JP6896247B2

JP6896247B2 - Ｇｌｐ−１分泌促進剤

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Publication number: JP6896247B2
Application number: JP2017530931A
Authority: JP
Inventors: 俊彦矢田; 有作岩崎; 原　博; 博原; 徹比良; 由香岸本; 真知子南
Original assignee: Hokkaido University NUC; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Jichi Medical University
Current assignee: Hokkaido University NUC; Matsutani Chemical Industries Co Ltd; Jichi Medical University
Priority date: 2015-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2036-07-29
Also published as: WO2017018500A1; JPWO2017018500A1; KR20180035878A; EP3329922A4; EP3329922A1; US20180214467A1; CN108135918A

Description

本発明は、耐糖能異常の治療又は糖尿病の予防などに有用な、インクレチンホルモンであるＧＬＰ−１の分泌促進剤に関する。

グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、食事摂取により消化管より分泌され、膵臓からのインスリンの分泌を促進する働きをもつインクレチンホルモンの一種である。ＧＬＰ−１は、消化管管腔内への栄養素の流入に応答して、消化管の内分泌細胞の一つであるL細胞から分泌され、膵臓のβ細胞表面にあるＧＬＰ−１受容体に結合し、β細胞内からインスリン分泌を促進する。ＧＬＰ−１は、血糖値を上昇させるホルモンであるグルカゴンの分泌を抑制し、また、膵臓β細胞の保護作用・増殖促進などの作用も動物で確認されている。そのほかの作用として、心保護作用や心拍出量を増加させたり、高血圧改善作用、炎症性免疫応答を弱める作用、摂取した食物の胃からの排出を遅らせる作用などもあり、ＧＬＰ−１の分泌を促進する作用を有する物質は極めて有用である。

一方、国際糖尿病連合（ＩＤＦ）は、世界の糖尿病に関する調査をまとめた「糖尿病アトラス第６版２０１４ＵＰＤＡＴＥ」において、世界の糖尿病人口は爆発的に増え続けており、２０１４年現在で糖尿病有病者数は３億８，６７０万人（有病率８．３％）に上り、有効な対策を施さないと２０３５年には５億９，１９０万にまで増加すると予測している。つまり、糖尿病は世界的に深刻な疾病であることは明白である。

日本糖尿病学会が公表する「科学的根拠に基づく糖尿病診療ガイドライン２０１３」の「糖尿病診断の指針」において、糖尿病の診断は、慢性高血糖か否かに症状等を加味して行うとしており、高血糖か否かは、空腹時血糖値と７５ｇ経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）２時間値の組合せによる判定、及び、ＨｂＡｃ１（ＮＧＳＰ）値≧６．５％を基準とする判定により行うとしている。そして、空腹時血糖値が１２６ｍｇ／ｄｌ以上を糖尿病域、１１０〜１２６ｍｇ／ｄｌを境界域と区分し、また、ＯＧＴＴ２時間値が２００ｍｇ／ｄｌ以上を糖尿病域、１４０〜２００ｍｇ／ｄｌを境界域と区分しており、米国糖尿病学会やＷＨＯでは、空腹時血糖値で定義したＩＦＧ（ｉｍｐａｉｒｅｄｆａｓｔｉｎｇｇｌｕｃｏｓｅ）とＯＧＴＴ２時間値で定義したＩＧＴ（ｉｍｐａｉｒｄｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ）とを区別しているところ、日本糖尿病学会では両者をまとめて「境界型」と呼んでいる。この「境界型」は、治療等の対処を何ら施さない場合は「糖尿病型」へと進行するので、適切な治療や対処が必要である。

これら「境界型」及び「糖尿病型」の糖尿病関連疾病の治療においては、近年、インクレチンホルモンであるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）やグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）関連薬が注目されている。特に、日本人はインスリン分泌能、特に食後のインスリン分泌能が低いといわれ、これまではインスリンの注射により血糖値を確実に下げる治療法が一般に採用されてきたが、インスリンは血糖値を下げ過ぎるというリスクもあるので、血糖値を下げ過ぎない上記インクレチンホルモン関連薬が注目されている。

ＧＩＰは、主に腸管上部に存在するＫ細胞への刺激により分泌され、ＧＬＰ−１は、上述のとおり主に腸管下部に存在するＬ細胞への刺激により分泌されるインクレチンホルモンである。インクレチンホルモンは、膵臓に働きかけて高血糖時にインスリン分泌を促進させ、高血糖でない場合は、インスリン分泌を促進させないため、低血糖を引き起こすリスクが小さい。しかし、一方でインクレチンホルモンは、インクレチン分解酵素（ＤＰＰ−４）によって速やかに分解されるという欠点があるため、インクレチンの分解を抑制する「ＤＰＰ−４阻害剤」やＤＰＰ−４の作用を受けない「インクレチンホルモンアナログ」の開発がされ、副作用の少ないものとして非常に期待されている。しかし、いずれのインクレチンホルモン関連薬も自然界に存在するものではなく、その製造コストは安価ではない。

