白质的降解维持蛋白质的半衰期。在一些实施方式中，防止蛋白质的降解维持蛋白质的半衰期。在一些实施方式中，减少蛋白质的降解为患有疾病或状况的对象提供益处。在某些实施方式中，益处可包括维持由蛋白质执行的一种或多种调节功能。
在本文提供的嵌合分子用于泛素化的蛋白质的去泛素化(例如将泛素分子中的全部或一些从蛋白质去除)的使用方法的一些实施方式中，该方法在体外发生。在本文提供的嵌合分子用于泛素化的蛋白质的去泛素化(例如将泛素分子中的全部或一些从蛋白质去除)的使用方法的一些实施方式中，该方法在体内发生。
在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括用于将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法，包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除。
在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法，其中所述方法是体外的。在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法，其中所述方法是体内的。
在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括用于防止或减少泛素化蛋白质降解的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而防止、减少、或改善泛素化蛋白质的降解。
在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括用于防止或减少泛素化蛋白质降解的方法，其中所述方法在体外。在一些实施方式中，本文所述嵌合分子的应用的非限制性实例包括用于防止或减少泛素化蛋白质降解的方法，其中所述方法在体内。
嵌合(SURTAC)分子及其组分已在上文详细描述。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括CACNA1H(电压依赖性T型钙通道亚基α-1H)、FOXM1(叉头框蛋白M1)、MAF(转录因子Maf)、SMURF1(E3泛素-蛋白连接酶SMURF1)、或TRIML1(三重基序家族样蛋白1)。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括CACNA1H(电压依赖性T型钙通道亚基α-1H)、FOXM1(叉头框蛋白M1)、MAF(转录因子Maf)、SMURF1(E3泛素-蛋白连接酶SMURF1)、或TRIML1(三重基序家族样蛋白1)，并且泛素蛋白酶包括USP5。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括UVSSA(UV刺激的支架蛋白A)、XPC(C组着色性干皮病互补蛋白)、ABL1(Abelson酪氨酸-蛋白激酶1)、AR(雄激素受体)、ATXN1(共济失调蛋白-1)、CHEK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1)、CHFR(E3泛素-蛋白连接酶CHFR)、CLSPN(Claspin)、CSNK2A1(酪蛋白激酶II亚基α)、DAXX(死亡结构域相关蛋白6)、DNMT1(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1)、FOXO1(叉头框蛋白O1)、FOXO4(叉头框蛋白O4)、GMPS(GMP合成酶)、IFNAR1(I型干扰素受体1)、IKBKG(I-κ-B激酶亚基γ)、KAT5(组蛋白乙酰转移酶KAT5)、KDM1A(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A)、MARCHF7(膜相关环-CH-型指7)、MDM2(E3泛素-蛋白连接酶Mdm2)、MDM4(Mdm2样p53结合蛋白)、MEX3C(RNA结合E3泛素-蛋白连接酶MEX3C)、MYC(MyC原癌基因蛋白)、MYD88(髓样分化初级反应蛋白MyD88)、PML(早幼粒细胞白血病蛋白)、POLH(DNA聚合酶θ)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、PTEN(磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶)、RAD18(E3泛素-蛋白连接酶RAD18)、RARA(视黄酸受体α)、RB1(视网膜母细胞瘤相关蛋白)、RELA(转录因子p65)、RNF168(E3泛素-蛋白连接酶RNF168)、RNF220(E泛素-蛋白连接酶RNF220)、SKP1(S期激酶相关蛋白1)、TP53(细胞肿瘤抗原p53)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、TRIP12(E3泛素-蛋白连接酶TRIP12)、或TRRAP(转化/转录结构域相关蛋白)。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括UVSSA(UV刺激的支架蛋白A)、XPC(C组着色性干皮病互补蛋白)、ABL1(Abelson酪氨酸-蛋白激酶1)、AR(雄激素受体)、ATXN1(共济失调蛋白-1)、CHEK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1)、CHFR(E3泛素-蛋白连接酶CHFR)、CLSPN(Claspin)、CSNK2A1(酪蛋白激酶II亚基α)、DAXX(死亡结构域相关蛋白6)、DNMT1(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1)、FOXO1(叉头框蛋白O1)、FOXO4(叉头框蛋白O4)、GMPS(GMP合成酶)、IFNAR1(I型干扰素受体1)、IKBKG(I-κ-B激酶亚基γ)、KAT5(组蛋白乙酰转移酶KAT5)、KDM1A(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A)、MARCHF7(膜相关环-CH-型指7)、MDM2(E3泛素-蛋白连接酶Mdm2)、MDM4(Mdm2样p53结合蛋白)、MEX3C(RNA结合E3泛素-蛋白连接酶MEX3C)、MYC(MyC原癌基因蛋白)、MYD88(髓样分化初级反应蛋白MyD88)、PML(早幼粒细胞白血病蛋白)、POLH(DNA聚合酶θ)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、PTEN(磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶)、RAD18(E3泛素-蛋白连接酶RAD18)、RARA(视黄酸受体α)、RB1(视网膜母细胞瘤相关蛋白)、RELA(转录因子p65)、RNF168(E3泛素-蛋白连接酶RNF168)、RNF220(E泛素-蛋白连接酶RNF220)、SKP1(S期激酶相关蛋白1)、TP53(细胞肿瘤抗原p53)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、TRIP12(E3泛素-蛋白连接酶TRIP12)、或TRRAP(转化/转录结构域相关蛋白)，并且泛素蛋白酶包括USP7。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括AR(雄激素受体)、ATM(丝氨酸-蛋白激酶ATM)、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)、EIF4G1(真核翻译起始因子4γ1)、MSH2(DNA错配修复蛋白Msh2)、PRKAA1(5'-AMP活化蛋白激酶催化亚基α-1)、PTEN(磷酸酶与张力蛋白同源物)、或TBX21(T-框转录因子TBX21)。