CN108707680B - 无乳链球菌毒力基因的三连七重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

无乳链球菌毒力基因的三连七重pcr检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组，包括毒力基因sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR、cspA、ponA、bibA、srr‑1、bca、iagA、scpB、fbsB、pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE对应的PCR扩增引物对。各引物序列如序列表所示。本发明还公开了包含上述引物组的试剂盒以及应用上述引物组的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法。所述检测方法以sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR和cspA为第一组，ponA、bibA、srr‑1、bca、iagA、scpB和fbsB为第二组，pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE为第三组，同时在同一反应条件下进行PCR反应，同时扩增21个毒力基因目的片段的靶序列，可根据检测结果确定样品是否为无乳链球菌，确定无乳链球菌宿主来源以及分型，评价菌株毒力基因谱型的变异。

Description

无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组、试剂盒及检 测方法
技术领域
本发明涉及无乳链球菌的检测，具体涉及无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR 检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)隶属于芽孢杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，链球菌属，也称B簇链球菌(group B streptococci，GBS)，为革兰氏阳性球菌，是引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎及奶牛乳腺炎等的重要病原菌，能感染多种水生动物，是重要的***鱼共患病原菌。目前，发现有80多种养殖鱼类容易受到无乳链球菌的感染，世界水产业每年因无乳链球菌病造成的损失高达100亿美元。
人源无乳链球菌的分子血清型和ST型都十分丰富，但鱼源的分子血清型和ST 型相对比较单一，因此，可考虑用毒力基因对鱼源无乳链球菌进行分型。目前，鱼源无乳链球菌毒力基因分型的方法主要是根据检出相关基因的阳性或阴性结果来确定毒力基因谱。研究显示，鱼源无乳链球菌Ia型和Ib型有3个毒力基因(bac、bca和 cylE)存在差异，而Ⅲ型无乳链球菌无bac基因但含有bca基因，Ib-ST-260/261均无bac和bca基因。通过检测毒力基因发现，鱼源无乳链球菌均缺失PI-2a基因，但含有PI-1+PI-2b。在中国，2011年之前PI-2b型鱼源无乳链球菌为主要流行株，而 PI-1+PI-2b型则是近几年流行株，与国外的研究结果存在差异。此外，与其他无乳链球菌基因组比较发现，鱼源无乳链球菌菌株中缺失scpB和lmb基因序列。目前，对无乳链球菌毒力基因检测涉及较少，如仅利用单一、双重和三重PCR的方法检测sip、 cpsE、hylB、ponA和cfb等毒力基因，这些方法只是为了单纯的检测某些基因的有或无，不能确定无乳链球菌的宿主来源、分型及毒力基因谱型变异情况。有鉴于此，开发一种快速、高效、灵敏度高的无乳链球菌毒力基因三连七重PCR势在必行，这对于确定该无乳链球菌的宿主来源、分型，全面展现无乳链球菌毒力基因谱、致病性、分子流行及遗传变异等方面具有重要的意义。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组。
本发明目的之二在于提供无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测试剂盒。
本发明目的之三在于提供无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法。
本发明目的之四涉及所述检测引物组的应用。
本发明人对不同来源的无乳链球菌毒力基因进行了梳理，筛选出表面免疫相关蛋白基因(sip)、纤维蛋白结合蛋白A基因(fbsA)、透明质酸酶基因(hylB)、CAMP因子基因(cfb)、超氧化物歧化酶基因(sodA)、调节蛋白基因(DltR)、丝氨酸蛋白酶基因(cspA)、青霉素结合蛋白基因(ponA)、免疫原性细菌黏附蛋白基因(bibA)、富含丝氨酸重复蛋白基因(srr-1)、αC蛋白基因(bca)、侵袭相关基因(iagA)、C5a肽酶基因(scpB)、纤维蛋白结合蛋白B基因(fbsB)、纤维蛋白结合蛋白基因(pavA)、肺炎球菌表面抗原A基因(psaA)、溶血素III(spb1)、βC蛋白基因(bac)、C3降解蛋白酶基因(cppA)、层黏连蛋白结合蛋白基因(lmb)和β-溶血素/溶细胞素基因 (cylE)等21个毒力基因，针对这21个毒力基因设计特异引物，可对不同来源的无乳链球菌进行特异性鉴别。
本发明的目的之一通过以下技术方案来实现：一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组，如表1所示：
表1：
Figure GDA0003319435630000021
Figure GDA0003319435630000031
本发明目的之二通过以下技术方案来实现：无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测试剂盒，包含表1所示的21个无乳链球菌毒力基因的21对引物对。
进一步地，所述的检测试剂盒，还包含TE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、CTAB的NaCl溶液、对照无乳链球菌DNA模板和PCR Mix。
所述无乳链球菌的DNA模板为人源或鱼源无乳链球菌的DNA模板。
进一步地，上述无乳链球菌的检测试剂盒，所述检测引物对中的各引物浓度均为10μM。
所述21对引物对分为3组混合引物组，分别为：混合引物组1包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组2包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca 引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组3包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成，置于容器，1管。
本发明目的之三通过以下技术方案来实现：无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法，包括如下步骤：
1)取待检测样品制备样品DNA模板；
2)构建样品组三连七重PCR反应体系：
第一组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第二组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA 引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
3)构建阳性对照组三连七重PCR反应体系：