インクレチンホルモン関連薬としては、上記ＤＰＰ−４阻害剤やインクレチンホルモンアナログ薬の他、アカルボース、ボグリボース、ミグリトールなどの二糖類分解酵素阻害薬（α−ＧＩ剤）も知られている。しかし、これらは合成されたものであって、安価ではなく、日々の食事と一緒に経口摂取できるものの、医師の処方が必要である。

さらに、これら従来のα−ＧＩ剤は拮抗型の二糖類分解酵素阻害剤であるため、その阻害作用にはバラつきがあって、常に一定の効果が得られるわけではなく、この問題を解決すべく、拮抗型阻害剤の代わりに不拮抗型のショ糖分解酵素阻害剤であるＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース及び／またはＤ−タガトースと、ショ糖とを有効成分として含有するかあるいはショ糖含有食品とともに摂取することを特徴とする薬剤が提案されている（特許文献１）。しかし、該薬剤は、ショ糖を必須の有効成分として含有することを特徴としており、本来、糖尿病患者に摂取制限を課すべきショ糖を必須とするため、その使用方法に細心の注意を払う必要があり、不便であった。

特開２０１３−６３９４７号公報

Ｔｅｃｈ．Ｂｕｌｌ．Ｆａｃ．Ａｇｒ．ＫａｇａｗａＵｎｉｖ．，Ｖｏｌ．５８，２７−３２，２００６

本発明の目的は、上記先行技術に鑑み、ショ糖を必須の有効成分とせずとも、あるいはショ糖を別途投与せずとも、ＧＬＰ−１の分泌を促進する、比較的安価で安全性に優れたインクレチンホルモン関連薬であるＧＬＰ−１促進剤を提供することにある。

本発明者らは、かかる課題を解決すべく種々検討したところ、意外にも、Ｄ−プシコースがショ糖を必須とすることなく、ＧＬＰ−１の分泌を促進することを見出した。

Ｄ−プシコースはα−ＧＩ剤として知られていたことから（非特許文献１）、当初、発明者らは、ショ糖分解酵素阻害剤として知られるＬ−アラビノース、Ｄ−キシロース又はＤ−タガトースと同様、Ｄ−プシコースもショ糖を同時摂取しない限りはＧＬＰ−１の分泌を促進しないであろうと推測した。また、詳細には後述するが、マウス大腸由来のＧＬＰ−１産生細胞におけるＧＬＰ−１分泌実験において、ＧＬＰ−１を分泌することが知られている難消化性デキストリン（ポジティブコントロール）とは異なり、Ｄ−プシコースがＧＬＰ−１を分泌しなかったという実験結果から、Ｄ−プシコースが、ショ糖を必須の有効成分とすることなく、あるいはショ糖あるいはショ糖含有食品を同時に摂取することなく、ＧＬＰ−１の分泌を促進するであろうとは全く想定できなかった。よって、哺乳動物にＤ−プシコースのみを経口摂取させるだけで、ＧＬＰ−１の分泌を促進することができるという事実は、驚くべき発見である。さらに、先に述べたＧＩＰは、ＧＬＰ-１と同様インスリン分泌を促進させるインクレチンホルモンとして知られるが、ＧＬＰ-１とは異なり、脂肪合成系を活性化して脂肪蓄積を誘導することが知られているところ、本発明のＧＬＰ-１分泌促進剤は、ＧＩＰの分泌を促進しないことがわかった。

すなわち、本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（６）から構成されるものである。
〔１〕Ｄ−プシコースを有効成分として含有することを特徴とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔２〕ショ糖を含有しないことを特徴とする前記〔１〕に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔３〕空腹時に投与されることを特徴とする前記〔１〕又は〔２〕に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔４〕有効成分であるＤ−プシコースが、一回に５ｇ以上の量となるように投与されることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔５〕ショ糖あるいはショ糖含有食品を摂取することなく投与されることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
〔６〕前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤及び水溶性食物繊維を有効成分として含有することを特徴とするＧＬＰ−１分泌促進組成物。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、Ｄ−プシコースを有効成分とするものであって、そのＤ−プシコースの食経験及び安全性は確認されており、薬剤のような副作用を認めることもなくショ糖を必須成分とすることもないので、非常に使いやすく、簡便に哺乳動物のＧＬＰ−１分泌を促進することができる。また、Ｄ−プシコースは、０キロカロリーでありながら砂糖の７０％程度の甘味を有し、ショ糖を必須成分とせずとも優れたＧＬＰ-１分泌能を有するため、２キロカロリー／ｇの熱量を有し、かつＧＬＰ−１分泌にショ糖が必須であるＤ−タガトースと比べて、摂取カロリーを大きく低減できる点において有用である。

