CN109374764A - 一种八味龙钻颗粒hplc指纹图谱及主要成分含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可同时用于八味龙钻颗粒主要成分HPLC指纹图谱定性与定量分析的方法。该法采用70％甲醇超声辅助提取，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈‑0.1％磷酸水溶液为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂的特征定性指纹图谱及7种主要活性成分的含量。经科学实验证明，该方法操作简便、快速，重复性和稳定性好，指纹图谱特征性强，含量测定结果准确，可用于八味龙钻颗粒产品的质量控制。

Description

一种八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱及主要成分含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种可同时用于八味龙钻颗粒主要成分定性与定量分析的方法，更确切地讲是一种八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱定性与7种主要功效相关成分没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素定量的同时检测方法，属于复方中药制剂的分析检测领域。

背景技术

八味龙钻颗粒是在挖掘总结壮医药治疗类风湿关节炎的传统药物的基础上及“壮医毒论”的内涵，按照壮医理论配伍的临床验方研发的壮成药。该方主要由飞龙掌血、大钻、两面针、青风藤、鸡血藤、九龙藤、八角枫及五指毛桃八味药组成，均具有抗炎、镇痛、抗风湿、免疫抑制之功效，对治疗类风湿关节炎疗效显著。方中的九龙藤、鸡血藤等常用于治疗风湿性免疫病，九龙藤具有较强的镇痛抗炎活性，是壮医风湿免疫病专科常用药，鸡血藤具有活血补血，通络、祛风除湿功效；青风藤具有祛风散瘀、利湿止痛的功效，五指毛桃可以健脾益气，化湿舒筋，行气止痛。现代药理研究表明，飞龙掌血的生物总碱、乙醇提取物和水提物均有镇痛抗炎作用；两面针具有消肿止痛作用，大血藤(大钻)中红景天苷有抗疲劳、抗炎、抗衰老、免疫调节等多种药理作用，是大钻的活性成分之一；青藤碱具有抗炎、镇痛、抗风湿等药理作用；补骨脂素常被用作五指毛桃药材的质量控制指标；而橙皮苷具有抗炎、调节免疫等的药理活性；氯化两面针碱在抗炎方面作用显著；没食子酸和原儿茶酸均具有明显的抗氧化、抑制血小板聚集作用；儿茶素具有一定的促进造血细胞增殖的作用，是鸡血藤补血活血的主要物质基础。而没食子酸具有抗菌、抗氧化及抗肿瘤的药理作用。以上各类成分均与该制剂功效密切相关。到目前为止，尚未有只用一个色谱***就可同时测定能体现八味龙钻颗粒药材特征信息的指纹图谱及同时测定制剂中主要特征成分含量的测定方法报道。

发明内容

本发明的解决方案是提供一种可同时测定能体现八味龙钻颗粒主要药材信息的特征指纹图谱及同时测定制剂中7种功效相关的主要特征成分含量的测定方法，该法采用70％甲醇超声辅助提取，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂的特征定性指纹图谱及7种主要活性成分的含量。经科学实验证明，该方法操作简便、快速，重复性和稳定性好，指纹图谱特征性强，含量测定结果准确，可用于八味龙钻颗粒产品的质量控制。

本发明八味龙钻颗粒特征指纹图谱及7种功效相关成分含量测定的检测方法包括以下步骤：

1.对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成适当浓度的对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含一定浓度没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.供试品溶液的制备：精密称取八味龙钻颗粒适量，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇适量，称定重量，超声，放冷到室温，再次称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，续滤液离心，取上清液作为供试品溶液。

3.色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长分别为270nm和245nm。

4.测定方法：分别精密吸取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的混合对照品溶液及供试品溶液各适量，按上述色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，计算，即得。

经过研究，本发明优化的八味龙钻颗粒特征指纹图谱及7种功效相关成分含量测定的检测方法按以下步骤实施：

1.对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成适当浓度对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含没食子酸0.05～0.10mg/mL、含原儿茶酸和补骨脂素浓度为0.005～0.01mg/mL，含青藤碱、红景天苷、儿茶素浓度为0.1～0.3mg/mL、含橙皮苷浓度为0.01～0.05mg/mL的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.供试品溶液的制备：取八味龙钻颗粒3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL 70％甲醇，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液离心，取上清液，即得供试品溶液；