第一组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA 引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
4)将步骤2)制得的样品组和步骤3)制得的对照组多重PCR反应体系分别混匀离心后置于PCR仪中，进行PCR反应，反应结束后进行电泳检测，并于凝胶成像***下观察结果，根据电泳条带判断样品是否为无乳链球菌或根据毒力基因缺失确定无乳链球菌的宿主来源以及分型，评价菌株毒力基因谱型的变异。
在多重PCR中，同一PCR反应管中同时加多对特异性引物，进行PCR扩增，其影响因素在于引物的设计和反应条件。由于各引物间存在竞争关系，强势引物可能掩盖弱势引物，导致目的片段丢失，因此各种引物混合后扩增会有条带丢失现象。此外，引物间相互作用会产生严重的引物二聚体而使引物失效。事实上，在同一个PCR反应管对21个无乳链球菌毒力基因进行扩增，出现了多个目的基因片段的丢失，根本无法获得准确的检测结果。本发明人经过研究发现，以检测毒力基因sip、fbsA、hylB、 cfb、sodA、DltR和cspA为第一组，ponA、bibA、srr-1、bca、iagA、scpB和fbsB为第二组，pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE为第三组，并调整各组中引物之间的浓度差异，能够避免引物间干扰以及条带丢失，有效地检测21个毒力基因。为此，发明人将21种毒力基因分为3组，在各毒力基因对应的特异性引物存在下并于同一反应条件分别进行7重PCR，在一次反应中能同时扩增21个目的片段的靶序列，构建了无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法。
所述步骤4)中，PCR反应条件为：于95℃预变性5min；95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s，38个循环；72℃延伸10min。
本发明所述的对照DNA模板为人源或鱼源无乳链球菌的DNA模板。
本发明上述检测方法可用于检测包括动物体、水产品、养殖环境、养殖用食物等是否存在无乳链球菌以及判断无乳链球菌的宿主来源、分型及毒力基因变异情况。所述养殖环境包括养殖水体和养殖土壤等。
本发明目的之四涉及的检测引物组的应用，具体为所述的检测引物组作为无乳链球菌毒力基因检测试剂的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1.本发明设置的各引物组对其对应的毒力基因具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品是否含有无乳链球菌，能够实现对该菌进行检测。
2.本发明提供的方法检测中以毒力基因sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR和cspA为一组，毒力基因ponA、bibA、srr-1、bca、iagA、scpB和fbsB为一组，毒力基因pavA、 psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE为一组，并调整每组中各引物之间的浓度差异，避免了强势引物掩盖弱势引物导致目的片段丢失以及避免引物间相互作用会产生严重的引物二聚体而失效，有效准确地检测21个毒力基因。
3.本发明提供的引物组及检测方法检测的灵敏度高，第一组检测无乳链球菌的最低浓度为0.912ng/μL，第二组检测无乳链球菌的最低浓度为0.912ng/μL，第三组检测无乳链球菌的最低浓度为1.824ng/μL。
4.本发明能够在一次反应中同时扩增21个毒力基因目的片段，相比传统检测方法，不仅节约了成本和时间，也减少了劳动力的支出。
5.本发明提供的检测方法，不但使得养殖鱼体内和环境中病原检测更加快速，而且可用于鱼类养殖过程中各时期跟踪检测，可以监测菌株毒力基因的变异，对病害的爆发进行及时预警，避免病原菌传播流行，降低养殖鱼类疾病爆发的风险，提高水产品质量安全，具有很高的实用价值，有利于增加水产养殖的经济和社会效益。
6.本发明可以确定无乳链球菌的宿主来源、分型及毒力基因谱，更加全面地展现无乳链球菌毒力谱、致病性、分子流行及遗传变异等方面，对研究具有重要意义。
4.本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只需常规PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可。
5.本发明提供的引物组及检测方法应用范围广泛，不仅可以检测鱼类体内和养殖水体中是否存在的无乳链球菌，也可针对其他环境或动物中是否存在无乳链球菌进行快速检测。
6.本发明提供的检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，不需经过细菌培养，检测所需样品量少，可实现微创取样，容易实现工业化大生产，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是本发明实施例2检测的电泳图。
图2是本发明实施例3的第一组引物检测的电泳图。
图3是本发明实施例3的第二组引物检测的电泳图。
图4是本发明实施例3的第三组引物检测的电泳图。
图5是本发明实施例4的第一组引物检测的电泳图。
图6是本发明实施例4的第二组引物检测的电泳图。
图7是本发明实施例4的第三组引物检测的电泳图。
图1中，M：2000bp marker，1-1.人源无乳链球菌第一组反应体系，1-2.鱼源无乳链球菌第一组反应体系，2-1.人源无乳链球菌第二组反应体系，2-2.鱼源无乳链球菌第二组反应体系，3-1.人源无乳链球菌第三组反应体系，3-2.鱼源无乳链球菌第三组反应体系。
图2-4中，M：2000bp marker，1.无乳链球菌DNA模板浓度228ng/μL，2.无乳链球菌DNA模板浓度45.6ng/μL，3.无乳链球菌DNA模板浓度9.12ng/μL，4.无乳链球菌DNA模板浓度1.824ng/μL，5.无乳链球菌DNA模板浓度0.912ng/μL，6. 无乳链球菌DNA模板浓度8.0.456ng/μL，7.无乳链球菌DNA模板浓度0.228 ng/μL，8.无乳链球菌DNA模板浓度0.114ng/μL。
图5-7中，M：2000bp marker，鱼源无乳链球菌：1.TZQ0902，2.TGY1001，3.TDH1001，4.TZJ1101，5.TMM1101，6.THZ1201，7.TZH1201，8.TBY1301，9. TGY1301，10.CTHZ1401，11.TZC1401，12.YJ1501，13.FS1501，14.HZ1501，15. MM1501，16.YX1622，17.MM1630，18.ZQ1673，19.TKP1601，20.TLJ1601，21. TGZ1601，22.TWC1601。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。
实施例1
取人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138和鱼源无乳链球菌标准菌株ATCC51487分别提取基因组DNA模板。
提取人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138基因组DNA模板：
(1)分别离心收集培养的人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138用1000μL的 TE缓冲液重悬细菌，取细菌重悬液180μL，转入到1.5mL的离心管中，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min。
(2)向步骤(1)溶液中加入10μL质量浓度为10％SDS和5μL 20mg/mL的蛋白酶 K，并于37℃温育1h。