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括AR(雄激素受体)、ATM(丝氨酸-蛋白激酶ATM)、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)、EIF4G1(真核翻译起始因子4γ1)、MSH2(DNA错配修复蛋白Msh2)、PRKAA1(5'-AMP活化蛋白激酶催化亚基α-1)、PTEN(磷酸酶与张力蛋白同源物)、或TBX21(T-框转录因子TBX21)，并且泛素蛋白酶包括USP10。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质包括泛素蛋白酶的非天然目标。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素蛋白酶包括USP5。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素蛋白酶包括USP7。在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素蛋白酶包括USP10。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素蛋白酶包括选自以下的结构域：泛素特异性蛋白酶(DUSP)结构域、泛素样(UBL)结构域、甲基多巴和TRAF同源物(MATH)结构域、锌指泛素特异性蛋白酶(ZnF-UBP)结构域、锌指髓样神经和DEAF1(ZnF-MYND)结构域、泛素相关(UBA)结构域、CHORD-SGT1(CS)结构域、微管互作和运输(MIT)结构域、硫氰酸酶样结构域、TBC/RABGAP结构域和B-框结构域，以及它们的任意组合。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素蛋白酶来自选自以下的家族：泛素特异性蛋白酶(USP)家族、卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族、泛素C末端水解酶(UCH)家族、Josephin结构域家族(Josephin)、与含有泛素的新型去泛素化酶家族相互作用的基序(MINDY)、和JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)。
在本文公开的SURTAC分子的使用方法的某些实施方式中，上述嵌合SURTAC分子的半数最大有效浓度(EC50)≤10μM。在某些实施方式中，上述嵌合SURTAC分子的EC50≤1μM。在某些实施方式中，上述嵌合SURTAC分子的EC50≤0.1μM。在某些实施方式中，上述嵌合SURTAC分子的EC50介于1μM与10μM之间。在某些实施方式中，上述嵌合SURTAC分子的EC50介于0.1μM与1μM之间。
本文提供的嵌合分子的一种应用的非限制性实例是对由于致瘤性转化或在致瘤性转化过程中而过度泛素化的蛋白质去泛素化(例如将泛素分子中的全部或一些从蛋白质去除)。由于细胞很少在保持功能性肿瘤抑制蛋白的正常水平的同时转化，否则会引导细胞凋亡，因此肿瘤抑制蛋白的过度泛素化并因此过度降解是致瘤性转化的标志。因此，本文提供的嵌合分子对泛素化肿瘤抑制蛋白的特异性救助有利于对抗致瘤性转化、癌症、和癌症的转移。
在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子的一种应用的非限制性实例是对由于致瘤性转化或在致瘤性转化过程中而过度泛素化的蛋白质去泛素化(例如将泛素分子中的全部或一些从蛋白质去除)，其中所述应用是在体内的。
本文提供的嵌合分子的一种应用的另一个非限制性实例是对由于细胞感染或在细胞感染过程中而过度泛素化的蛋白质去泛素化。当细胞检测到被寄生虫感染时，它们通常通过提高凋亡蛋白的水平来启动细胞凋亡。由于细胞在诱导自我凋亡后不再保持活力，因此细胞凋亡蛋白的过度泛素化和因此的过度降解是例如病毒和细菌，如人***瘤病毒16和18感染的标志。因此，本文提供的嵌合分子对泛素化凋亡蛋白的特异性救助有利于对抗感染。
在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子的一种应用的另一个非限制性实例是对由于细胞感染或在细胞感染过程中而过度泛素化的蛋白质去泛素化，其中所述应用是在体内的。
本文提供的嵌合分子的一种应用的另一个非限制性实例是对由于错折叠而泛素化的蛋白质去泛素化。当细胞检测到错折叠的蛋白时，它们通常会标记这些蛋白质以供降解。由于细胞并不在非功能性错折叠蛋白与有部分功能的错折叠蛋白之间进行区分，因此有部分功能的错折叠蛋白的泛素化并因此降解是某些疾病(如囊性纤维化)的标志。因此，本文提供的嵌合分子对错折叠的但仍有功能的蛋白质的特异性救助利于对抗由错折叠的蛋白引起的疾病或状况。
在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子的一种应用的另一个非限制性实例是对由于错折叠而泛素化的蛋白质去泛素化，其中所述应用是在体外的。在一些实施方式中，本文提供的嵌合分子的一种应用的另一个非限制性实例是对由于错折叠而泛素化的蛋白质去泛素化，其中所述应用是在体内的。
本文进一步提供了在不同用途(utilities)中采用本文提供的嵌合分子的方法。在一个实施方式中，提供了用于将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与本文所述的嵌合分子接触，使泛素蛋白酶紧邻泛素化蛋白质以将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除。在一些实施方式中，在不同用途中采用本文提供的嵌合分子的方法是体外方法。在一些实施方式中，在不同用途中采用本文提供的嵌合分子的方法是体内方法。
本文进一步提供了调节泛素化蛋白质的活性的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与本文所述的嵌合分子接触。结果，泛素蛋白酶紧邻泛素化蛋白质放置以将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除，从而调节泛素化蛋白质的活性。在一些实施方式中，调节泛素化蛋白质的活性的方法包括体外方法。在一些实施方式中，调节泛素化蛋白质的活性的方法包括体内方法。
本文进一步提供了用于调节泛素化蛋白质的细胞定位的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与本文所述的嵌合分子接触。结果，泛素蛋白酶紧邻泛素化蛋白质放置以将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除，从而调节泛素化蛋白质的细胞定位。
本文进一步提供了调节泛素化蛋白质与另一种蛋白质相互作用的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与本文所述的嵌合分子接触。结果，泛素蛋白酶紧邻泛素化蛋白质放置以将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除，从而调节泛素化蛋白质与另一种蛋白质的相互作用。
本文进一步提供了用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的方法，该方法包括向对象施用本文所述的嵌合分子。结果，泛素蛋白酶紧邻泛素化蛋白质放置以将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除，从而治疗、减少、或改善对象中的癌症。
