CN103405408B - 白杨素在治疗缺血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白杨素（Chrysin）在治疗缺血性脑卒中药物中的应用。本发明的实验结果表明白杨素对局灶性脑缺血再灌注损伤有较好的神经保护作用，可改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失，减轻脑含水量，减小脑梗死体积，增加过氧化物歧化酶（SOD）活力，减少丙二醛（MDA）含量；局灶性脑缺血再灌注后，白杨素可降低缺血再灌注脑组织的核因子-κB（NF-κB）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）基因的相对表达量；白杨素亦可减少缺血再灌注脑组织中GFAP、Iba1的表达，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，同时减少IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A、TNF-α、IFN-γ等前炎性因子的表达，从而减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现缺血后的神经保护作用。

Description

白杨素在治疗缺血性脑卒中药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物白杨素的新用途，尤其涉及白杨素在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

背景技术

脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一，其高死亡率、高致残率给社会和家庭带来了沉重的负担。在脑血管病中作为症状最严重的病症之一，缺血性脑卒中对患者健康危害极大，往往造成不可逆的脑部损伤。因大脑动脉血流量和氧供应的中断，显著损害脑部生理活性，从而导致了一系列复杂的病理生理过程，包括脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、炎症反应、细胞凋亡等。脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，反而出现了更加严重的脑机能障碍，即脑缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤病生理过程是一个多环节、多因素、多途径损伤的酶促级联反应，涉及脑细胞能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内钙超载、氧化应激损伤及神经细胞凋亡等。

脑组织缺血后，小胶质细胞、星形胶质细胞被激活，产生大量的细胞因子和化学趋化因子。细胞因子使脑血管内皮细胞黏附分子表达上调，循环中的白细胞在黏附分子和趋化因子的作用下，黏附并迁移至损伤的脑实质，与胶质细胞一起释放大量的白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子，从而加强白细胞浸润，同时花生四烯酸代谢产物等炎症介质大量增加，加重局部损伤，最终导致神经细胞凋亡、坏死。

脑缺血通常是由血栓形成或栓塞造成脑部大动脉阻塞引起的，阻塞后该动脉供血区的局部脑血流量（regionalcerebralbloodflow,rCBF）迅速下降。缺血区域血流量的下降是不均衡的，缺血中心的血流下降最严重，被称为缺血中心区，缺血中心区的脑血流阈值为10ml/（100g·min），神经细胞膜离子泵和细胞能量代谢衰竭，脑组织发生不可逆性损害，而缺血中心区周围区域的CBF下降相对较轻，被称为缺血半暗带。缺血半暗带的脑血流处于电衰竭[约为20ml/（100g·min）]与能量衰竭[约为10ml/（100g·min）]之间，局部脑组织存在大动脉残留血流和（或）侧枝循环，尚有大量存活的神经元。因此，缺血半暗带区是一个组织结构完整性保留但功能减弱或消失的低灌注区。缺血中心区和缺血半暗带是一个动态的病理生理过程，随着缺血程度的加重和缺血时间的延长，中心坏死区逐渐扩大，缺血半暗带逐渐缩小，脑梗死范围增大。但如果能在短时间内恢复缺血半暗带的血流，该区脑组织功能是可逆的，神经细胞可存活并恢复功能。因此，尽早恢复缺血半暗带区的血液供应，可以减少脑梗死体积，改善脑卒中病人的预后。挽救缺血半暗带的关键除了及时恢复血流外，还在于抑制缺血性级联反应。

现有技术中，对缺血性脑卒中治疗的策略主要包括两方面，一是恢复脑再灌，改善脑血供（溶栓）；二是阻断损伤级联反应，防止神经元损伤（脑保护）。针对缺血性脑卒中的病理机制的复杂性，除了超早期溶栓有确切疗效外，尚未有一种为循证医学证明有肯定疗效的神经保护剂。神经保护剂的目标是干预缺血半暗带区的病生理级联反应，挽救尚具有活力的脑组织，防止或延迟细胞死亡。白杨素，5,7-二羟黄酮，又称白杨黄素。它是黄酮类化合物的一种，存在于紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等。现有技术表明，白杨素具有抗肿瘤、抗炎等多种生物学特性，但截至目前白杨素对于对缺血性脑卒中的治疗作用尚无报道。

