CN103451176A

CN103451176A - 一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法

Info

Publication number: CN103451176A
Application number: CN2013104278825A
Authority: CN
Inventors: 李海云; 余艳葵; 阮贵华; 李子院
Original assignee: Guilin University of Technology
Current assignee: Guilin University of Technology
Priority date: 2013-09-21
Filing date: 2013-09-21
Publication date: 2013-12-18

Abstract

本发明提供了一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法。利用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶对K₂ZrF₆锆前驱体仿生锆化的诱导效应，在诱导仿生锆化的过程中实现蛋白酶的固定化，获得以氧化锆为载体的固定化蛋白酶。本发明克服了现有传统固定化方法存在的固定化过程复杂、酶与载体的生物相容性差、其与载体之间的结合作用相对较弱、固定化酶的稳定性差、使用寿命低以及固定化反应条件通常较剧烈而造成酶的失活等缺陷，具有固定化过程简单、无需额外的诱导剂、条件温和、效率高、可重复利用等优点。

Description

一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，特别涉及一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法。

背景技术

蛋白酶具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、绿色环保等优点。已在食品、医药、环境等领域得到广泛应用。然而在自然状态下，大多数酶是水溶性的，使得游离状态下的酶在生物催化过程中的应用受到很大的限制，主要表现在游离酶的稳定性差、不能循环使用、生成的产物难于从反应混合物中分离、纯化等。进行酶的固定化是解决上述问题的有效方法，所以探索酶的固定化载体和固定化方法，制备高活性、高稳定性、高机械强度的固定化酶将有重要的理论和实际意义。

现有的常用酶固定化方法大致可分为4类：吸附法、交联法、共价结合法、包埋法。吸附法操作简便，且对酶构象的破坏小，但是酶与载体的结合力弱，酶固定化后易脱落；交联法的反应条件较激烈，酶分子中有些基团被交联，会导致酶活回收率降低较大；共价结合法则要求酶具有特殊的能够与载体发生偶联反应的官能团，但剧烈的化学反应常会造成酶的失活，通常情况下酶活力回收率仅有30%左右；与吸附法、交联法、共价结合法相比，包埋法用到的载体的制备方法具有所需反应条件温和、酶分子不易泄漏、对生物活性单元失活作用小及可固定高浓度的生物活性单元等优点。酶被包在高聚物的网格中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微囊型两种，又由于载体可将酶与外界环境隔开，所以还有助于提高酶的稳定性。包埋法所具有得较普遍的适用性，使其近年来得到了广泛的关注。

目前固定化酶载体价格昂贵，多数固定化酶的活力热稳定性还不够高，操作半衰期也不够长，很难以实现工业上的连续化生产。在改进传统载体材料的同时，研究开发新型材料成为今后固定化酶载体研究的主要方向。随着材料仿生学的不断发展，固定化酶领域的研究人员将仿生的思想，特别是结构仿生和过程仿生的思想引入到固定化酶载体这种特殊材料的设计和制备中，开发出了新型的固定化酶载体。

模拟生物矿化的仿生矿化就是将生物矿化的机理引入无机材料的合成，以有机物组装体为模板，去控制无机物形成，制备具有特殊组装方式和多级结构特点的有机无机复合体，使材料具有优异的物理化学性能。诱导仿生矿化的基本方法一般是利用诱导剂诱导带有负电的无机前驱体(如正硅酸乙酯、氟锆酸钾、二氢氧化二铵合钛等)水解并缩聚生成氧化物，同时将酶包埋于氧化物颗粒之中，形成固定化酶，在材料学、工业生产、化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

目前利用仿生矿化进行酶固定化的一般方法是利用精蛋白等碱性蛋白作为诱导剂。由于体系中加入了额外的蛋白质诱导剂，该方法只适用于非蛋白质水解酶类的固定化而不宜进行蛋白质水解酶类的固定化。本发明利用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对仿生锆化的诱导作用实现仿生矿化固定化，体系中不需额外加入蛋白诱导剂，克服了上述方法的不足。目前利用自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服传统固定化方法的缺陷，提供一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法。

具体步骤为：

室温下，在固定化反应器中加入8~12 mL浓度为0.01~0.05 mol/L 的锆前驱体溶液，然后加入8~24 mL用pH 6.0~8.0、浓度0.02 mol/L~0.12 mol/L的缓冲液配制的浓度为4 mg/mL~12 mg/mL 游离蛋白酶溶液，使锆前驱体溶液与游离蛋白酶溶液的体积比为1:1~2；轻轻搅拌5 min，5000 rpm冷冻离心10 min，收集沉淀；沉淀用蒸馏水洗涤3次后，冷冻干燥，得到固定化酶。

