CN103402517A

CN103402517A - 使用braf抑制剂的治疗方法

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Publication number: CN103402517A
Application number: CN2011800652457A
Authority: CN
Inventors: M·布利姆; T·M·吉尔默; 小詹姆斯·G·格雷杰; S·G·拉奎尔; L·刘
Original assignee: Ge Lan Element Smith's Gram Lay Intellecture Property (no 2) Co Ltd
Current assignee: Ge Lan Element Smith's Gram Lay Intellecture Property (no 2) Co Ltd; GlaxoSmithKline Intellectual Property No 2 Ltd
Priority date: 2010-11-19
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-11-20
Also published as: KR20130116291A; IL226352A0; JP2013543008A; BR112013012485A2; EA201390740A1; EP2640387A1; US20130231347A1; AU2011329666A1; EP2640387A4; WO2012068468A1; SG190689A1; CA2818544A1; MX2013005668A; CN104689318A

Abstract

本发明涉及治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法，所述方法包括检测至少一个NRAS蛋白和/或至少一个MEK1蛋白或者编码所述蛋白的基因中是否存在至少一个突变；随后根据是否存在所述突变来启动、改进或者中止利用选自BRAF抑制剂或者其它合适药物的化疗剂进行的治疗。

Description

使用BRAF抑制剂的治疗方法

发明领域

本发明涉及利用BRAF抑制剂进行治疗的方法。更具体地说，发明涉及利用BRAF抑制剂，根据特定遗传变异的存在与否，对患有敏感性癌的人受试对象进行测试和治疗的方法。

发明背景

在个体化医疗的时代，癌症治疗日渐建立在患者的基因和其它生物标记以及要治疗的肿瘤的基础上。当前，许多治疗方法针对的是具体的细胞机制，而不是象以前那样的一般性的疗法。

近年，由于对Ras-Raf-MEK-ERK激酶途径(被称为MAPK途径)的更多了解，考察了B-Raf抑制剂在癌症治疗中的用途。特别是这样的理解，即Ras蛋白在应答生长因子、激素、细胞因子等时被激活刺激了Raf激酶的磷酸化和活化，而Raf激酶的磷酸化和活化随之使MEK1和MEK2激酶磷酸化和活化，然后这两种激酶又将ERK1和2激酶磷酸化和活化。

MAPK取代型激酶中的突变被认为对该途径的生长信号功能有负面效应，导致多种人类癌症的建立、发生和进展。在相当大百分比的人类黑素瘤(Davies,H.,et al.,Nature(2002)9:1-6;Garnett,M.J.&Marais,R.,Cancer Cell(2004)6:313-319)和甲状腺癌(Cohen et al J.Nat.Cancer Inst.(2003)95(8)625-627和Kimura et al Cancer Res.(2003)63(7)1454-1457)中，以及发生率低一些但仍然是显著的多种其它癌症中都观察到了B-Raf激酶中天然发生的突变。

GlaxoSmithKline发现了一族化合物(以前在国际专利申请PCT/US2009/042682中描述过，该申请的国际公开号是WO2009/137391)，包括具有化学式(I)的化合物:

下文中称为化合物A。

发现这些化合物是强力的有选择性的RAF激酶抑制剂。特别是具有化学式(I)的化合物显示是强力的有选择性的抗人野生型BRAF和CRAF以及在人黑素瘤和其它癌症中常见的几种它们的突变体形式(包括BRAFV600E、BRAFV600K、BRAFV600D、BRAFV600L和BRAFV600R)的抑制剂。该化合物抗BRAFV600E突变体的效率对于诸如黑素瘤的癌症的治疗意义重大，因为BRAF突变在大部分黑素瘤中都有发生，而V600E突变是最主要的BRAF突变。

展望未来，通过更进一步的发现和关联其它生物标记物仍有机会完善个体化医疗手段。具体到利用化学式(I)的化合物和同类的BRaf抑制剂进行的治疗，鉴定到更多的生物标记物并明确它们与疾病和治疗之间的关系将有助于把治疗特别集中在能够受益同时避免无效治疗的那些上。

发明概述

本发明涉及治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法，所述方法包括检测至少一个NRAS基因和/或至少一个MEK1基因中是否存在至少一个突变，或者所述蛋白的改变；随后根据是否存在所述突变来启动、改进或者中止利用选自BRaf抑制剂或者其它合适药物的化疗剂进行的治疗。本发明还涉及治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法，所述方法包括检测至少一个NRAS基因和/或至少一个MEK1基因中是否存在至少一个突变，或者所述蛋白的改变；随后根据是否存在所述突变来启动、改进或者中止利用选自BRaf抑制剂或MEK1抑制剂或者其它合适药物的化疗剂进行的治疗。更具体地说，发明是治疗V600突变体黑素瘤的方法，所述方法包括检测位于密码子61和/或146的一个或者组合的NRAS突变，例如Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V；位于密码子59的MEK1缺失；位于密码子387的MEK1突变，例如P387S；或者位于密码子56的MEK1突变，例如Q56P；或者位于密码子121的MEK1突变，例如C121S；或者位于密码子124的MEK1突变，比如P124L；或者位于密码子129的MEK1突变，比如F129L；其中这样的突变表明对使用BRaf抑制剂或者MEK1抑制剂进行的治疗有抗性的可能性增加，因此根据所述检测对所述癌症疗法进行改进。

根据发明的一个实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括检测是否存在下述突变的步骤：位于密码子61和/或146的一个或者组合的NRAS突变，例如Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V；位于密码子59的MEK1缺失；位于密码子387的MEK1突变，例如P387S；或者位于密码子56的MEK1突变，例如Q56P；或者位于密码子121的MEK1突变，比如C121S；或者位于密码子124的MEK1突变，比如P124L；或者位于密码子129的MEK1突变，比如F129L；以及据此预测对BRaf抑制剂或者MEK1抑制剂是否有反应或者反应持续时间(或者无进展的生存期)的步骤。

根据发明的另一个实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括检测下述突变的程度的步骤：位于密码子61和/或146的一个或者组合的NRAS突变，例如Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V；位于密码子59的MEK1缺失；位于密码子387的MEK1突变，例如P387S；或者位于密码子56的MEK1突变，例如Q56P；或者位于密码子121的MEK1突变，比如C121S；或者位于密码子124的MEK1突变，比如P124L；或者位于密码子129的MEK1突变，比如F129L；以及据此预测对BRaf抑制剂或者MEK1抑制剂是否有反应或者反应持续时间(或者无进展的生存期)的步骤。

根据发明的另一个实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括检测是否存在下述突变的步骤：位于密码子61和/或146的一个或者组合的NRAS突变，例如Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V；位于密码子59的MEK1缺失；位于密码子387的MEK1突变，例如P387S；或者位于密码子56的MEK1突变，例如Q56P；或者位于密码子121的MEK1突变，比如C121S；或者位于密码子124的MEK1突变，比如P124L；或者位于密码子129的MEK1突变，比如F129L；以及据此预测对化合物A或化合物B和/或它们的盐是否有反应或者反应持续时间(或者无进展的生存期)的步骤。

根据发明的另一个实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括检测下述突变的程度的步骤：位于密码子61和/或146的一个或者组合的NRAS突变，例如Q61K、Q61H、Q61R、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V；位于密码子59的MEK1缺失；位于密码子387的MEK1突变，例如P387S；或者位于密码子56的MEK1突变，例如Q56P；或者位于密码子121的MEK1突变，比如C121S；或者位于密码子124的MEK1突变，比如P124L；或者位于密码子129的MEK1突变，比如F129L；以及据此预测对化合物A或者它的盐是否有反应或者反应持续时间(或者无进展的生存期)的步骤。

根据发明的另一个实施方案，确定个体中对BRaf抑制剂的易感受性或MEK1抗性的方法包括提供来自所述个体的样品，其中样品包含DNA或RNA；和通过利用引物鉴定易感受性，所述引物能够检测表明所述BRaf抑制剂抗性的序列。鉴定步骤可以进一步定义为使引物处于合适的聚合条件，这样由引物发生聚合时，NRAS DNA或RNA或者MEK1DNA或RNA中存在表明BRaf抑制剂或者MEK1抑制剂抗性的序列。在特定实施方案中，个体患有黑素瘤。这个方法可以发生在BRaf抑制剂疗法之前。在特定实施方案中，当个体中鉴定到所述序列时，提供了预后和/或治疗信息。

根据发明的另一个实施方案，启动以BRaf抑制剂或者MEK1抑制剂进行的治疗后，当鉴定到可以赋予抗性的NRAS突变或MEK1突变时，调整疗法以便避开至少某些对治疗有抗性的问题。例如，采用替代的抗癌疗法，比如替代的化疗；和/或改变所用的化合物A或其盐的剂量。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。第一和第二BRaf抑制剂可以是但不必须是相同的。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利的是第二BRaf抑制剂是BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐。有利的是，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐和MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐和N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利的是，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和如果存在所述突变或缺失，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。有利的是，PI3K抑制剂是化合物C或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐的步骤。

在进一步的实施方案中，以上任何治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂，比如化合物A或其PLX4032盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否含有NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1K59缺失、MEK1P387突变、或者MEK1Q56P突变、或C121S突变、P124L突变或F129L突变中的至少一个；和组合给予BRaf抑制剂、MEK1抑制剂和PI3K抑制剂。在再进一步的实施方案中，所述BRaf抑制剂、MEK1抑制剂和PI3K抑制剂的组合是化合物A、化合物B和化合物C的组合。

赋予对特定疗法(比如化合物A或其盐或者PLX4032或其盐)抗性的突变可能在癌症发病前或者之后存在，或者在开始疗法之前或者之后存在。在具体实施方案中，赋予药物抗性的突变是治疗之前以非常低的频率已经存在的。在药物治疗的选择压下，突变克隆超过了其它细胞，导致药物抗性和快速进展。发明的特定方面中，对赋予抗性的已有突变和反应可能性或者反应的临床持续期之间进行了相关性分析。例如，治疗前已经存在的突变的出现率可以作为预后和治疗决策的肿瘤标记物。

附图简述

图1:NRAS核苷酸和氨基酸序列(基因登录号NM_002524.3)。标明了密码子Q61和A146的位置以及它们各自的核苷酸序列。

图2:MEK1核苷酸和氨基酸序列(基因登录号NM_002755.3)。标明了密码子K59和P387的位置以及它们各自的核苷酸序列。

图3:含有共突变BRAF V600E和NRAS Q61和/或A146的黑素瘤细胞显示出提高的RAS GTPase活性。

图4:含有共突变NRAS Q61和/或A146、任选还含有共突变MEK1P387的BRAF V600E黑素瘤细胞对BRAF抑制剂化合物A有抗性，但对化合物A和化合物B组合敏感(克隆分析法)。

图5:含有共突变NRAS Q61和/或A146,任选还含有共突变MEK1P387的BRAF V600E黑素瘤细胞对BRAF抑制剂化合物A有抗性，但对化合物B和化合物C组合敏感(克隆分析法)。

图6是两种BRAF抑制剂(化合物A和PLX4032)、一种MEK1抑制剂化合物B、和一种PI3K抑制剂化合物C的图像。

图7是各种A375F11黑素瘤细胞系克隆在不同浓度的BRAF抑制剂化合物A中的相对细胞生长曲线。

图8的表格总结了化合物A(BRAF抑制剂)、化合物B(MEK抑制剂)、化合物C(PI3K抑制剂)及其组合在获得了对化合物A的抗性的A375克隆中的细胞生长抑制试验。

图9的表格总结了化合物A、化合物B、化合物C及其组合在获得了对化合物A的抗性的YUSIT1克隆中的细胞生长抑制试验。

图10的Western印迹图像比较了与亲代克隆(A375)相比，用化合物A(BRAF抑制剂)处理四个A375克隆的信号转导效应。

图11阐述了将细胞用化合物A处理24小时后，用BRAF或者CRAF抗体提取和免疫沉淀的Western印迹，该图显示化合物A诱导BRAF-CRAF异二聚体复合体。亲代A375，和12R5-3和16R6-4克隆。

图12是用或没有用NRAS shRNA处理过的细胞的相对生长曲线(NRAS克隆2和9，对照克隆2和7)，表明NRAS表达的减少使得对化合物A(BRAF抑制剂)的敏感性恢复。

图13是用或没有用NRAS shRNA处理过的细胞的相对生长曲线(NRAS克隆2和9，对照克隆2和7)，表明NRAS表达的减少使得对化合物B(MEK1抑制剂)的敏感性恢复。

图14是用或者没有用NRAS shRNA处理的，以及用或者没有用化合物A(BRAF抑制剂)处理的A375克隆的Western印迹，该图显示化合物A减少了MEK和ERK的磷酸化。

图15是表达外源突变体NRAS蛋白并在有不同量化合物A(BRAF抑制剂)的情况下生长的A375细胞的相对生长曲线图。

图16是表达外源突变体NRAS蛋白并用化合物B(MEK1抑制剂)处理了3天的A375细胞的相对生长曲线图。A375PF11(空心圆)、5个表达FLAG-NRASQ61K的A375PF11克隆(实心圆)以及两个表达FLAG-NRASA146T的A375PF11克隆用化合物B(MEK1抑制剂)处理三天后。