図１は、マウス大腸由来のＧＬＰ−１産生細胞における、Ｄ-プシコース１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭの各溶液または難消化性デキストリン（ファイバーソル２）１０ｍＭ溶液に対するＧＬＰ−１分泌実験の結果を示す図である。図２は、絶食マウスに１ｇ／ｋｇのＤ−プシコースを経口投与した後の経時的な門脈中のアクティブＧＬＰ−１濃度（ａ）、トータルＧＬＰ−１濃度（ｂ）及びトータルＧＩＰ濃度（ｃ）を示す図である。図３は、マウスに生理食塩水、Ｄ−プシコース０．３ｇ／ｋｇ若しくは１．０ｇ／ｋｇ、Ｄ−タガトース１．０ｇ／ｋｇ又はＤ−グルコース１．０ｇ／ｋｇを各々経口投与し、投与３０分後の門脈血におけるアクティブＧＬＰ−１濃度（ａ）及びトータルＧＩＰ濃度（ｂ）を示す図である。図４は、絶食マウスを用いたＤ−プシコース１ｇ／ｋｇ経口投与による摂食抑制効果に対するＧＬＰ−１受容体阻害剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ-９，Ｅｘ-９）の効果を示す図である。すなわち、絶食マウスにＥｘ-９（２００ｍｍｏｌ／ｋｇ）又は生理食塩水を腹腔内投与し、その後直ちに生理食塩水若しくはＤ−プシコース１ｇ／ｋｇを経口投与し、投与後３０分から６時間後の経時的な摂食量をエネルギー値（ｋｃａｌ）により示す図である。図５は、Ｄ−プシコース若しくはＤ−タガトース各１ｇ／ｋｇをマウスに経口投与した後１時間から６時間後の経時的な摂食量を、生理食塩水を経口投与したときの摂食量に対する相対値により示す図である。図６は、Ｄ−プシコース、難消化性デキストリン（ファイバーソル２）、デキストリン（松谷化学工業株式会社製品「パインデックス＃２」）の各０．２ｇ／ｋｇをそれぞれＳＤラットに投与後０分から２４０分後の経時的な血中グルコース濃度（ａ）及びトータルＧＬＰ−１濃度（ｂ）を示す図である。図７は、ヒトに水２００ｍｌ又はＤ−プシコース５ｇ／２００ｍｌ、１０ｇ／２００ｍｌ若しくは１５ｇ／２００ｍｌを摂取させた後、１５分後、３０分後、６０分後、１２０分後及び１８０分後の各血中のトータルＧＬＰ−１を定量し、血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した結果を示す図である。

本発明の薬剤は、ＧＬＰ−１の分泌を促進するものであり、耐糖能異常の治療や糖尿病に対する予防・治療など、ＧＬＰ−１の機能を介した様々な生理機能及び疾病・症状を改善に極めて有用なものである。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の有効成分であるＤ−プシコースは、従来から公知のどのようなものでも使用することができ、その精製度いかんを問わず、ズイナ等の植物から抽出したもの、アルカリ異性化法によりＤ−グルコースやＤ−フラクトースを原料に異性化したもの（例えば、松谷化学工業（株）製「レアシュガースウィート」）、微生物又はその組換体から得られる酵素（イソメラーゼやエピメラーゼ等）を利用する酵素法によりＤ−グルコースやＤ−フラクトースを原料として異性化したもの（例えば、松谷化学工業（株）製「ＡｓｔｒａｅａＡｌｌｕｌｏｓｅ」）などがあり、比較的容易に入手することができる。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤がその効果を発揮するためには、Ｄ−プシコースを経口摂取することが重要であり、この際にショ糖が腸内で同時に存在する状態は必須としない。すなわち、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤をショ糖含有食品に含有させる必要はなく、また、本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤をショ糖あるいはショ糖含有食品と同時に摂取したり摂取後に投与する必要もない。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の剤型は特に限定されず、例えば、タブレット状、顆粒状、粉末状、カプセル状、ゲル状、ゾル状のいずれであってもよく、また、製剤化は、公知の方法に従って行えばよく、有効成分のＤ−プシコースをデンプンやカルボキシメチルセルロースなどの薬学的に許容できる担体と混合し、さらに必要に応じて安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤などを添加することにより行うことができる。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、有効成分であるＤ−プシコースが、一回に０．０７／体重ｋｇ以上の量となるように投与されることが好ましく、一回に０．０７〜２．０ｇ／体重ｋｇがより好ましく、一回に０．１〜０．６ｇ／体重ｋｇの量であることがさらにより好ましい。
本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤は、空腹時に摂取されることが好ましい。具体的には、食前５分以前に摂取されることが好ましく、さらに具体的には、先の食後３時間経過後、かつ、次の食前１０分以前に摂取することがより好ましい。