在本文所述方法的一些实施方式中，嵌合SURTAC分子特异性结合各种细胞蛋白，例如泛素蛋白酶和泛素化蛋白质。在本文所述方法的某些实施方式中，本文提供的嵌合SURTAC分子与泛素化蛋白质结合。在本文所述方法的某些实施方式中，本文提供的嵌合SURTAC分子与泛素蛋白酶结合。在本文所述方法的某些实施方式中，本文提供的嵌合SURTAC分子与泛素化蛋白质和泛素蛋白酶两者结合。在本文所述方法的某些实施方式中，本文提供的嵌合SURTAC分子与泛素化蛋白质结合、与泛素蛋白酶结合、或与泛素化蛋白质和泛素蛋白酶两者结合。图3中呈现了本文提供的嵌合SURTAC分子的使用方法的一个实施方式的非限制性实例，其中嵌合SURTAC分子进入细胞，结合泛素化蛋白质和泛素蛋白酶，并释放去泛素化蛋白质。
在本文所述使用方法的某些实施方式中，本文提供的嵌合SURTAC分子进一步包含与目标细胞上呈递的抗原结合的第三结合结构域。如本领域技术人员将理解的，特异性靶向细胞上或特定细胞群上呈递的抗原的第三结合结构域允许将本文提供的嵌合分子递送至预定细胞，例如通过与其膜上呈递的其分化簇(CD)分子结合。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的某些实施方式中，嵌合SURTAC分子进一步包含细胞穿透标签。如本领域技术人员将理解的，增加嵌合SURTAC分子进入细胞的细胞穿透标签允许将嵌合分子有效递送至细胞。在一些实施方式中，细胞穿透标签包括细胞穿透肽(CPP)。在一些实施方式中，CPP包括促进各种分子的细胞摄入/摄取的短肽。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，嵌合分子通过经由共价键的化学连接或通过非共价相互作用与CPP关联。
在本文提供的嵌合SURTAC分子的使用方法的某些实施方式中，该使用方法在已受到损害攻击的细胞中使正常细胞功能恢复。在嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，该方法在已受到损害攻击的细胞中使正常细胞功能部分地恢复。对细胞的损害可以是暂时的或永久的，破坏性的或非破坏性的。在该使用方法的一些实施方式中，嵌合SURTAC分子使经历损害，如热休克、结构损伤、感染和致瘤性转化的细胞的功能恢复或部分恢复。虽然某些损害可能被细胞机制修正，但其它损害可能决定细胞死亡的命运，例如通过坏死或细胞凋亡。在一些实施方式中，本文所述的使用方法有利于人工操纵细胞的命运。
在一些实施方式中，为了在损害后重新获得稳态，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法可有益于减少泛素化稳态蛋白质的降解。在某些实施方式中，第一结合结构域与泛素化稳态蛋白质结合。在某些实施方式中，泛素化稳态蛋白质包括野生型功能性蛋白质。在某些实施方式中，第一结合结构域与泛素化p53蛋白结合。在某些实施方式中，第二结合结构域与p53的去泛素化酶结合。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶包括USP5、USP7、USP9X、USP10、USP11、USP24、USP29、USP42、OTUD1、OTUD5、共济失调蛋白-3、USP28或USP49蛋白酶。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP5。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP7。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP9X。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP10。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP11。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP24。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP29。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP42。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是OTUD1。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是OTUD5。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是共济失调蛋白-3。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP28。在某些实施方式中，p53的去泛素化酶是USP49。
在表达野生型功能性p53蛋白的肿瘤中，其肿瘤抑制功能通常受到与p53结合并靶向p53进行蛋白酶体降解的HDM2的损害。RITA((2,5-双(5-羟甲基-2-噻吩基)呋喃)(重新激活p53并诱导肿瘤细胞凋亡))与p53结合并诱导其在肿瘤细胞中积累。RITA在体外和体内阻止p53-HDM-2相互作用，并影响p53与几种负调控子的相互作用。RITA在表达野生型p53的各种肿瘤细胞系中诱导p53目标基因的表达和大量细胞凋亡(Issaeva等人,2004,NatureMedicine,第10卷,第1321-1328页)。
在某些实施方式中，嵌合SURTAC分子的第一结合结构域包括RITA。在本文使用方法的某些实施方式中，嵌合SURTAC分子的第一结合结构域与RITA结合。RITA是既对结合p53具有特异性，又不抑制p53细胞功能的分子或“中间分子”的非限制性实例。
在一些实施方式中，RITA的使用可以是有益的，其中RITA可用于通过本文提供的嵌合分子特异性靶向p53蛋白。在某些实施方式中，本文提供的嵌合分子的第一结合结构域包括RITA，如图5所示。在某些实施方式中，RITA可例如结合本文提供的嵌合分子的使用方法用于将p53蛋白从MDM2释放，从而允许p53蛋白促进细胞凋亡级联，如图6所示。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，嵌合分子用于预防、减少、或改善泛素化蛋白质降解的方法中，该方法包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体的嵌合SURTAC分子接触，其中：第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而防止、减少、或改善泛素化蛋白质的降解。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质是稳态蛋白质。技术人员将理解，许多稳态蛋白质是本领域已知的，例如Uhlén等人,(2015)Science.1月23日；347(6220)：1260419中描述的稳态蛋白质，以其整体将所列举的稳态蛋白质并入本文。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，稳态蛋白质可以是本领域已知的任何稳态蛋白质。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质是肿瘤抑制蛋白。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白选自p53、磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、希-林二氏肿瘤阻抑因子(pVHL)、大肠腺瘤性息肉(APC)、分化簇95(CD95)、肿瘤发生抑制素5(suppression of tumorigenicity 5)(ST5)、Yippee样蛋白3(Yippee-like 3)(YPEL3)、和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。
肿瘤蛋白p53，也被称为p53、细胞肿瘤抗原p53(UniProt名称)、磷蛋白p53、抑癌基因p53、抗原NY-CO-13、或转化相关蛋白53(TRP53)，包括由各种生物体中的同源基因编码的蛋白质的任何同种型，如TP53(人)和Trp53(小鼠)。p53被描述为“基因组的守卫”，因为它的作用在于通过防止基因组突变来保持稳定性。因此TP53被归类为肿瘤抑制基因。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是p53。
磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)是一种在人类中由PTEN基因编码的蛋白质。此基因的突变是许多癌症发展的一个步骤。PTEN通过其磷酸酶蛋白产物的作用充当肿瘤抑制基因。此磷酸酶参与细胞周期的调节，防止细胞生长和***过快。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是PTEN。
希-林二氏肿瘤阻抑因子(von Hippel-Lindau tumor suppressor)也称为pVHL，是一种在人类中由VHL基因编码的蛋白质。VHL基因的突变与希-林二氏病有关。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是pVHL。
大肠腺瘤性息肉(APC)，也被称为息肉病2.5(DP2.5)缺失，是一种在人类中由APC基因编码的蛋白质。APC蛋白是一种负调控子，控制β-联蛋白浓度并与参与细胞粘附的E-钙黏着蛋白相互作用。APC基因的突变可能导致结直肠癌。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是APC。
FaS或FasR，也被称为细胞凋亡抗原1(APO-1或APT)、分化簇95(CD95)或肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNFRSF6)，是一种在人类中由FAS基因编码的蛋白质。FaS受体是细胞表面上的死亡受体，导致程序性细胞死亡(细胞凋亡)。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是CD95。
肿瘤发生抑制素5(Suppresison of tumorigenicity 5)是一种在人类中由ST5基因编码的蛋白质。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是ST5。
Yippee样蛋白3是一种在人类中由YPEL3基因编码的蛋白质。YPEL3在正常和肿瘤细胞系中具有生长抑制作用。已显示YPEL3的诱导在某些人类正常和肿瘤细胞类型中触发永久性生长停滞或细胞衰老。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是YPEL3。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，也被称为雷帕霉素的机械目标和FK506结合蛋白12雷帕霉素相关蛋白1(FRAP1)，是一种在人类中由MTOR基因编码的激酶。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是mTOR。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，(i)泛素化蛋白质是p53，(ii)第二结合结构域与选自USP5、USP7、USP9X、USP10、USP11、USP24、USP29、USP42、OTUD1、OTUD5、共济失调蛋白-3、USP28和USP49的去泛素化酶结合，(iii)第一结合结构域包含RITA小分子或与RITA小分子结合，或(iv)(i)、(ii)和(iii)的任意组合。
在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，泛素化蛋白质是神经保护蛋白。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，神经保护蛋白选自睫状神经营养因子(CTNF)、***1(IGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、和脑源神经营养因子(BDNF)。
睫状神经营养因子是一种在人类中由CNTF基因编码的蛋白质。此基因编码的蛋白质是一种多肽激素和神经营养因子，促进神经群中神经递质的合成和神经突增生(outgrowth)。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，神经保护蛋白是CTNF。
***1(IGF-1)，也被称为生长调节素C，是一种在人类中由IGF1基因编码的蛋白质。IGF-1是分子结构与胰岛素相似的激素。它在儿童成长中起着重要作用，并继续在成人中有合成作用。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，神经保护蛋白是IGF-1。
血管内皮生长因子(VEGF)，原来被称为血管通透因子(VPF)，是一种由细胞产生的信号蛋白，刺激血管形成。VEGF是生长因子的一个亚家族，胱氨酸结生长因子的血小板衍生生长因子家族。它们是参与血管生成(胚胎循环***的从头形成)和血管发生(血管从预先存在的脉管***生长)两者的重要的信号传导蛋白。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，神经保护蛋白是VEGF。
脑源神经营养因子，也被称为BDNF，是一种在人类中由BDNF基因编码的蛋白质。BDNF是与经典神经生长因子有关的生长因子的神经营养蛋白家族的成员。在本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法的一些实施方式中，神经保护蛋白是BDNF。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括使用嵌合分子调节泛素化蛋白质的活性的方法，该方法包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的嵌合SURTAC分子接触，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；
从而调节泛素化蛋白质的活性。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括调节泛素化蛋白质的细胞定位的用途，该方法包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而调节泛素化蛋白质的细胞定位。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括调节泛素化蛋白质与另一种蛋白质的相互作用的用途，该方法包括使泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而调节泛素化蛋白质与其它蛋白质的相互作用。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括恢复细胞内稳态的用途，该方法包括使细胞与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化稳态蛋白结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而恢复细胞内的稳态。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途，该方法包括向对象施用包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化肿瘤抑制蛋白结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而治疗、减少、或改善对象中的癌症。