图17是亲代(A375)以及表达外源突变体NRASQ61K和NRASA146T克隆的A375细胞的Western印迹图像，表明表达突变体NRAS的细胞没有显示出MEK、ERK和S6P磷酸化的下降。

图18是化合物B(MEK1抑制剂)与MEK1蛋白的模型化结合图像。

图19是表达外源MEK1突变体的A375细胞在用不同量的化合物A处理后的相对生长曲线。

图20是表达外源MEK1突变体的A375细胞在用一定量化合物B处理后的相对生长曲线。

图21是表达外源MEK1突变体的A375细胞在用化合物A处理后，细胞裂解物的Western印迹。

图22是为了敲除MEK1或MEK2表达而用siRNA处理过的A375亲代和化合物A抗性细胞的相对生长曲线。

图23的Western印迹图像检测了MEK1和MEK2siRNA处理过的A375细胞中的表达或表达的缺失。

图24显示了在用化合物A、化合物B、或者A与B以10:1恒定摩尔比率组合处理3天后，A375PF11(A.)和获得了对化合物A抗性的A375PF11衍生克隆12R5-1(B.)、12R5-3(C.)、16R6-2(D.)和16R6-4(E.)的相对生长曲线。

图25显示了在用化合物A、化合物B、或者A与B以10:1恒定摩尔比率组合处理3天后，稳定表达NRAS Q61R(B.)、NRAS Q61K(C.,D.)和NRASA146T(E.,F.)或介质的细胞的相对生长曲线。

图26显示了在用化合物A、化合物B、或者A与B以10:1恒定摩尔比率组合处理3天后，转导了载体、MEK1WT、MEK1K59del和MEK1Q56P的A375PF11相对于介质的代表性生长曲线。

图27显示了A375PF11衍生克隆12R5-3、16R6-4和12R5-5的代表性生长曲线，所述克隆在有0、0.1、0.3和1μM化合物A的情况下以对化合物B的剂量反应处理后获得了对化合物A的抗性。还显示了只用不同量化合物B处理过的A375PF11细胞(虚线、空心圆)作为比较。

图28显示了延时增殖分析的结果的代表性图像，表明1uM化合物A(BRAF抑制剂)和0.1uM化合物B的组合抑制了NRAS突变体克隆90%以上的细胞生长。

图29显示的各种A375突变体的Western印迹检测了在有化合物A、化合物B、或者两者都有的情况下不同的RAF-MEK-ERK途径分子的磷酸化。

图30显示的Western印迹检测了，在有或没有化合物A(BRAF抑制剂)或化合物B(MEK1抑制剂)的情形下，用化合物C(PI3K抑制剂)处理的A375突变体细胞的细胞裂解物中MEK、ERK、S6P和AKT的磷酸化。

图31显示了延时增殖分析的结果的代表性图像，表明化合物A(BRAF抑制剂)或化合物B(MEK1)与化合物C(PI3K抑制剂)的组合加强了对生长的抑制。

图32的表格总结了，用化合物A、化合物B、和化合物C、以及它们的组合处理，对表达各种MEK1突变体的细胞的生长抑制试验。

图33显示了表达各种MEK1突变体的细胞在有化合物A或化合物B的情况下的相对生长曲线。

图34的表格总结了用化合物A、化合物B、化合物C、或者所示组合处理过的YUSIT Q61K克隆的细胞生长抑制试验。

图35显示了表达各种MEK1突变体的细胞在有化合物A的情况下的相对生长曲线。

发明详述

突变与突变的检测

本发明基于检测患有V600突变体黑素瘤的人体内NRAS Q61突变、NRASA146突变、MEK1K59缺失或者MEK1P387突变中的一个或者组合。

术语“Ras蛋白”用于本文意味着是ras亚家族成员的任何蛋白，其中所述ras亚家族是参与细胞信号转导的GTPases亚家族。正如本领域已知的，Ras的激活会导致细胞生长、分化和存活。Ras蛋白包括，但不限于H-ras、K-ras和N-ras。

本文中，“编码Ras蛋白的基因”意味着编码任何Ras蛋白的基因或者多核苷酸的任意部分。包含在该术语的含义内的是编码Ras的外显子。编码Ras蛋白的基因包括，但不限于编码H-ras、K-ras和N-ras的一部分或者全部的基因。

“NRAS蛋白”是在人体中由NRAS(神经母细胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因同源物)基因编码的GTPase酶。

术语“突变体NRAS蛋白”和“N-ras突变”是指这样的N-ras蛋白，所述蛋白含有至少一个选自Q61R、Q61K、Q61H、Q61L、Q61N、Q61E、Q61P、A146T、A146P或A146V的突变。突变体N-ras多肽可能包括，但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或***变体、融合多肽、直系同源物和种间同源物。在某些实施方案中，突变体N-ras多肽包含位于C或者N末端的额外残基，比如但不限于前导序列残基、寻靶残基、氨基端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、tag残基和/或融合蛋白残基。

MEK1蛋白是双特异性丝裂原活化蛋白激酶激酶1，它在人体中由MAP2K1基因编码的酶。术语“突变体MEK1蛋白”和“MEK1突变”是指含有至少一个选自59delK和P387S或Q56P或C121S或P124L或F129L的突变的MEK1蛋白，或者含有至少一个选自175-177AAG缺失或C1159T的突变的MAP2K1基因。

此外，突变体NRAS或MEK1多肽包括，在所述细胞中缺失一部分或整个缺失的多肽或编码该多肽的基因。例如，NRAS蛋白可以是由细胞产生的截短的形式。缺失可能意味着失去了基因或者由基因编码的蛋白的全部或者一部分。

术语“V600突变体B-raf蛋白”和类似的术语是指包含位于V600位点的突变的B-raf多肽。B-raf蛋白可能含有其它突变，所述突变包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或***变体、融合多肽、直系同源物和种间同源物。在某些实施方案中，突变体B-raf多肽包含位于C或者N末端的额外残基，比如但不限于前导序列残基、寻靶残基、氨基端甲硫氨酸残基、赖氨酸残基、tag残基和/或融合蛋白残基。某些V600B-raf突变体包括但不限于含有选自V600E、V600D、V600K、V600R和V600L的氨基酸取代的BRAF。参见例如Halilovic and Solvit(2008)Current Opinion inPharmacology8:419-26中的图2。

术语“野生型”按照本领域的理解是指出现在天然群体中未经过基因改造的多肽或者多核苷酸序列。同样按照本领域的理解，“突变体”包括这样的多肽或多核苷酸序列，所述多肽或多核苷酸序列分别与野生型多肽或多核苷酸中可以见到的相应氨基酸或者核酸相比，含有至少一个氨基酸或核酸的改变。术语突变体包括了单核苷酸多态性(SNP)，其中与最常见(野生型)的核酸链相比，核酸链序列中存在单个碱基对的差别。

本文中，给细胞(包括来自受试对象的肿瘤细胞，或者DNA或其它生物样品)进行基因突变或者基因多态等位基因的“基因作图”意味着检测受试对象(或者样品)中存在或者缺少基因或者基因表达产物(例如hnRNA、mRNA或蛋白质)的哪个等位基因或多态性形式和/或野生型或者体细胞突变形式。由这样的基因表达的相关RNA或者蛋白质也可以用于检测多态性变异。为了本发明的目的，“基因作图”包括确定样品的体细胞型以及基因型突变。本文中，当其它可能的等位基因变体被排除时，可以认为“检测到”某个等位基因；例如当发现特定的核酸位点不是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或者胞嘧啶(C)时，可以论断该位点上的是鸟嘌呤(G)(即受试对象中“检测到”或者“诊断出”G)。可以直接(通过例如测序，例如EST测序或者部分或全基因组测序)或间接(例如通过限制酶片段长度多态性分析，或者通过检测与序列已知的探针的杂交情况，或者通过参照链构象多态性)，或者通过利用其它已知方法来检测序列变异。

任何核酸，包括基因或PCR产物或者它们的片段或部分的序列可以通过本领域任何已知方法(例如化学测序或酶法测序)测定。DNA的“化学测序”可以表示诸如Maxam和Gilbert(1977)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:560)的方法，其中利用个体碱基特异性反应将DNA随机切割。DNA的“酶法测序”可以表示比如Sanger(Sanger,et al.,(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463)的方法。

常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术，包括测序技术是本领域技术人员熟知的。这类技术在文献中有充分解释。参见例如Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(herein"Sambrook,etal.,1989");DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glovered.1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984);Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985));Transcription AndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins,eds.(1984));Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1986));Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,(1986));B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)。

肽核酸(PNA)亲和分析法是由传统的杂交检验(Nielsen et al.,Science254:1497-1500(1991);Egholm et al.,J.Am.Chem.Soc.114:1895-1897(1992);James et al.,Protein Science3:1347-1350(1994))衍生建立的。PNAs是遵循Watson-Crick碱基配对原则的DNA结构模拟物，可用于标准的DNA杂交检验。在杂交检验中PNAs展示出更高的特异性，因为PNA/DNA错配比DNA/DNA错配更不稳定，互补的PNA/DNA链比互补的DNA/DNA链形成的键更强。

DNA微阵列经建立用于检测基因变异和多态性(Taton et al.,Science289:1757-60,2000;Lockhart et al.,Nature405:827-836(2000);Gerhold et al.,Trends in Biochemical Sciences24:168-73(1999);Wallace,R.W.,MolecularMedicine Today3:384-89(1997);Blanchard and Hood,Nature Biotechnology149:1649(1996))。DNA微阵列是由高速机器人在玻璃或者尼龙基质上制作的，含有成分已知的DNA片段(“探针”)。微阵列被用于在传统碱基配对原则的基础上与已知和未知DNA片段(“靶”)配对。

多肽或者编码多肽的基因以及它们的语法变形中的术语“至少一个突变”意味着多肽或编码多肽的基因含有一或多个等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体、截短变体和/或***变体、融合多肽、直系同源物和/或种间同源物。举例来说，至少一个NRAS蛋白突变包括这样的NRAS蛋白，其中对于细胞中产生的至少一个NRAS蛋白，细胞中没有或者不表达多肽或者编码NRAS蛋白的基因的部分或全部序列。例如细胞产生的可以是截短形式的NRAS蛋白，而截短形式的序列在截短序列上是野生型的。缺失可能意味着缺少基因或者由基因编码的蛋白的全部或者部分。此外，细胞中表达的或者由细胞编码的蛋白中的一些可能被突变，而相同细胞中产生的相同蛋白的其它拷贝是野生型。另一个例子，NRAS蛋白中的突变应当包括这样的NRAS蛋白，所述NRAS蛋白与野生型的相同NRAS蛋白相比，氨基酸序列中含有一或多个氨基酸差别。

本文中“基因异常”意味着相对受试对象细胞中正常天然核酸内容物的缺失、取代、添加、易位、扩增等。

术语“多肽”和“蛋白”可以交换使用，在本文中作为一个广义上的术语表示天然蛋白、片段、肽或者多肽序列的类似物。因此天然蛋白、片段和类似物可以看作多肽属中的种。

在说到多肽序列的突变的语境下使用的术语“X#Y”是本领域认可的，其中“#”表示就多肽中氨基酸编号来说的突变位点，“X”表示野生型氨基酸序列中该位点的氨基酸，而“Y”表示该位点的突变氨基酸。例如，提到K-ras多肽时的标记“G12S”表明野生型K-ras序列中第12号氨基酸是甘氨酸，而在突变体K-ras序列中甘氨酸被丝氨酸代替。

本文中，术语“扩增”及其语法变形是指染色体组存在一或多个额外的基因拷贝。在某些实施方案中，细胞中编码Ras蛋白的基因可能发生了扩增。已经发现HER2基因的扩增与某些类型的癌症相关。在人唾液腺和胃的肿瘤衍生细胞系、胃和结肠腺癌、以及乳腺腺癌中曾经发现HER2基因的扩增。Semba et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6497-6501(1985);Yokota et al.,Oncogene,2:283-287(1988);Zhou et al.,Cancer Res.,47:6123-6125(1987);Kinget al.,Science,229:974-976(1985);Kraus et al.,EMBO J.,6:605-610(1987);vande Vijver et al.,Mol.Cell.Biol.,7:2019-2023(1987);Yamamoto et al.,Nature,319:230-234(1986)。

本文中，“过表达的”蛋白或多肽以及蛋白或多肽的“过表达”和它们的语法上的变形意味着给定细胞相对正常细胞产生的某种蛋白的数量增加。举例来说，相对非肿瘤细胞，肿瘤细胞可能过表达ras蛋白。此外，可能相比野生型ras蛋白，细胞中过表达了突变体ras蛋白。正如本领域理解的，细胞中多肽的表达水平可以相对管家基因，比如肌动蛋白进行归一化。一些情况中，与非肿瘤细胞相比，某个多肽在肿瘤细胞中可能表达不足。

本文中，“表达至少一个基因产物所需要的核酸”是指这样的核酸序列，所述核酸序列编码基因的任何部分，和/或与编码基因产物的核酸可操纵地连接，但不一定包含编码序列。举例来说，表达至少一个基因产物所需要的核酸序列包括，但不限于增强子、启动子、调控序列、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化序列和/或编码序列。多肽在特定细胞中的表达水平可能，但不限于被细胞基因组中各种调控元件和/或非编码序列的突变、缺失和/或取代影响。

文中提到的术语“多核苷酸”意味着至少10个碱基长的核苷酸聚合形式，其中所述核苷酸是核糖核苷酸或脱氧核苷酸或者这两种之一的核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。

本文中提到的术语“寡核苷酸”包括通过天然和非天然寡核苷酸连接键连接在一起的天然发生的和经过改造的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的一个子集，通常包含200个或者更少的碱基。优选寡核苷酸长10–60个碱基，最优选长12、13、14、15、16、17、18、19或者20-40个碱基。寡核苷酸通常是单链的，例如对于探针来说，虽然寡核苷酸可以是双链的，例如用于构建基因突变体的寡核苷酸。寡核苷酸可以是有义或者反义寡核苷酸.