本発明はさらに上記ＧＬＰ−１分泌促進剤の他に水溶性食物繊維を有効成分として含有することを特徴とするＧＬＰ−１分泌促進組成物を提供する。
水溶性食物繊維としてはペクチン、コンニャクマンナン、アルギン酸、グアーガム、寒天などの高粘性食物繊維、あるいは難消化性デキストリン、ポリデキストロース、グアーガム分解物などの低粘性食物繊維が例示される。
これらの中で、効果の観点から、特に難消化性デキストリン、グアーガム加水分解物、ポリデキストロース等が好ましい。

これらのうち低粘性食物繊維が、取り扱い及び大腸までの移動時間が短い観点から好ましい。低粘性の水溶性食物繊維とは、５０質量％以上の食物繊維を含有し、常温水に溶解して低粘性の溶液、おおむね５質量％水溶液で２０ｍＰａｓ以下の粘度を示す溶液となる食物繊維素材を意味する。低粘性食物繊維としてより具体的には、難消化性デキストリン、グアーガム加水分解物、ポリデキストロース（例えばライテスなど）、ヘミセルロース由来の物などが挙げられる。

難消化性デキストリンは、各種の澱粉、例えば馬鈴薯澱粉、タピオカ澱粉、コーンスターチ、小麦粉澱粉等を１３０℃以上で加熱分解し、これをアミラーゼで更に加水分解し、常法に従って、必要に応じ脱色、脱塩して製造したものである。食物繊維の平均分子量が５００から３０００程度、好ましくは１４００〜２５００、さらに好ましくは２０００前後である。グルコース残基がα−１，４、α−１，６、β−１，２、β−１，３、β−１，６−グルコシド結合し、還元末端の一部はレボグルコサン（１，６−アンヒドログルコース）である、分岐構造の発達したデキストリンである。「ニュートリオース」（ロケット社製）、「パインファイバー」、「ファイバーソル２」（松谷化学工業株式会社製）の商品名で市販されている（”食品新素材フォーラム”ＮＯ．３（１９９５、食品新素材協議会編））。

グアーガムの加水分解物はグアーガムを酵素により加水分解したもので、その性状は通常低粘性で冷水可溶、水溶液は中性で無色透明である。グアーガム加水分解物としては、「サンファイバー」（太陽化学社）、「ファイバロン」（大日本製薬社）の商品名で市販されている。
ヘミセルロース由来の物は、通常コーンの外皮からアルカリで抽出し、精製して製造されたもので、平均分子量は約２０万と大きいが、５％水溶液の粘度は１０ｃｐｓ程度と低く、水に溶けて透明な液になる。ヘミセルロース由来の物は「セルエース」（日本食品化工社）の商品名で市販されている。
ポリデキストロース（ライテス）はブドウ糖とソルビトールをクエン酸の存在下で液圧加熱して重合させ、精製したものであり、水溶性で低粘性である。「ライテス」（ファイザー社）として市販されている。
これら低粘性の水溶性食物繊維の中でも、難消化性デキストリンが最も効果的で好ましい。

本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の有効成分としては、Ｄ−プシコースを単独で使用することができるが、ＧＬＰ−１の分泌を長時間維持したい場合は、難消化性デキストリンを併用することが好ましい。難消化性デキストリンは、Ｄ−プシコースよりも遅延してＧＬＰ−１の分泌促進効果を発揮するので、併用することでＧＬＰ−１の分泌を長時間維持することができるからである。
本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤と難消化性デキストリンは、質量比で１：０．１〜１：１００の比で含まれることが好ましく、１：０．５〜１：５０であることがより好ましい。

