CN1321191C - 一种用固定化酶生产壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及壳寡糖的制备，具体地说是一种用固定化酶生产壳寡糖的方法，按如下步骤进行操作：1)固定化介质的活化：将固定化介质与耦联剂反应，温度20-110℃，时间5-24小时，耦联剂的用量为3%-30%(v/v)；2)固定化酶的制备：将酶与活化的固定化介质于磷酸盐缓冲溶液中反应，使酶固定在介质的表面，反应体系的pH为3.0-8.0，温度0-25℃，时间24-48小时，酶的量为2-10mg酶/g湿重固定化介质；3)壳寡糖的制备：在搅拌条件下，将溶于反应介质中的壳聚糖与固定化酶进行酶降解反应，制得壳寡糖；反应结束后，过滤回收固定化酶。本发明的优点为：成本低，固定化酶可以重复使用，适应于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及壳寡糖的制备，具体地说是一种用固定化酶生产壳寡糖的方法。
背景技术
壳寡糖是指β-1，4连接的，由2-10个2-氨基葡萄糖残基构成的低聚糖，它具有增强机体免疫力，抑制肿瘤生长；促进双歧杆菌增殖，抑制肠道有害菌生长；阻碍病原菌的生长繁殖，增强植物对病虫害的防御能力等等多种功能，因而被广泛应用于医药、保健食品及农业生产等多个领域。壳寡糖通常由壳聚糖降解而获得，降解方法有酸降解、氧化降解和酶降解，酶降解是现在常用的降解方法。
现在壳寡糖的生产多采用游离酶降解壳聚糖方法，由于游离酶溶解于反应体系中，尚没有简单的方法将其从反应体系中分离出来，酶只使用一次就被丢掉了；酶在降解反应完成后无法回收，造成壳寡糖的生产成本高，产品价格高；因此，在壳寡糖的生产成本中，酶占有相当大的比重，降低该部分成本是降低总成本的关键。又由于游离酶的水溶特征，游离酶降解壳聚糖多采用间歇搅拌反应方式，效率低，周期长，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种酶可以回收并重复利用的用固定化酶降解壳聚糖生产壳寡糖的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
用固定化酶生产壳寡糖的方法，按如下步骤进行操作：
1)固定化介质的活化
将固定化介质与耦联剂于液相介质中进行反应，反应温度为20-110℃，反应时间5-24小时，耦联剂的用量为反应体系体积的3％-30％(v/v)；
2)固定化酶的制备
将酶与步骤1)活化的固定化介质子0-0.2M磷酸盐或醋酸盐缓冲溶液中进行反应，使酶固定在介质的表面，该反应体系的pH为3.0-8.0，反应温度为0-25℃，反应时间为24-48小时，酶的量为2-10mg酶/g湿重固定化介质；
3)壳寡糖的制备
在搅拌条件下，将溶于反应介质水或弱酸溶液中的壳聚糖，于30-50℃下，与步骤2)制备的固定化酶进行酶降解反应，壳聚糖与反应体系的重量体积比为0.5-3.0％(w/v)，固定化酶与反应体系的重量体积比为2-10％(w/v)，反应时间10-50小时，即制得壳寡糖；反应结束后，过滤回收固定化酶。
固定化介质可为无机或有机的多孔或徼孔材料，如分子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂等；耦联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、环氧氯丙烷或戊二醛等；所述酶通常为几丁质酶、壳聚糖酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、蜗牛酶等的一种酶或几种酶的混合物。酶降解反应为可在搅拌釜中进行的间歇或连续搅拌反应；或是将固定化酶装入填充床、流化床或膜生物反应器等反应器中，将壳聚糖溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应；液相介质可为有机相或水相，其中有机相为甲苯或二甲苯；所述弱酸溶液为稀的无机酸或小分子的有机酸溶液，如稀盐酸、甲酸、乙酸、丙酮酸、乳酸溶液等。