发明内容

本发明的目的是公开了白杨素在制备治疗缺血性脑卒中药物方面的应用。本发明通过大量实验数据确定了白杨素用于治疗缺血性脑卒中的有效剂量为47-53mg/Kg体重/天，进而将有效剂量优选为50mg/Kg体重/天。

目前，脑神经保护活性的筛选动物实验按照常规方法是采用颈内动脉线栓法制备小鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）局灶性脑缺血模型来评价抗脑缺血药物的疗效。本发明运用实验动物模型进行了大量的实验，结果表明：预防性给予白杨素对局灶性脑缺血再灌注小鼠有较好的神经保护作用，可改善脑缺血再灌注损伤后的神经功能缺失，减轻脑含水量，减小脑梗死体积，增加过氧化物歧化酶（SOD）活力，减少丙二醛（MDA）的含量；局灶性脑缺血再灌注后，白杨素可下调缺血再灌注脑组织的核因子-κB（NF-κB）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶-2（COX-2）基因的相对表达量；白杨素亦可减少缺血再灌注脑组织中GFAP、Iba1的表达，抑制星形胶质细胞和小胶质细胞激活，同时减少IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17A、TNF-α、IFN-γ等前炎性因子的表达，从而减轻缺血脑组织的过度炎症反应，实现缺血后的神经保护作用。

附图说明

图1为白杨素（Chrysin）改善大脑中动脉缺血后造成的神经功能缺损图；说明白杨素可改善脑缺血再灌注损伤所致的神经功能缺损，具有神经保护作用。

图2为白杨素（Chrysin）减轻小鼠脑组织含水量图；说明白杨素具有神经保护作用。

图3为白杨素（Chrysin）减轻局灶性脑缺血再灌注损伤后的梗死体积图；说明白杨素具有脑组织保护作用。

图4为白杨素（Chrysin）改善缺血再灌注后脑组织的病理变化图；说明白杨素对局灶性脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

图5为白杨素（Chrysin）减少iNOS的阳性细胞表达图；说明白杨素具有神经保护作用。

图6为白杨素（Chrysin）减少COX-2的阳性细胞表达图；说明白杨素具有神经保护作用。

图7为白杨素（Chrysin）减少NF-κB的阳性细胞表达图；说明白杨素具有神经保护作用。

图8为白杨素（Chrysin）减少iNOS、COX-2、NF-κBmRNA的相对表达量图；说明白杨素具有神经保护作用。

图9为白杨素（Chrysin）减少GFAP的阳性细胞表达效果图；说明白杨素具有神经保护作用。

图10为白杨素（Chrysin）减少Iba-1的阳性细胞表达效果图；说明白杨素具有神经保护作用。

图11为白杨素（Chrysin）提高缺血再灌注后小鼠脑组织SOD活力、降低其MDA表达的效果图；说明白杨素具有脑部保护作用。

图12为白杨素（Chrysin）降低脑组织缺血再灌注后IL-1β、IL-6、IL-12、IL-1A、IL-17A、TNF-α、IFN-γ等炎性因子的表达效果图；说明白杨素具有脑部保护作用。

具体实施方式

实施例1

1.1MCAO小鼠模型的建立

（1）实验动物及来源

雄性野生型C57/BL6无病原体（SPF级）小鼠72只，6-8周龄，体重25-30g，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，饲养与天津医科大学实验动物中心，小鼠的饲养环境为室温20-25℃，相对湿度40%-60%。

（2）实验分组

为研究白杨素在小鼠MCAO动物模型中的药物作用，小鼠随机分为三组，每组24只，分别为假手术组；缺血再灌注模型组（模型组）；白杨素治疗组（治疗组）。治疗组与制备MCAO模型前7天给予白杨素50mg/Kg/天灌胃。假手术组和模型组于MCAO模型制备前7天给予与治疗组相同体积的生理盐水灌胃。模型组和治疗组小鼠采用Longa线栓法建立MCAO模型，缺血1h，再灌注24h。

