CN103405759A - 一种应用脐血cd34+细胞制备肿瘤特异性dc疫苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种应用脐血CD34+细胞制备肿瘤特异性DC疫苗方法，本发明所述方法，步骤如下：步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：步骤2、脐血的获取：步骤3、脐带血单状核细胞的获取：步骤4、脐带血单状核细胞CD34+细胞的纯化：步骤5、前体DC的诱导培养：步骤6、未成熟DC的扩增和培养：步骤7、DC疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别涉及一种应用脐血CD34+细胞制备肿瘤特异性DC疫苗方法。
背景技术
肿瘤的细胞免疫治疗主要依靠DC诱导的T细胞免疫。DC是人体专职的抗原提呈细胞，因而在肿瘤免疫治疗中，承担着摄取和加工肿瘤抗原，将抗原信息提呈给T细胞，从而启动肿瘤特异性T细胞免疫的重要功能。
目前临床应用的DC细胞主要来源于外周血单状核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMC），而且主要应用于个体化细胞免疫治疗。由于PBMC来源DC（PBMC-DC）的个体化特征，限制了临床应用，特别是限制了DC疫苗的大批量生产及DC疫苗制剂的产业化生产。
本发明专利创新性提出，应用脐带血单状核细胞（Umbilical cord blood derived mononuclear cells, UCB-MNCs），分选出CD34+细胞（UBC-CD34+），经过2周扩增培养，制备成未成熟DC（Immature DC），扩增培养5天负载肿瘤抗原，成熟48小时（Mature DC），制备成肿瘤特异性DC疫苗。
应用UBC-CD34+细胞所制备的肿瘤特异性DC疫苗，具备以下优点：①、脐血作为临床废弃物可以大量获得和冻存，能够满足临床应用；②、从UBC-CD34+细胞诱导培养，可获得未成熟DC和成熟DC（UCB-CD34-DC）；③、UBC-CD34+细胞经14天诱导培养的前体DC，数量上能够扩增15-17倍，足以满足临床需要；④、UBC-CD34+细胞来源的前体DC和成熟DC冻存复苏后，其细胞表型、功能、数量不发生明显改变；⑤、和PBMC-DC相比，UBC-CD34+细胞诱导的未成熟DC，抗原摄取、加工、抗原提呈能力更强； ⑥、和PBMC-DC相比，UBC-CD34-DC表面的功能分子表达更高，激活T细胞免疫的能力更强； ⑦、和PBMC-DC相比，UBC-CD34-DC激活的CTL，肿瘤特异性杀伤功能更强；⑧、由于UBC-CD34-DC的免疫原性极低，用于同种异体ACT治疗（Adoptive cell transfer, ACT），不存在HLA表型限制和免疫排斥反应，因而可用于同种异体的细胞免疫治疗（Immunotherapy），突破了细胞免疫治疗的个体化瓶颈，使DC疫苗大规模产业化生产成为可能。
发明内容
本发明根据现有技术，提出应用脐带血来源的CD34+细胞制备DC疫苗的技术，取得了成功，本发明为此提供一种DC疫苗的制备方法，所述方法，步骤如下：
步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：
步骤2、脐血的获取：
步骤3、脐带血单状核细胞的获取：
步骤4、脐带血单状核细胞CD34+细胞的纯化：
步骤5、前体DC的诱导培养：
步骤6、未成熟DC的扩增和培养：
步骤7、DC疫苗的制备：
其中各步骤具体操作方法如下：
步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：
①、手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织（避免肿瘤中心的坏死组织）0.3-1.0cm3（可液氮或-80℃冰箱保存备用），剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
②、胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
③、同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原。
步骤2、脐血的获取：
① 、产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史。
②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；
③、采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪。
④、胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端。胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器（含抗凝剂）脐静脉穿刺抽取脐血（大约100-120ml）。
⑤、采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时。
步骤3、UCB-MNCs的获取：
将上述脐血按1:1体积比加入PBS稀释（0.01M，PH=7.4），200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液（密度1.077g/ml）的50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs。
步骤4、UCB-MNCs来源CD34+细胞的纯化：
应用美天旎抗CD34+微小免疫磁珠，按说明书从UCB-MNCs中提取纯化的CD34+细胞（微小磁珠分选后，细胞纯度为97%，细胞形态、表型、扩增能力、生物学特征等不发生改变，且随着细胞传代，微小磁珠逐渐脱落，因而不影响细胞学实验，且不影响人体应用）。
步骤5、前体DC的诱导培养：
CD34+细胞分别行生理盐水离心洗涤3次（2000r、1500r、1000r/min），接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞。收集悬浮细胞，按照106/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC（图 1），可冻存备用，可继续诱导成熟DC。
步骤6、未成熟DC的扩增和培养：
前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×105/well，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC。未成熟DC中加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养5天（每2-3天半量换液），完成未成熟DC的扩增培养（图 2）。