在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，泛素化肿瘤抑制蛋白包括野生型功能性肿瘤抑制蛋白。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白选自p53、PTEN、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3和mTor。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是p53。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是PTEN。在用于治疗、减少、或改善对象癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是pVHL。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是APC。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白CD95。在用于治疗、减少、或改善对象癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是ST5。在用于治疗、减少、或改善对象的癌症的用途的方法的某些实施方式中，，肿瘤抑制蛋白是YPEL3。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，肿瘤抑制蛋白是mTor。在用于治疗、减少、或改善对象中的癌症的用途的方法的某些实施方式中，泛素化肿瘤抑制蛋白是p53，第二结合位点与选自以下的去泛素化酶结合：USP5、USP7、USP9X、USP10、USP11、USP24、USP29、USP42、OTUD1、OTUD5、共济失调蛋白-3、USP28和USP49，第一结合位点包含RITA小分子或与RITA小分子结合，或(iv)其任意组合。
在一些实施方式中，本文所述嵌合SURTAC分子的使用方法包括用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的用途，该方法包括向对象施用包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子，其中：
第一结合结构域被配置以与泛素化神经保护蛋白结合；
第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，泛素蛋白酶将泛素从与第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
连接体结构域被配置以将第一结合结构域与第二结合结构域连接；从而治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤。
在使用嵌合SURTAC分子用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的方法的某些实施方式中，泛素化神经保护蛋白包括野生型功能性神经保护蛋白。在使用嵌合SURTAC分子用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的方法的某些实施方式中，神经保护蛋白选自CTNF、IGF-1、VEGF和BDNF。在某些实施方式中，神经保护蛋白是CTNF。在使用嵌合SURTAC分子用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的方法的某些实施方式中，神经保护蛋白是IGF-1。在使用嵌合SURTAC分子用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的方法的某些实施方式中，神经保护蛋白是VEGF。在使用嵌合SURTAC分子用于治疗、减少、或改善对象中的神经元损伤的方法的某些实施方式中，神经保护蛋白是BDNF。
定义
应当理解，本文提供的嵌合分子可选地被描述为“合成的”、“多结构域的”、“双结构域的”、“三结构域的”、“多功能的”、“双功能的”、“双特异性的”、“三特异性的”、和/或“嵌合的”来表征本文提供的嵌合分子的不同属性，因此每个术语都可单独使用或与任何其它术语组合使用来定义嵌合分子。
术语“合成分子”总体上是指所提及的分子是人造的并且在自然界中未被发现。
术语“多结构域分子”总体上是指所提及的分子包含至少两个不同的结构域。本文提供的嵌合分子具有两个不同的强制性结构域——负责结合泛素化蛋白质的第一结合结构域和负责结合DUB酶的第二结合结构域。术语“双结构域分子”总体上是指所提及的分子包含两个功能结构域，即如上所述的第一和第二结合结构域。术语“三结构域分子”总体上是指所提及的分子包含三个功能域，即如上所述的第一和第二结合结构域，以及另一个结构域——例如包含与目标细胞和/或细胞穿透标签上呈递的抗原结合的结合结构域。
术语“多功能分子”总体上是指所提及的分子可执行多种功能。本文提供的嵌合分子具有两种不同的强制性功能——结合DUB酶和结合泛素化蛋白质，因此也可被称为“双功能”。术语“三功能分子”总体上是指所提及的分子具有两种强制性功能，以及另一种功能——例如与目标细胞上呈递的抗原结合和/或穿透细胞。
术语“嵌合分子”总体上是指所提及的分子由两个或更多个不同的结构域或结构构成，这些结构域或结构在自然界中未在单个分子中一起发现。本文提供的嵌合分子被认为是嵌合的，因为它们包含至少两个不同的结构域或结构，这些结构域或结构在自然界中未在单个分子中一起发现，即如上所述的第一和第二结合结构域。在自然界中，尚未发现任何分子能特异性地并同时结合本文所述的DUB酶和泛素化蛋白质。
本领域技术人员将理解，术语“泛素蛋白酶”或“去泛素化酶”总体上是指这样的蛋白质，其是能够将一个或多个泛素分子从蛋白质和其它分子切割的蛋白酶。DUB可切割泛素与其底物蛋白之间的肽键或异肽键。在一个实施方式中，DUB可切割泛素分子和底物蛋白之间的键和/或同一泛素链上泛素分子和相邻泛素分子之间的键。
本领域技术人员将理解，术语“结合结构域”，如“第一结合结构域”和“第二结合结构域”，总体上是指分子的一部分，其特异性靶向单独的分子或被单独的分子特异性识别。第一结合结构域可特异性靶向泛素化蛋白质，即最终一个或多个泛素分子将会从其去除的感兴趣的蛋白质，或被泛素化蛋白质特异性识别。第二结合结构域可特异性靶向去泛素化酶，即将泛素从蛋白质和其它分子切割的蛋白酶，即最终会将一个或多个泛素分子从感兴趣的蛋白质去除的酶，或被去泛素化酶特异性识别。
本领域技术人员将理解，术语“连接体”或“连接结构域”总体上是指分子的与多个其它分子相连、连接、关联或以其它方式相互作用的一部分。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子的连接体结构域将第一结合结构域与本文提供的嵌合分子的第二结合结构域连接或相连。
术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”在本文中以广义使用并且包括多克隆和单克隆抗体。除了完整或“完全”的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”中还包括片段(例如CDR、Fv、Fab和FC片段)或那些免疫球蛋白分子的聚合物和免疫球蛋白分子的人源化形式(versions)。也可使用公知的方法产生抗体。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子的第二结合结构域可包含结合DUB的抗体或其泛素蛋白酶结合片段，并且本文提供的嵌合分子的第一结合结构域可以是结合泛素化蛋白质的抗体或其泛素化蛋白质结合片段。
如本文所用，术语“抗体”还包括Fab，该片段含有抗体分子的单价抗原结合片段，其可通过用酶，木瓜蛋白酶消化整个抗体以产生完整轻链和一条重链的部分；Fab'，抗体分子的片段，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，然后还原，得到完整的轻链和部分重链，每个抗体分子获得两个Fab'片段；(Fab')2，可通过用酶，胃蛋白酶处理整个抗体而不进行后续还原而获得的抗体片段，F(ab')2是由两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；Fv，一种经基因工程改造的片段，含有轻链可变区和重链可变区，表示为两条链；以及单链抗体(“SCA”)，一种经基因工程改造的分子，含有轻链可变区和重链可变区，通过合适的多肽连接体连接成经基因改造的融合的单链分子。