3.色谱条件及色谱适用性试验：以Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱为固定相，乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～10min，6％A：10～20min，12％A；20～30min，19％A；30～40min，27％A；40～50min，35％A；50～60min，45％A；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长为0～50min：270nm，50～60min：245nm；进样量10μL；色谱柱柱效以青藤碱计不小于30000。

4.测定方法：分别精密吸取上述含一定浓度没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的混合对照品溶液及供试品溶液各10μl，按上述的色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，计算，即得。

本发明与现有技术相比，其主要优点及积极效果在于：

(1)本发明的检测方法，通过采用波长转换技术，只用一个色谱条件便可同时测定该制剂的特征指纹图谱及制剂中没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素7种功效相关成分的含量。

(2)本发明的检测方法，简便、快速，易于操作，没有繁琐的操作过程。

(3)本发明的检测方法具有简便、快速、稳定，重复性及重现性好、准确性高，易于掌握和操作的特点。

本发明的检测方法，是通过大量实验摸索得到的切实可行的方法，具有可重复性和较好的稳定性，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它实施方案，但只要使用本发明所述的检测方法，均在本发明保护范围之内。

附图说明：

附图1青藤碱等7种混合对照品溶液HPLC-UV图谱

附图2八味龙钻颗粒供试品溶液中7种成分含量测定HPLC-UV图谱

附图3八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱叠加图

附图4八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱共有模式

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在说明本发明，并不构成对本发明的限制。

实施例1八味龙钻颗粒中7种主要成分的含量测定

1仪器与试药

1.1仪器

Agilent-1260高效液相色谱仪；二极管阵列紫外检测器；超声清洗器(KQ5200，昆山市超声仪器有限公司)；离心机(TGL-16G，上海安亭科学仪器厂)；电子天平(十万分之一，SQP，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；密思博超纯水机等。

1.2试药

对照品没食子酸(Gallic acid)(110831-201605，含量90.8％)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)(110809-201205，含量99.9％)、青藤碱(Sinomenine)(110774-200507，含量99.1％)、红景天苷(Salidroside)(110818-2015007，含量99.4％)、儿茶素((+)-Catechin)(110877-201604，含量99.2％)、橙皮苷(Hesperidin)(110721-201617，含量96.7％)及补骨腊素(Psoralen)(110739-201617，含量99.1％)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯；Fisher公司)；甲醇、磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为超纯水。

10批八味龙钻颗粒(10g/每袋，每袋相当于原药材35克，实验用各样品批号见表4)，均由广西中医药大学制药厂提供；实验所用的原药材八角枫、大钻、飞龙掌血、鸡血藤、两面针、九龙藤、五指毛桃、青风藤均采购自广西广西玉林市祥生中药饮片有限责任公司，经广西中医药大学制药厂质量保证部罗宇东副主任药师鉴定，飞龙掌血、大钻、两面针等8种药材均符合《广西瑶药材质量标准》的相关要求。

2方法与结果

2.1色谱条件及***适用性试验

以Phenomenex Gemini C18(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱为固定相，乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～10min，6％A；10～20min，12％A 20～30min，19％A30～40min，27％A；40～50min，35％A；50～60min，45％A；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长为0～50min：270nm，50～60min：245nm；进样量10μL；色谱柱柱效以青藤碱计不小于30000。在此色谱条件下，处方中其它成分对测定无干扰。八味龙钻颗粒中7种主要成分的混合对照品溶液及八味龙钻颗粒供试品溶液的HPLC-UV图谱分别见附图1和附图2。

2.2对照品及供试品溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备

精密称取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解制成对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素浓度分别为0.0696mg/mL、0.0087mg/mL、0.2046mg/mL、0.2564mg/mL、0.1004mg/mL、0.0243mg/mL、0.0071mg/mL的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用。

2.2.2供试品溶液的制备

精密称取八味龙钻颗粒3g，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL 70％甲醇，称定重量，超声20min(功率200W，频率40kHz)，放冷到室温，再次称重，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，续滤液离心，取上清液作为供试品溶液。