寡核苷酸探针或者探针是长度通常在大约8个核苷酸到几百个核苷酸的核酸分子。这类分子一般被用于通过在严紧杂交条件下，与靶核酸序列杂交来鉴定样品中的靶核酸序列。上文中已经详细描述了杂交条件。

PCR引物也是核酸序列，虽然PCR引物一般是用于聚合酶链式反应的比较短的寡核苷酸。本领域技术人员利用来自靶序列的序列信息，可以容易地建立和制备PCR引物和杂交探针(参见例如Sambrook et al.,同前或者Glick etal.,同前)。

正如本领域已知的，有多种基于PCR和/或测序的方法被用于检测NRAS、MEK1和BRAF突变，在研究文章和美国专利中都有描述，包括但不限于Brose,et al.Cancer Research62:6997-7000(2002)、Solit et al,CancerResearch70(14):5901-5911(1010)、Xu,et al.Cancer research63:4561-4567(2003)以及美国专利7,745,128和几种商品试剂盒(参见Dxs DiagnosticInnovations、Applied Biosystems和Quest diagnostics)。总的来说，可以根据基因登录号NM_002524.3s的NRAS序列(图1)和密码子突变Q61K(C181A)、Q61H(A183C or A183T)、Q61R(A182G)、Q61L(A182T)、Q61N(C181A,A183C)、Q61E(C181G)、Q61P(A182C)、A146T(G436A)、A146P(G436C)和A146V(C437G)；以及基因登录号NM_002755.3的MEK1序列(图2)和位于密码子59的MEK1缺失(AAG缺失)或者P387S(C1159T)设计用于测序或PCR的引物和探针

Ras/Raf野生型或者突变的癌症可以通过已知方法来鉴定。例如，野生型或突变Ras/Raf肿瘤细胞可以通过DNA扩增和测序技术、DNA和RNA检测技术来鉴定，所述技术分别包括但不限于Northern和Southern印迹，和/或各种生物芯片和阵列技术。野生型和突变多肽可以通过多种技术检测，包括但不限于免疫诊断技术，比如ELISA、Western印迹或者免疫细胞化学。

黑素瘤

合适地，本发明涉及治疗或减轻BRAF V600突变黑素瘤严重程度的方法，所述突变黑素瘤包括的黑素瘤亚型是比如但不限于浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、恶性雀斑样痣黑素瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤和脉络膜黑素瘤、眼的眼内黑素瘤和葡萄膜眼内黑素瘤。

本文中，术语“癌症”、“瘤”和“肿瘤”可以交换使用，单数或者复数形式都是指发生了恶性转化，对宿主生物来说是病理性的细胞。通过成熟技术，特别是组织学检验可以容易地将原发性癌细胞(即从恶性转化部位附近获得的细胞)与非癌变细胞区分开。本文中，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括来自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞、来自癌细胞的体外培养物和细胞系。提到正常情况下表现为实体瘤的癌症类型时，“临床上可检测的”肿瘤是通过例如CAT扫描、MR成像、X射线、超声或者触诊的程序在肿瘤块的基础上可以检测的，和/或因为从患者获得的样品中表达了一或多种癌症特异性抗原所以可以检测的肿瘤。

正如本领域众所周知的，肿瘤可能从第一或者原发肿瘤病灶转移到一或多个其它身体组织或部位。特别是转移到中枢神经***(即继发性CNS肿瘤)，尤其是脑(即脑转移)对于肿瘤和癌症有很多记录，比如乳癌、肺癌、黑素瘤、肾癌和结直肠癌。本文中，提到用于受试对象中的“瘤”、“肿瘤”或“癌症”的治疗用途或方法包括用于原发瘤、肿瘤或者癌症的用途和治疗，合适情况下，也包括用于转移(即转移性肿瘤生长)的用途和治疗。

克服BRaf抗性的疗法

BRAF+MEK

已经发现了象上文描述的展示NRAS Q61和/或A146突变，因此对使用BRaf抑制剂进行的治疗有抗性的V600突变体黑素瘤，仍然可以用不同抑制剂类型的少数药物组合治疗。

令人惊讶的是，展现NRAS Q61和/或A146突变的V600突变体黑素瘤可以用BRaf抑制剂和MEK抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现NRAS Q61和/或A146突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐，以及化学式(II)的MEK抑制剂(下文称为“化合物B”)或其药学上可接受的盐或溶剂化物组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应:

化合物B又被称为USAN名曲美替尼(trametinib)。

正如下文中实施例部分显示的，BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及化学式(II)的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出NRAS Q61和/或A146突变有相关性。这种组合对NRAS突变细胞的抑制比任何单个药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。第一和第二TBRaf抑制剂可以是，但不必须是相同的。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利地，第二BRaf抑制剂是BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐。有利地，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及组合给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐和MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的步骤。

已经发现象上文描述的展示MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变,因此对使用BRaf抑制剂进行的治疗有抗性的V600突变体黑素瘤，仍然可以用不同抑制剂类型的少数药物组合治疗。

令人惊讶的是，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤可以用BRaf抑制剂和MEK抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐，以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应。

正如下文中实施例部分显示的，BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变有相关性。这种组合对MEK1突变细胞的抑制比任何单个药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失或者MEK1P387突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。第一和第二TBRaf抑制剂可以是，但不必须是相同的。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予第二BRaf抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利地，第二BRaf抑制剂是BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐。有利地，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐和MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐或溶剂化物的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；和组合给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐和-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-yl]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；和组合给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐和N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

为了避免混淆，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，即位于密码子61的NRAS突变、位于密码子146的NRAS突变、位于密码子59的MEK1缺失或者位于密码子387、56、121、124或129的MEK1突变中的任何一个均与用BRaf抑制剂(例如化合物A的抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。类似地，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变的组合发生与用BRaf抑制剂(例如化合物A的抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。此外，还要声明以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，无论单独发生的或者任何组合形式的，均与用文中描述的化合物A和化合物B的组合有效治疗所述黑素瘤的可能性提高互相关联。

PCT专利公开WO2009/137391(通过引用并入本文)中公开并且请求保护化合物A及其药学上可接受的盐作为特别是癌症治疗中BRaf活性的抑制剂。化合物A在该申请中的实施例58a-58e体现。

WO2005/121142(通过引用并入本文)中公开并且请求保护化合物B及其药学上可接受的盐作为特别是癌症治疗中MEK活性的抑制剂。化合物B是实施例4-1中的化合物。化合物B可以按照WO2005/121142中的描述进行制备。合适地，化合物B处于二甲基亚砜溶剂化物的形式。合适地，化合物B处于钠盐的形式。合适地，化合物B处于选自下述的溶剂化物的形式:水合物、乙酸、乙醇、硝基甲烷、氯苯、1-戊醇、异丙醇、乙二醇和3-甲基-1-丁醇。这些溶剂化物和盐形式可以由本领域技术人员根据WO2005/121142(通过引用并入本文)中的描述来制备。

2010年10月15日提交的PCT/US2010/052808中公开了组合给予化合物A和化合物B，以及合适的成剂和给剂，该申请的教导通过引用并入本文，并且可以作为各种可能的组合给药方法的指导。

化合物A和B可以分开或者同时作为溶剂化物存在。本文中，术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中化学式(I)或(II)的化合物或其盐)与溶剂形成的化学计量可变的复合体。适合本发明目的的这类溶剂不能干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的例子包括，但不限于水、甲醇、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。在一个实施方案中，使用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的例子包括，但不限于水、乙醇和乙酸。在另一个实施方案中，使用的溶剂是水。

化合物A和B可能具有形成一种以上形式的晶体的能力，这种特性被称为多晶现象，应当理解，这类多晶形式(“多晶型物”)也在化合物A和B的范围内。多晶现象通常是作为对温度或者压强或者这两者的变化的反应发生的，也可以是结晶过程的差异导致的。多晶型物可以通过本领域已知的各种物理特性，比如X射线衍射图谱、溶解性和熔点来区别。

合适地，根据本发明，作为组合给药一部分给予的化合物A的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约10mg–大约600mg的量。合适地，每天给予1-4次所选择的量的化合物A。合适地，每天两次给予150mg用量的化合物A。

合适地，根据本发明，作为组合给药一部分给予的化合物B的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约0.125mg–大约10mg的量。

MEK+PI3K

令人惊讶的是，展现NRAS Q61和/或A146突变的V600突变体黑素瘤可以用PI3K抑制剂和MEK抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现NRAS Q61和/或A146突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用化学式(III)的PI3K抑制剂(下文称为“化合物C”)或其药学上可接受的盐，以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应:

正如下文中实施例部分显示的，PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例中显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出NRAS Q61和/或A146突变有相关性。这种组合对NRAS突变细胞的抑制比任何单个药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利地，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐和MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的步骤。

令人惊讶的是，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤可以用PI3K/mTOR抑制剂和MEK抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐，以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应。

正如下文中实施例部分显示的，PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变有相关性。这种组合对MEK1突变细胞的抑制比任何单个药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予PI3K抑制剂和MEK抑制剂的步骤。有利地，MEK抑制剂是化合物B或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐和MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和N-{3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘-苯基氨基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代-3,4,6,7-四氢-2H-吡啶并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基}乙酰胺作为二甲基亚砜溶剂化物的步骤。

为了避免混淆，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，即位于密码子61的NRAS突变、位于密码子146的NRAS突变、位于密码子59的MEK1缺失或者位于密码子387、56、121、124或129的MEK1突变中的任何一个均与用BRaf抑制剂(例如化合物A抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。类似地，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变的组合发生与用BRaf抑制剂(例如化合物A抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。此外，还要声明以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，无论单独发生的或者任何组合形式的，均与用文中描述的化合物B和化合物C的组合有效治疗所述黑素瘤的可能性提高互相关联。

用于与化合物C组合的化合物B或其药学上可接受的盐可以按照上文的描述来制备。

国际公开号WO2008/144463(通过引用全部并入本文)中公开并且请求保护化合物C及其药学上可接受的盐和溶剂化物作为特别是癌症治疗中PI3K活性的抑制剂。化合物C还可以作为m-TOR抑制剂，已知具有m-TOR抑制活性。化合物B是WO’463公开中实施例345中示范的化合物，并且可以按照该实施例进行制备。

2010年9月28日提交的PCT/US2010/050495中公开了组合给予化合物B和化合物C，以及合适的制剂和给药剂量，该申请的教导通过引用并入本文，并且可以作为各种可能的组合给药方法的指导。

化合物B和/或化合物C在组合使用时可能形成溶剂化物，所述溶剂化物应当理解为由溶质(在本发明中化合物B或其盐和/或化合物C或其盐)与溶剂形成的化学计量可变的复合体。适合本发明目的的这类溶剂不能干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的例子包括，但不限于水、甲醇、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。合适地，使用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的例子包括，但不限于水、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。合适地，使用的溶剂是水。

合适地，化合物C以其游离碱形式提供。替代地，本发明的化合物的药学上可接受的盐可以由本领域技术人员根据本公开容易地制备。

合适地，根据本发明，作为化合物B和化合物C组合给药一部分给予的化合物B的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约0.125mg–大约10mg的量；例如这个量可以是大约5mg。

合适地，根据本发明，作为化合物B和化合物C组合给药一部分给予的化合物C的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约0.25mg–大约75mg的量；合适地，用量选自大约6mg–大约12mg；合适地，这个量可以是大约10mg。

BRAF+PI3K

在其它实施方案中，可以组合使用BRaf抑制剂和PI3K抑制剂。合适地，可以使用象上文描述的化合物A和象上文描述的化合物C。

令人惊讶的是，展现NRAS Q61和/或A146突变或者MEK1突变的V600突变体黑素瘤可以用BRaf抑制剂和PI3K抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现NRAS Q61和/或A146突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用化学式(III)的PI3K抑制剂(下文称为“化合物C”)或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应:

正如下文中实施例部分显示的，PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出NRAS Q61和/或A146突变有相关性。这种组合对NRAS突变细胞的抑制比任何单一药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及如果存在所述NRAS Q61和/或A146突变，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。有利地，BRaf抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；以及组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐和BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐的步骤。

令人惊讶的是，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤可以用PI3K/mTOR抑制剂和BRaf抑制剂的组合来治疗，并且对细胞生长的抑制超过了各个药物的效应相加。

举例来说，展现MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变的V600突变体黑素瘤已被证实在用PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐组合治疗时，重新出现细胞生长被抑制的反应。

正如下文中实施例部分显示的，PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐以及BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐的组合能够抑制肿瘤细胞的细胞增殖；其中正如实施例显示的，所述肿瘤细胞先前接触过BRaf抑制剂化合物A，并且已经发展出对BRaf抑制剂化合物A的抗性，这与展示出MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变有相关性。这种组合对MEK1突变细胞的抑制比任何单个药物都更佳。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予第一BRaf抑制剂；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及如果存在所述MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变，组合给予PI3K抑制剂和BRaf抑制剂的步骤。有利地，BRaf抑制剂是化合物A或其药学上可接受的盐。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；以及组合给予PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐和BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予BRaf N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含NRAS Q61和/或A146突变；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐的步骤。

根据发明的实施方案，治疗患有V600突变体黑素瘤的人的方法包括给予N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐；确定所述人的黑素瘤肿瘤组织是否包含MEK1K59缺失、MEK1P387突变、MEK1Q56突变、MEK1C121突变、MEK1P124突变或者MEK1F129突变；和组合给予2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-哒嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺酰胺和N-{3-[5-(2-氨基-4-嘧啶基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基}-2,6-二氟苯磺酰胺甲磺酸盐的步骤。

为了避免混淆，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，即位于密码子61的NRAS突变、位于密码子146的NRAS突变、位于密码子59的MEK1缺失或者位于密码子387、56、121、124或129的MEK1突变中的任何一个均与用BRaf抑制剂(例如化合物A抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。类似地，需要声明任何以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变的组合发生与用BRaf抑制剂(例如化合物A抑制剂)对所述黑素瘤进行治疗的响应降低或者有抗性互相关联。此外，还要声明以上描述的V600突变BRAF黑素瘤中的缺失或突变，无论单独发生的或者任何组合形式的，均与用文中描述的化合物A和化合物C的组合有效治疗所述黑素瘤的可能性提高互相关联。

用于与化合物C组合使用的化合物A或其药学上可接受的盐可以按照以上的描述制备。

国际公开号WO2008/144463(通过引用全部并入本文)中公开并且请求保护化合物C及其药学上可接受的盐和溶剂化物作为特别是癌症治疗中PI3K活性的抑制剂。化合物C还可以作为m-TOR抑制剂，已知具有m-TOR抑制活性。

PCT/US2010/052242(以国际公开号WO2011/046894出版)中公开了组合给予化合物A和化合物C，以及合适的制剂和给药剂量，申请分别通过引用并入本文，并且可以作为各种可能的组合给药方法的指导。

化合物A和/或化合物C在组合使用时可能形成溶剂化物，所述溶剂化物应当理解为由溶质(在本发明中化合物A或其盐和/或化合物C或其盐)与溶剂形成的化学计量可变的复合体。适合本发明目的的这类溶剂不能干扰溶质的生物活性。合适的溶剂的例子包括，但不限于水、甲醇、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。合适地，使用的溶剂是药学上可接受的溶剂。合适的药学上可接受的溶剂的例子包括，但不限于水、二甲基亚砜、乙醇和乙酸。合适地，使用的溶剂是水。

合适地，根据本发明，作为化合物A和化合物C组合给药一部分给予的化合物A的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约0.125mg–大约10mg的量；例如这个量可以是大约5mg。

合适地，根据本发明，作为化合物A和化合物C组合给药一部分给予的化合物C的量(根据未成盐/未溶剂化用量的重量)是选自大约0.25mg–大约75mg的量；合适地，用量选自大约6mg–大约12mg；合适地，这个量可以是大约10mg。

其它组合

另外的实施方案采用了其它BRaf、MEK(例如MEK1)和PI3K抑制剂进行治疗。例如，在一个实施方案中，BRaf抑制剂是PLX4032。在其它实施方案中，治疗包括给予至少PLX4032和化合物B，或者PLX4032和化合物C。在另一个实施方案中，治疗包括给予PLX4032和化合物A和化合物C。

另外的实施方案采用了下述MEK1抑制剂中的至少一种:来自Eisai Co.Ltd.的AZD6244、AE6201；来自Merck KGaA的AS703026；来自Roche的R7420；来自Roche和Chugai Pharmaceutical Co.Ltd的R7167；来自TakedaPharmaceutical Co.Ltd.的TAK-733；来自Ardea Bioscience Inc.和Bayer的RDEA119；以及来自UCB Group的WX-555。在优选实施方案中，MEK1抑制剂是别构MEK1抑制剂。其它实施方案包括Fremin et al.,Journal ofHematology&Oncology2010,3:8中提及的MEK1抑制剂，该文献通过引用并入本文部分提供其中MEK1抑制剂的化学结构和名称。在其它实施方案中，治疗包括给予本段落中提到的或者本文并入的参考文献中描述的MEK1抑制剂和化合物A，或者本段落中提到的或者本文并入的参考文献中描述的MEK1抑制剂和化合物C。

在另一个实施方案中，采用了下述PI3K抑制剂中的至少一种:CAL101、PX-866、BKM120、XL147、GDC0941、PX-866、CAL101、BEZ235、BGT226、XL765、SF1126。这些化合物的结构通过引用并入本文。在其它实施方案中，治疗包括给予以下组合中的至少一种:本段落中提到的PI3K抑制剂和化合物A；本段落中提到PI3K抑制剂和化合物B；PI3K抑制剂、PLX4032和化合物B。

一般来说，本发明的癌症治疗中可以共同给予任何对被治疗的敏感性肿瘤有活性的抗肿瘤药。这类药剂的例子可以在Cancer Principles and Practice ofOncology by V.T.Devita and S.Hellman(editors),6^th edition(February15,2001),Lippincott Williams&Wilkins Publishers中可以找到。可以与以上讨论的BRaf、MEK和PI3K抑制剂组合使用的典型抗肿瘤药包括，但不限于抗微管剂，比如二萜类化合物和长春花生物碱；铂配合物；烷化剂，比如氮芥类、oxazaphosphorines、烷基磺酸酯类、亚硝基脲和三氮烯；抗生素，比如蒽环类、放射菌素和博莱霉素；拓扑异构酶II抑制剂，比如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxins)；抗代谢物，比如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂，比如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂;受体酪氨酸激酶抑制剂；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂；非受体型酪氨酸激酶抑制剂；血管生成抑制剂,免疫治疗剂；促凋亡剂；和细胞周期信号转导抑制剂。

本发明还提供了治疗V600突变体黑素瘤的方法，包括除了其它抗肿瘤药以外，给予MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐与BRaf抑制剂化合物A或其药学上可接受的盐的组合，和/或MEK抑制剂化合物B或其药学上可接受的盐与PI3K抑制剂化合物C或其药学上可接受的盐的组合。可以用于这类组合的其它活性成分(抗肿瘤药)的例子如下:

抗微管或抗有丝***剂，比如二萜类化合物和长春花生物碱(比如长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)；二萜类化合物，比如太平洋紫杉醇

及其类似物多西紫杉醇；铂配合物，比如顺铂和卡铂；烷基化剂，比如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯类，比如白消安；亚硝基脲，比如卡氮芥；和三氮烯，比如达卡巴嗪(dacarbazine)。

其它可以与发明组合使用的抗肿瘤药包括抗肿瘤抗生素，比如放射菌素，比如更生霉素；蒽环类，比如道诺霉素(daunorubicin)和多柔比星(doxorubicin)；和博莱霉素；拓扑异构酶II抑制剂，比如表鬼臼毒素，比如依托泊甙(etoposide)和替尼泊甙(teniposide)。

其它可以与发明组合使用的抗肿瘤药包括抗代谢物肿瘤药，比如氟尿嘧啶(5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮、5-氟脱氧尿苷(floxuridine)和5-一磷酸氟代脱氧尿苷)、甲氨蝶呤、阿糖胞苷(cytarabine)、巯基嘌呤

硫代鸟嘌呤

和吉西他滨(gemcitabine)

其它可以与发明组合使用的抗肿瘤药包括喜树碱，包括作为或者开发作为拓扑异构酶I抑制剂的喜树碱和喜树碱衍生物，比如伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)和7-(4-甲基哌嗪-亚甲基)-10,11-ethylenedioxy-20-喜树碱的各种光学形式；伊立替康HCl

伊立替康；和拓扑替康HCl

其它可以与发明组合使用的抗肿瘤药包括利妥昔单抗(rituximab)

和

ofatumumab

mTOR抑制剂，包括但不限于雷帕霉素(rapamycin)和雷帕霉素类似物、RAD001或依维莫司(everolimus)(Afinitor)、CCI-779或坦罗莫司(temsirolimus)、AP23573、AZD8055、WYE-354、WYE-600、WYE-687和Pp121；贝沙罗汀(bexarotene)

和索拉非尼(sorafenib)

本发明的组合可以与癌症治疗使用的激素联用。可以用于癌症治疗的激素和激素类似物的例子包括，但不限于肾上腺皮质类固醇，比如***和***龙；氨鲁米特(aminoglutethimide)和其它芳香酶抑制剂，比如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrazole)、伏氯唑(vorazole)和依西美坦(exemestane)；孕酮，比如醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)；***、雄激素和抗雄激素，比如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)和5α-还原酶，比如非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)；抗***，比如它莫西芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、iodoxyfene以及选择性***受体调节剂(SERMS)，比如美国专利5,681,835、5,877,219和6,207,716中描述的那些；和***释放激素(GnRH)及其类似物，它们刺激促黄体激素(LH)和/或促卵泡激素(FSH)的释放，用于治疗***癌，例如，LHRH激动剂和拮抗剂，比如醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)和亮丙瑞林(luprolide)。

本发明的组合还可以用于与信号转导途径抑制剂联用，比如下述的抑制剂：酪氨酸激酶受体、非受体型络氨酸激酶、SH2/SH3结构域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇-3激酶、肌醇信号转导和Ras癌基因，包括生长因子受体，比如例如表皮生长因子受体(EGFr)、血小板衍生生长因子受体(PDGFr)、erbB2、erbB4、ret、血管内皮生长因子(VEGFr)、含有免疫球蛋白样和表皮生长因子同源结构域的酪氨酸激酶(TIE-2)、胰岛素生长因子–I(IGFI)受体、巨噬细胞集落刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet、成纤维生长因子(FGF)受体。Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)、ephrin(eph)受体和RET原癌基因。示范性的信号转导途径抑制剂是拉帕替尼(lapatinib)(Tykerb/

)，它是EGFR/ErbB2双抑制剂。

酪氨酸激酶中不是生长因子受体激酶的被命名为非受体型酪氨酸激酶。可以用于本发明作为抗癌药物的靶点或者潜在靶点的非受体型酪氨酸激酶包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(粘着斑激酶Focal adhesion kinase)、Brutons酪氨酸激酶和Bcr-Abl。这类非受体型激酶以及可以抑制非受体型酪氨酸激酶功能的药物在Sinh,S.and Corey,S.J.,(1999)Journal ofHematotherapy and Stem Cell Research8(5):465–80和Bolen,J.B.,Brugge,J.S.,(1997)Annual review of Immunology.15:371-404中有描述。

SH2/SH3结构域阻断剂是能够破坏多种酶或适配体蛋白中SH2或SH3结构域结合的药物，包括PI3-K p85亚基、Src家族激酶、适配体分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)和Ras-GAP。SH2/SH3结构域作为抗癌药物的靶点在Smithgall,T.E.(1995),Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.34(3)125-32中有讨论。

丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂包括MAP激酶级联阻断剂，其包括Raf激酶(rafk)、促细胞***原或胞外调节激酶(MEKs)和胞外调节激酶(ERKs)的阻断剂；以及蛋白激酶C家族成员阻断剂，其包括PKCs(α、β、γ、ε、μ、λ、ι、δ)、IkB激酶家族(IKKa,IKKb)、PKB家族激酶、akt激酶家族成员、和TGF-β受体激酶的阻断剂。这类丝氨酸/苏氨酸激酶及其抑制剂在Yamamoto,T.,Taya,S.,Kaibuchi,K.,(1999),Journal of Biochemistry.126(5)799-803;Brodt,P,Samani,A.,and Navab,R.(2000),Biochemical Pharmacology,60.1101-1107;Massague,J.,Weis-Garcia,F.(1996)Cancer Surveys.27:41-64;Philip,P.A.,and Harris,A.L.(1995),Cancer Treatment and Research.78:3-27,Lackey,K.et alBioorganic and Medicinal Chemistry Letters,(10),2000,223-226;美国专利6,268,391和Martinez-Iacaci,L.,et al,Int.J.Cancer(2000),88(1),44-52中有描述。