以下に本発明のＧＬＰ−１分泌促進剤の優れた効果を具体的に示す。なお、実施例の記載は発明の理解のためにのみ挙げるものであり、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、実施例を示す前に、参考のために予備試験の結果を示す。
活性型（アクティブ）ＧＬＰ−１は、血中において、酵素であるＤＰＰ−４による非常に速やかな限定的分解を受けることで生理活性を失い、不活性型ＧＬＰ−１となることが知られている。よって、活性型ＧＬＰ−１を測定したい場合は、血液を即座にペプチド分解抑制剤（ＤＰＰ−４阻害剤）入りのサンプリングシリンジに保存して測定したり、相当量の血液を採取するなどの工夫が必要である。そこで、活性型（アクティブ）ＧＬＰ−１と不活性型ＧＬＰ−１を合わせた、ＤＰＰ−４による影響を受けない、血中のトータルＧＬＰ−１を定量することにより、その体内分泌量自体は知ることはできるため、原則、トータルＧＬＰ−１を定量することによりＧＬＰ−１分泌促進効果を確認することとし、実験によっては、参考のためにアクティブＧＬＰ−１も合わせて測定することとした。
ＧＩＰについては活性型と不活性型を合わせたトータルＧＩＰを測定した。

（予備試験）
＜培養細胞＞
マウス大腸由来のＧｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ−１（ＧＬＰ−１）産生細胞株ＧＬＵＴａｇを、１０％ＦＢＳを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍにて、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。

＜ＧＬＰ−１分泌試験＞
ＧＬＵＴａｇ細胞を、４８ウェルプレートでサブコンフルエントになるまで２、３日間培養した。各試料（Ｄ−プシコース又は難消化性デキストリン）を添加する前に、Ｈｅｐｅｓバッファー（１４０ｍＭＮａＣｌ、４．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＨｅｐｅｓ、１．２ｍＭＣａＣｌ₂、１．２ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＤ−ｇｌｕｃｏｓｅ、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）にてウェルを洗浄し、同バッファーに溶解した試料溶液を８０μｌ添加して、３７℃にて６０分間インキュベーションした。上清を回収後、遠心分離（８００×ｇ、５分間、４℃）により細胞を沈殿させ、その上清７０μｌを凍結保存した。この上清中のトータルＧＬＰ−１を、市販の「Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ」（株式会社矢内原研究所製）にて測定した。

＜結果＞
Ｄ−プシコースの１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭの各溶液または難消化性デキストリン（松谷化学工業株式会社製品「ファイバーソル２」（ＤＥ１０））１０ｍM溶液を加え、上記ＧＬＰ−１分泌試験を行ったところ、難消化性デキストリンがＧＬＰ−１分泌を顕著に促進した一方、Ｄ−プシコースにおいては、わずかに分泌促進傾向が見られる程度であった（図１）。すなわち、Ｄ−プシコースが、ＧＬＰ−１産生細胞株への直接作用によりＧＬＰ−１分泌を促進する効果は観察されなかった。

（実施例１）
実験動物として、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（９−１１週齢）を用いた。実験前日の１８時００分から１６時間絶食させたマウスに、午前１０：００にＤ−プシコースを１ｇ／ｋｇ経口胃内投与した。経口投与量は１０ｍｌ／ｋｇとした。Ｄ−プシコース投与前及び投与してから３０分及び６０分後にイソフルラン麻酔下で門脈採血した。なお、サンプリングシリンジには血液凝固抑制剤（ヘパリン（終濃度５０ＩＵ／ｍｌ））とペプチド分解抑制剤（アプロチニン（終濃度５００ＫＩＵ／ｍｌ）及びビルダグリプチン（終濃度１０μＭ））を予め加えておいた。採取した血液は冷却遠心し、得られた血漿を分析するまで−８０℃で保存しておいた。アクティブＧＬＰ−１、トータルＧＬＰ-１及びトータルＧＩＰの定量分析は、ＥＬＩＳＡキット（ミリポア社製。各々ＥＧＬＰ-３５Ｋ、ＥＺＧＬＰ１Ｔ-３６Ｋ及びＥＺＲＭＧＩＰ-５５Ｋ）を用いて行った。また、統計解析は、一元配置分散分析（対応あり）を行い、次いでＤ−プシコース投与前（０分）を対照としたＤｕｎｎｅｔｔ検定を行った。結果は図２に示す。なお、図２中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。また、図２中の棒グラフ内の数値は実験数を示す。

その結果、Ｄ−プシコースを経口投与すると、投与後３０分から６０分後まで、時間依存的に門脈中のアクティブＧＬＰ−１及びトータルＧＬＰ−１濃度が上昇した（図２(ａ)、(ｂ)）。すなわち、Ｄ−プシコースの単独経口投与によってＧＬＰ-１の分泌が誘導されることがマウスを用いた実験で初めて明らかとなり、その作用機序として、Ｄ−プシコースがＧＬＰ−１産生細胞（Ｌ細胞）に直接作用する事が推察された。一方、Ｄ−プシコースの経口投与は、投与後６０分までの間、ＧＩＰ分泌には影響を及ぼさなかった（図２(ｃ)）。以上より、Ｄ−プシコースの単独経口投与は、脂肪合成を促進させるＧＩＰの分泌には影響を与えず、インスリン分泌促進・食欲抑制・胃排出抑制などの作用を有するＧＬＰ-１の分泌を強く誘導することが明らかとなった。

