CN103397023B - 猪丹毒杆菌的pcr引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了猪丹毒杆菌的PCR引物及其应用，属于动物医学的分子生物学和生产领域。该猪丹毒杆菌的PCR引物核苷酸序列如SEQIDNO:1~2所示，可以用于制备猪丹毒杆菌的检测试剂，能够区分猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和其他野生流行毒株，有利于在生产中监测疫苗的防疫情况和猪丹毒病情的诊断。
Description
技术领域
本发明属于动物医学的分子生物学和生产领域，具体涉及主要用于鉴别猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和野毒流行株（包括强毒流行株GD1201等非猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株的其他猪丹毒毒株）的PCR扩增引物及其应用。
背景技术
猪丹毒（Swine erysipelas,SE）是由猪丹毒杆菌（Erysipelothrix rhusiopathiae, ER）引起的一种急性热性传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块（亚急性）、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎(Wood R.L., Erysipelas, in: Leman, et al. (Eds.), Diseases of swine, Iowa State University Press, Ames, Iowa, 1992,pp. 475–486)。从这些症状的猪体内分离到的猪丹毒杆菌大多为血清1型（1a亚型和1b亚型）和2型（Takashi et al., Protection Effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix rhusiopathiae J.Vet.Med.Sci.60(1):9-14.1998)。本病曾经被称为我国“三大传染病” 之一，近年来，随着养猪集约化发展猪丹毒逐渐淡出人们的视野，但该病并没有完全被净化，在全国各地区一直都有零星出现，给养猪户造成了严重的经济损失（龚平阳，王连想，阳志香．广东地区猪场猪丹毒的发病特点及综合防控措施［Ｊ］．畜禽业总，2010（11）：11－12．）。
猪丹毒杆菌表面膜蛋白(Surface protective antigen A, SpaA)基因全长约为1881bp，编码大小64KD的蛋白。SpaA蛋白是其主要的免疫原性蛋白，并在感染过程中起作用（Takahashi et al., DNA relatedness amongst Erysipelothrixrhusiopathiae strains representing all twenty-three serovars and Erisiperothrix tonsillarum. Int.J.Syst.Bacteriol.42, 469-473.1992，Sou-ichi Makino et al., Surface antigen, SpaA, of Erysipelothrix rhusiopathiae binds to Gram-positive bacterial cell surfaces，FEMS Microbiology Letters 186 (2000) 313-317）。
目前预防该疾病主要采用猪丹毒杆菌弱毒疫苗来进行免疫防控，我国采用的疫苗主要为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株，该疫苗株是由江苏省农业科学院和南京生物药品厂在20世纪70年代联合研制而成，猪丹毒弱毒株G4T10是强毒株经豚鼠370代和在含有0.01%~0.04%吖啶黄血液琼脂培养基上传10代获得的。
目前，由于生产上常用猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株进行对猪丹毒的免疫防控，为了监测疫苗的防疫情况和猪丹毒病情的诊断，迫切需要一种对疫苗弱毒株和野毒流行株感染的鉴别诊断方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题，通过猪丹毒弱毒疫苗G4T10株的SpaA基因序列（Genbank登录号：KF150604）和强毒株Fujishawa、GD1201株（Genbank登录号：KF177344）等毒株序列对比发现疫苗弱毒株在1369-1488位置缺失119bp，针对序列此特征设计引物建立疫苗弱毒株G4T10株和野毒株鉴别诊断的PCR扩增方法。
本发明提供的猪丹毒杆菌的PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
本发明还提供了上述猪丹毒杆菌的PCR引物在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用。
优选地，上述猪丹毒杆菌的PCR引物在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用，所述猪丹毒杆菌为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和/或猪丹毒野毒流行株。
本发明还提供了一种猪丹毒杆菌的检测试剂盒，包括如下组分：SEQ ID NO:1~2所示的引物序列，DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP混合物和无菌双蒸水。
优选地，上述猪丹毒杆菌的检测试剂盒，具体组分为： 10倍稀释的PCR缓冲液1.5-3μL，dNTPs混合物1.5-3μL，浓度为2.5M/μL 的Taq DNA聚合酶1μL，浓度均为10pmol/μL 的SEQ ID NO:1~2所示引物各2μL，ddH2O补足25μL。
本发明的有益效果：本发明的引物序列，对猪丹毒杆菌病进行鉴别诊断，敏感性高，特异性好，而且该引物可区分猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和猪丹毒野毒流行株感染，为生产中监测疫苗的防疫情况和猪丹毒病情的诊断提供依据。
附图说明
图1为两种样品经PCR扩增后产物的电泳图，其中泳道1、2、3分别为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、强毒流行株GD1201和阴性对照。
图2为本发明引物的特异性检验结果电泳图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10和强毒流行株GD1201、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌，猪水肿大肠杆菌、猪巴氏杆菌和阴性对照。
图3为本发明引物的灵敏度检验结果电泳图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株DNA含量为55.8μg、55.8μg、0558μg、0.0558μg、5.58ng、0.558ng、0.0558ng、5.58pg。