(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入50μL 5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入40μL CTAB的NaCl溶液，65℃温育20min。
(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min。
(5)将步骤(4)离心后的上清液转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min。
(6)步骤(5)离心后去上清液，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min。
(7)步骤(6)离心后去上清液，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为人源无乳链球菌ATCC BAA-1138基因组DNA模板。
采用上述方法提取获得鱼源无乳链球菌标准菌株ATCC51487基因组DNA模板。
实施例2
分别构建人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138和鱼源无乳链球菌标准菌株ATCC51487三连七重PCR反应体系。
第一组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
表1：
Figure GDA0003319435630000081
Figure GDA0003319435630000091
PCR程序：于95℃预变性5min；95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90 s，38个循环；72℃延伸10min。
PCR反应结束后进行电泳检测，并于凝胶成像***下观察结果。如图1及表2所示，人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138缺失bibA，而鱼源无乳链球菌标准菌株ATCC51487缺失scpB和lmb，从而实现了无乳链球菌的宿主来源的确定。
表2：
Figure GDA0003319435630000092
Figure GDA0003319435630000101
实施例3灵敏性试验
取鱼源无乳链球菌标准菌株ATCC51487菌液，以实施例1的方法提取细菌基因组DNA，对基因组DNA浓度稀释：228ng/μL、45.6ng/μL、9.12ng/μL、1.824ng/μL、 0.912ng/μL、0.456ng/μL、0.228ng/μL、0.114ng/μL。根据实施例2的方法分别进行 PCR扩增以及电泳检测，结果如图2-4所示。从图中可得到，第一组引物的灵敏度在 0.912ng/μL，第二组引物的灵敏度在0.912ng/μL，第三组引物灵敏度在1.824ng/μL，可见本发明的检测无乳链球菌的检测限比较低，具有较高的灵敏性。
实施例4
取表3所示的22株鱼源无乳链球菌：TZQ0902、TGY1001、TDH1001、TZJ1101、TMM1101、THZ1201、TZH1201、TBY1301、TGY1301、CTHZ1401、TZC1401、YJ1501、 FS1501、HZ1501、MM1501、YX1622、MM1630、ZQ1673、TKP1601、TLJ1601、TGZ1601、 TWC1601。
表3：
Figure GDA0003319435630000102
Figure GDA0003319435630000111
取上述鱼源无乳链球菌菌株分别提取基因组DNA，方法参见实施例1，然后进行三连七重PCR反应，反应结束后进行电泳检测。方法参见实施例2，结果图5-7。由表4可看出，22株菌中均可扩增出19个毒力基因，而缺失scpB和lmb，根据实施例 2可判定此22株菌为鱼源无乳链球菌。
表4：
Figure GDA0003319435630000112
Figure GDA0003319435630000121
Figure GDA0003319435630000131
实施例5
1.鱼(包括鱼体内细菌)基因组DNA提取：
(1)取鱼组织待检测样品50～100mg并加入1000μL的TE缓冲液，用匀浆器充分匀浆，取组织匀浆液180μL，转入到1.5mL的离心管中，加入20μL浓度为50mg/mL 的溶菌酶，30℃孵育10min。
(2)向步骤(1)溶液中加入10μL质量浓度为10％SDS和5μL 20mg/mL的蛋白酶 K，并于37℃温育1h。
(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入50μL 5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入40μL CTAB的NaCl溶液，65℃温育20min。
(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min。
(5)将步骤(4)离心后的上清液转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min。
(6)步骤(5)离心后去上清液，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min。
(7)步骤(6)离心后去上清液，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为样品DNA模板。
2.细菌基因组DNA提取：
(1)分别离心收集培养的人源无乳链球菌、以及实施例4所述22株鱼源无乳链球菌，分别用1000μL的TE缓冲液重悬细菌，取细菌重悬液180μL，转入到1.5mL的离心管中，加入20μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，30℃孵育10min。
(2)向步骤(1)溶液中加入10μL质量浓度为10％SDS和5μL 20mg/mL的蛋白酶 K，并于37℃温育1h。
(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入50μL 5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入40μL CTAB的NaCl溶液，65℃温育20min。
(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min。
(5)将步骤(4)离心后的上清液转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min。
(6)步骤(5)离心后去上清液，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min。
(7)步骤(6)离心后去上清液，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为细菌基因组DNA模板。
3.三连七重PCR反应：
分别构建样品组三连七重PCR反应体系、以及人源无乳链球菌标准菌株ATCC BAA-1138和实施例4所述22种鱼源无乳链球菌标准菌株的对照品三组七重PCR反应体系。
样品组三连七重PCR反应体系：
第一组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25μL Mix，混合引物组17μL，样品DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
阳性对照组三连七重PCR反应体系：
第一组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25μL Mix，混合引物组17μL，对照DNA模板4μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