（実施例２）
実験前日の１８時００分から１６時間絶食させたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（９−１１週齢）に、午前１０：００にＤ−プシコースを０．３ｇ／ｋｇ若しくは１ｇ／ｋｇ、Ｄ−タガトース若しくはＤ−グルコースを各１ｇ／ｋｇ、又は生理食塩水を経口胃内投与した。経口投与量は１０ｍｌ／ｋｇとした。投与してから３０分後にイソフルラン麻酔下で門脈採血した。なお、サンプリングシリンジには血液凝固抑制剤（ヘパリン（終濃度５０ＩＵ／ｍｌ））とペプチド分解抑制剤（アプロチニン（終濃度５００ＫＩＵ／ｍｌ）及びビルダグリプチン（終濃度１０μＭ））を予め加えておいた。採取した血液は冷却遠心し、血漿は分析するまで−８０℃で保存した。アクティブＧＬＰ−１及びトータルＧＩＰの定量分析は、前述したキットを用いて行った。また、統計解析は、一元配置分散分析（対応なし）を行い、次いで生理食塩水を対照としたＤｕｎｎｅｔｔ検定により行った。結果は図３に示す。なお、図３中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。また、図中の棒グラフ内の数値は実験数を示す。

その結果、Ｄ−グルコース１ｇ／ｋｇの経口投与は、投与後３０分の門脈中アクティブＧＬＰ−１濃度を全く変動させない一方、Ｄ−プシコース０．３ｇ／ｋｇの経口投与は、投与後３０分の門脈中アクティブＧＬＰ−１濃度を上昇させる傾向にあり、Ｄ−プシコース１ｇ／ｋｇの経口投与は、門脈中のアクティブＧＬＰ−１濃度を有意に上昇させた（図３(ａ)）。また、Ｄ−タガトース（１ｇ／ｋｇ）を単独で経口投与すると、投与後３０分後の門脈中アクティブＧＬＰ−１濃度は上昇する傾向にはあったが、その値は対照群と比較して有意な上昇ではく、Ｄ−プシコース１ｇ／ｋｇとの値と比較すると低値であった（図３(ａ)）。従って、Ｄ−プシコースはＤ−タガトースより有利なＧＬＰ-１分泌促進剤であることが示された。最後に、Ｄ−プシコース０．３ｇ／ｋｇ若しくは１ｇ／ｋｇ、Ｄ−グルコース１ｇ／ｋｇ又はＤ−タガトース１ｇ／ｋｇの経口投与後の門脈中トータルＧＩＰを測定した結果、Ｄ−グルコース投与群のみＧＩＰ濃度が有意に上昇した（図３(ｂ)）。従って、単糖の経口投与によるＧＬＰ-１及びＧＩＰ分泌機構には、それぞれ独立した分泌促進機序が存在することが明らかとなった。

（実施例３）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（９−１１週齢）を個別ケージ内で１週間以上予備飼育し、実験者によるハンドリングをして、飼育・実験環境に順化させた。実験前日の１８時００分から１６時間絶食させた後、９時４５分から生理食塩水又はＧＬＰ−１受容体阻害剤（Ｅｘｅｎｄｉｎ-９，Ｅｘ-９，２００ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内投与し、その直後に生理食塩水又はＤ−プシコース１ｇ／ｋｇを経口胃内投与した。腹腔内投与及び経口投与の各投与容量はそれぞれ５ｍｌ／ｋｇ及び１０ｍｌ／ｋｇとした。１０時００分から、ＣＥ−２飼料（栄養バランスの摂れた一般的なマウス用飼料、日本クレア製）をマウスに自由摂食させ、０．５時間、１時間、２時間、３時間及び６時間後の摂食量を経時的に測定した。摂食量は、経口胃内投与したＤ−プシコース１ｇ当たりを０ｋｃａｌ、ＣＥ−２飼料1ｇ当たりを３．４５ｋｃａｌとしたエネルギー摂取量（ｋｃａｌ）として算出した。統計解析は、各時点における結果に対して一元配置分散分析（対応なし）を行い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定による全群比較を行った。結果は図４に示す。なお、図４中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。