磷脂酰肌醇-3激酶家族成员的抑制剂，包括PI3激酶、ATM、DNA-PK和Ku的阻断剂也可以用于本发明。这类激酶在Abraham,R.T.(1996),CurrentOpinion in Immunology.8(3)412-8;Canman,C.E.,Lim,D.S.(1998),Oncogene17(25)3301-3308;Jackson,S.P.(1997),International Journal of Biochemistryand Cell Biology.29(7):935-8和Zhong,H.et al,Cancer res,(2000)60(6),1541-1545中讨论过。

还可以用于本发明的是肌醇信号转导抑制剂，比如磷酸酶C阻断剂和肌醇类似物。这类信号转导抑制剂在Powis,G.,and Kozikowski A.,(1994)NewMolecular Targets for Cancer Chemotherapy ed.,Paul Workman and David Kerr,CRC press1994,London中有描述。

另一组信号转导途径抑制剂是Ras癌基因的抑制剂。这类抑制剂包括法尼酰基转移酶、牛儿基牛儿醇转移酶和CAAX蛋白酶的抑制剂以及反义寡核苷酸、核酶和免疫疗法。这类抑制剂已知可以阻断含有野生型突变体ras的细胞中ras的激活，从而具有抗增殖剂的作用。Ras癌基因抑制剂在Scharovsky,O.G.,Rozados,V.R.,Gervasoni,S.I.Matar,P.(2000),Journal of BiomedicalScience.7(4)292-8;Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology.9(2)99–102；和BioChim.Biophys.Acta,(19899)1423(3):19-30中有讨论。

正如以上提到的，受体激酶配体结合的抗体拮抗剂也可以作为信号转导的抑制剂。这一组信号转导途径抑制剂包括利用受体型酪氨酸激酶的胞外配体结合结构域的人源化抗体。例如Imclone C225EGFR特异性抗体(参见Green,M.C.et al,Monoclonal Antibody Therapy for Solid Tumors,Cancer Treat.Rev.,(2000),26(4),269-286)；

erbB2抗体(参见Tyrosine KinaseSignalling in Breast cancer:erbB Family Receptor Tyrosine Kinases,Breast cancerRes.,2000,2(3),176-183)；和2CB VEGFR2特异性抗体(参见Brekken,R.A.etal,Selective Inhibition of VEGFR2Activity by a monoclonal Anti-VEGF antibodyblocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000)60,5117-5124)。

还可以使用抗血管生成剂，包括非受体型抗血管生成抑制剂。抗血管生成剂包括那些能够抑制血管内皮生长因子(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(bevacizumab)[Avastin^TM])的效用的药物以及通过其它机制发挥作用的化合物(例如利诺胺(linomide)、整合素αvβ3功能的抑制剂、内皮生成抑制素和血管生成抑制素)。

用于免疫治疗方案的药物也可与发明的化合物联用。免疫疗法手段，包括例如提高患者肿瘤细胞免疫原性的体外和体内手段，比如转染细胞因子(白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；降低T细胞无变应性的手段；利用转染免疫细胞(比如转染了细胞因子的树突状细胞)的手段；利用转染了细胞因子的肿瘤细胞系的手段以及利用抗个体基因型抗体的手段。

促凋亡方案中使用的药物(例如bcl-2反义寡核苷酸)也可以用于本发明的组合。

细胞周期信号转导抑制剂(包括CDK2、CDK4和CDK6)及其抑制剂在例如Rosania et al,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(2):215-230中有描述。

治疗方法

将治疗有效量的发明所述组合给予人。一般来说，本发明给予的药剂的治疗有效量取决于多个因素，包括例如受试对象的年龄、体重、需要治疗的确切病症、病症的严重程度、制剂的性质和给药途径。最终治疗有效量需要主治医师的判断。本文提供了关于给予化合物A和给予文中描述的化合物组合物的给剂指导方针。

本文中，在治疗方法语境中的术语“治疗(treatment或treating)”是指缓解特定病症、消除或者减轻病症的症状、减慢或者消除病症的进展、侵入或者转移扩散，以及防止或者延缓先前罹患该病症的受试对象的复发。本发明还提供了发明所述化合物在制备治疗哺乳动物(例如人)中多种病症的药物中的用途。

本文中，术语“有效量”意味着这样的药物或者药剂的量，所述量能够引发例如研究人员或者临床医师希望达到的组织、***、动物或者人的生物或者医学反应。而且，术语“治疗有效量”意味着与没有接受这样的量的相应受试对象相比，该量导致提高的治疗、治愈、防止或者疾病、紊乱或副作用的减轻，或者疾病或紊乱的进展速度下降。该术语的范围内还包括能够有效增强正常生理功能的量。

根据发明，通过将包含两种化合物的单位药物组合物同时给予可以组合施用化合物。替代地，可以将组合分开以独立的药物组合物按顺序给药，其中所述每个药物组合物各自包含一种化合物，例如先给予一种化合物，再给予另一种化合物。这种顺序给予可能时间上很接近(例如同时)或者差很久。而且，化合物是否以相同的剂形给予不重要，例如一种化合物是局部给药，另一种是经口给药。合适地，两种化合物都是经口给药。因此在发明的一个实施方案中，一或多个剂量的第一化合物与一或多个剂量的另一种化合物同时或者分开给药。

根据发明，化合物之一可以作为负荷剂量给予，其中术语“负荷剂量”本文中应当理解为意味着一种或者另一种化合物的单个剂量或者短期方案，其剂量比给药受试对象的维持剂量高，例如能够快速提高药物的血液浓度水平。

术语“维持剂量”本文中应当理解为意味着系列给予(例如至少两次)的剂量，其意在将化合物的血液浓度水平缓慢提高到治疗有效水平，或者维持这样的治疗有效水平。维持剂量通常是每天给予一次，维持剂量的每日剂量低于负荷剂量的整体每日剂量。

合适地，本发明的组合是在“限定时期”内给予的。术语“限定时期”及其衍生说法用于本文意味着给予一个化合物和给予另一个化合物之间的时间间隔。除非另有定义，限定时期可以包括同时给药。当发明的两种化合物每天给予一次时，限定时期是指一天内第一和第二化合物的给予。当一种或者两种化合物每天给予一次以上时，限定时期是根据给定一天中每个化合物第一次给药来计算的。计算限定时期时，给定一天中第一次给药后的所有化合物给药都不考虑。合适地，如果化合物是在“限定时期”内，而不是同时给予的，它们是在相互间隔大约24小时内给予的。本文中，在少于大约45分钟给予两种化合物被认为是同时给药。合适地，在特定的时间段内给予两种化合物至少一天，并持续到不需要治疗为止。

替代地，在治疗过程中，所述化合物可以在第二个时间段中的第一时间段内给予，比如在7天的时间段中给药1-4天，其中第二个时间段内给予了单个化合物或者两种都没有给予。

化合物可以顺序给予。术语“顺序给予”及其衍生的说法用于本文意味着其中一种化合物被给予了连续的两天或者更多天，另一种化合物随后被给予了连续的两天或者更多天。本文还考虑了在化合物的顺序给药之间使用药物假期。本文中，药物假期是在顺序给予一种化合物之后，给予另一种化合物之前，例如1-14天的一段时间，这段时期内不给予任何化合物。

对于顺序给药，合适地，一种化合物被给予连续的1-30天，然后是任选的药物假期，然后给予另一种化合物连续的1–30天。

其它定义

本文中，术语“药物”应当理解为能在组织、***、动物、哺乳动物、人或其它受试对象中产生希望的效果的物质。相应地，术语“抗肿瘤剂”应当理解为意味着在组织、***、动物、哺乳动物、人或其它受试对象中产生抗肿瘤效应的物质。还应当理解，“药物”可以是单一化合物或者是两个或更多个化合物的组合或者组合物。

一般来说，本发明的盐是药学上可接受的盐。涵盖在术语“药学上可接受的盐”内的盐是指本发明的化合物的没有毒性的盐。本发明的化合物的盐可以包括由发明所述化合物中取代基上的氮衍生的酸加成盐。代表性的盐包括以下盐:醋酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、棒酸盐(clavulanate)、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂基硫酸盐、乙磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿散酸盐(glycollylarsanilate)、己基间苯二酚盐(hexylresorcinate)、海巴明(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳酸醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、马来酸氢钾、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、N-甲葡糖胺、草酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐embonate)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、钾盐、水杨酸盐、钠盐、硬脂酸盐、碱式醋酸盐、琥珀酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、氯茶碱盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘、三甲基铵和戊酸盐。其它不是药学上可接受的盐也可能用于制备本发明的化合物，它们构成了发明的再一个方面。所述盐可以由本领域技术人员容易地制备。

虽然为了在疗法中使用，根据发明使用的化合物可以以粗化学品给予，也可以将活性成分做成药物组合物。相应地，发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包含化合物的一或多种组合、一或多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。载体、稀释剂或赋形剂在与制剂中其它成分的相容性方面必须是可以接受的，能够进行药学成剂，并且对接受者没有损害。根据发明的另一方面，还提供了制备药物组合物的过程，包括将化合物与一或多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合。药物组合物使用的这些元素可以存在于分开的药物组合中或者被配制成一种药物组合物。相应地，发明还提供了治疗或者使用药物组合物组合的方法，其中所述药物组合物组合中的一个包括化合物A、B或C中的一个以及一或多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，和含有化合物A、B或C中的另一个以及一或多个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

药物组合物可以以单位剂量形式存在，其中每个单位剂量含有预先确定量的活性成分。正如本领域技术人员已知的，每个剂量中的活性成分的量取决于要治疗的病症、给药途径和患者的年龄、体重和健康病症。优选的单位剂量组合物是那些含有每日剂量或亚剂量，或者合适的分剂量活性成分的组合物。而且，这样的药物组合物可以通过医药行业公知的任何方法来制备。

试验

方法

化学品与试剂

磷-AKT(T308)、磷-AKT(S473)、AKT、ERK、磷-S6P(S235/236)、S6P、细胞周期蛋白D1、磷-MEK1/2(S217/S221)、MEK1/2、MEK1、MEK2和切割的PARP抗体购自Cell Signaling。GAPDH、RAF-1、BRAF和ARAF的一抗购自Santa Cruz Biotechnology。二磷-ERK1/2(T202/Y204)抗体购自Sigma，p27kip1抗体购自Epitomics。抗小鼠

800CW抗体购自LI-CORBiosciences。抗兔ALEXA

680抗体购自Invitrogen。化合物A、化合物B、化合物C和PLX4032(20)是由GlaxoSmithKline Research Labs合成的，其结构如图7所示。

细胞系

由A375细胞系(得自ATCC)获得了一个以下称为“A375F11”的对BRaf抑制剂敏感性提高的克隆分离物。使A375F11细胞接触浓度渐高的化合物A并维持在终浓度1.26μM或1.6μM中。从这些A375F11混合细胞群中，挑选在有化合物A时生长的12R5-3、12R8-1、12R8-3、16R5-5、16R6-2、16R6-3和16R6-4单细胞克隆。细胞全部生长在含有10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640中。

YUSIT1黑素瘤细胞从Yale Dermatology Cell Culture Facility获得。根据对BRaf抑制剂化合物A的提高的敏感性获得了总共13个YUSIT1化合物A抗性克隆。具体来说，使YUSIT1细胞接触浓度渐高的化合物A并保持在终浓度0.1umole/L的化合物A中。从有化合物A的情况下能够增殖的群体中通过有限稀释***到单细胞克隆，例如YUSIT1-B5、YUSIT1-B11和YUSIT1-B31克隆。细胞生长在和A375F11细胞一样的培养基中。

PCR与序列分析

利用Promega Maxwell16Cell DNA纯化试剂盒(Promega,Madison WI)制备gDNA分离物。所有gDNA PCR引物从IDT(Integrated DNA TechnologiesInc,Coralville,Iowa)订购的。PCR引物添加了M13通用测序引物序列尾巴。PCR反应用Roche FastPCR DNA聚合酶(ROCHE,Indianapolis,IN)进行。将DNA扩增35个循环:95°C20秒、60°C30秒、72°C45秒，然后在72°C延伸7分钟。所有gDNA引物在用于细胞系样品前，在Promega Human GenomicDNA(Promega,Madison WI)上进行了测试(QC)。PCR产物利用AgencourtAmPure(Agencourt Bioscience Corporation,Beverly,MA)进行了纯化。纯化的PCR产物用AB v3.1BigDye-terminator循环测序试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行了直接测序，测序反应用Agencourt CleanSeq(AgencourtBioscience Corporation,Beverly,MA)纯化。测序反应利用Genetic Analyzer3730XL(Applied Biosystems,Foster City,CA)进行了分析。所有序列结构数据利用Codon Code Aligner(CodonCode Corporation,Dedham,MA)进行了组装和分析。引物序列是:

NRAS.NM_002524.3		SEQ ID NO:
			Exon02正向	tgtaaaacgacggccagtTGAGGCCGATATTAATCCGGTG	1
Exon02反向	caggaaacagctatgaccTCGCTACTATGGCCTGTGTTTCTCA	2
			Exon03正向	tgtaaaacgacggccagtCCAGATAGGCAGAAATGGGCTTG	3
Exon03反向	caggaaacagctatgaccGGTTCCAAGTCATTCCCAGTAGCA	4
			Exon03b正向	tgtaaaacgacggccagtGAAATGGGCTTGAATAGTTA	5
Exon03b反向	caggaaacagctatgaccCTTCCCTAGTGTGGTAACCTC	6
			Exon04正向	tgtaaaacgacggccagtATGAGCCACTGTACCCAGCCTAAT	7
Exon04反向	caggaaacagctatgaccTTTGGGTTTAAACAAGCGTTAAGAAA	8
			Exon04b正向	tgtaaaacgacggccagtGTGCTGAGATTGCAGGCATG	9
Exon04b反向	caggaaacagctatgaccATGAATATGGATCACATCTC	10
			Exon05正向	tgtaaaacgacggccagtCAACACCAGCCCGTTTATGGC	11
Exon05反向	caggaaacagctatgaccTGCAGAAGAGGATAGGCAGAAACTCA	12

MEK1.NM_002755.3		SEQ ID NO:
			Exon01正向	tgtaaaacgacggccagtAGCGGGAGGAAGCGAGAGGT	55
Exon01反向	caggaaacagctatgaccCCCAGACGTACGTGACAAACCA	56
			Exon02正向	tgtaaaacgacggccagtCGGGTGGCTGGAGTGAAGTG	57
Exon02反向	caggaaacagctatgaccCAGTCTTCCTTCTACCCTGGTCCC	58
			Exon03正向	tgtaaaacgacggccagtCCGAGGCACAGCTGGAACAG	59

Exon03反向	caggaaacagctatgaccGGAGGCCTGCCATCTTGTGA	60
			Exon04正向	tgtaaaacgacggccagtCATAGGACAAGGTATGGGAGTGGG	61
Exon04反向	caggaaacagctatgaccTCCAGACAGGGAAGAGTCTAGTGAGAA	62
			Exon05正向	tgtaaaacgacggccagtGGAGGAAGGCAAATTTGTGATGA	63
Exon05反向	caggaaacagctatgaccAGCTGGCCAGTCCTGGCTTT	64
			Exon06正向	tgtaaaacgacggccagtCCAAGGGCTGCCTCTGATGG	65
Exon06反向	caggaaacagctatgaccGCCACACTCTGGAGCTGGACA	66
			Exon07正向	tgtaaaacgacggccagtCAGCCAGGGCACAGCTGATT	67
Exon07反向	caggaaacagctatgaccTAGCCTGGCATCCAGGGACA	68
			Exon08正向	tgtaaaacgacggccagtTGTGGCTGTTTAATGTTTATTGTCCA	69
Exon08反向	caggaaacagctatgaccTGAACCTGTGACAGCGATGTGTT	70
			Exon09正向	tgtaaaacgacggccagtTACGTTCCCATGCCGCACTC	71
Exon09反向	caggaaacagctatgaccTCAGACGGGAGGGTAAAGGGC	72
			Exon10正向	tgtaaaacgacggccagtGGATGAATCAAGCCCAGGCA	73
Exon10反向	caggaaacagctatgaccTGCCACCAAACGAGACAGCA	74
			Exon11正向	tgtaaaacgacggccagtCACCACGTCCTCTCGTTTCCTT	75
Exon11反向	caggaaacagctatgaccAGGATCTCACAAGGCTCCCTCC	76

MEK2.NM_030662.3		SEQ ID NO:
			Exon1正向	tgtaaaacgacggccagtCTATGGGCCCCGGCTAGAGG	77
Exon1反向	caggaaacagctatgaccGCCTCGTGCACTCCTCGCGAA	78
			Exon2正向	tgtaaaacgacggccagtCCCAGAAGCTGGGCCCTTTC	79
Exon2反向	caggaaacagctatgaccCCGCCCTGGATTCTGGTCAT	80
			Exon3正向	tgtaaaacgacggccagtTGGCATCGACTGCCTTGAGAA	81
Exon3反向	caggaaacagctatgaccTGACCACTGTTGGGAACGCC	82
			Exon4正向	tgtaaaacgacggccagtAGGTCCTGGCGTCCCACATC	83
Exon4反向	caggaaacagctatgaccCGTGGGTGGAGTTGGGCTC	84
			Exon4b正向	tgtaaaacgacggccagtACGCATCCGTGGCTTCCCG	85
Exon4b反向	caggaaacagctatgaccGGCAGATGGTGACCTCAGGC	86
			Exon5和6正向	tgtaaaacgacggccagtGTTGGGAAAGCCTCGTGGGA	87
Exon5和6反向	caggaaacagctatgaccGCGAGCTCCTCACAGCCTGA	88
			Exon5b正向	tgtaaaacgacggccagtCAGCTCTGACTGCTCAGCTC	89
Exon5b反向	caggaaacagctatgaccGCCATGGAGTCGATGAGCTG	90
			Exon6b正向	tgtaaaacgacggccagtCAGATCATGCACCGAGGTAAG	91
Exon6b反向	caggaaacagctatgaccGACAGCTGCGCAGGAGACATG	92

Exon7正向	tgtaaaacgacggccagtGACCACAGTCGGCACCATCC	93
			Exon7反向	caggaaacagctatgaccCTGCGGTCAACACCAGCTCC	94
Exon8正向	tgtaaaacgacggccagtGGGAAGGAGCTGGGCTTGTG	95
			Exon8反向	caggaaacagctatgaccCGCCTCCAATTTAGGCTGGC	96
Exon8b正向	tgtaaaacgacggccagtCAGTGCCTCTGCACACCCGC	97
			Exon8b反向	caggaaacagctatgaccCTCTTGCTCTGGTCAGAGAG	98
Exon9正向	tgtaaaacgacggccagtACAGGGCCTGCAATCCTGCT	99
			Exon9反向	caggaaacagctatgaccAGTTGGCATGTGGTGTCGGC	100
Exon10正向	tgtaaaacgacggccagtCCAGAGCTGTTCCCACGCAC	101
			Exon10反向	caggaaacagctatgaccCCCTGGCACCAAAGTGCAGA	102
Exon11正向	tgtaaaacgacggccagtGCTCAGGGATGTCCTCTCCG	103
			Exon11反向	caggaaacagctatgaccGGAAGGGAGGGTCTCCTCTGTTT	104
Exon11b正向	tgtaaaacgacggccagtGTCCTACTGTGACTCCAGG	105
			Exon11b反向	caggaaacagctatgaccGCCAGCCTGTCCTCAGCTG	106

每个引物带有M13通用引物尾巴。尾巴用小写表示(用于测序)。标记了“b”的引物是用于扩增指定外显子的替代引物。

人神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(NRAS)cDNA的克隆和加FLAG标签

根据已经公开的人5’和3’UTR序列(NM_002524.3)的UTR侧翼区，设计了用于PCR扩增人NRAS-WT的引物。使用引物NRASfornest(5’-ATGACTGAGTACAAACTGGTG3’)(SEQ ID NO:107)和NRASrevNEST(5’-TTACATCACCACACATGGCAATC-3’)(SEQ ID NO:108)扩增了全长ORF。将得到的ORF TOPO克隆到pCR BLUNT载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，证实双链序列。该质粒被用作NRAS-WT FLAG-标签和突变反应的模板。利用引物NRASflagtag(5’caccATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGA atg act gagtacaaactggtggtgg-3’)(SEQ ID NO:109)和NRASrevNEST(5’TTACATCACCACACATGGCAATC-3’)(SEQ ID NO:110)引入了5’FLAG标签。所有PCR反应使用人骨髓cDNA(Marathon Ready,Clontech,Mountainview,CA)作为模板，和Phusion聚合酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)。按照销售商的指导，使用以下参数进行一级和巢式反应:98°C10s、55°C30s和72°C每kb15s，共29个循环，最后在72°C延伸10分钟，反应在MJ Research PTC200温度循环仪中进行。FLAG标签引入在59°C退火。将这样得到的ORF经TOPO克隆到pcDNA3.1D(Invitrogen)中，证实双链序列。

诱变NRAS:Q61K、Q61R和A146T

人NRAS全长ORF(NM_002524.3)如上制备，并作为突变反应和FLAG标签反应的模板。PCR扩增使用了Pfu Ultra聚合酶(Stratagene,Santa Clara,CA)。反应95°C30s、60°C60s和72°C14分钟，进行了16个循环，保持在4°C。突变完成后，向每个反应中加入DpNI酶，转化前完成37°C温育。将克隆测序以确认期望的突变。序列分析后，制备质粒，如上所述引入5’FLAG标签。将这样得到的ORF经TOPO克隆到pcDNA3.1D(Invitrogen)中，证实双链序列。

诱变引物:

Q61K正向(5’-GTTTGTTGGACATACTGGATAC AGC TGG AAA AGAAGAGTA CAGTGCCATGAGAGACCAAT-3’)(SEQ ID NO:111)

Q61K反向(5’-TTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTTTCCAGCTGTATCCAGTA TGTCCAACAAAC-3’)(SEQ ID NO:112)

Q61R正向(5-GTTTGTTGGACATACTGGATACAGCTGGACGAGAAGAGTACAGTGCCATGAG AGACCAAT-’3)(SEQ ID NO:113)

Q61R反向(5’-ATTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTCGTCCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAAC-‘)(SEQ ID NO:114)

A146T正向(5’-GTTACGGGATTCCATTCATTGAAACCTCAACCAAGACCAGACAGGGTGTTGAAGATGCTT-‘3)(SEQ ID NO:115)

A146T反向(5’-AAGCATCTTCAACACCCTGTCTGGTCTTGGTTGAGGTTTCAATGAATGGAATCCCGTAAC-3’)(SEQ ID NO:116)

NRASflagTAG(5’-caccATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAatgactgag tacaaac tggtggtgg-3’)(SEQ ID NO:117)。

BacMAM质粒构建

将带有EcoRI和BamHI的人MEK1编码区经PCR扩增，PCR产物经EcoRI和BamHI消化。将PCR产物克隆到用EcoRI和BamHI消化的pFNcmvNA载体(1)中。得到的pFNcmvNA-人MEK1质粒经QuickChange Lighting定点突变(Agilent Technologies)进行突变，使用的引物位点如下:

BacMam的生成

BacMam病毒基本按照描述(1)产生，过程基于LifeTechnologies(www.invitrogen.com)的Bac-to-Bac***。简单来说，将pFNcmvNA-人MEK1和pFNcmvNA-人MEK2以及它们的突变衍生物转化到DH10Bac细胞中。用得到的重组bacmid DNA转染Sf9细胞。3-4天后，收集BacMams的P0批次，利用该批次感染Sf9细胞，从而产生P1批次的BacMams。

RAS活化分析:

利用RAS Activation ELISA(Millipore)确定活化的RAS的量。简单来说，取100微克在镁水解缓冲液中水解的总蛋白加入包被RAF-1-RBD的谷胱甘肽培养板。捕获的RAS利用抗Ras抗体在读板器上通过化学发光检测。活化的RAS报告为减去未加蛋白的对照后，任意单位(AU)的化学发光信号。

克隆分析:

将细胞培养以每孔5k培养在6孔培养板(BD Falcon)中含有10%FBS的RPMI培养基中。第二天，细胞用溶于含有10%FBS的RPMI培养基中的指定化合物处理。14天分析过程中，更换一次化合物处理。14天后，去除培养基，将细胞在溶于50%乙醇的0.5%亚甲基蓝溶液中染色至少30分钟。移走染料，将培养板通过浸在蒸馏水中清洗，并风干。用平板扫描仪(HP)将经过染色的6孔培养板的完整图像捕获为JPEG文件。

细胞生长抑制分析和组合数据分析.