（3）实验步骤

a.小鼠称重，10%水合氯醛（3ml/Kg）腹腔注射麻醉，将其仰卧位固定在解剖手术台上，以左侧大脑中动脉为手术侧，颈部备皮，碘伏消毒；

b.行颈部前正中切口，剪开皮肤，分离皮下组织，暴露鼓泡腺并将其推向两侧，钝性分离组织，暴露颈总动脉鞘；

c.钝性分离颈总动脉（commoncarotidartery,CCA）、颈内动脉（intemalcarotidartery,ICA）、颈外动脉（externalcarotidartery,ECA）及ECA的主要分支动脉枕动脉、甲状腺上动脉等，保护周围神经如迷走神经不受损伤；

d.先结扎ECA的主要分支动脉，结扎CCA近心端，在远心端置一备用丝线略做结扎，留作固定线栓用，在ICA近心端置一备用丝线，留作止血用；

e.在CCA上两条结扎线之间剪一V型切口，将已备好的线栓***CCA内，稍收紧远心端结扎线，将线栓越过ECA和ICA的分叉处进入ICA管腔，缓慢送入颅内，遇到轻微阻力时即到达大脑中动脉（middlecerebralartery,MCA）的起始部（***的平均深度为距颈内外动脉分叉处9-10mm），收紧并结扎CCA上的结扎线；

f.确认伤口无渗血，逐层缝合肌肉与皮肤，碘伏消毒手术切口，线栓末端暴露在皮肤外面，并将其标记；

g.缺血1h后，将线栓退出约5mm，但线栓头仍留置在ECA断端内，从而使小鼠实现再灌注，剪断线栓的多余部分；

h.术后注意保温及切口的护理，手术动物苏醒后单笼饲养，保持鼠笼干燥清洁，供应流质，密切观察。

i.假手术组模型制备同上，但经ECA侧壁***线栓仅约5mm，即线栓并不***ICA颅内段。

（4）MCAO模型的入选标准

参照ZeaLonga的方法，在小鼠手术麻醉清醒后进行5分制评分：

0分：无神经功能损伤症状；

1分：提尾时栓塞动脉对侧前肢不能伸直；

2分：行走时向栓塞动脉对侧旋转；

3分：行走时向栓塞动脉对侧倾倒；

4分：不能自发行走，意识丧失。

评分在1-3分者入组。

（5）MCAO模型的排除标准

a．依据ZeaLonga评分法，神经功能评分低于1分者；

b．取脑时发现并发蛛网膜下腔出血者；

c．TTC染色未见缺血灶者；

d．缺血再灌注24h内死亡者。

因上述因素导致各实验组动物数不足者，随时补齐动物数并重新造模。

1.2神经功能缺损评分

小鼠手术麻醉清醒后，采用改良的神经功能缺损评分（modifiedneurologicalseverityscores,mNSS）对小鼠的运动、感觉、平衡功能和反射进行评价，评分范围为0-18分，分值越高，其神经损害越严重，其中，13-18分为严重损伤，7-12分为中度损伤，1-6分为轻度损伤，0分为无损伤。

表1：改良的神经功能缺损评分（mNSS）

1.3小鼠脑梗死体积的评价

应用TTC染色对脑梗死体积进行评价。

MCAO小鼠缺血再灌注24h后，以10%水合氯醛过量麻醉后仰卧位固定，快速开胸暴露心脏，由心尖部将16号针头插至主动脉根部，血管钳夹闭腹主动脉，同时剪开右心耳放血。经心脏快速灌注4℃生理盐水100ml左右，直至流出液变清为止。灌注后立即断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，-20℃冰箱内冷冻20min后取出，自前脑额极起向后连续切出5片厚度约2mm的冠状位脑切片。将脑片放入预先配制的1%TTC溶液中，37℃避光孵育约30min，15min时脑片翻面一次，使其与TTC均匀接触。然后将脑片置于新鲜配制的4%多聚甲醛溶液中固定24h，观察并拍照，正常脑组织呈鲜红色，坏死区不染色而呈苍白色。

分析：应用ImageJ图像（MediaCybernetics,Inc）处理软件计算梗死体积占同侧脑体积的百分比。考虑脑水肿的影响，采用校正后的梗死体积计算公式：校正的测量梗死面积=测量的梗死面积×{1一[（同侧半球面积一对侧半球面积）/同侧半球面积]}。

