CN103454374A - 骨康药物的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了骨康药物的质量控制方法，该方法主要是增加了酢浆草中的刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷的含量测定和指纹图谱检测方法。该方法是采用高效液相色谱法进行测定，操作简便，重现性好，能有效控制产品质量。

Description

骨康药物的质量控制方法

技术领域

本发明涉及骨康药物的质量控制方法，属于药品的技术领域。 

背景技术

骨康胶囊为中成药地方标准上升国家标准部分（骨伤科分册）中收载的品种，其质量标准是在2002年进行提升的，主要采用薄层色谱法对芭蕉根药材和三七药材进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素进行定量测定。为了进一步有效的控制产品质量，我们研究开发了一种对酢浆草药材进行含量测定的方法。酢浆草是骨康胶囊中的主要药味，具有清热利湿，凉血消肿，解毒散瘀的功效，用于跌扑损伤。一直以来都只能做到定性鉴别，不能做到定量测定，为了能进一步有效的控制产品质量，我们对酢浆草药材有效成份进行了研究，开发了一种用于控制酢浆草的含量测定方法。除此之外，我们还对骨康胶囊成品进行了指纹图谱方法的研究，并最终制定了指纹图谱检测方法。 

发明内容

芭蕉根药材是骨康胶囊的君药，但在多次研究、筛选后，发现无指标性成分用于含量测定。酢浆草作为骨康胶囊中的主要药味，具有清热利湿，凉血消肿，解毒散瘀的功效，用于跌扑损伤。故选择酢浆草中的指标性成分作为骨康胶囊的另一指标性成分测定。通过对酢浆草药材有效成份的研究发现，酢浆草中的有效成份为刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷，故选择了刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷作为骨康胶囊中另一含量测定指标性成分。 

  

一、酢浆草中刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷含量测定方法研究：

1、样品与试剂

   样品：骨康胶囊 （批号：20100622、20100624、20100701）

   对照品：刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷  批号：20101107-2 纯度：≥98% 

   试剂：甲醇、磷酸为分析纯；甲醇为色谱纯

   仪器：岛津AUW-220D型十万分之一电子天平

         梅特勒AB104-N型万分之一电子天平

         Waters 2695-2996高效液相色谱仪

2、液相条件

   仪器：Waters 2695-2996高效液相色谱仪

   色谱柱：Diamonsil 二代C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）

   流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（19:81）

   流速：1.0ml/min

   柱温：室温

3、溶液制备

3.1 供试品溶液制备

取本品内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

3.2 对照品溶液制备

   取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品10.48mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1048mg/ml的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液2ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

3.3 阴性样品溶液制备

   取缺酢浆草药材的阴性样品，同供试品制备方法制得阴性样品溶液；

3.4 检测波长的选择

   在对酢浆草药材建立刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷含量测定时，对其紫外吸收进行了扫描，得出刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷在330nm处有最大吸收，故选择330nm为其含量测定的波长。见图1；

3.5 ***适应性研究

   取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按上述液相条件进行测定，结果见图2、图3、图4； 

结论：骨康胶囊样品色谱图在此条件下能达到很好的分离，阴性样品对测定无干扰；

3.6 不同提取方式考察

称取骨康胶囊内容物0.5g，六份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇25ml，称重，考察回流30分钟、超声30分钟、冷浸1小时后超声处理30分钟三种提取方式，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述色相条件进样，分析，结果见表1；

表1   成品不同提取方式考察结果

结论：以上3种提取方式所得的结果非常接近，说明回流、超声及冷浸超声均可以作为样品的处理方法，但超声的操作简便，所以选择超声作为骨康胶囊含量测定的提取方式；

3.7 提取时间考察

称取骨康胶囊内容物0.5g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入甲醇25ml，称重，分别超声处理20、30、40分钟，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。按上述色相条件进样，分析，结果见表2；

表2   成品提取时间考察结果

结论：通过上表可得，超声20、30、40分钟其含量差异不大，最终选择了超声30分钟；

3.8 方法学研究

3.8.1线性试验

    分别精密量取浓度为0.1048mg/ml的对照品溶液，用甲醇分别配成浓度为0.05135、0.01712、0.01027、0.01027、0.00642、0.00103mg/ml的对照品溶液。分别注入液相色谱仪中，记录色谱峰面积，以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得回归方程为A＝5×10⁷C+13104，R＝0.9996，结果见表3和图5；