在铺板前，将细胞在没有化合物(例如化合物A)的情况下培养至少72小时。所有细胞以每孔1000个细胞在96孔组织培养板(NUNC136102)中的含有10%FBS的RPMI培养基中进行分析。铺板后大约24小时，将细胞与化合物的或者恒定摩尔比率的两种药物的组合(例如溶于含有10%FBS的RPMI培养基中的10：1化合物A:化合物B)的10倍、3倍梯度稀释接触。细胞在有化合物的情况下温育3天。按照制造商的试验方案，加入Cell Titer

(Promega)来确定ATP水平。简单来说，每个板中加入Cell Titer

温育30分钟，然后在SpectraMax L读板仪上以0.5秒的整合时间读取发光信号。用化合物或者化合物组合处理3天后，将Cell Titer

信号与用介质(DMSO)处理的细胞的进行比较，从而估计对细胞生长的抑制。相对介质(DMSO)处理的对照孔来计算细胞生长。利用非线性回归公式y=(A+(B-A)/(1+(C/x)^D))，当y=50%介质对照时，抑制50%对照细胞生长的浓度(IC₅₀)进行插值，其中A是最小反应(y_min)，B是最大反应(y_max)，C是曲线的拐点(EC₅₀)，D是Hill系数。

利用组合指数(CI)评估对效力的组合效应，所述组合指数利用back-interpolated IC₅₀值以及Chou和Talalay推导的非互斥公式(1):CI=Da/IC₅₀(a)+Db/IC₅₀(b)+(Da x Db)/(IC₅₀(a)x IC₅₀(b))计算的，

其中IC₅₀(a)是化合物A的IC₅₀；IC₅₀(b)是化合物B的IC₅₀；Da是能够抑制50%细胞生长的与化合物B组合的化合物A浓度；Db是能够抑制50%细胞生长的与化合物A组合的化合物B浓度。一般来说，CI值<0.9、0.9-1.1或者>1.1分别表明协同、相加和拮抗效应。通常，CI数值越小，协同效应越强。

基于Peterson and Novick(2007)以及Peterson(2010)[(2;3)[Peterson andNovick,2007;Peterson,2010]详细描述的非线性混合概念，由Excess OverHighest Single Agent(EOHSA)定量对反应等级的组合效应。EOHSA值定义为相对最佳单一药物(处于它在组合中的成分剂量水平)，组合所带来的改善的提高(这里以“百分点”(ppts)差别表示)。对于单一药物和组合处理，将细胞与固定剂量比的化合物接触，利用回归模型将剂量反应曲线与试验数据拟合并分析。在剂量反应曲线上限定的IC₅₀总剂量水平，确定剂量组合(对应IC₅₀)以进行EOHSA统计推断。更具体地说，对于涉及剂量d1的药物1和剂量d2的药物2的组合药物试验(即总剂量等于d1+d2)，如果组合的平均反应比剂量d1的药物1或者剂量d2的药物2的平均反应要好，可以说具有正的EOHSA。

A375细胞的转染

A375细胞用Lipofectamine2000(Invitrogen)转染指定的NRAS构建体。用0.1μM化合物A选择稳定的单细胞转染物，并用克隆环分离。在用载体、野生型NRAS和突变NRAS质粒转染A375后，用G418进行选择时观察到菌落。用含有10%FBS和0.1μM化合物A的RPMI1640培养基维持转染克隆，并铺不含化合物A的培养板用于增殖和Western印迹试验。

小发夹RNA(shRNA)介导的NRAS敲低

用来自Sigma Aldrich(St.Louis)的表达靶向NRAS的shRNAs(TRCN0000300442)或非寻靶对照(SHC002V)的慢病毒转导A375。利用嘌呤霉素选择带有稳定shRNA慢病毒整合的细胞，并用克隆环分离单细胞克隆。将稳定整合克隆保留在嘌呤霉素用于后续试验。

siRNA介导的敲低

用RNAiMAX(Invitrogen)将MAP2K1(D-003571-01、D-003571-04和D-003571-05)、MAP2K2(D-003573-01和D-003573-02)和非寻靶对照(D-001210-02和D-001210-05)的Single oligo siRNAs(Dharmacon)间隔48小时两次反向转染到指定的细胞中。第二次转染后一天，将细胞铺板以便增殖并进行对比提取。铺板后24小时提取蛋白。如上所述对蛋白进行Western印迹分析。通过Cell Titer

确定72小时后的相对细胞生长。

A375细胞的BacMAM转导

利用MEK1cDNA生成BacMAM构建体并通过定点突变引入MEK1突变。BacMAM病毒颗粒按照补充方法中的描述制备。A375细胞用指定的BacMAM病毒转导。转导后48小时，将细胞铺板进行如上所述的增殖和Western印迹分析。

化合物B MEK1模型构建

利用Maestro(Schrodinger,LLC)中的蛋白制备向导制备了晶体结构3EQG(23)用于模型构建。加上氢、分配了双键，删除了一些水，指定了H键，最后利用Impref和OPLS2005力场对结构进行了能量最小化。该步骤使用了重原子收敛阈值0.15埃。小分子化合物B经手动与变构抑制剂进行了大概的结构比对，然后去除这个另外的抑制剂。利用Maestro中的Macromodel和OPLS2005力场，通过将蛋白保持固定，对化合物B Mek1复合体进行能量最小化。化合物B中乙酰化的苯胺基部分似乎需要进一步精确，并且利用Macromodel进行了构象搜索。最后，利用Macromodel将最多相距7埃的配体和非骨架原子进行了能量最小化。对模型的目测表明只有化合物B的乙酰基NH和附近的精氨酸之间存在一个可能的还不确定的相互作用。但是，因为抑制剂的这个部分位于柔性的P环下，并且也暴露在溶剂中，判断模型适合用于说明的目的。

DNA分析

在Affymetrix Genome Wide Human SNP Array6.0芯片上进行的SNP分析证实获得了对化合物A抗性的克隆来自A375，因为通过Array Studio(Omicsoft)中的阶层同一(identical by state)和血统同一(identical by deScent)计算确定所述克隆与A375有95%以上的相似性。

Affymetrix表达分析

选择16R6-4在用单独的化合物A和化合物B以及两者组合的复合处理24小时后，与A375进行比较。每个克隆或者克隆的每个处理使用两个或者三个独立样品。制备RNA和cDNA，并在Response Genetics Inc.(Los Angeles,CA)使用Affymetrix HG-U133Plus2阵列按照标准Affymetrix试验方案进行了微阵列分析。经MAS5对RNA微阵列信号进行归一化。QC和数据分析使用Array Studio(Omicsoft)进行。排除MAD打分<-5的样品，不再做进一步分析。通过采用p值<0.05的单因素ANOVA和改变>2倍鉴定差异表达的基因。达到了筛选标准，但平均强度在100以下的探针组排除。

结果

A375F11黑素瘤细胞

将A375F11细胞与浓度渐高的化合物A接触后，分离到获得了对化合物A的抗性的十个A375F11黑素瘤细胞衍生细胞系。对BRAF、NRAS和MAP2K1(MEK1)进行了基因组DNA测序。如表1所示，所有克隆保留了在亲代A375F11细胞中观察到的纯合BRAF V600E突变。除了BRAF V600E，化合物A抗性黑素瘤细胞还含有多个杂合突变:MEK1K59缺失(12R5-1和12R5-5)、NRAS Q61R或A146T(12R9、12R5-5、12R5-3、12R8-1)、或者以下两者：NRAS Q61K和/或A146T与MEK1P387S(16R6-3、15R5-5、16R6-2和16R6-4)。具体来说，12R5-1和12R5-5细胞含有位于MAP2K1基因175-177核苷酸的AAG缺失(Het175-177delAAG)导致MEK1中赖氨酸59缺失(Het59delK)；12R5-3、12R8-1和12R8-3细胞系含有NRAS G436A杂合突变导致氨基酸146位由丙氨酸变为苏氨酸(A146T)；16R6-3细胞系含有NRAS G436A(A146T)杂合突变，以及MAP2K1C1159T杂合突变，后者导致氨基酸387位由脯氨酸变为丝氨酸(P387P/S)；12R9细胞系含有NRAS A182G杂合突变，导致氨基酸61位由谷氨酰胺变为精氨酸(Q61R)；16R5-5和16R6-2细胞系含有导致氨基酸61位由谷氨酰胺变为赖氨酸(Q61K)的NRAS C181A杂合突变，还含有MAP2K1C1159/T(P387S)；16R6-4细胞含有杂合突变NRAS C181A(Q61K)、NRAS G436A(A146T)和MAP2K1C1159/T(P387S)。测序证实这些克隆中保留了纯合BRAF^V600E突变，没有其它BRAF突变。此外，KRAS、HRAS、ARAF、CRAF或PTEN中没有鉴定到突变。所有克隆保留了来自A375亲代细胞系I220位置的同义MEK2多态性。以上数据表明MEK1K59缺失、NRAS Q61K/R和/或A146T、或者以下两者：NRAS Q61K和/或A146T和MEK1P387S突变，都与BRAF V600突变黑素瘤中对作为BRAF抑制剂的化合物A的抗性相关。

表1.BRAF和NRAS的基因组DNA序列分析

*只对BRAF的外显子15进行了测序

ND,未确定

在携带BRAF V600E突变的获得了化合物A抗性的细胞中检测到NRASQ61和/或A146T突变是很出乎意料的。而且，如图3所示，含有BRAF V600E和NRAS突变(Q61K和/或A146T)的抗性细胞16R6-4、12R5-3和12R8-1与没有这些NRAS突变的黑素瘤细胞(A375F11细胞)相比，使RAS GTPase活性提高。该提高的RAS GTPase活性预计是由于这些NRAS突变。例如，已有报道NRAS Q61突变通过将Ras蛋白锁定在GTP结合态，而提高NRAS活性，之后持续激活其下游效应物(Taparowsky et al,cell,34:581-586,1983)。

在这些获得了化合物A抗性的A375F11克隆中确定了化合物A、化合物B或者它们的组合对细胞生长抑制的效应(表2和图4)。带有野生型NRAS和MEK1的A375F11BRAF V600E突变细胞对单独的化合物A或者化合物B以及它们的组合的细胞生长抑制作用高度敏感。相反，BRAF V600E突变细胞系(含有MEK159delK突变的12R5-1和12R5-5；含有NRAS A146T突变的12R5-3、12R8-1和12R8-3；含有NRAS A146T和MEK1P387S的16R6-3细胞系；含有NRAS Q61R的12R9；含有NRAS Q61/K和MEK1P387S的16R5-5和16R6-2；以及含有NRAS Q61/K、NRAS A146T和MEK1P387S突变的16R6-4)对BRAF抑制剂化合物A有抗性(IC50>10μM)，并且显示出对MEK抑制剂化合物B的敏感性下降。但是，这些含有NRAS或MEK1，或者NRAS和MEK1突变两者的BRAF V600E突变细胞系对化合物A和化合物B的组合敏感，其中对化合物A的IC50s在0.178-0.392μM的范围，对化合物B的IC50s在0.018-0.039μM的范围。如EOSHA证实的，10:1摩尔比的化合物A和化合物B组合显示出更强的细胞生长抑制。

表2.获得化合物A抗性的克隆中化合物A、化合物B以及它们的组合对细胞生长的抑制

类似地，如表3和图5所示，具有对BRAF抑制剂化合物A的抗性并且分别含有共突变MEK159delK;NRAS A146;或者NRAS Q61K和/或A146与MEK1P387的BRAF V600E突变黑素瘤细胞对MEK抑制剂化合物B和PI3K抑制剂化合物C的组合敏感。化合物B和C的组合的IC_50s在0.013-0.043μM的范围。等摩尔的化合物B和化合物C组合在所有带有所示共突变的黑素瘤细胞中有协同效应(CI值在0.25和0.67之间)，和/或增强了细胞生长抑制(EOHSA值≥10ppt)。

表3.获得化合物A抗性的克隆中化合物B、化合物C以及它们的组合对细胞生长的抑制

*n=1

ND,未确定

细胞生长分析显示，这些A375克隆对化合物A有抗性(IC₅₀>10μmol/L)(图7)。此外，这些A375克隆对另一种BRAF抑制剂PLX4032有抗性(IC₅₀>10μmol/L，数据未显示)，并且与亲代A375细胞相比，展示出对MEK抑制剂化合物B的敏感性下降10倍以上(图8)。

YUSIT1克隆

多个来自YUSIT1细胞的含有BRAF V600K突变的克隆根据在有0.1umol/L化合物A的情况下它们的增殖能力被选中。与亲代YUSIT1细胞相比，这些YUSIT1克隆显示对化合物A的敏感性下降了38倍以上(IC₅₀>0.5μmol/L)，对化合物B的敏感性下降了3-7倍(IC₅₀s,0.002-0.005μmol/L)(图9)。来自YUSIT1的抗性克隆，与那些来自A375的克隆一样，在测试的三个克隆中全部获得NRAS Q61K。这些克隆保留了BRAFV600K和MEK2E27K。

如图34所示，获得了对化合物A抗性的YUSIT1克隆表现出对化合物B的敏感性下降，对化合物C的敏感性类似。在这些YUSIT1克隆中，化合物A和化合物B的组合的效力是从略有协同效应到几乎是相加效应(组合指数(combination index,CI)，0.8-0.92)适度增加(图9)。这些YUSIT1克隆中，化合物A和化合物C的组合的效应是从协同到几乎相加。类似地，化合物B和化合物C的组合在YUSIT1抗性克隆中的效应是从协同到几乎相加。两种组合都适度地提高了该最有活性单一药物的效力。