步骤7、DC疫苗的制备：
第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟（图3），并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存（冻存方法：106/ml个细胞，加入含20%自体血清、10%DMSO的IMDM培养基中，混匀，梯度冻存板-80℃冰箱过夜，转存于液氮）。
本发明上述步骤得到的中间产物和终产物通过以下方法进行了检测，发现其在制备过程中完全符合要求。
①、UCB-CD34来源前体DC细胞：UCB-CD34+细胞诱导培养14天所获得的前体DC进行流式细胞检测发现，90%以上的前体DC具有 CD33高表达，说明前体DC属于髓细胞系。冻存1周复苏后检测，细胞标志物没有变化，表明细胞功能稳定（表 1）。
②、UCB-CD34来源未成熟DC抗原摄取功能检测：未成熟DC加入20μg/ml FITC-dextran，4℃（对照）和37℃共培养30分钟和60分钟，PBS离心洗涤3次，流式细胞检测发现，30分钟抗原摄取率为50%，60分钟为71%。表明未成熟DC具有强大的抗原摄取功能（图4）。
③、UCB-CD34来源成熟DC（DC疫苗）：未成熟DC扩增5天加入抗原并成熟培养后，流式细胞检测发现，细胞表面重要标志物均有大幅升高，表明DC的抗原提呈功能大幅提高（表 2）。
④、混合淋巴细胞反应（MLR）检测UCB-CD34来源DC功能：取健康人外周血T细胞105/well，加入圆底96孔板，按不同比例加入成熟DC共培养16小时检测发现，DC能够有效诱导同种异体T细胞增殖（图5）。
表 1. 诱导培养14天时，UCB-CD34来源的前体DC表面标志
* 新鲜前体DC和冻存前体DC表面各标志物比较，分别P>0.05。
表 2. UCB-MNCs来源成熟DC的表面标志
* 新鲜成熟DCs和冻存成熟DCs各标志物比较，分别P>0.05。
UCB-CD34来源DC（UCB-CD34-DC）和外周血单状核细胞来源DC（PBMC-DC）的对比研究：
①、分别在未成熟PBMC-DC和UBC-CD34-DC中加入20μg/ml FITC-dextran，37℃、5% CO2饱和湿度分别培养30分钟和60分钟。PBS离心洗涤3次，流式细胞检测发现，UBC-CD34-DC的抗原摄取功能高于PBMC-DC（图6）。
②、UBC-CD34-DC和PBMC-DC分别于培养第5天负载肿瘤细胞裂解物抗原，加入TNF-α培养至第7天ELISA检测发现， PBMC-DC上清中IL-12和INF-γ分泌量显著升高（P<0.01），UBC-CD34-DC上清中IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α分泌量显著升高（P<0.01），UBC-DC的IL-12分泌量和PBMC-DC相同（图 7）。
③、UBC-CD34-DC和PBMC-DC分别负载E7抗原多肽，按照T/DC 3:1的比例，和CD8+T细胞共培养（UBC-CD34-DC，A1-A3；PBMC-DC，B1-B3），ELISApot方法检测INF-γ分泌量。发现UBC-DC诱导T细胞活化的能力显著高于PBMC-DC的诱导能力（P<0.01；图 8）
④、UBC-CD34-DC和PBMC-DC分别诱导BGC-823胃癌特异性，及HT-29结肠癌特异性CTL，行in vitro杀伤试验（Cytotoxicity assay）发现，UBC-CD34-DC诱导的CTL具有更强的肿瘤特异性杀伤效应（P<0.05; 图9）。
DC疫苗的临床应用：
接种方式：根据个体化治疗原则，DC疫苗宜采取引流区域***注射方式进行接种治疗。如：肺癌，采取同侧锁骨上***区域接种治疗；乳癌，采用同侧锁骨上或腋窝***区域接种治疗；直肠癌，采用左侧腹股沟***区域接种治疗。
临床流程：DC疫苗接种治疗前，首先应用CTX 800-1000mg干扰肿瘤微环境、打破肿瘤免疫耐受（有效降低Treg、IL-10、TGF-β水平），然后实施DC疫苗的区域***接种，每2-3天接种治疗一次，3-5次为一个疗程；或静脉回输治疗（ACT）每日一次或隔日一次。
附图说明：
图1. UCB-CD34来源的前体DC细胞（×200）。
图2.扩增培养第五天的UCB-CD34来源未成熟DC细胞（×200）。
图3. UCB-CD34来源未成熟DC负载抗原后成熟培养48小时获得成熟DC（×200）。
图4. UCB-CD34来源未成熟DC 对FITC-dextran的摄取能力明显增强(n=3)。
图5. 混合淋巴细胞反应（MLR）发现，UCB-MNCs来源的DC和
UCB-CD34来源的DC，均能有效激活正常人外周血T细胞。
图6. UCB-CD34来源未成熟DC的抗原摄取功能高于PBMC-DC。
图7. PBMC-DC的IL-12和INF-γ分泌量明显升高（P<0.01）；UCB-CD34-DC的IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α分泌量显著升高（P<0.01）。
图8. UCB-CD34-DC激活T细胞的能力显著高于PBMC-DC（P<0.01）。
图9. UCB-CD34-DC诱导的CTL，和PBMC-DC诱导的CTL相比，具有更强的肿瘤特异性杀伤效应（P<0.05）。
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
脐带血来源的CD34+细胞制备DC疫苗的制备方法，步骤如下：
步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：
①、手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织（避免肿瘤中心的坏死组织）0.3-1.0cm3（可液氮或-80℃冰箱保存备用），剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
②、胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
③、同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用。
取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原。
步骤2、脐血的获取：
①、产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史。
