CN103405784B - c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103405784B CN103405784B CN201310356778.1A CN201310356778A CN103405784B CN 103405784 B CN103405784 B CN 103405784B CN 201310356778 A CN201310356778 A CN 201310356778A CN 103405784 B CN103405784 B CN 103405784B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fos
- fos gene
- cancer
- gene
- cancer cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用，特别是c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建c-Fos基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中c-Fos基因的mRNA和蛋白水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降66.2%，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
Description
技术领域
本发明涉及c-Fos基因的新用途，具体是c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
FOS基因家族包括4个成员，编码亮氨酸拉链的FOSL1，FOSL2和FOS，FOSB，他们与JUN家族结合形成转录因子复合物AP-1。原癌基因c-Fos是由FOS基因编码的转录因子，转录因子c-Fos一般与Jun家族聚合形成AP-1行使其功能，最常见的AP-1是由c-Fos和c-Jun构成，当它们形成二聚体AP-1后，与AP-1DNA识别位点结合来激活受到刺激的细胞的转录。大量研究发现，c-Fos原癌基因及其蛋白产物参与生物体内许多重要的生理过程，包括调控细胞的生长分化，细胞内信息传递过程和细胞的能量代谢过程，在生命活动中起着极为重要的作用。
原癌基因c-Fos是众所周知的具有致癌作用的基因，参与肿瘤的形成、增殖、血管生成、肿瘤的浸润和转移。因此，长久以来，c-Fos被认为是抗凋亡分子。如Wang等研究发现，当c-Fos在小鼠中过表达时，会导致小鼠在体内形成肉瘤。
发明内容
本发明的目的在于提供c-Fos基因的一种新用途。
本发明提供c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用，特别是c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。所述的c-Fos基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
本发明通过构建c-fos基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中c-fos基因的mRNA和蛋白水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降低，最终出现死亡。
本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
附图说明
图1：c-Fos超表达后mRNA及蛋白水平表达：A qPCR结果（PCDNA3.1为空载体；PCDNA3.1-c-Fos为带有c-Fos基因的超表达载体）；B western-blot结果（β-actin做为内参基因）
图2：超表达c-Fos后肿瘤细胞形态变化：A重组质粒PCDNA3.1-c-Fos转染到T24细胞24h后细胞形态；B重组质粒PCDNA3.1-c-Fos转染到T24细胞48h后细胞形态
图3：c-Fos超表达后细胞活性检测
具体实施方式
实施例1：c-Fos基因抑制膀胱癌T24细胞
一、重组表达载体的构建
1、PCR产物的制备
以T24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于c-Fos基因的全长cDNA序列（Gene ID:2353）设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min30s，共35个循环，72℃保温10min，引物序列见表5.3。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
表1c-Fos表达引物
2、目的基因全长验证
将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。
3、PCR产物及表达载体的双酶切反应
选取测序成功的质粒，在2个eppendorf管中分别进行PCR产物和PCDNA3.1双酶切反应，反应体系参照Hind III、BamH I说明书（NEB）进行。
4、胶回收酶切产物
将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
5、目的基因c-Fos与PCDNA3.1的连接
将含目的基因c-Fos的胶回收产物连接到PCDNA3.1上，在离心管中建立如下反应体系：
轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于4℃过夜连接。
二、重组表达载体的转化
1、将Trans-T1Phage Resistant感受态细胞置于冰上；
2、在离心管中依次加入50μL感受态细胞核5μL的连接产物，轻轻混匀，置于冰上30min；
3、42℃水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min；
4、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；
5、取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养；
三、重组表达载体的验证
1、用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落，将枪头置于1mL LB液体培养基（含有0.1%氨苄）中，在37℃、200rpm的振荡培养箱中培养1h。
2、菌液PCR检测（1）中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃30s，60℃40s，72℃2min，35个循环；72℃5min，4℃保存。之后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。
四、重组质粒转染T24细胞
取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实验分为2组，对照组：PCDNA3.1空质粒及EGFP-N1，实验组：PC DNA3.1-c-Fos及EGFP-N1。每组3个重复。采用英俊公司lipo2000将构建好的质粒PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
五、Real-time PCR检测转染后c-Fos mRNA表达水平
将PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，Trizol法提取总RNA，步骤按照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书进行。反转录后Real-time PCR检测c-Fos mRNA表达水平。
六、Western blot检测转染后c-Fos的表达量
将PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，收集蛋白，western blot检测c-Fos的表达量。
七、形态学观察
重组质粒转入T24细胞24h及48h后显微镜（OLYMPUS1X71）观察细胞形态。
八、MTT检测转染后细胞活性
转染24h后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培养。培养24h后，弃去培养液，加入180μL新鲜培养基，再加入20μL5mg/mL MTT（终浓度为0.5mg/mL），继续培养4h。待到时间后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，摇床低速振摇10min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理数据，计算巴西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取平均值为最终结果。