表3  线性关系考察结果

结果表明，刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷在0.00103～0.05135mg间，刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷量与峰面积呈良好线性关系；

3.8.2精密度试验

取同一份刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品溶液，连续进样六次，计算其RSD值，结果见表4；

表4  精密度试验结果

结果显示，连续六次进样，平均峰面积为2694054，其RSD值为1.04%，说明本法精密度良好；

3.8.3重复性试验

    平行制备6份骨康胶囊成品（1.2g）供试品溶液进行测定，计算其RSD值，结果见表5；

表5  重复性试验结果

结果显示，平行制备6份骨康胶囊供试品溶液测定平均值为0.09672mg/g，其RSD值为1.82%，说明本方法重复性良好；

3.8.4溶液稳定性试验

取同一份骨康胶囊成品供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、24小时后进行测定，记录峰面积，计算RSD值，结果见表6；

表6  溶液稳定性试验结果

结果表明，同一份骨康胶囊成品供试品溶液在24小时内稳定，RSD值为2.21%，说明本法稳定性良好；

3.8.5 回收率

精密称取已知含量的同一批号样品内容物0.5g，共6份，分别按80%、100%、120%精密加入刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品，按供试品溶液的制备方法制备，并进样10μl测定， 结果见表7；

表7  加样回收试验结果

结果表明，平均回收率为104.69%，其RSD%值为0.74%，表明本法回收率良好；

3.9 含量测定

通过以上方法学验证，表明该方法线性、精密度、重复性、溶液稳定性及回收率均达到要求，适用于骨康胶囊成品中刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷的含量测定。我们对三批骨康胶囊进了含量测定，结果见表8；

表8 骨康胶囊成品含量测定结果

以上3批骨康胶囊成品中刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷含量约为0.03mg粒，标准可定为刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷不的低于0.02mg/粒。

  

二、指纹图谱研究：在建立了骨康胶囊含量测定方法的基础上，继续对骨康胶囊的指纹图谱进行研究，最终初步建立骨康胶囊指纹图谱体系，能有效控制产品质量；

1、样品与试剂

   样品：骨康胶囊 （批号：20100618、20100619、20100620、20100621、20100623、20100624、20100627、20100701、20100702、20100703）

   对照品：刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷  批号：20101107-2       纯度：98% 

   试剂：甲醇、磷酸为分析纯；甲醇为色谱纯

   仪器：岛津AUW-220D型十万分之一电子天平

         梅特勒AB104-N型万分之一电子天平

         Waters 2695-2996高效液相色谱仪

2、液相条件

   仪器：Waters 2695-2996高效液相色谱仪

   色谱柱：Diamonsil 二代C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）

   检测波长：330nm

   流速：1.0ml/min

   柱温：室温

流动相：乙腈为A，0.1%磷酸溶液为B

3、溶液制备

3.1 供试品溶液制备

取本品内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

3.2 对照品溶液制备

   取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品10.48mg，置100ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.1048mg/ml的对照品贮备液；再精密量取对照品贮备液2ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得 ；

3.3 测定

取十批骨康胶囊按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别取10μl供试品溶液注入液相色谱仪中，10批骨康胶囊测定色谱图合成对照指纹图谱见图6；

将10批骨康胶囊成品色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价***》2004年A版相似度软件，进行相似度评价。骨康胶囊成品指纹图谱相似度研究结果表9； 

表9   10批骨康胶囊成品指纹图谱相似度

结论：以图6中所标示的16个色谱峰作为多点校正，10批骨康胶囊成品指纹图谱相似度均在0.90以上。

附图说明： 

图1  刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品紫外光谱图；

图2  刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品色谱图；

图3  骨康胶囊供试品溶液色谱图； 

图4  骨康胶囊缺酢浆草阴性样品色谱图；

图5  刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷线性关系图；

图6  骨康胶囊成品指纹图谱。

  

具体实施方式：

实施例1：

骨康胶囊中的检测方法如下：

1、酢浆草含量测定

色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液（19∶81）为流动相；检测波长为330nm。理论板数按刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  精密称取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取骨康胶囊装量差异项下的内容物，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

2、指纹图谱检测

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为330nm。理论塔板数以刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计不得少于5000；

参照物溶液的制备  取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液制备  取本品内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

测定法  精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

   

实施例2：本方法还可用在骨康片中，其检测方法如下：

1、酢浆草含量测定

色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）为流动相；检测波长为330nm。理论板数按刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  精密称取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取20片骨康片，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