在一个实施方式中，Fv片段包括VH和VL链的缔合。这种缔合可以是非共价的，如Inbar等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA69:2659-62,1972中描述的。在可选方案中，可变链可通过分子间二硫键连接或通过化学品如戊二醛交联。可选地，Fv片段包括通过肽连接体连接的VH和VL链。
如本文所用，术语“抗体”还包括编码一个或多个互补决定区(CDR)的肽。在一个实施方式中，CDR肽(“最小识别单元”)可通过构建编码感兴趣抗体的CDR的基因来获得。
如本文所用，术语“肽”包括天然肽(降解产物、以合成方式合成的肽或重组肽)和肽模拟物(一般是以合成方式合成的肽)，如作为肽类似物的拟肽(peptoids)和半拟肽(semipeptoids)，其可具有例如使肽在体内更稳定或更能够穿透到细菌细胞中的修饰。此类修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、骨架修饰、和残基修饰。
肽内的肽键(-CO-NH-)可被例如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮基亚甲基键(ketomethylen bonds)(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任意烷基，例如，甲基、卡巴键(carba bonds)(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯烃双键(-CH＝CH-)、逆向酰胺键(retro amidebonds)(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是“正常”侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可发生在沿肽链的任何键上，并且甚至可同时发生在几个键上(例如2-3个)。天然芳族氨基酸Trp、Tyr和Phe可替代合成的非天然酸，如TIC、萘基丙氨酸(naphthylelanine)(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或邻-甲基-Tyr。除上述之外，本文提供的嵌合分子的连接体还可包括一种或多种修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
如本文所用，术语“氨基酸(amino acid)”或“氨基酸(amino acids)”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些经常在体内进行翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
本领域技术人员将理解，术语“配体”总体上是指与另一生物分子形成复合物的物质，如小分子。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子的第一结合结构域可包含结合泛素化蛋白质的配体，而本文提供的嵌合分子的第二结合结构域可包含结合泛素蛋白酶的配体。
本领域技术人员将理解，术语“泛素化蛋白质”总体上是指最终会将一个或多个泛素分子从其去除的感兴趣的蛋白质。如本领域技术人员将理解的，“泛素化蛋白质”可携带单个泛素分子、多个泛素分子、单个泛素链、多个泛素链、线性泛素链、支化泛素链、或其任意组合。在一个实施方式中，本文提供的嵌合分子的第一结合结构域可与泛素化蛋白质，即共价连接到至少一个泛素分子的蛋白质结合。
本领域技术人员将理解，术语“催化结构域”和“活性位点”是可互换的，并且总体上是指底物分子结合并发生化学反应的酶区域。例如，半胱氨酸蛋白酶去泛素化酶(DUB)的催化结构域利用催化二联体或三联体(两个或三个氨基酸)催化泛素和底物之间酰胺键的水解。导致半胱氨酸蛋白酶DUB的催化活性的活性位点残基是半胱氨酸(二联体/三联体)、组氨酸(二联体/三联体)和天冬氨酸或天冬酰胺(仅三联体)。组氨酸被催化三联体中的天冬氨酸或天冬酰胺或二联体的其它方式极化。这种极化的残基降低了半胱氨酸的pKa，从而使其对泛素C末端和底物赖氨酸之间的异肽键进行亲核攻击。金属蛋白酶使锌离子与组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基配位，其激活水分子并允许它们攻击异肽键。
本领域技术人员将理解，术语“辅助结构域(accessory domain)”总体上是指例如通过结合底物分子和/或参与化学反应来协助酶的催化结构域执行其功能的酶区域。
应当理解，本文使用的术语“调节”总体上是指属性的任何改变。例如，“调节泛素化蛋白质的活性”可意指提高或降低泛素化蛋白质的活性，“调节泛素化蛋白质的细胞位置”意指改变泛素化蛋白质在细胞内的位置，以及“调节泛素化蛋白质与另一种蛋白质的相互作用”可意指增加或减少泛素化蛋白质与不同蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。
本领域技术人员将理解，短语“防止、减少、或改善蛋白质降解”是指蛋白质降解完全停止、每时间单位所降解的蛋白质数量减少、或蛋白质降解的速率降低。
本领域技术人员将理解，短语“治疗、减少、或改善疾病”是指预防与疾病相关的症状、减少与疾病相关的症状、推迟与疾病相关的症状、减轻疾病的严重程度或治愈疾病。
实施例
实施例1.体外癌细胞中的细胞穿透和靶向的去泛素化。
产生了如本文详细公开的嵌合分子，其包含与泛素化p53蛋白特异性结合的第一结合结构域(TAR接合基序(TEM))和与USP11特异性结合的第二结合结构域(DUB接合基序(DEM))，USP11是一种已知的泛素化p53蛋白的去泛素化蛋白酶。将嵌合分子加入到活的癌细胞的溶液中，癌细胞过度泛素化并因此过度降解p53蛋白。然后将溶液混合并在37℃下孵育数小时。在孵育过程中监测细胞中p53蛋白的泛素化水平和细胞的活力。表明，随着细胞中p53蛋白泛素化水平的降低，细胞的活力降低。
实施例2.实体瘤小鼠模型中的癌症治疗。
产生了如本文详细公开的嵌合分子，其包含与泛素化p53蛋白特异性结合的第一结合结构域(TAR接合基序)和与USP11特异性结合的第二结合结构域(DUB接合基序)，USP11是一种已知的泛素化p53蛋白的去泛素化蛋白酶。嵌合分子被瘤内注射到携带已建立实体瘤的裸鼠体内，实体瘤过度泛素化并因此过度降解p53蛋白。携带肿瘤的对照组小鼠用PBS进行模拟处理。在数周内监测实体瘤的体积和小鼠的活力。表明，在嵌合分子处理组中，随着小鼠活力的提高，肿瘤体积减小。在模拟处理组中，肿瘤进展并且生活质量恶化，直到小鼠被人道处死。
实施例3.血癌小鼠模型中的癌症治疗。
产生了如本文详细公开的嵌合分子，其包含与泛素化p53蛋白特异性结合的第一结合结构域(TAR接合基序)和与USP11特异性结合的第二结合结构域(DUB接合基序)，USP11是一种已知的泛素化p53蛋白的去泛素化蛋白酶。嵌合分子被全身注射给患有淋巴瘤的裸鼠，淋巴瘤过度泛素化并因此过度降解p53蛋白。用PBS模拟处理患有淋巴瘤的对照组小鼠。在数周内监测小鼠的活力。表明，嵌合分子处理组的小鼠活力提高。在模拟处理组中，生活质量下降，直到小鼠被人道处死。
实施例4.体外ΔF508 CFTR细胞中的细胞穿透和靶向的去泛素化。
产生了如本文详细公开的嵌合分子，其包含与泛素化ΔF508囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白特异性结合的第一结合结构域(TAR接合基序)和与已知的泛素化CFTR蛋白的去泛素化蛋白酶特异性结合的第二结合结构域(DUB接合基序)。将嵌合分子添加到原代活ΔF508 CFTR细胞的溶液中，ΔF508 CFTR细胞泛素化并因此降解ΔF508 CFTR蛋白。然后将溶液混合并在37℃下孵育数小时。在孵育过程中监测细胞中ΔF508 CFTR蛋白的泛素化水平和细胞的活力。表明，随着细胞中ΔF508 CFTR蛋白泛素化水平的降低，细胞的活力提高。