1.4小鼠脑组织含水量测定

采用干湿重法，去除额极后取病变侧约2mm厚的脑组织用于脑含水量测定。

（1）将脑组织放入事先称重（A）的锡纸中，立即称重（B），B-A即得湿重；

（2）用锡纸包裹脑组织，放入95℃烤箱内烘干24h后取出恢复到室温，称重（C），C-A即得干重，反复称量至恒重；

（3）代入公式计算脑组织含水量：（脑组织湿重-脑组织干重）/湿重×100%，即（B-C）/（B-A）×100%。

结果如下：

表2：小鼠神经功能缺损评分及脑梗死体积比较

与模型组相比，^aP＜0.05

1.5小鼠脑组织石蜡切片的制备

（1）应用10%水合氯醛麻醉小鼠，按3ml/Kg给予腹腔注射；

（2）待麻醉满意后，做一前正中线长约3cm胸腹联合切口，充分暴露胸腔及腹腔脏器；

（3）游离心脏，寻找右心耳并剪开，开放静脉（动作要快）；

（4）从左心室***连接有20ml注射器的头皮针（头皮针磨钝，从以身体纵轴45度角方向进针，针尖***升主动脉内，动作要轻柔）；

（5）推入20ml生理盐水，可见肝脏、肠道等器官变白，推完以后迅速更换4℃多聚甲醛20ml，并快速推入；

（6）灌注成功的标志：刚开始灌注时小鼠全身剧烈抽动，之后全身僵硬；

（7）应用鼠断头刀．将小鼠头部取下；

（8）应用剪刀沿头正中线剪开皮肤，并剔除头部肌肉，充分暴露颅骨；

（9）用小号止血钳（直）掰除颅骨，去除脑膜，充分暴露脑组织，并将止血钳深入颅底，取出脑组织；

（10）将脑组织置于4%多聚甲醛中固定24h；

（11）依次从低浓度酒精到高浓度酒精脱水：（注意：高浓度酒精时间不能太长，否则组织易碎。）70%乙醇可过夜，80%乙醇1h，95%乙醇1h（两次），无水乙醇1h（两次）；

（12）透明：应用等体积的乙醇和二甲苯透明，一般浸泡30-45min即可（二甲苯透明则为30min×2次）；

（13）浸蜡：组织经透明后先放入熔化的软蜡（熔点为52-54℃）内1h；然后入硬蜡（熔点56-58℃）1h；

（14）包埋：将组织放入预热的包埋模具中，包埋盒置顶，继续添加石蜡，直至包埋底盒部浸没于石蜡；

（15）冷却：将模具置于冷却台上，充分冷却后，取出蜡块常温贮存备用。

1.6小鼠脑组织石蜡切片HE染色

（1）脑组织切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇脱水后至水洗：二甲苯（I）5min、二甲苯（Ⅱ）5min、100%乙醇2min、95%乙醇1min、80%乙醇1min+75%乙醇1min、蒸馏水洗2min；

（2）苏木素染色5min，自来水冲洗2min；

（3）盐酸乙醇酸化30s（提插数下）；

（4）自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min；

（5）置伊红液染色2min；

（6）常规脱水，透明，封片：80%乙醇（I）1min、95%乙醇（Ⅱ）1min、100%乙醇（I）1min、100%乙醇（Ⅱ）1min、二甲苯石碳酸（3：1）1min、二甲苯（I）1min、二甲苯（Ⅱ）1min、中性树脂封固。

1.7小鼠脑组织石蜡切片免疫荧光染色

（1）脱蜡：将组织切片置于烤箱中60℃2h；

水化：将组织切片依次置于：

（2）在摇床上用PBS洗石蜡切片，5min×2次；

（3）抗原修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入脑组织切片加热20min；

（4）缓慢冷却至室温；

（5）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（6）加入3%BSA，37℃恒温温箱孵育30min，甩干，勿洗；