将样品组和阳性对照组多重PCR反应体系分别混匀离心后置于PCR仪中，进行 PCR反应。PCR程序：于95℃预变性5min，95℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸90s、38个循环；72℃延伸10min。
PCR反应结束后进行电泳检测，并于凝胶成像***下观察结果。将样品的电泳图与各对照品电泳图(图1-7)进行比对，即可判断样品是否为无乳链球菌，且根据它的毒力基因特点判断宿主的来源以及分型。
实施例6试剂盒
本实施例的检测试剂盒可用于三连七重PCR快速检测样品中是否含有无乳链球菌，且根据它的毒力基因特点判断宿主的来源以、分型及毒力基因谱的变异。该检测试剂盒由可检测无乳链球菌21种毒力基因的3个混合引物组、TE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、 CTAB的NaCl溶液、对照无乳链球菌DNA模板和PCR Mix组成，其中：
(1)21对引物对分为3组混合引物组，分别为：混合引物组1包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对:DltR引物对:cspA引物对＝3:3:2:3:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组2包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca 引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对＝3:3:3:2:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组3包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对＝3:3:3:2:2:2:3进行混合而成，置于容器，1管。
(2)溶菌酶(50mg/mL)，置于容器，1管。
(3)蛋白酶K(20mg/mL)，置于容器，1管。
(4)制备TE缓冲液(10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA，pH 8.0)，置于容器，1管。
(5)质量浓度为10％SDS，置于容器，1管。
(6)酚-氯仿-异戊醇混合溶液，酚-氯仿-异戊醇体积比25:24:1，置于容器，1管。
(7)异丙醇，置于容器，1管。
(8)体积浓度为70％乙醇，置于容器，1管。
(9)CTAB的NaCl溶液，5g CTAB溶于100mL 0.5M NaCl溶液中，置于容器， 1管。
(10)对照无乳链球菌DNA模板：分别提取人源无乳链球菌标准菌株、鱼源无乳链球菌标准菌株的基因组DNA，置于容器，2管。
(11)2×PCR Mix，置于容器，1管。
(12)一块泡沫板，将上述14个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的检测试剂盒。
本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。如可采用上述实施例的引物组和检测方法对养殖水体、养殖土壤、养殖食物等进行检测，以判断是否存在无乳链球菌，确定无乳链球菌宿主来源以及分型，评价菌株毒力基因谱型的变异。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组、试剂盒及检测方法
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acagatacga cgtggacagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accacgatct ggcattgcat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtgttggaa atcaaagtca aggt 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcattgcgt ctcaaaccgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccacaaccc gtcacaacac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacgcgcccc atatctacta 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aactctagtg gctggtgcat 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctccaacagc atgtgtgatt gc 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgatgcgctt gagccacata 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctttgatgt agttaggacg aaca 24
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtctgaaggt ccccaaacct 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttacccaa acgctcagga t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcacgtaac cagtatcgca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaccgagtt taacggcatc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acaacttgct ttgctcgctg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agagcccttc tggcattgtc 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgcataatat ccaggtgtag gca 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgagagattg ggaagtggtg c 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgttgcagt aaagcgctgc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaagagagt cgttttcggc 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcaagtttgg tgcagcttct g 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tccggtactg acaatactaa caat 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gcatggccat tccactgaag 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gctagcactc atggcacctt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgcggccttt atcagtcgaa 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