2.3测定法

分别精密吸取上述含一定浓度没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的混合对照品溶液及供试品溶液各10μl，按上述的色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，计算，即得。

2.4方法学考察

2.4.1***适用性试验

分别取对照品溶液、样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，用二极管阵列检测器进行检测，结果显示没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素这7个成分的色谱峰保留时间与UV光谱与样品中相应色谱峰保留时间与UV光谱一致，各峰分离度较好，拖尾因子均在0.95～1.05之间，样品中其他成分对这7个成分的测定无干扰，色谱柱理论塔板数以青藤碱计不小于30000，结果见附图1和附图2。

2.4.2线性关系的考察

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，采用自动进样器，分别精密取4、6、8、10、12、14μL注入色谱仪分析，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录相应色谱峰的峰面积，分别以峰面积Y为纵坐标，进样量(μg)X为横坐标，求得线性回归方程及线性相关系数(r)，结果见表1。

表1回归方程及线性范围

2.4.2精密度试验

取“2.2.1”项下的混合对照品溶液，按“2.1”色谱条件测定，连续进样6次，分别测得没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素峰面积的RSD分别为1.3％、1.3％、0.77％、0.87％、1.1％、0.94％及1.2％，显示仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验

取八味龙钻颗粒(批号20170501)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h，依次测得没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素峰面积的RSD分别为1.2％、1.1％、1.4％、1.8％、1.0％、1.0％、及1.2％，显示样品溶液在24h内稳定。

2.4.4重复性试验

精密称取八味龙钻颗粒(批号20170501)6份，各3.0g，按“2.2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素峰的平均含量分别为：0.6959mg/g、0.1364mg/g、3.5620mg/g、3.6991mg/g、1.2136mg/g、0.3234mg/g、0.07650mg/g，RSD分别为0.71％、1.9％、2.0％、1.5％、2.0％、1.5％及1.5％，表明该方法的重复性良好。

2.4.5加样回收率试验

取八味龙钻颗粒(批号20170501)(没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素平均含量分别为0.6959、0.1364、3.5620、3.6991、1.2136、0.3234、0.07650mg/g)约1.5g，共6份，精密称定，分别精密加入没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品各1.0500mg、0.2050mg、5.5000mg、5.6000mg、1.8200mg、0.4800mg及0.1200mg。按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测定各峰面积，计算各成分的加样回收率分别为103.6％、102.1％、102.5％、99.6％、103.2％、99.2％及98.5％，RSD分别为1.1％、1.0％、1.4％、1.7％、1.4％、0.92％、及1.3％，表明方法准确度良好，见表2。

表2 7个成分的回收率试验结果(n＝6)

2.5样品测定

取10批八味龙钻颗粒各2份，各约3g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，根据测得的峰面积，计算样品中各成分的平均含量，结果见表3。

表3样品含量测定结果(n＝2)(mg/g)

实施例2八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱研究与测定

1仪器与试药：同实施例一。

2方法与结果：同实施例一。

2.1色谱条件及***适用性试验：同实施例一。

2.2对照品及供试品溶液的制备：同实施例一。

2.3测定法：同实施例一。

2.4八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱方法学考察与测定

2.4.1稳定性试验

取八味龙钻颗粒(批号20170501)，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别在0、2、4、8、12、24h测定，以6号峰(青藤碱)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除参照峰青藤碱外其余11个共有峰的相对保留时间RSD在0.33％～1.8％之间，相对峰面积RSD在0.88％～1.7％之间，实验结果显示，八味龙钻颗粒供试品溶液在24h内稳定，符合指纹图谱测定的相关要求和规定。

2.4.2精密度试验

取八味龙钻颗粒(批号20170501)，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，测定HPLC色谱图，以6号峰(青藤碱)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除青藤碱外其余11个共有峰的相对保留时间RSD在0.40％～1.6％之间，相对峰面积RSD在0.62％～1.8％之间，表明仪器精密度良好，并符合指纹图谱测定的相关要求和规定。