所述游离蛋白酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种。

所述锆前驱体溶液为K₂ZrF₆溶液。

所述缓冲液为磷酸盐（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合）缓冲液。

本发明的优点和效果在于：游离酶的固定化过程简单，条件温和，时间缩短，生物相容性好，能耗降低；固定化酶的酶活回收率和包埋率较高；固定化的酶稳定性好。

附图说明

图1为本发明实施例1仿生锆化固定化菠萝蛋白酶、二氧化锆标准参照及K₂ZrF₆的红外光谱图。

图中：A-二氧化锆；B-固定化菠萝蛋白酶；C- K₂ZrF₆。

具体实施方式

下述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合配制的缓冲液。

实施例1：

室温下，在固定化反应器中加入10 mL 0.02 mol/L K₂ZrF₆溶液，再向固定化反应器中加入20 mL用pH 7.5、浓度为 0.10 mol/L磷酸盐缓冲液配制的浓度为6 mg/mL菠萝蛋白酶溶液，使K₂ZrF₆溶液与菠萝蛋白酶溶液的体积比为1:2；轻轻搅拌5 min，5000 rpm冷冻离心10 min，收集沉淀。蒸馏水洗涤沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后将沉淀冷冻干燥24 小时，所得的固定化酶酶活回收率为59.52%，菠萝蛋白酶包埋率为63.03%，同批固定化酶重复使用6次后酶活仍可保持60%以上。

所获的固定化菠萝蛋白酶，样品研细后，溴化钾压片，采用傅立叶红外光谱仪测定其红外光谱，如图1所示。对比固定化菠萝蛋白酶（图1-B）与锆前驱体K₂ZrF₆（图1-C）可知，经菠萝蛋白酶诱导锆前驱体K₂ZrF₆锆化后，在3360 cm^-1、2977 cm^-1、1667 cm^-1、1557 cm^-1、537 cm^-1等波数处出现新的谱峰，其中3360 cm^-1归属于菠萝蛋白酶分子中的酰胺基中的胺基基团，2977 cm^-1归属于烷基，1667 cm^-1和1557 cm^-1是由酰胺基中的羰基伸缩振动引起的，表明菠萝蛋白酶诱导K₂ZrF₆锆化产生的沉淀中确实包埋有菠萝蛋白酶。对比固定化菠萝蛋白酶（图1-B）与二氧化锆（图1-A）可知，在500~600 cm^-1范围内均有明显吸收，这是由Zr-O-Zr伸缩振动引起的，表明在菠萝蛋白酶的诱导下，K₂ZrF₆锆化确实生成了二氧化锆。结果表明，菠萝蛋白酶可作为模板诱导K₂ZrF₆锆化生成二氧化锆且菠萝蛋白酶分子本身被包埋在沉淀中从而实现固定化。

实施例2：

室温下，在固定化反应器中加入10 mL 0.035 mol/L K₂ZrF₆溶液，再向固定化反应器中加入10 mL用pH 8.0 、浓度为0.08 mol/L磷酸盐缓冲液配制的浓度为8 mg/mL胰蛋白酶溶液，使K₂ZrF₆溶液与胰蛋白酶溶液的体积比为1:1；轻轻搅拌5 min，5000 rpm冷冻离心10 min，收集沉淀；蒸馏水洗涤沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后将沉淀冷冻干燥24 小时，所得的固定化酶酶活回收率为46.69%，胰蛋白酶包埋率为63.03%，同批固定化酶重复使用5次后酶活仍可保持60%以上。

实施例3：

室温下，在固定化反应器中加入10 mL 0.02 mol/L K₂ZrF₆溶液，再向固定化反应器中加入20 mL用pH 6.5、浓度为 0.08 mol/L磷酸盐缓冲液配制的浓度为8 mg/mL木瓜蛋白酶溶液，使K₂ZrF₆溶液与木瓜蛋白酶溶液的体积比为1:2；轻轻搅拌5 min，5000 rpm冷冻离心10 min，收集沉淀；蒸馏水洗涤沉淀3次，收集洗液、合并上清液，然后将沉淀冷冻干燥24 小时，所得的固定化酶酶活回收率为54.45%，木瓜蛋白酶包埋率为89.15%，同批固定化酶重复使用6次后酶活仍可保持60%以上。

Claims

1.一种基于自诱导仿生锆化固定化蛋白酶的方法，其特征在于具体步骤为：

室温下，在固定化反应器中加入8~12 mL浓度为0.01~0.05 mol/L 的锆前驱体溶液，然后加入8~24 mL用pH 6.0~8.0、浓度0.02 mol/L~0.12 mol/L的缓冲液配制的浓度为4 mg/mL~12 mg/mL 游离蛋白酶溶液，使锆前驱体溶液与游离蛋白酶溶液的体积比为1:1~2；轻轻搅拌5 min，5000 rpm冷冻离心10 min，收集沉淀；沉淀用蒸馏水洗涤3次后，冷冻干燥，得到固定化酶；

所述游离蛋白酶为菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种；

所述锆前驱体溶液为K₂ZrF₆溶液；

所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠混合制成。