aacagtccca tgatacccgc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agttgcgcaa acttctgtcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttccgcagt tgttacaccg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcgacttaca ttgccccacc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggcggcatct gtcttaacct 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agctgtcacc cttttgacct t 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
taggcttagg tgcctgtgct 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gacatgggga gatggtggtg 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agcttctgtg ccccattcaa 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tgattccctt ttgctctgcc a 21
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gttcatggga agcgttgctc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgcaaatctt gtccctgtgc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tcgtactcgt gcggtgaatg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atttgtgacg caacacacgg 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcttgtttcc gcttggagca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
attctcctcc tggcaaagcc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgacgcttgg tagttgctgt 20

Claims (10)

1.一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组，其特征是，包括毒力基因sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR、cspA、ponA、bibA、srr-1、bca、iagA、scpB、fbsB、pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE对应的PCR扩增引物对，所述的PCR扩增引物对为：
(1) 所述sip的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的引物sip-F和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列所示的引物sip-R；
(2) 所述fbsA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的引物fbsA-F和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的引物fbsA-R；
(3) 所述hylB的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物hylB-F和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的引物hylB-R；
(4) 所述cfb的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的引物cfb-F和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的引物 cfb-R；
(5) 所述sodA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的引物sodA-F和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的引物sodA-R；
(6) 所述DltR的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物DltR-F和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的引物DltR-R；
(7) 所述cspA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的引物cspA-F和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的引物cspA-R；
(8) 所述ponA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的引物ponA-F和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的引物ponA-R；
(9) 所述bibA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的引物bibA-F和SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的引物bibA-R；
(10) 所述srr-1的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列的引物srr- 1-F和SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列的引物srr-1-R；
(11) 所述bca的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列的引物bca-F和SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列的引物bca-R；
(12) 所述iagA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.23所示的核苷酸序列的引物iagA-F和SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列的引物iagA-R；
(13) 所述scpB的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列的引物scpB-F和SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列的引物scpB -R；