2.4.3重复性试验

取同一批次八味龙钻颗粒样品(批号20170501)6份，各约3g，精密称定，按“2.2.2”项下的方法制备，在“2.1”项色谱条件下测定，以6号峰(青藤碱)的保留时间和色谱峰面积为参照，计算得到除青藤碱外其余11个共有峰的相对保留时间的相对保留时间RSD在0.18％～1.2％之间，相对峰面积RSD在0.33％～1.8％之间，结果表明该方法重复性良好，符合指纹图谱的要求。

2.4.4八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱的建立

取八味龙钻颗粒样品10批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下的色谱条件下测定分析，见附图3。建立八味龙钻颗粒HPLC指纹图谱的共有模式图谱(平均值)，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价***》进行分析，见附图4。在对照图谱上共生成12个共有峰，其中，对照图谱中6号色谱峰(青藤碱)分离度较好，色谱响应值较高，保留时间居中，因此选择6号峰(青藤碱)为参照峰。八味龙钻颗粒指纹图谱相似度评价采用“中药色谱指纹图谱相似度评价***(2012.130723版)”，对10批次八味龙钻颗粒的指纹图谱的检测数据进行处理分析其相似度计算结果见表1。由表1可知，各个批次八味龙钻颗粒的相似度均在0.989以上，相似性良好。表明各批样品中所含指标性成分的一致性较好。

表1 10批八味龙钻颗粒与对照指纹图谱的相似度

2.4.5 HPLC指纹图谱主要共有特征峰归属分析

分别精密吸取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析测定，采用二极管阵列检测器同时记录色谱图和各峰的紫外吸收光谱，并与指纹图谱共有模式中的各主要主要共有峰进行对比，结果显示指纹图谱共有模式中的3、5、6、7、9、10、12号特征峰的保留时间及其光谱分别与没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品的保留时间及紫外吸收光谱一致，因此确认八味龙钻颗粒图谱的3号峰为没食子酸，5号峰为原儿茶酸，6号峰为青藤碱，7号峰为红景天苷，9号峰儿茶素，10号峰为橙皮苷，12号峰为补骨脂素。

Claims (5)

1.一种可用于八味龙钻颗粒主要成分的定性与定量分析的同时检测方法，其特征在于该法采用70％甲醇为溶剂超声辅助提取，仅用一个色谱条件就可同时测定该制剂的HPLC指纹图谱及7种主要成分的含量。

2.如权利要求1所述的八味龙钻颗粒，是由飞龙掌血、大钻、两面针、青风藤、鸡血藤、九龙藤、八角枫及五指毛桃八味药制备而成的颗粒剂。

3.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件包括：

以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长分别为270nm和245nm。

4.如权利要求1所述的检测方法，其测定的色谱条件为：

以Phenomenex Gemini C₁₈(250mm×4.6mm i.d.，5μm)色谱柱为固定相，乙腈(A)-0.1％磷酸水(B)为流动相，其梯度洗脱的体积百分比条件是：0～10min，6％A；10～20min，12％A；20～30min，19％A；30～40min，27％A；40～50min，35％A；50～60min，45％A；柱温为25～30℃；流速为1ml/min；检测器为紫外检测器，检测波长为0～50min：270nm，50～60min：245nm；进样量10μL；色谱柱柱效以青藤碱计不小于30000。

5.如权利要求1所述的检测方法，其试样溶液的制备及测定方法包括：

(1)对照品溶液的制备：精密称取没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素对照品适量，加甲醇溶解，分别制成适当浓度对照品储备液。另取上述溶液适量，置于同一量瓶中，加甲醇稀释，制成含没食子酸0.05～0.10mg/mL、含原儿茶酸和补骨脂素浓度为0.005～0.01mg/mL，含青藤碱、红景天苷、儿茶素浓度为0.1～0.3mg/mL、含橙皮苷浓度为0.01～0.05mg/mL的混合对照品溶液，置于冰箱贮存，备用；

(2)供试品溶液的制备：取八味龙钻颗粒3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50mL70％甲醇，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液离心，取上清液，即得供试品溶液；

(3)测定方法

分别精密吸取上述含一定浓度没食子酸、原儿茶酸、青藤碱、红景天苷、儿茶素、橙皮苷及补骨脂素的混合对照品溶液及供试品溶液各10μl，按权利要求3、4所述的色谱条件注入高效液相色谱仪，测定相应峰面积，计算，即得。