（7）滴加一抗（anti-iNOS、anti-COX-2、anti-NF-κB、anti-GFAP），4℃过夜；从4℃取出后，室温放置复温30min；

（8）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（9）滴加荧光二抗，室温避光孵育1h；

（10）在摇床上，用PBS洗5min×3次，注意避光；

（11）在摇床上，用PBS洗5min×3次，注意避光；

（12）滴加DAPI，室温避光孵育5min；

（13）在摇床上，用PBS洗5min×3次，注意避光；

（14）用抗荧光淬灭封片剂封片；

（15）荧光显微镜镜下观察。

结果观察：光学显微镜下取梗死组织周边2mm范围进行观察，每张切片取6个视野（200×或400×）统计阳性细胞数，取平均值作为测量值。

1.8小鼠脑组织石蜡切片免疫组织化学染色

（1）脱蜡、水化（同1.7）；

（2）在摇床上用PBS洗石蜡切片，5min×2次；

（3）抗原修复：电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入脑组织切片加热20min；

（4）缓慢冷却至室温；

（5）加入浓度为3%的H₂O₂孵育30min（室温）；

（6）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（7）加入3%BSA，37℃恒温温箱孵育30min，甩干，勿洗；

（8）滴加一抗，4℃过夜；从4℃取出后，室温放置复温30min；

（9）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（10）滴加兔超敏两步法二抗中的聚合物辅助剂工作也，37℃温箱孵育15min；

（11）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（12）滴加兔超敏两步法二抗中的辣根过氧化酶标记羊抗兔多克隆IgGⅡ抗工作液（1：200），37℃温箱孵育20min；

（13）在摇床上，用PBS洗5min×3次；

（14）使用中山公司DAB显色套装进行显色，显微镜下观察显色情况，蒸馏水终止反应（1ml蒸馏水+A、B、C液各一滴）；

（15）苏木素复染，约5min；

（16）盐酸酒精分化，视复染深浅而定；自来水冲洗，1%氨水返蓝；

（17）脱水：80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、二甲苯各一次，每次需5min；

（18）封片：滴加中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），自然晾干；

（19）光学显微镜下观察结果。

结果观察：光学显微镜下取梗死组织周边2mm范围进行观察，每张切片取6个视野（200×或400×）统计阳性细胞数，取平均值作为测量值。

1.9小鼠脑组织匀浆过氧化物歧化酶（SOD）活力检测

（1）脑组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成组织匀浆，2500转/分，离心10min，取上清即10%组织匀浆；

（2）上清液制备：取10%组织匀浆0.1ml，加0.1ml试剂一混匀，4000/分离心10min，取上清液待测；

（3）上述样本准备好后，测定蛋白浓度；

（4）按照下表进行加样；

表3：小鼠脑组织匀浆过氧化物歧化酶（SOD）活力检测加样方法

（5）计算公式

（6）应用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较行SNK法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.0小鼠脑组织匀浆丙二醛（MDA）含量测定

（1）按照1.9准备脑组织匀浆上清；

（2）按照下表进行加样；

表4：小鼠脑组织匀浆丙二醛（MDA）含量测定加样方法

（3）漩涡混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后4000转/分，离心10min，取上清液加于比色皿中，在可见光分光光度计532nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值；

（4）计算公式为：组织中MDA含量（nmol/mgprot）=（测定管吸光度－测定空白管吸光度）/（标准管吸光度－标准空白管吸光度）×标准品浓度（10nmol/ml）÷待测样本蛋白浓度（mgprot/ml）；

（5）应用SPSS17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较行SNK法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果：

表5：白杨素对MCAO/R小鼠脑组织SOD活力、MDA含量的影响

与假手术组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05

2.1小鼠脑组织实时定量PCR检测

（1）引物序列

（2）标本的留取

各实验组小鼠断头处死后，无菌操作下取梗死侧皮层脑组织，快速称取100mg，置冻存管中放入液氮保存待用，用于抽提总RNA。

（3）组织总RNA提取

a.取组织50mg，按下列程序提取总RNA在冰浴匀浆器中加入1mlTrizol及50mg组织,迅速研磨将匀浆液转移至DEPC处理的无菌离心管中，4℃12000rpm离心10min。

b.上清液转移至另一离心管中，室温孵育5min后加入200ml氯仿，震荡混匀，再在室温下孵育3min，剧烈震摇30s，冰上放置5-10min

c.4℃，12000rpm，离心20min

d.取上层水相转移至另一EP管中，加等体积的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置2h以上

e.4℃，12000rpm，20min

f.轻轻遗弃上清，加1ml75%乙醇轻轻混匀

g.4℃，12000rpm，10min，轻轻遗弃上清,空气中晾晒5min，加20μlDEPC处理的去离子水溶解沉淀，58℃水浴溶解RNA，-80℃保存备用

（4）提取RNA完整性的检测

取RNA溶液4μl，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，明显可见28S、18S条带，且28S为18S条带的两倍，5S条带较弱，且弥散，表明RNA降解较少，完整性良好。用756型紫外分光光度计分别测定OD₂₆₀与OD₂₈₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间，表明提取的RNA蛋白污染很少，因此可于后续反转录反应。