实施例5.体外***状瘤感染的细胞中的细胞穿透和靶向的去泛素化。
产生了如本文详细公开的嵌合分子，其包含与泛素化p53蛋白特异性结合的第一结合结构域(TAR接合基序)和与USP11特异性结合的第二结合结构域(DUB接合基序)，USP11是一种已知的泛素化p53蛋白的去泛素化蛋白酶。将嵌合分子添加到被人***瘤病毒16(HPV16)感染的活上皮细胞的溶液中，HPV16过度泛素化并因此过度降解p53蛋白。然后将溶液混合并在37℃下孵育数小时。在孵育过程中监测细胞中p53蛋白的泛素化水平和细胞的活力。表明，随着细胞中p53蛋白泛素化水平降低，细胞的活力降低。

Claims (33)

1.存活靶向性嵌合(SURTAC)分子，其包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域，其中：
(i)所述第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
(ii)所述第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，所述泛素蛋白酶将泛素从与所述第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
(iii)所述连接体结构域被配置以将所述第一结合结构域与所述第二结合结构域连接。
2.根据权利要求1所述的嵌合分子，其中所述第一结合结构域包括肽或小分子。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合分子，其中所述第一结合结构域被配置以直接与所述泛素化蛋白质结合。
4.根据权利要求3所述的嵌合分子，其中所述第一结合结构域包括：
(a)与所述泛素化蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段；或
(b)与所述泛素化蛋白质结合的配体。
5.根据权利要求1或2所述的嵌合分子，其中所述第一结合结构域结合与所述泛素化蛋白质结合的中间分子。
6.根据权利要求5所述的嵌合分子，其中所述中间分子包括：
(a)与所述泛素化蛋白质结合的抗体或其抗原结合片段；或
(b)与所述泛素化蛋白质结合的配体。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合分子，其中所述第一结合结构域与所述泛素化蛋白质瞬时结合并在一个或多个泛素分子从所述泛素化蛋白质切割后与所述蛋白质解离。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质携带一个或多个泛素分子。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素蛋白酶将一个或多个泛素分子从所述泛素化蛋白质切割。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP5相互作用。
11.根据权利要求10所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质包括CACNA1H(电压依赖性T型钙通道亚基α-1H)、FOXM1(叉头框蛋白M1)、MAF(转录因子Maf)、SMURF1(E3泛素-蛋白连接酶SMURF1)、或TRIML1(三重基序家族样蛋白1)。
12.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP7相互作用。
13.根据权利要求12所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质包括UVSSA(UV刺激的支架蛋白A)、XPC(C组着色性干皮病互补蛋白)、ABL1(Abelson酪氨酸-蛋白激酶1)、AR(雄激素受体)、ATXN1(共济失调蛋白-1)、CHEK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1)、CHFR(E3泛素-蛋白连接酶CHFR)、CLSPN(Claspin)、CSNK2A1(酪蛋白激酶II亚基α)、DAXX(死亡结构域相关蛋白6)、DNMT1(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1)、FOXO1(叉头框蛋白O1)、FOXO4(叉头框蛋白O4)、GMPS(GMP合成酶)、IFNAR1(I型干扰素受体1)、IKBKG(I-κ-B激酶亚基γ)、KAT5(组蛋白乙酰转移酶KAT5)、KDM1A(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A)、MARCHF7(膜相关环-CH-型指7)、MDM2(E3泛素-蛋白连接酶Mdm2)、MDM4(Mdm2样p53结合蛋白)、MEX3C(RNA结合E3泛素-蛋白连接酶MEX3C)、MYC(MyC原癌基因蛋白)、MYD88(髓样分化初级反应蛋白MyD88)、PML(早幼粒细胞白血病蛋白)、POLH(DNA聚合酶θ)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、PTEN(磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶)、RAD18(E3泛素-蛋白连接酶RAD18)、RARA(视黄酸受体α)、RB1(视网膜母细胞瘤相关蛋白)、RELA(转录因子p65)、RNF168(E3泛素-蛋白连接酶RNF168)、RNF220(E泛素-蛋白连接酶RNF220)、SKP1(S期激酶相关蛋白1)、TP53(细胞肿瘤抗原p53)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、TRIP12(E3泛素-蛋白连接酶TRIP12)、或TRRAP(转化/转录结构域相关蛋白)。
14.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质与泛素蛋白酶USP10相互作用。
15.根据权利要求14所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质包括AR(雄激素受体)、ATM(丝氨酸-蛋白激酶ATM)、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)、EIF4G1(真核翻译起始因子4γ1)、MSH2(DNA错配修复蛋白Msh2)、PRKAA1(5'-AMP活化蛋白激酶催化亚基α-1)、PTEN(磷酸酶与张力蛋白同源物)、或TBX21(T-框转录因子TBX21)。
16.根据权利要求1-9中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素化蛋白质是泛素蛋白酶的非天然目标。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二结合结构域包括肽或小分子。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二结合结构域被配置以直接与所述泛素蛋白酶结合。
19.根据权利要求18所述的嵌合分子，其中所述第二结合结构域包括：
(a)与所述泛素蛋白酶结合的抗体或其抗原结合片段；或
(b)与所述泛素蛋白酶结合的配体。
20.根据权利要求1-16中任一项所述的嵌合分子，其中所述第二结合结构域结合与所述泛素蛋白酶结合的中间分子。
21.根据权利要求20所述的嵌合分子，其中所述中间分子包括：
(a)与所述泛素蛋白酶结合的抗体或其抗原结合片段；或