(14) 所述fbsB的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列的引物fbsB-F和SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列的引物fbsB-R；
(15) 所述pavA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.29所示的核苷酸序列的引物pavA -F和SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列的引物pavA-R；
(16) 所述psaA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.31所示的核苷酸序列的引物psaA-F和SEQ ID NO.32所示的核苷酸序列的引物psaA -R；
(17) 所述spb1的PCR扩增引物：包括SEQ ID NO.33所示的核苷酸序列的引物spb1-F和SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列的引物spb1-R；
(18) 所述bac的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列的引物bac-F和SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列的引物bac-R；
(19) 所述cppA的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列的引物cppA -F和SEQ ID NO.38所示的核苷酸序列的引物cppA-R；
(20) 所述lmb的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列的引物lmb-F和SEQ ID NO.40所示的核苷酸序列的引物lmb-R；
(21) 所述cylE的PCR扩增引物对：包括SEQ ID NO.41所示的核苷酸序列的引物cylE-F和SEQ ID NO.42所示的核苷酸序列的引物cylE-R。
2.包含如权利要求1所述的检测引物组的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，还包含TE缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70%的乙醇、CTAB的NaCl溶液、对照无乳链球菌DNA模板和PCR Mix。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述无乳链球菌的DNA模板为人源或鱼源无乳链球菌的DNA模板。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述检测引物组中的各引物浓度均为10 μM。
6.根据权利要求2或3或5所述的试剂盒，其特征是，所述21对引物对分为3组混合引物组，分别为：混合引物组1包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对: DltR引物对: cspA引物对=3:3:2:3:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组2包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对=3:3:3:2:2:2:2进行混合而成，置于容器，1管；混合引物组3包含7种毒力基因引物对，即由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对=3:3:3:2:2:2:3进行混合而成，置于容器，1管。
7.应用如权利要求1所述的检测引物组的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法，为非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征是，包括如下步骤：
1）取待检测样品制备样品DNA模板；
2）构建样品组三连七重PCR反应体系：
第一组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，样品DNA模板4 μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对: DltR引物对: cspA引物对=3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，样品DNA模板4 μL，补充ddH2O至50μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对=3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，样品DNA模板4 μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对=3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
3）构建阳性对照组三连七重PCR反应体系：
第一组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，对照DNA模板4 μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为sip引物对:fbsA引物对:hylB引物对:cfb引物对:sodA引物对: DltR引物对: cspA引物对=3:3:2:3:2:2:2进行混合而成；
第二组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，对照DNA模板4 μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为ponA引物对:bibA引物对:srr-1引物对:bca引物对:iagA引物对:scpB引物对:fbsB引物对=3:3:3:2:2:2:2进行混合而成；
第三组：25 μL Mix，混合引物组17 μL，对照DNA模板4 μL，补充ddH2O至50 μL体系，混合引物组是由引物浓度均为10 μM的各引物对溶液按照体积比为pavA引物对:psaA引物对:spb1引物对:bac引物对:cppA引物对:lmb引物对:cylE引物对=3:3:3:2:2:2:3进行混合而成；
4）将步骤2）制得的样品组和步骤3）制得的对照组多重PCR反应体系分别混匀离心后置于PCR仪中，进行PCR反应，反应结束后进行电泳检测，并于凝胶成像***下观察结果，根据电泳条带判断样品是否为无乳链球菌或根据毒力基因缺失确定无乳链球菌的宿主来源以及分型，评价菌株毒力基因谱型的变异。
8.根据权利要求7所述的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法，为非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征是，所述步骤4)中，PCR反应条件为：于95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s, 38个循环; 72 ℃延伸10 min。
9.根据权利要求8所述的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法，为非疾病诊断和治疗目的的检测方法，其特征是，所述对照DNA模板为人源或鱼源无乳链球菌的DNA模板。
10.如权利要求1所述的检测引物组在制备无乳链球菌毒力基因检测试剂的应用。
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