その結果、「対照群」（生理食塩水腹腔内投与−生理食塩水経口投与、白）と「Ｄ−プシコース群」（生理食塩水腹腔内投与−Ｄ−プシコース経口投与、網点）を比較すると、Ｄ−プシコース１ｇ／ｋｇ経口投与は投与後３０分から６時間まで有意に摂食量を低下させた。「ＧＬＰ−１受容体阻害剤単独投与群」（Ｅｘ９腹腔内投与−生理食塩水経口投与、網目斜線）は、「対照群」と比較して、全ての時間帯において同レベルの摂食量であり（図４）、ＣＥ−２飼料の摂取よって分泌される内因性のＧＬＰ-１は摂食量に影響を与えていないことが示唆された。
一方、「ＧＬＰ−１受容体阻害剤＋Ｄ−プシコース群」（Ｅｘ９腹腔内投与−Ｄ−プシコース経口投与、斜線）について比較すると、投与後３０分の「ＧＬＰ−１受容体阻害剤＋Ｄ−プシコース群」の摂食量は、「対照群」若しくは「ＧＬＰ−１受容体阻害剤単独投与群」と比較して、有意に減少し、「Ｄ−プシコース群」と同レベルの摂食量であった。したがって、投与後３０分後のＤ−プシコースによる摂食抑制作用は、ＧＬＰ−１以外の摂食抑制作用であることが示唆された（図４）。投与後１時間以降の摂食量は、「対照群」や「ＧＬＰ−１受容体阻害剤単独投与群」の摂食量と有意な差はなく、逆に、「Ｄ−プシコース群」より有意に摂食量が増加した（図４）。すなわち、Ｄ−プシコース経口投与後１時間から６時間の摂食抑制作用が、ＧＬＰ−１受容体阻害剤の腹腔内投与によって消失することが示された。以上より、Ｄ−プシコース１ｇ／ｋｇの経口投与は、ＧＬＰ-１分泌促進を介して摂食量を抑制することが明らかとなった。

（実施例４）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウス（７−１１週齢）を個別ケージ内で１週間以上予備飼育し、実験者によるハンドリングをして、飼育・実験環境に順化させた。実験前日の１８時００分から１６時間絶食させた後、９時５０分から生理食塩水、Ｄ−プシコース１ｇ／ｋｇ又はＤ−タガトース１ｇ／ｋｇを各々経口胃内投与した。投与容量は１０ｍｌ／ｋｇとした。１０時００分からＣＥ−２飼料をマウスに自由摂食させ、１時間、２時間及び６時間後の摂食量を経時的に測定した。摂食量は、経口胃内投与したＤ−タガトース1ｇ当たりを２ｋｃａｌ、ＣＥ−２飼料1ｇが当たり３．４５ｋｃａｌとしたエネルギー摂取量（ｋｃａｌ）として算出した。統計解析は、各時点における結果に対して一元配置分散分析（対応なし）を行い、Ｔｕｋｅｙ’ｓ検定による全群比較を行った。結果は図５に示す。なお、図５中、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１である。

その結果、「Ｄ-プシコース群」（網点）は、Ｄ-プシコース経口投与後１時間から６時間まで、「対照群」（生理食塩水投与、白）より有意に摂食量が低値であった（図５）。「Ｄ-タガトース投与群」（斜線）は、投与後１時間の摂食量は「対照群」より有意に低値であったが、「Ｄ-プシコース群」より有意に高値であった。さらに、「Ｄ-タガトース投与群」（斜線）は、Ｄ-タガトース投与後２時間及び６時間の摂食量は「対照群」と同程度であり、「プシコース群」より有意に高値であり、摂食抑制作用は認められなかった。
従って、Ｄ-タガトース１ｇ／ｋｇ経口投与には摂食抑制作用が認められるが、その作用は投与後１時間までの短期的なものであって、Ｄ-プシコース１ｇ／ｋｇ経口投与と比較すると、その作用程度は弱いことが明らかとなった。Ｄ-タガトース１ｇ／ｋｇ経口投与による摂食抑制作用が弱い理由としては、Ｄ-プシコースよりＧＬＰ-１分泌促進効果が弱い（図３）ことが推測された。

（実施例５）
一夜絶食させたＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（８〜９週齢の雄）の尾静脈より試料投与前（０分）の採血を行った。フィーディングチューブを用いて、脱イオン水（コントロール群）、Ｄ−プシコース、難消化性デキストリン（ＤＥ１０）、デキストリン（松谷化学工業株式会社製品「パインデックス＃２」（ＤＥ１０））の各溶液を２ｇ／ｋｇ体重（１０ｍＬ／ｋｇ体重）にて経口投与した。その後、１５分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分、２４０分後に尾静脈より採血を行った。
血液は、あらかじめＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（ミリポア社製）、アプロチニン（和光純薬工業社製）、ヘパリン（ナカライテスク社製）を添加したチューブに回収した。遠心分離により血漿を回収し、-８０℃にて凍結保存した。得られた血漿中のトータルＧＬＰ−１濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（ミリポア社製ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｉｅｓＧＬＰ−１ＴｏｔａｌＥＬＩＳＡ）にて測定した。血漿中のグルコース濃度は、グルコースCII−テストワコー（和光純薬工業社製）にて測定した。