图4为本发明引物的灵敏度检验结果电泳图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别表示待检样品中强毒流行株GD1201的DNA含量为23.8μg、23.8μg、0.238μg、0.0238μg、2.38ng、0.238ng、0.0238ng、2.38pg。
图5猪丹毒的不同血清型标准株和临床分离株的PCR扩增产物电泳检测结果，其中泳道1、2、3、4、5、6分别为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株、强毒流行株GD1201、CVCC123（血清型1a）、CVCC127（血清型1b）、CVCC140（血清型2）、临床分离株HB和临床分离株GX。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明，但不用来限制本发明的实施范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为市售商品（10×PCR buffer<即10倍稀释PCR缓冲液>、dNTPs Mixture、Taq DNA聚合酶均购自于TAKARA公司，引物合成由上海生工股份有限公司完成）。猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株（以下简称G4T10株）购自中牧实业股份有限公司，强毒流行株GD1201（以下简称GD1201株）为分离于广东的菌株，经鉴定为强毒力流行株，BHI培养液购自于美国BD公司。
实施例1
（1）待检样品提取DNA：1.5mL含G4T10株的BHI培养液、1.5mL 含GD1201株的BHI培养液，BHI培养液作为阴性对照，分别按照TIANGEN细菌基因组DNA提取操作步骤（提取试剂购自TIANGEN公司）进行提取的DNA放于-20℃保存。
（2）将1μL DNA模板加入到PCR预混液中，配制25μL反应体系，并混合均匀。
PCR预混液：10倍稀释的PCR缓冲液1.5~3μL，dNTP混合物1.5~3μL，浓度为2.5M/μL 的Taq DNA聚合酶1μL，浓度均为10pmol/μL 的SEQ ID NO:1~2所示引物各2μL，ddH2O补足25μL。
（3）将步骤（2）的PCR反应体系置于PCR仪上进行循环扩增反应。扩增条件为：95℃预变性10min；然后95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s共进行30次循环；最后72℃ 延伸7min。PCR反应产物各取5μL在1%（质量比）的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。
（4）结果判定：如果PCR产物仅有一条379 bp的条带，则表明待检样品为G4T10株；如果PCR产物仅有一条498bp的条带，则表明待检样品为GD1201株，无条带出现的为阴性。检测结果见图1和表1。
表1 待检样品检测结果
| 待检样品 | 电泳条带 | 扩增序列测序鉴定 |
| G4T10株培养液 | 379bp | G4T10株 |
| GD1201株培养液 | 498bp | GD1201株 |
| BHI培养液 | 无扩增条带 | 无 |
实施例2 特异性检验
以含有G4T10株的BHI培养液和含有GD1201株的BHI培养液作为阳性对照，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪水肿大肠杆菌和猪巴氏杆菌的BHI培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，检测结果见图2。从图2的结果可以看出，除阳性对照外均未能扩出任何条带，阳性病料经过PCR分别扩增出379bp条带和498bp条带，表明SEQ ID NO:1~2的引物具有很高的特异性。
实施例3 灵敏度检验
实施例1中提取得到的两种菌株（G4T10株和GD1201株）的DNA分别用灭菌双蒸水做10倍的梯度稀释，G4T10株的DNA含量分别为55.8μg、55.8μg、0558μg、0.0558μg、5.58ng、0.558ng、0.0558ng、5.58pg，GD1201株培养样品中提取的DNA稀释后含量分别为23.8μg、23.8μg、0.238μg、0.0238μg、2.38ng、0.238ng、0.0238ng、2.38pg。每个稀释度各取2μL作为模板，按实施例1方法进行PCR扩增检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量分别为0.56ng和2.4 ng，见图3、图4。
实施例4 不同血清型标准菌株和临床分离株的检验
对临床分离流行株HB株（分离于湖北某猪场发病猪群）、临床分离流行株GX（分离于广西某猪场发病猪群）和购自中国兽药监察所菌种保藏中心的猪丹毒杆菌标准菌株CVCC123（血清型1a）、CVCC127（血清型1b）、CVCC140（血清型2），按照实例1中的方法分别提取DNA，使用SEQ ID NO:1~2所示引物，进行PCR扩增，产物通过电泳检测，结果表明本发明的引物序列既可以区分G4T10疫苗株和临床流行野毒株，也可以区分G4T10疫苗株和常见流行血清型猪丹毒杆菌毒株，具有广泛适用性。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 猪丹毒杆菌的PCR引物及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagggtggat taagaaagat aataagtg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caatagattt tgaacctgta accatcat 28
Claims (5)
1.一种猪丹毒杆菌的PCR引物对，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO:1~2所示。
2.权利要求1所述的猪丹毒杆菌的PCR引物对在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的猪丹毒杆菌的PCR引物对在制备猪丹毒杆菌的检测试剂中的应用，其特征在于，所述猪丹毒杆菌为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株和/或猪丹毒野生流行毒株。
4.一种猪丹毒杆菌的检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：SEQ ID NO:1~2所示的引物序列，DNA聚合酶，PCR缓冲液，dNTP混合物和无菌双蒸水。
5.根据权利要求4所述的猪丹毒杆菌的检测试剂盒，其特征在于，具体组分为： 10倍稀释的PCR缓冲液1.5~3μL，dNTP混合物1.5~3μL，浓度为2.5U/μL 的Taq DNA聚合酶1μL，浓度均为10pmol/μL 的SEQ ID NO:1~2所示引物各2μL，ddH2O补足25μL。
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