②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；
③、采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪。
④、胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端。胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器（含抗凝剂）脐静脉穿刺抽取脐血（大约100-120ml）。
⑤、采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时。
步骤3、UCB-MNCs的获取：
将上述脐血按1:1体积比加入PBS稀释（0.01M，PH=7.4），200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液（密度1.077g/ml）的50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs。
步骤4、UCB-MNCs来源CD34+细胞的纯化：
应用美天旎抗CD34+微小免疫磁珠，按说明书从UCB-MNCs中提取纯化的CD34+细胞（微小磁珠分选后，细胞纯度为97%，细胞形态、表型、扩增能力、生物学特征等不发生改变，且随着细胞传代，微小磁珠逐渐脱落，因而不影响细胞学实验，且不影响人体应用）。
步骤5、前体DC的诱导培养：
CD34+细胞分别行生理盐水离心洗涤3次（2000r、1500r、1000r/min），接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞。收集悬浮细胞，按照106/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC（图 1），可冻存备用，可继续诱导成熟DC。
步骤6、未成熟DC的扩增和培养：
前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×105/well，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC。未成熟DC中加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养5天（每2-3天半量换液），完成未成熟DC的扩增培养（图 2）。
步骤7、DC疫苗的制备：
第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟（图3），并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存（冻存方法：106/ml个细胞，加入含20%自体血清、10%DMSO的IMDM培养基中，混匀，梯度冻存板-80℃冰箱过夜，转存于液氮）。
Claims (2)
1.一种应用脐血CD34+细胞制备肿瘤特异性DC疫苗方法，所述方法，步骤如下：
步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：
步骤2、脐血的获取：
步骤3、脐带血单状核细胞的获取：
步骤4、脐带血单状核细胞CD34+细胞的纯化：
步骤5、前体DC的诱导培养：
步骤6、未成熟DC的扩增和培养：
步骤7、DC疫苗的制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，操作步骤如下：
步骤1、自体肿瘤相关全抗原的制备：
①、手术切除的新鲜肿瘤组织：取肿瘤周边部分组织0.3-1.0cm3，剪除周围非肿瘤组织，庆大霉素-生理盐水反复洗涤3-5次，剪碎，300目钢网研磨制备单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；
②、胸、腹水获得的肿瘤细胞：取胸、腹水1500-2000ml，1200rpm离心，生理盐水洗涤离心3次，300目钢网过网后获得单细胞悬液，反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；
③、同组织来源细胞株：反复冻融法制备肿瘤细胞裂解物，过网后蛋白定量备用；
取以上自体肿瘤裂解物蛋白和同源细胞株裂解物蛋白各50%，混合制备成自体肿瘤相关全抗原；
步骤2、脐血的获取：
、产妇选择：选择足月或早产剖腹产健康妇女，应符合以下条件：年龄35岁以下；无恶性肿瘤；无遗传性疾病；无肝炎、梅毒、艾滋等传染性疾病；无严重妊娠并发症；无家族性遗传病；无孕期输血史；
②、胎儿选择：胎儿体重超过3000g；无先天性疾病或畸形；
③、采血禁忌症：胎盘剥离超过12小时；胎膜早破超过24小时；羊水检测发现染色体异常；生产时产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水中有胎粪；
④、胎儿剖出后5分钟内，距胎儿5-7cm处双重结扎胎儿侧脐带并于两线间切断，75%酒精消毒断端，胎盘侧脐带2-3cm行75%酒精消毒，一次性采血器脐静脉穿刺抽取脐血100-120ml；
⑤、采血完成后，尽快18℃保存箱内输送到GMP实验室，并在6小时内进行细胞分离，最晚不能超过12个小时；
步骤3、UCB-MNCs的获取：
将上述脐血按1:1体积比加入0.01M，PH=7.4的PBS稀释，200目筛网过滤，重悬于含15ml淋巴细胞分离液50ml离心管中，2500r/min梯度密度离心20分钟，仔细抽吸白膜层获取UCB-MNCs；
步骤4、UCB-MNCs来源CD34+细胞的纯化：
应用美天旎抗CD34+微小免疫磁珠，按说明书从UCB-MNCs中提取纯化的CD34+细胞；
步骤5、前体DC的诱导培养：
CD34+细胞分别行生理盐水离心洗涤3次，接种于塑料培养瓶，在含有5%自体血清的IMDM培养基中贴壁1.5小时，移除CD14+细胞，收集悬浮细胞，按照106/ml的细胞密度接种于培养瓶，在含有FLT3-L 25ng/ml，TPO 10ng/ml，SCF 20ng/ml，以及5%自体血清的IMDM培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养2周，每2-3天换液，80%融合时移瓶，第14天收获前体DC，可冻存备用，可继续诱导成熟DC；
步骤6、未成熟DC的扩增和培养：
前体DC接种于含有5%自体血清的IMDM培养基2ml 的6孔板，细胞密度调整为3×105/well，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中贴壁培养1.5小时，移除悬浮细胞，贴壁细胞为未成熟DC，未成熟DC中加入GM-CSF 50ng/ml，IL-4 20ng/ml，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养5天，完成未成熟DC的扩增培养；