＜試験結果＞
図６に血糖値の変化及び血中トータルＧＬＰ−１濃度の変化を示す。血糖値はデキストリン投与で上昇し、難消化性デキストリンではわずかに上昇し、Ｄ−プシコース投与ではコントロール群（水投与）と同様のわずかな変動が見られた（図６(ａ)）。この結果から、Ｄ−プシコースには血糖値を上昇させる作用がないことが確かめられた。
一方、ＧＬＰ−１濃度は、Ｄ−プシコース投与により投与後６０分〜１２０分をピークとして大きく上昇したのに対し、難消化性デキストリン投与では投与後９０分以降に上昇したが、Ｄ−プシコースよりは弱い作用であり、ＧＬＰ−１の分泌刺激として最もよく知られるグルコースから構成される消化性のデキストリン（パインデックス＃２）の投与によってはＧＬＰ−１分泌を促進しなかった（図６(ｂ)）。この結果より、Ｄ−プシコースに強いＧＬＰ−１分泌促進作用があり、投与後６０〜１２０分をピークとした持続性のある作用であることが示された。

（実施例６）
＜試験方法＞
１週間以上の休止期を予め設けた後、健常な被験者６名（男３名及び女３名。体重５３．３±７．４ｋｇ。）に対して、１回につき、水２００ｍｌ（対照飲料）又はＤ−プシコース５ｇ／２００ｍｌ（体重換算するとＤ−プシコース０．０７〜０．１１ｇ／ｋｇ）、１０ｇ／２００ｍｌ（体重換算するとＤ−プシコース０．１４〜０．２２ｇ／ｋｇ）若しくは１５ｇ／２００ｍｌ（試験飲料）（体重換算するとＤ−プシコース０．２１〜０．３３ｇ／ｋｇ）、をランダムに摂取させた。対照飲料又は試験飲料を摂取する日（試験日）の前夜は指定の夕食を摂取させ、前夜２１時以降、試験当日の午前９時まで、水及び茶飲料を除く飲食物の摂取を禁じた。前記指定食は、食物繊維、乳酸菌、発酵性糖質といった腸内細菌が利用して発酵する可能性のある物質をほとんど含まないメニュー（カレー、親子丼、牛丼、中華丼）のいずれかの選択性とした。試験日当日の午前９時の空腹時に採血後、対照飲料又は試験飲料を摂取させ、その摂取後１５分、３０分、６０分、１２０分及び１８０分後に採血をした。なお、その採血の間は、指定された分量の水のみ摂取可能とした。採血は、各被験者自身が糖尿病患者用に市販される穿刺器で指先を刺して得られる出血液をヘマトクリット管により採取することにより行った。採取した血液はマイクロチューブに移して遠心分離器に供し、遠心分離された血漿のトータルＧＬＰ−１量を、メルク（株）製品「ＭｕｌｔｉＳｐｅｃｉｅｓＧＬＰ−１ＴｏｔａｌＥＬＩＳＡ」を用いて測定した。なお、被験者には、試験期間である約１か月間は規則的な生活を心がけて過激な運動や暴飲暴食を慎むこと、及び、試験中は室内にて穏やかに過ごすことを遵守させた。

＜試験結果＞
各血中のトータルＧＬＰ−１を縦軸に、上記Ｄ−プシコース摂取後１５分〜１８０分後の各時間を横軸にして折れ線グラフを描いたときの、血中トータルＧＬＰ−１濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、得られた数値を図７に示す。Ｄ−プシコース摂取量に依存してＡＵＣ数値が大きくなっており、Ｄ−プシコースを１回に０．０７ｇ／体重ｋｇ以上摂取することにより、血中のトータルＧＬＰ−１分泌量を促進する効果が得られることがわかった。

Claims

Ｄ−プシコースを有効成分として含有するＧＬＰ−１分泌促進剤であって、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤がショ糖を含有せず、前記ＧＬＰ−１分泌促進剤がショ糖あるいはショ糖含有食品と共に投与されず、かつ空腹時に投与されることを特徴とするＧＬＰ−１分泌促進剤。
有効成分であるＤ−プシコースが、一回に０．０７ｇ／体重ｋｇ以上の量となるように投与されることを特徴とする請求項１に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤。
請求項１または２に記載のＧＬＰ−１分泌促進剤及び水溶性食物繊維を有効成分として含有することを特徴とするＧＬＰ−１分泌促進組成物。