本发明同游离酶降解壳聚糖生产壳寡糖方法相比较，具有如下优点：
1.成本低，固定化酶可以重复使用。本发明采用固定化酶生产壳寡糖，由于将酶固定化，实现了降解反应后酶可以回收并重复利用，从而大大降低壳寡糖的生产成本；此外，本发明所用的固定化介质价格低廉，固定化酶方法简单有效，也使得该法的成本降低。
2.适应于规模化生产。固定化酶反应过程较游离酶反应过程操作灵活，可选择多种反应方式及反应器，该方法采用固定化酶，适合间歇或连续等多种反应方式，如在搅拌釜中进行的间歇或连续搅拌反应或是将固定化酶装入填充床或流化床或膜生物反应器等反应器中，将壳聚糖溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应，极有利于实现工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明的技术进一步说明。
实施例1：多孔氧化铝微球固定化壳聚糖酶
将预先脱水脱气的18目多孔氧化铝微球装入玻璃容器，加入30％(v/v)氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液至浸没多孔氧化铝微球，加热使甲苯回流12h；取已反应完毕的多孔氧化铝微球，依次用甲苯、异丙醇、水洗涤，然后将该多孔氧化铝微球加入到25％(v/v)戊二醛水溶液中，30℃，搅拌反应1h，水洗，即为活化的多孔氧化铝微球；将已活化的多孔氧化铝微球加入壳聚糖酶的磷酸盐缓冲液中(0.2M，pH6.0；酶浓度2mg/ml，总酶量6mg酶/克湿重活化的多孔氧化铝微球)，4℃反应24h，间歇搅拌。酶活收率40％。
实施例2：分子筛固定化壳聚糖酶
取3、4、5分子筛，同实施例1方法活化，将已活化的分子筛加入壳聚糖酶的磷酸盐缓冲液中(0.2M，pH6.0；酶浓度2mg/ml，总酶量4mg酶/g湿重活化的分子筛)，4℃反应24h，间歇搅拌。酶活收率20-30％。
实施例3：多孔玻璃珠固定化壳聚糖酶
取多孔玻璃珠同实施例2方法固定化壳聚糖酶，酶活收率30％。
实施例4：吸附树脂固定化壳聚糖酶
取吸附树脂各5g(湿重)分别加入到5ml的水、0.02M pH6.0、0.1M pH6.0及0.02M pH8.0磷酸盐缓冲溶液中，将壳聚糖酶添加到上述四种溶液中，以四种溶液在280nm处光密度值(OD280)检测吸附树脂D3520、D4006、X-5、HZ801、HZ802、HZ803吸附壳聚糖酶的量，壳聚糖酶在不同吸附树脂及不同溶液中的吸附量不同，从2mg酶/g湿重吸附树脂至8mg酶/g湿重吸附树脂，其中HZ801在0.1M pH6.0磷酸盐缓冲溶液中吸附量最大，为8mg酶/g湿重吸附树脂。将吸附壳聚糖酶的HZ801吸附树脂重新悬浮于水中，20℃，搅拌状态下滴加8％(v/v)戊二醛水溶液，反应2h，使壳聚糖酶固定于吸附树脂上，酶活收率60％。
实施例5：吸附树脂固定化几丁质酶
取几丁质酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率60％。
实施例6：吸附树脂固定化纤维素酶
取纤维素酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为7mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率40％。
实施例7：吸附树脂固定化菠萝蛋白酶
取菠萝蛋白酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率60％。
实施例8：吸附树脂固定化中性蛋白酶
取中性蛋白酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率70％。
实施例9：吸附树脂固定化溶菌酶
取溶菌酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率40％。