Claims (1)
1.c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用，所述的c-Fos基因，其核苷酸序列是SEQ IDNO：1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310356778.1A CN103405784B (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310356778.1A CN103405784B (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103405784A CN103405784A (zh) | 2013-11-27 |
| CN103405784B true CN103405784B (zh) | 2014-10-22 |
Family
ID=49598854
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310356778.1A Expired - Fee Related CN103405784B (zh) | 2013-08-15 | 2013-08-15 | c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103405784B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104906596A (zh) * | 2015-05-20 | 2015-09-16 | 山西大学 | p50基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 |
| CN111939264A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-11-17 | 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） | c-Fos基因及c-Fos抑制剂在复发耐药弥漫大B细胞淋巴瘤中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1382448A (zh) * | 2002-03-28 | 2002-12-04 | 叶青 | 肿瘤基因开关药物 |
| US20060105956A1 (en) * | 2004-05-28 | 2006-05-18 | Matthew Pincus | Phenotypic reversion of pancreatic carcinoma cells |
-
2013
- 2013-08-15 CN CN201310356778.1A patent/CN103405784B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1382448A (zh) * | 2002-03-28 | 2002-12-04 | 叶青 | 肿瘤基因开关药物 |
| US20060105956A1 (en) * | 2004-05-28 | 2006-05-18 | Matthew Pincus | Phenotypic reversion of pancreatic carcinoma cells |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| c-fos基因在胆管细胞性肝癌中的表达及其预后关系的研究;张浩 等;《中华肝胆外科杂志》;19991031;第5卷(第4期);1－2 * |
| 人膀胱癌中某些癌基因的研究;葛正龙 等;《生物化学杂志》;19921031;第8卷(第5期);565－569 * |
| 张浩 等.c-fos基因在胆管细胞性肝癌中的表达及其预后关系的研究.《中华肝胆外科杂志》.1999,第5卷(第4期),1－2. |
| 曾晓勇 等.原癌基因c2jun 、c2fos 与人膀胱癌耐药细胞株谷胱甘肽及其多药耐药基因表达的关系.《华中科技大学学报（医学版）》.2004,第33卷(第4期),173－177. * |
| 葛正龙 等.人膀胱癌中某些癌基因的研究.《生物化学杂志》.1992,第8卷(第5期),565－569. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103405784A (zh) | 2013-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105463003A (zh) | 一种消除卡那霉素耐药基因活性的重组载体及其构建方法 | |
| CN104651398A (zh) | 利用CRISPR-Cas9特异敲出microRNA基因家族的方法 | |
| CN111849979B (zh) | 一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法 | |
| CN101948794A (zh) | 产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用 | |
| CN103405784B (zh) | c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 | |
| CN105861551B (zh) | 联合表达microRNAs抑制乳腺癌细胞增殖的载体及其构建方法和应用 | |
| CN103405785B (zh) | GADD45β基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 | |
| CN105671067A (zh) | 一种幽门螺杆菌基因敲除载体质粒的构建方法 | |
| CN104857529A (zh) | Egr-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 | |
| CN103981209A (zh) | 一种牛β-防御素5成熟肽的制备方法及其重组菌和应用 | |
| CN103387992A (zh) | 编码重组猪β-防御素-1的基因及猪β-防御素-1的制备方法 | |
| CN104056277A (zh) | Mlh1基因或其表达产物在dkk4高表达的结直肠癌中的应用 | |
| CN110106191A (zh) | 人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用 | |
| CN104928313B (zh) | 阿维链霉菌rex基因在提高阿维菌素产量中的应用 | |
| CN104293962A (zh) | 一种筛选公共引物的方法 | |
| CN106834270A (zh) | 一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法 | |
| CN103923938A (zh) | 藻蓝蛋白β亚基基因的克隆表达 | |
| CN103320512B (zh) | 一种草菇v14菌株分子特异性检测标记及其检测方法 | |
| CN102443561B (zh) | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 | |
| CN106480185B (zh) | 富产胞外多糖的嗜热链球菌的快速筛选方法及实现所述方法的联合基因核酸序列 | |
| Yu et al. | Complete mitochondrial genome of the important phytopathogenic fungus Macrophomina phaseolina (Botryosphaeriales, Ascomycota) | |
| CN103981210A (zh) | 一种牛β-防御素4成熟肽的制备方法及其重组菌和应用 | |
| CN105087418A (zh) | 用于哺乳动物细胞中rna干扰的沙门氏菌菌株、其制备方法及应用 | |
| CN108841737A (zh) | 一株含有Rpf1p基因的高产核酸酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN114540351B (zh) | 靶向肺炎克雷伯菌MdtABC外排泵的sRNA及在制备四环素类抗生素耐药株中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141022 Termination date: 20180815 |