2、指纹图谱检测

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为330nm。理论塔板数以刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计不得少于5000；

参照物溶液的制备  取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液制备  取20片骨康片，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

测定法  精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

  

实施例3：本方法还可用在骨康颗粒中，其检测方法如下：

1、酢浆草含量测定

色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液（21∶79）为流动相；检测波长为330nm。理论板数按刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  精密称取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取骨康颗粒，研细，混匀，取4.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

2、指纹图谱检测

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为20cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为330nm。理论塔板数以刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计不得少于5000；

参照物溶液的制备  取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液制备  取骨康颗粒，研细，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

测定法  精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

   

实施例4：本方法还可用在骨康药酒中，其检测方法如下：

1、酢浆草含量测定

色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液（20∶80）为流动相；检测波长为330nm。理论板数按刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  精密称取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  精密量取骨康药酒20ml，置50ml量瓶中，加入20ml甲醇，超声处理30分钟，放冷，滴加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

2、指纹图谱检测

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为330nm。理论塔板数以刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计不得少于5000；

参照物溶液的制备  取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液制备   精密量取骨康药酒20ml，置50ml量瓶中，加入20ml甲醇，超声处理30分钟，放冷，滴加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。 

Claims (5)

1.骨康药物的质量控制方法，骨康药物由芭蕉根、酢浆草、续断、三七、补骨脂组成，其质量控制方法为：

【鉴别】（1）取本品内容物5g，加甲醇30ml，超声处理30分钟，滤过，滤液浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取芭蕉根对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法实验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60~90℃）-乙酸乙酯（20:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外灯（365nm）下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点或荧光斑点；

（2）取本品内容物5g，加甲醇40ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水15ml使溶解，用三氯甲烷20ml振摇提取，弃去三氯甲烷液，水溶液用水饱和的正丁醇振摇提取2次（20ml、15ml），合并正丁醇液，加氨试液洗涤2次（30ml、15ml），弃去氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取三七对照药材1g，加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液；再取三七皂苷R1、人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2～5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置过夜的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

【检查】  应符合胶囊剂项下的各项规定；

【含量测定】  补骨脂  照高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（42∶58）为流动相；检测波长为245nm；柱温40℃；理论板数按补骨脂素峰计算应不低于4500，补骨脂素峰和异补骨脂素峰的分离度应大于1.5；

对照品溶液的制备  取补骨脂素和异补骨脂素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含补骨脂素0.25mg、异补骨脂素0.2mg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备  取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.5g，精密称定，置25ml量瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜滤过，取滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，测定，即得 ；

本品每粒含补骨脂以补骨脂素（C₁₁H₆O₃）和异补骨脂素（C₁₁H₆O₃）的总量计，不得少于0.61mg；

其特征在于所述含量测定项目中还含有酢浆草中刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷的含量测定，其测定方法如下：

【含量测定】  酢浆草  照高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1%磷酸水溶液（15~25∶85~75）为流动相；检测波长为330nm；理论板数按刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计算应不低于3000；

对照品溶液的制备  精密称取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含2μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  取骨康药物装量差异项下的内容物，混匀，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理20~60分钟，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5~20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于骨康药物每粒含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷（C₂₂H₂₂O₁₀）计不得少于0.02mg。

3.骨康药物的质量控制方法，其特征在于增加了指纹图谱的检查方法，其检测方法为：

【指纹图谱】照高效液相色谱法测定；

色谱条件与***适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，其洗脱方法为：0～10分钟使用10%流动相A和90%流动相B，10～30分钟流动相A由10%渐变到30%，流动相B由90%渐变到70%，30～60分钟流动相A由30%渐变到50%，流动相B由70%渐变到50%，60～100分钟流动相A由50%渐变到70%，流动相B由50%渐变到30%；流速为1.0ml/min；检测波长为330nm；

理论塔板数以刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷计不得少于5000；

参照物溶液的制备  取刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含刺槐素-6-C-β-D-葡萄糖苷0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液制备  取骨康药物内容物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，称重，超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；

测定法  精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

4.根据权利要求3所述的质量控制方法，其特征在于所述的指纹图谱：按中药色谱指纹图谱相似度评价***，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

5.如权利要求1—4中任意一项所述的质量控制方法，其特征在于该方法还适用于片剂、颗粒剂、滴丸剂、注射剂、煎膏剂、糖浆剂、合剂、酒剂、丸剂、散剂。

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