实施例10：吸附树脂固定化脂肪酶
取溶菌酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率20％。
实施例11：吸附树脂固定化蜗牛酶
取蜗牛酶同实施例4方法固定于吸附树脂上，HZ801吸附树脂吸附量为8mg酶/g湿重吸附树脂，戊二醛固定化酶活收率80％。
实施例12：离子交换树脂固定化壳聚糖酶
取弱阴离子交换树脂D301R、D392，依次用乙醇，水，1N氢氧化钠，5％氯化钠，1N盐酸，1N氢氧化钠，水清洗；脱气；每毫升树脂滴加7％戊二醛水溶液20毫升，室温搅拌反应24h；水清洗后将树脂悬浮于pH5.0，0.2M醋酸盐缓冲液中，加入壳聚糖酶4℃反应24h，间歇搅拌，酶用量为5mg/ml树脂。
实施例13：离子交换树脂固定化蜗牛酶
取蜗牛酶同实施例12方法固定于离子交换树脂D392上，酶用量为8mg/ml树脂。
实施例14：离子交换树脂固定化中性蛋白酶
取蜗中性蛋白酶同实施例12方法固定于离子交换树脂D392上，酶用量为8mg/ml树脂。
实施例15：固定化酶降解壳聚糖反应1
在玻璃反应器中，将1g壳聚糖溶于100ml的1％醋酸溶液中，加入2ml实施例12所述的固定化壳聚糖酶，38℃搅拌反应；2h后停止反应，过滤，用水清洗固定化酶，重新将该固定化酶投入反应器进行上述反应；共重复进行15次反应，固定化酶活性没有明显变化。
实施例16：固定化酶降解壳聚糖反应2
在不锈钢反应器中，将20g壳聚糖溶于2000ml的1％醋酸溶液中；将80ml实施例13所述的固定化蜗牛酶装入玻璃柱中，制成固定化酶柱；将壳聚糖溶液泵入固定化酶柱进行反应，反应流出液回到不锈钢反应器中，如此循环反应，反应温度50℃，反应时间20h；反应完成后，放掉反应液，用水清洗固定化酶柱，重新开始上述反应；共进行28批反应，固定化酶活性仍保留80％以上。
Claims (4)
1.一种用固定化酶生产壳寡糖的方法，其特征在于按如下步骤进行操作：
1)固定化介质的活化
将固定化介质与耦联剂于液相介质中进行反应，反应温度为20-110℃，反应时间5-24小时，耦联剂的用量为反应体系体积的3％-30％；
2)固定化酶的制备
将酶与步骤1)活化的固定化介质于0-0.2M磷酸盐或醋酸盐缓冲溶液中进行反应，使酶固定在介质的表面，该反应体系的pH为3.0-8.0，反应温度为0-25℃，反应时间为24-48小时，酶的量为2-10mg酶/g湿重固定化介质；
3)壳寡糖的制备
在搅拌条件下，将溶于反应介质水或弱酸溶液中的壳聚糖，于30-50℃下，与步骤2)制备的固定化酶进行酶降解反应，壳聚糖与反应体系的重量体积比为0.5-3.0％，固定化酶与反应体系的重量体积比为2-10％，反应时间10-50小时，即制得壳寡糖；反应结束后，过滤回收固定化酶；
所述固定化介质为分子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂；所述耦联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、环氧氯丙烷或戊二醛；所述液相介质为有机相或水相。
3.根据权利要求1所述用固定化酶生产壳寡糖的方法，其特征在于：所述酶为几丁质酶、壳聚糖酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶、脂肪酶、蜗牛酶的一种酶或几种酶的混合物。
4.根据权利要求1所述用固定化酶生产壳寡糖的方法，其特征在于：所述酶降解反应为在搅拌釜中进行的间歇或连续搅拌反应；或是将固定化酶装入填充床、流化床或膜生物反应器反应器中，将壳聚糖溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应。
5.根据权利要求1所述用固定化酶生产壳寡糖的方法，其特征在于：所述弱酸溶液为稀盐酸、甲酸、乙酸、丙酮酸或乳酸溶液。
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