经化合物A处理的获得抗性的克隆中MAP激酶信号转导增强

将四个代表性A375克隆用化合物A处理，通过与亲代克隆相比的Western印迹分析对信号转导的效应(图10)。在没有化合物A的情况下，A375和这些抗性克隆均显示高水平的MEK、ERK和S6核糖体蛋白(S6P)磷酸化，和低水平的位于T308的AKT磷酸化。抗性克隆和亲代细胞之间的ARAF、BRAF和CRAF蛋白水平相似(图7.,数据未显示)。在这些A375细胞中，化合物A强力抑制MEK、ERK和S6P磷酸化达75%以上，使细胞周期蛋白D1的蛋白水平下降65%以上(图10)。这些效应在抗性克隆用化合物A处理后被减弱。例如，MEK磷酸化下降30-70%，而ERK和S6P磷酸化分别被减少了不到50%和25%。与亲代细胞系不同，这些克隆在化合物A处理后仍有高水平细胞周期蛋白D1。

NRAS突变介导对化合物A的抗性

接下来，在含有NRASA146T(12R5-3和12R8-1)、或者NRASQ61K和NRASA146T(16R6-4)的***性克隆中评估了观察到的NRAS突变对化合物A和化合物B敏感性的效应。这些克隆中的活化RAS水平比亲代提高了2.5到7倍(图3,数据未显示)。在12R5-3(NRASA146T)和16R6-4(NRASQ61K和NRASA146T)中，化合物A均提高了CRAF与BRAF V600E的共沉淀(图11)。在16R6-4中，由shRNA造成的NRAS的稳定下降部分恢复了它对化合物A(图12)和化合物B(图13)的敏感性，以及化合物A降低MEK和ERK磷酸化的能力(图14)。在12R5-3和12R8-1中，稳定敲低NRAS后也观察到对化合物A和化合物B敏感性的部分恢复(数据未显示)。

为了进一步证实NRAS Q61K或NRAS A146T突变促进了对化合物A的抗性，将编码这些突变和新霉素抗性基因的质粒转染到A375细胞中。用G418进行的筛选产生了不表达突变体NRAS的克隆(数据未显示)。但是用低剂量化合物A(0.1μM)进行的筛选得到了表达突变体NRAS的克隆。模拟或野生型NRAS转染在用化合物A进行筛选时未能形成菌落。突变体NRAS表达克隆对化合物A(图15)和化合物B(图16)的细胞生长抑制效应不敏感，同时在化合物A处理后也未能减少MEK、ERK和S6P磷酸化，以及细胞周期蛋白D1的水平(图17)。

MEK突变赋予对化合物A的抗性

接下来，考察了在化合物A抗性克隆中发现的K59del和P387S MEK突变是否能够活化MEK并促进对化合物A和化合物B的抗性。K59位于MEK核心激酶结构域前面的负调控螺旋的旁边。已有假设认为螺旋A能够稳定MEK1的无活性构象。该构象与图18显示的结合变构抑制剂(比如化合物B)的构象相同或相似。位于该调节螺旋中的诸如MEK1Q56P等突变已被证实能够活化未磷酸化的MEK1并降低对BRAF和MEK抑制剂的敏感性(Emery CMet al.,Proc Natl Acad Sci USA2009,106:20411-6)。P387位于MEK1的非常无序的C末端，挨着T386，其参与MEK1的负调控(Fischmann TO,et al.Biochemistry,2009,48:2661-74)。

如图19、32所示，并且如图20、35和36所示，与模拟和野生型MEK1(IC50s=0.030μM和0.028μM)相比，A375细胞中MEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124L和MEK1F129L的表达降低了化合物A抑制增殖的能力(IC50分别=0.179μM、≥0.420μM、≥0.330μM、0.084μM和0.140μM)。MEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124L和MEK1F129L的表达降低了对化合物B的敏感性(图20)。与增殖数据一致，只有MEK1Q56P和MEK1K59del在用化合物A处理后维持了ERK的磷酸化(图21)。同样，表达MEK1Q56P和MEK1K59del的细胞中未发生p27kip1诱导。MEK1Q56P中缺少对S6P磷酸化的抑制的现象最显著,而在MEK1K59del中仍然是可观的(appreciable)。MEK1Q56P和MEK1K59del均表现出提高的ERK基础磷酸化水平。

为了证实MEK突变对我们的A375克隆的化合物A抗性的贡献，利用小干扰RNA(siRNA)将12R5-1和12R5-5中的MEK1敲低。在没有化合物时，这些克隆对MEK1下调非常敏感，12R5-1中细胞增殖下降>75%，12R5-5中下降>60%，表明了对MEK1的依赖性(图22,图23)。MEK2敲低对增殖没有影响。

获得化合物A抗性的黑素瘤细胞对化合物A和化合物B的组合敏感

因为抗性克隆在化合物A处理后显示保留了ERK磷酸化，测试了BRAF和MEK组合抑制是否能够克服这个抗性。恒定10:1摩尔比的化合物A和化合物B组合在所有无论是含有NRAS或者MEK1突变的获得抗性克隆中加强了对细胞生长的抑制(图8)。虽然因为缺少化合物A单一药物的活性无法计算组合指数，与单独的化合物B比较时，Excess Over Highest Single Agent(EOSHA)显示，在该IC50时细胞生长抑制有19-50%的增长(图8和图24)。在稳定表达NRASQ61K和NRASA146T的A375细胞(图25)、或者转导了MEK1K59del和MEK1Q56P的A375细胞，或者转导了MEK1K59del、MEK1Q56P、MEK1C121S、MEK1P124L和MEK1F129L的A375细胞(图26,图32)中，观察到化合物A和化合物B组合的类似益处。

一个微摩尔的化合物A在所有含有获得性NRAS突变的克隆中均几乎恢复了它们对化合物B的敏感性(图27)。但是，类似的剂量在克隆16R6-4(NRASQ61K和NRASA146T)和12R5-5(MEK1K59del)中只部分恢复了对化合物B的敏感性。在用获得抗性克隆进行的延时增殖分析中，1μM化合物A和0.01μM化合物B的组合抑制了NRAS突变克隆的90%以上的细胞生长(图28)。NRAS突变克隆中的生长抑制比MEK1K59del克隆中的更显著，后者需要更高浓度的化合物B才能观察到类似的效果。

为了进一步对化合物A和化合物B组合进行表征，检验了这种组合对RAF-MEK-ERK途径的影响。如图29所示，单一药物化合物A或化合物B有效地减少了A375中的ERK和S6P磷酸化。这些抑制剂足以减少细胞周期蛋白D1并提高p27kip1。组合的情况下，ERK和S6P磷酸化被进一步减少，但细胞周期蛋白D1或p27kip1蛋白水平显示很少的加强效果。在代表性的获得抗性克隆亚组中，单独的化合物A对ERK或S6P磷酸化或者细胞周期蛋白D1和p27kip1蛋白水平没有什么影响。单独的化合物B减少了ERK磷酸化。组合情况下，NRAS突变体克隆中的ERK磷酸化水平被降低到经化合物A处理过的A375中观察到的水平。这种组合处理对ERK磷酸化的影响在MEK1K59del克隆中被减弱。此外，对这些克隆的组合给药减少了细胞周期蛋白D1并增加了p27kip1，虽然没有达到用化合物A处理的A375那样的程度。在经组合处理的克隆中观察到不同程度的S6P磷酸化减少。A375和这些抗性克隆中的AKT磷酸化略有下降或者没有变化。

因为化合物A和化合物B的组合减少了获得化合物A抗性的克隆的信号转导和增殖，对该组合在16R6-4克隆(NRASQ61K和NRASA146T,MEK1P387S)中对整体基因调控的效应进行了评估。与16R6-4细胞中观察到的抗性一致，化合物A处理改变了少数基因，这些基因与代谢相关(PHGDH、PCK2、ASNS)以及与小分子转运相关(SLC1A4,CHAC1)。化合物A加上化合物B对基因表达的改变与在用这种组合处理的A375细胞中观察到的变化基本重叠(图9，数据未显示)。正如利用以上描述的微阵列分析所确定的，该组合在抗性克隆中对参与细胞增殖和存活的基因(例如CCND1、CDC25A、PCNA、MYC、MCL1)的下调与化合物A或化合物B处理的亲代细胞中类似(数据未显示)。与凋亡相关的转录物(例如BIK、CASP1、CARD6)在该组合处理的抗性克隆中被上调，但没有达到用任何单一药物处理的亲代细胞中的相同程度。该组合在16R6-4和A375中均降低了依赖于MEK-ERK信号转导的转录物(例如DUSP4、DUSP5、DUSP7、ETV1、ETV4、FOXC2、SPRY2)，并上调了与旁路途径有关的转录物(例如RAB26、RHOB、SNAI2)。数据显示化合物A和化合物B的组合几乎恢复了亲代中与RAF或MEK抑制相关的基因表达，导致显著的细胞生长抑制。MAPK和PI3K/mTOR途径的抑制增强了对获得化合物A抗性的克隆的细胞生长抑制。

虽然化合物A和化合物B的组合显著抑制了抗性克隆的增殖，克隆中仍保留了残余的S6P磷酸化。因为S6P磷酸化可以通过活化PI3K/mTOR途径来诱导，化合物A或者化合物B与化合物C的组合。对化合物C表现出一般敏感性的所有克隆都被评估(图8)。对代表性抗性克隆的化合物C处理降低了AKT磷酸化并且略微降低了S6P磷酸化(图30)。给化合物C加上化合物A或者化合物B进一步降低S6P磷酸化和细胞周期D1蛋白。MEK和ERK的磷酸化与用单独的化合物A或者化合物B处理的类似。在一些克隆(比如16R6-4)中，化合物C与化合物A或者化合物B的组合提高了指示凋亡的切割型PARP水平。其它克隆，比如12R5-1，表现出高基础水平的切割型PARP。给化合物C加上化合物A，在7个含有NRAS突变的克隆中的5个、以及在两个MEK1K59del克隆中增强了细胞生长抑制作用(EOSHA>10ppts)(图8)。化合物B和化合物C的组合在9个克隆的8个中有协同效应(CI<0.8)，并且在所有9个克隆(不论NRAS或MEK1突变状态如何)中均增强了细胞生长抑制(EOSHA>20ppts)(图8)。长期增殖分析证实了化合物A或者化合物B与化合物C的组合对生长抑制的增强效果(图31)。总体上，抗性克隆对所用浓度的化合物C和化合物B组合的细胞生长抑制更敏感，但是1μmol/L化合物A和0.03μmol/L化合物C也观察到了可观的活性。化合物A与化合物C组合的抗增殖效应不象在化合物A和化合物B组合，以及化合物B和化合物C组合中观察的那样强力。在含有NRAS突变的YUSIT1克隆中观察到这些组合的类似效益(图9)。

Claims

1.治疗有需要的人中展示V600突变的黑素瘤的方法，所述方法包括

确定黑素瘤是否展示NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1 K59缺失或者MEK1 P387突变中的至少一个，和

如果所述黑素瘤展示NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1 K59缺失或者MEK1 P387突变中的至少一个，则给予所述人有效量的下述中的至少一种:

PI3K抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂的组合。

2.治疗有需要的人中展示V600突变的黑素瘤的方法，所述方法包括

PI3K抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和PI3K抑制剂的组合。

3.治疗有需要的人中展示V600突变的黑素瘤的方法，所述方法包括

PI3K抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和PI3K抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂和PI3K抑制剂的组合。

4.治疗有需要的人中展示V600突变的黑素瘤的方法，所述方法包括

确定黑素瘤是否展示NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1 K59缺失、MEK1 P387突变、MEK1Q56P突变、MEK1 C121突变、MEK1 P124突变或者MEK1 F129突变中的至少一个，和

如果所述黑素瘤展示NRAS Q61突变、NRAS A146突变、MEK1 K59缺失或者MEK1 P387突变、MEK1Q56P突变、MEK1 C121突变、MEK1 P124突变或者MEK1 F129突变中的至少一个，则给予所述人有效量的下述中的至少一种:

PI3K抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和PI3K抑制剂的组合，或者

BRAF抑制剂和MEK抑制剂和PI3K抑制剂的组合。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中黑素瘤展示选自V600E和V600K的V600突变。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中黑素瘤展示NRAS Q61R、NRAS Q61K突变、NRAS Q61H突变、NRAS Q61L突变、NRAS Q61N突变、NRAS Q61E突变、NRAS Q61P突变、NRAS A146T突变、NRAS A146P突变、NRAS A146V突变、MEK1 K59缺失、MEK1 P387L突变、MEK1 Q56P突变、MEK1 C121S突变、MEK1 P124L突变或者MEK1 F129L突变中的至少一个。

6.如权利要求1-5所述的方法，其中BRAF抑制剂是具有以下化学式的化合物:

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

4.如权利要求1-5所述的方法，其中BRAF抑制剂是具有以下化学式的化合物(PLX4032):

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

5.如权利要求1-4所述的方法，其中MEK抑制剂是具有以下化学式的化合物:

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

6.如权利要求1-5所述的方法，其中PI3K抑制剂是具有以下化学式的化合物:

或其药学上可接受的盐或溶剂化物。