步骤7、DC疫苗的制备：
第5天加入自体肿瘤相关全抗原50μg/ml、TNF-α100ng/ml、及CD40L 100ng/ml，并补充10%的自体血清，培养48小时，诱导DC成熟，并制备成肿瘤特异性DC疫苗，临床接种治疗或冻存。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CAI YING Free format text: FORMER OWNER: CAI JIANHUI Effective date: 20131105 Free format text: FORMER OWNER: LI CAIZHEN Effective date: 20131105 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cai Jianhui Inventor after: Liu Gang Inventor after: Chen Baoping Inventor after: Yuan Can Inventor after: Feng Ruicheng Inventor before: Cai Jianhui Inventor before: Gao Fei Inventor before: Liu Gang |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CAI JIANHUI GAO FEI LIU GANG TO: CAI JIANHUI LIU GANG CHEN BAOPING YUAN CAN FENG RUICHENG |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20131105 Address after: 050000 Heping West Road, Hebei, Shijiazhuang, No. 348 Applicant after: Cai Ying Address before: 050000 Heping West Road, Hebei, Shijiazhuang, No. 348 Applicant before: Cai Jianhui Applicant before: Li Caizhen |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: HEBEI LITONGKANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: CAI YING Effective date: 20150413 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cai Jianhui Inventor after: Liu Gang Inventor after: Chen Baoping Inventor after: Li Hanlin Inventor before: Cai Jianhui Inventor before: Liu Gang Inventor before: Chen Baoping Inventor before: Yuan Can Inventor before: Feng Ruicheng |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: CAI JIANHUI LIU GANG CHEN BAOPING YUAN CAN FENG RUICHENG TO: CAI JIANHUI LIU GANG CHEN BAOPING LI HANLIN |
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| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20150413 Address after: 050000 No. 219, Qinshan street, hi tech Zone, Hebei, Shijiazhuang 1-206 Patentee after: Li Tongkang bio tech ltd, Hebei Address before: 050000 Heping West Road, Hebei, Shijiazhuang, No. 348 Patentee before: Cai Ying |
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| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 050000 Floor 1, Building 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee after: Hebei Fu Fu Yu Biological Technology Co., Ltd. Address before: 050000 1-206, No. 219 Qinshan Street, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee before: Li Tongkang bio tech ltd, Hebei |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211126 Address after: 050000 a2-145, No. 22, yuanboyuan street, South Zone, Zhengding County high tech Industrial Development Zone, Zhengding District, China (Hebei) pilot Free Trade Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province Patentee after: Yuetenong biotechnology Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 floor 1, building 1, 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province Patentee before: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. |