(b)与所述泛素蛋白酶结合的配体。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素蛋白酶包括选自以下的结构域：泛素特异性蛋白酶(DUSP)结构域、泛素样(UBL)结构域、甲基多巴和TRAF同源物(MATH)结构域、锌指泛素特异性蛋白酶(ZnF-UBP)结构域、锌指髓样神经和DEAF1(ZnF-MYND)结构域、泛素相关(UBA)结构域、CHORD-SGT1(CS)结构域、微管互作和运输(MIT)结构域、硫氰酸酶样结构域、TBC/RABGAP结构域和B-框结构域，以及其任意组合。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素蛋白酶来自选自以下的家族：泛素特异性蛋白酶(USP)家族、卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族、泛素C末端水解酶(UCH)家族、Josephin结构域家族(Josephin)、与含有泛素的新型去泛素化酶家族相互作用的基序(MINDY)、和JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的嵌合分子，其中所述泛素蛋白酶包括USP5、USP7、或USP10。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的嵌合分子，其中所述连接体结构域包括肽或小分子。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的嵌合分子，其中所述连接体结构域共价地将所述第一结合结构域连接至所述第二结合结构域。
27.根据权利要求1-25中任一项所述的嵌合分子，其中所述连接体结构域非共价地将所述第一结合结构域连接至所述第二结合结构域。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的嵌合分子，其中所述连接体结构域包括：
(a)选自以下的结构：聚乙二醇、芳族基团、烷基、烯基、磷酸烷基酯、烷基硅氧烷、环氧基、酰卤、缩水甘油基、羧酸酯、和酸酐；或
(b)链长介于2至18个碳原子之间的天然或合成来源的多肽。
29.用于将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除的方法，所述方法包括使所述泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：
(i)所述第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
(ii)所述第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，所述泛素蛋白酶将泛素从与所述第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
(iii)所述连接体结构域被配置以将所述第一结合结构域与所述第二结合结构域连接；从而将至少一个泛素分子从泛素化蛋白质去除。
30.用于防止或减少泛素化蛋白质降解的方法，所述方法包括使所述泛素化蛋白质与包含第一结合结构域、第二结合结构域、和连接体结构域的存活靶向性嵌合(SURTAC)分子接触，其中：
(i)所述第一结合结构域被配置以与泛素化蛋白质结合；
(ii)所述第二结合结构域被配置以与泛素蛋白酶结合，所述泛素蛋白酶将泛素从与所述第一结合结构域结合的泛素化蛋白质切割，并且
(iii)所述连接体结构域被配置以将所述第一结合结构域与所述第二结合结构域连接；从而防止、减少、或改善所述泛素化蛋白质的降解。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中：
(a)所述泛素化蛋白质包括CACNA1H(电压依赖性T型钙通道亚基α-1H)、FOXM1(叉头框蛋白M1)、MAF(转录因子Maf)、SMURF1(E3泛素-蛋白连接酶SMURF1)、或TRIML1(三重基序家族样蛋白1)，并且所述泛素蛋白酶包括USP5；或
(b)所述泛素化蛋白质包括UVSSA(UV刺激的支架蛋白A)、XPC(C组着色性干皮病互补蛋白)、ABL1(Abelson酪氨酸-蛋白激酶1)、AR(雄激素受体)、ATXN1(共济失调蛋白-1)、CHEK1(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Chk1)、CHFR(E3泛素-蛋白连接酶CHFR)、CLSPN(Claspin)、CSNK2A1(酪蛋白激酶II亚基α)、DAXX(死亡结构域相关蛋白6)、DNMT1(DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1)、FOXO1(叉头框蛋白O1)、FOXO4(叉头框蛋白O4)、GMPS(GMP合成酶)、IFNAR1(I型干扰素受体1)、IKBKG(I-κ-B激酶亚基γ)、KAT5(组蛋白乙酰转移酶KAT5)、KDM1A(赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1A)、MARCHF7(膜相关环-CH-型指7)、MDM2(E3泛素-蛋白连接酶Mdm2)、MDM4(Mdm2样p53结合蛋白)、MEX3C(RNA结合E3泛素-蛋白连接酶MEX3C)、MYC(MyC原癌基因蛋白)、MYD88(髓样分化初级反应蛋白MyD88)、PML(早幼粒细胞白血病蛋白)、POLH(DNA聚合酶θ)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、PTEN(磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸3-磷酸酶和双特异性蛋白磷酸酶)、RAD18(E3泛素-蛋白连接酶RAD18)、RARA(视黄酸受体α)、RB1(视网膜母细胞瘤相关蛋白)、RELA(转录因子p65)、RNF168(E3泛素-蛋白连接酶RNF168)、RNF220(E泛素-蛋白连接酶RNF220)、SKP1(S期激酶相关蛋白1)、TP53(细胞肿瘤抗原p53)、TRAF6(TNF受体相关因子6)、TRIP12(E3泛素-蛋白连接酶TRIP12)、或TRRAP(转化/转录结构域相关蛋白)，并且所述泛素蛋白酶包括USP7；或
(c)所述泛素化蛋白质包括AR(雄激素受体)、ATM(丝氨酸-蛋白激酶ATM)、CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)、EIF4G1(真核翻译起始因子4γ1)、MSH2(DNA错配修复蛋白Msh2)、PRKAA1(5'-AMP活化蛋白激酶催化亚基α-1)、PTEN(磷酸酶与张力蛋白同源物)、或TBX21(T-框转录因子TBX21)，并且所述泛素蛋白酶包括USP10。
32.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述泛素化蛋白质包括所述泛素蛋白酶的非天然目标。
33.根据权利要求29-32中任一项所述的方法，其中所述泛素蛋白酶包括
(a)选自以下的结构域：泛素特异性蛋白酶(DUSP)结构域、泛素样(UBL)结构域、甲基多巴和TRAF同源物(MATH)结构域、锌指泛素特异性蛋白酶(ZnF-UBP)结构域、锌指髓样神经和DEAF1(ZnF-MYND)结构域、泛素相关(UBA)结构域、CHORD-SGT1(CS)结构域、微管互作和运输(MIT)结构域、硫氰酸酶样结构域、TBC/RABGAP结构域和B-框结构域，以及其任意组合；或
(b)来自选自以下的家族：泛素特异性蛋白酶(USP)家族、卵巢肿瘤蛋白酶(OUT)家族、泛素C末端水解酶(UCH)家族、Josephin结构域家族(Josephin)、与含有泛素的新型去泛素化酶家族相互作用的基序(MINDY)、和JAB1/MPN/Mov34金属酶结构域家族(JAMM)；或
(c)其组合。
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