（5）提取RNA的定量

用756型紫外分光光度计测量OD₂₆₀/OD₂₈₀比值，可检测RNA的纯度和含量，选用OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.8-2.0的RNA用作反转录。RNA含量采用紫外分光光度计检测法。

（6）cDNA第一链合成

表6：cDNA第一链合成反应液组成

PCR热循环参数：96℃4min，然后三步反应：94℃30S，8℃30s，2℃30s，行40个循环，每个循环的第三步72℃30s收集荧光信号。

（8）实时荧光定量PCR结果分析

扩增完毕后，进入结果分析界面，以β-actin为内参照基因，与对照组相比，得到目的基因表达的相对定量值（RQ值），将RQ值统计分析。

表8：白杨素对MCAO/R小鼠脑组织NF-κB、iNOS、COX-2基因的相对表达量

与假手术组比较，^aP＜0.05；与模型组比较，^bP＜0.05

2.2酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）测定小鼠脑组织上清中炎症因子的含量

（1）提前20min从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温；

（2）Washbuffer稀释液：用蒸馏水以1：10稀释，50mlwashbuffer加450ml蒸馏水至500ml；

（3）Assaybuffer稀释液：用蒸馏水以1：20稀释，5mlassaybuffer加95ml蒸馏水至100ml；

（4）SampleDilutionBuffer稀释液：2ml10%BSA加SampleDilutionBuffer至20ml；

（5）HRP连接物的配制（Avidin-HRP）：用1倍的Assaybuffer液以1：1000稀释，11μlHRP连接物底液加入到11mlAssaybuffer中。

（6）AntigenStandardCocktail的配制：将12种抗原标准品各吸取10μl放入880μl稀释的SampleDilutionBuffer中，配制成浓缩的AntigenStandardCocktail，再用稀释的SampleDilutionBuffer按1：4配制成FinalAntigenStandardCocktail.

（7）DectionAntibodies稀释液：分别向12种DetectionAntibodies中加入855μlAssayBuffer混匀。

（8）从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条；

（9）用多道移液器向每个孔加入50μlAssayBuffer洗板：

（10）加样：分别将标本和12种标准品加入相应孔中（50ul/孔），用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h；

（11）洗板3次：

（12）加入100μl稀释的DectionAntibodySolution，室温孵育1h；

（13）洗板4次；

（14）加入100μlAvidin-HRP，室温孵育30min；

（15）洗板4次；

（16）加入100μlDevelopmentSolution，室温避光孵育15min；

（17）加入100μlStopSolution，酶标仪450nm处读取OD值。

实施例2

白杨素50g与280g淀粉混合均匀，用淀粉浆（取淀粉220g用水制成淀粉浆）制颗粒，过筛，干燥，装胶囊。

实施例3

白杨素80g与淀粉340g混合均匀，用淀粉浆（取淀粉210g用水制成淀粉浆）制颗粒，过筛，干燥，加6%硬脂酸镁，混匀，压制成片，包薄膜衣即可。

实施例4

白杨素100g，淀粉100g和纤维素适量过筛，并充分混匀，将适量聚乙烯吡咯烷酮溶液与上述的粉混合，过筛，制得湿颗粒与60℃干燥，将羟甲基淀粉钠盐，6%硬脂酸镁和滑石粉预先过筛，然后加入到上述的颗粒中压片。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.白杨素在制备治疗缺血性脑卒中患者的脑组织过度炎症反应的药物的应用，所述白杨素的结构如式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的剂型为口服剂和注射剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述白杨素的每日有效剂量为47-53mg/kg体重。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述白杨素的每日有效剂量为50mg/kg体重。